Bioluminescencyjny i fluorescencyjny, ortotopowy, syngeniczny mysi model androgenowego i opornego na kastrację raka gruczołu krokowego

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie domięśniowego wstrzykiwania komórek raka prostaty do środka prostaty, z późniejszą kastracją. Ortotopowe modele przedkliniczne androgenozależnego i opornego na kastrację raka gruczołu krokowego mają kluczowe znaczenie dla badania choroby w kontekście klinicznie istotnego mikrośrodowiska guza i immunokompetentnego gospodarza.

Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie iniekcji do gruczołu krokowego mysich komórek raka w celu wywołania powstawania syngennych guzów ortotopowych, które mogą modelować zarówno raka prostaty zależnego od androgenów, jak i opornego na kastrację. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie raka prostaty, takie jak to, co napędza rozwój raka prostaty i jakie metody leczenia najlepiej eliminują te guzy. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że guzy ortotopowe są genetycznie bardziej złożone, rozwijają się w klinicznie reprezentatywnym mikrośrodowisku guza i mogą być genetycznie modyfikowane przed wstrzyknięciem.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii ludzkiego raka prostaty, ponieważ guzy ortotopowe reagują na terapie w podobny sposób, jak obserwowany u ludzi. Po potwierdzeniu braku reakcji na szczypanie palców u nóg, nałóż maść na oczy myszy i zgol całe futro z brzucha zwierzęcia. Wysterylizuj odsłoniętą skórę za pomocą trzech rund peelingu chirurgicznego za pomocą sterylnych, nieprzywierających wacików, a następnie sterylnych chusteczek nasączonych alkoholem.

Gdy skóra jest sucha, umieść mysz w pozycji leżącej na czystej powierzchni nad poduszką grzewczą bezpośrednio pod obiektywem czystego mikroskopu chirurgicznego. I przykryj zwierzę sterylną serwetą z małym otworem wyciętym nad brzuchem. Wykonaj jednocentymetrowe nacięcie w zewnętrznej skórze i wewnętrznej muskulaturze brzucha wzdłuż linii środkowej brzucha powyżej penisa i gruczołów napletkowych.

Zlokalizuj jeden z obustronnych pęcherzyków nasiennych i przyczepionych przednich płatów prostaty, które są zwykle tylne, boczne i nieco wyższe od pęcherza Poproś asystenta o wymieszanie roztworu komórek rakowych MIC-CAP Matrigel z delikatnym pipetowaniem i powolne odsysanie 30 mikrolitrów komórek do igły o rozmiarze 28 dołączonej do strzykawki o pojemności 50 mikrolitrów. Następnie, za pomocą kleszczy tkankowych Graefe, delikatnie podnieś końcówkę jednego pęcherzyka nasiennego, aby wytworzyć napięcie na tkance bez nakłuwania pęcherzyka i ostrożnie włóż skos igły równolegle do długiej osi przedniego płata prostaty. Powoli wstrzyknij całą objętość komórek do płata, a następnie powoli wycofaj igłę, aby zapobiec wyciekowi.

Udane wstrzyknięcie będzie widoczne po obrzęku przedniego płata prostaty. Ostrożnie i stabilnie utrzymuj pęcherzyk nasienny i wstrzyknięty płat prostaty na zewnątrz myszy przez około 30 sekund, aby umożliwić Matrigel częściowe zestalenie się w płacie. Użyj sterylnego aplikatora z końcówką poliestrową, aby zebrać wyciek roztworu komórkowego do jamy brzusznej, aby zapobiec rozwojowi guza ortonostopowego.

Dokładne wstrzyknięcie do protezy ma kluczowe znaczenie dla rozwoju guza noortotopowego. Zachowanie szczególnej ostrożności, aby uniknąć przebicia pęcherzyka nasiennego, powolne wstrzykiwanie zawiesiny komórek rakowych i zbieranie wszelkich wycieków komórkowych zwiększy powodzenie tej procedury. Teraz delikatnie przywróć pęcherzyk nasienny i wstrzyknięty płat do jamy brzusznej bez wywierania nacisku na płat i wymień wszelkie zewnętrzne tkanki.

Używając wchłanialnych szwów igłowych 5-0 vicryl z odwróconym cięciem, zamknij wewnętrzną muskulaturę brzucha ciągłymi szwami, a następnie zamknij zewnętrzną skórę brzucha przerywanymi szwami za pomocą niewchłanialnych nici z nylonu monofilamentowego 4-0. Następnie zastosuj analgezję pooperacyjną i umieść mysz w klatce bez ściółki do połowy na poduszce grzewczej z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia. Stabilna transfekcja komórek Myc-CaP pod kątem lucyferazy świetlika i ekspresji mCherry pozwala na śledzenie guzów prostaty przez nieinwazyjną bioluminescencję i fluorescencję in vivo.

Tutaj pokazano reprezentatywne guzy wycięte z jamy brzusznej w 30 dniu po wstrzyknięciu dogruczołu krokowego. Przy odpowiedniej technice objętość i masę guza można zarejestrować ze stosunkowo małym błędem standardowym, chociaż oczekuje się pewnej zmienności między małymi i dużymi masami guza. Mysie komórki rakowe wstrzyknięte doprostatycznie mogą być również analizowane za pomocą immunohistochemii pod kątem obecności naciekających nowotwór limfocytów T CD3-dodatnich lub innych komórek odpornościowych będących przedmiotem zainteresowania.

Co więcej, model ten zapewnia obiektywny punkt końcowy przeżycia, ponieważ duża masa guza pierwotnego powoduje krwotoczne wodobrzusze jamy brzusznej i/lub zmniejszone uwodzenie podczas poruszania się i/lub piloerekcję. Kastracja trzy dni po wstrzyknięciu dogruczołu krokowego powoduje silną regresję guza, a następnie ostateczny nawrót guza po około 30 dniach, reprezentatywny dla opornego na kastrację raka prostaty. Sekcja i analiza histologiczna guzów raka prostaty opornych na kastrację nie wykazuje różnicowania neuroendokrynnego, ponieważ guzy utrzymują wysoki poziom receptorów androgenowych i są ujemne dla markera neuroendokrynnego synaptofizyny.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 20 do 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Przystępując do tego zabiegu, należy pamiętać o podawaniu przed- i pooperacyjnych leków przeciwbólowych oraz o wykonywaniu wszystkich operacji techniką sterylną i z pomocą asystenta chirurgicznego. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak immunohistochemia, cytometria przepływowa oraz ocena objętości i masy guza oraz przeżywalności zwierząt, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące odpowiedzi na immunoterapie i inne eksperymentalne terapie

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wstrzykiwać komórki raka prostaty do przedniego płata prostaty myszy w celu ewentualnej kastracji chirurgicznej oraz analizy regresji i nawrotu guza. Nie zapominaj, że praca z komórkami rakowymi może być niezwykle niebezpieczna i istnieją środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej podczas wykonywania tej procedury.