Name: Metoda szybkiego rozciągania indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych w formacie 96-dołkowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Poznaj metodę szybkiego rozciągania neuronów pochodzących z ludzkich komórek iPSC w formacie 96-dołkowym. Technika umożliwia badanie neurotraumy i odkrywanie leków w modelu in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca jest częściowo wspierana przez grant z National Institutes of Health (R21NS098129). Chcielibyśmy podziękować za doskonałą pomoc techniczną ze strony SueSan Chen, Jonathana Tana, Courtney Cavanaugh, Shi Kai Ng i Feng Yuan Bu, którzy zaprojektowali i zbudowali konstrukcję podtrzymującą światła używane podczas eksperymentów z obrazowaniem z dużą prędkością opisanych w tym manuskrypcie.

<ol><li>Faul, M., L, X. u, Wald, M. M., Coronado, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFaul%2C+M+%22Traumatic+brain+injury+in+the+United+States%3A+emergency+department+visits%2C+hospitalizations%2C+and+deaths%2C+2002-2006%22">Traumatic brain injury in the United States: emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006</a>. , (2010).</li>
<li>Kabadi, S. V., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+strategies+for+traumatic+brain+injury%3A+improving+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective strategies for traumatic brain injury: improving clinical translation.</a> Int J Mol Sci. 15 (1), 1216-1236 (2014).</li>
<li>Kiskinis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+disrupted+in+human+ALS+motor+neurons+identified+through+genetic+correction+of+mutant+SOD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathways disrupted in human ALS motor neurons identified through genetic correction of mutant SOD1.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 781-795 (2014).</li>
<li>Smith, D. H., Wolf, J. A., Lusardi, T. A., Lee, V. M., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+tolerance+and+delayed+elastic+response+of+cultured+axons+to+dynamic+stretch+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">High tolerance and delayed elastic response of cultured axons to dynamic stretch injury.</a> J Neurosci. 19 (11), 4263-4269 (1999).</li>
<li>Wolf, J. A., Stys, P. K., Lusardi, T., Meaney, D., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+axonal+injury+induces+calcium+influx+modulated+by+tetrodotoxin-sensitive+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Traumatic axonal injury induces calcium influx modulated by tetrodotoxin-sensitive sodium channels.</a> J Neurosci. 21 (6), 1923-1930 (2001).</li>
<li>Lusardi, T. A., Wolf, J. A., Putt, M. E., Smith, D. H., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+acute+calcium+influx+after+mechanical+stretch+injury+in+vitro+on+the+viability+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Effect of acute calcium influx after mechanical stretch injury in vitro on the viability of hippocampal neurons.</a> J Neurotrauma. 21 (1), 61-72 (2004).</li>
<li>Magou, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+high+throughput+axon+injury+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Engineering a high throughput axon injury system.</a> J Neurotrauma. 28 (11), 2203-2218 (2011).</li>
<li>Morrison, B. 3rd, Cater, H. L., Benham, C. D., Sundstrom, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+traumatic+brain+injury+utilising+two-dimensional+stretch+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of traumatic brain injury utilising two-dimensional stretch of organotypic hippocampal slice cultures.</a> J Neurosci Methods. 150 (2), 192-201 (2006).</li>
<li>Cater, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-induced+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures+reproduces+in+vivo+post-traumatic+neurodegeneration%3A+role+of+glutamate+receptors+and+voltage-dependent+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Stretch-induced injury in organotypic hippocampal slice cultures reproduces in vivo post-traumatic neurodegeneration: role of glutamate receptors and voltage-dependent calcium channels.</a> J Neurochem. 101 (2), 434-447 (2007).</li>
<li>Kang, W. H., Morrison, B. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+tolerance+to+mechanical+deformation+developed+from+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomech+Model+Mechanobiol%22%5BJournal%5D)">Functional tolerance to mechanical deformation developed from organotypic hippocampal slice cultures.</a> Biomech Model Mechanobiol. 14 (3), 561-575 (2015).</li>
<li>Sherman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+Injury+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Neurons+in+a+96+Well+Format%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Neurons in a 96 Well Format.</a> Sci Rep. 6, 34097(2016).</li>
<li>Hardy, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+Head+Injury+Mechanisms+Using+Neutral+Density+Technology+and+High-Speed+Biplanar+X-ray%5BTitle%5D)+AND+%22Stapp+Car+Crash+J%22%5BJournal%5D)">Investigation of Head Injury Mechanisms Using Neutral Density Technology and High-Speed Biplanar X-ray.</a> Stapp Car Crash J. 45, 337-368 (2001).</li>
<li>Hardy, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+response+of+the+human+cadaver+head+to+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Stapp+Car+Crash+J%22%5BJournal%5D)">A study of the response of the human cadaver head to impact.</a> Stapp Car Crash J. 51, 17-80 (2007).</li>
<li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+room+temperature+bonding+of+thermoplastics+and+poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple room temperature bonding of thermoplastics and poly(dimethylsiloxane).</a> Lab Chip. 11 (5), 962-965 (2011).</li>
<li>Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22285252">Axonal pathology in traumatic brain injury.</a> Exp Neurol. 246, 35-43 (2013).</li>
<li>Lacour, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+and+stretchable+micro-electrodes+for+in+vitro+and+in+vivo+neural+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng+Comput%22%5BJournal%5D)">Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces.</a> Med Biol Eng Comput. 48 (10), 945-954 (2010).</li>
<li>Yu, Z., Morrison, B. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+mild+traumatic+brain+injury+induces+functional+alteration+of+the+developing+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Experimental mild traumatic brain injury induces functional alteration of the developing hippocampus.</a> J Neurophysiol. 103 (1), 499-510 (2010).</li>
<li>Tcw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Platform+for+Astrocyte+Differentiation+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).</li>
<li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kluczem do uzyskania spójnego, biofidelicznego fenotypu w tym modelu jest zastosowanie konsekwentnej mechanicznej zniewagi biofidelicznej. Model ten może generować czas trwania impulsu tak krótki, jak 10-15 ms, który jest podobny do czasu trwania impulsu w przypadku uderzeń głową człowieka zgodnie z eksperymentami ze zwłokami12,13. Konsystencja tej zniewagi zależy od wyrównania płytki z blokiem wgłębnika i konsekwentnego smarowania wgłębników. Gdy blok wgłębnika jest dobrze wyrównany, nie ma trendu w przyłożonym odkształceniu w rzędach lub kolumnach (Rysunek 2C). Cienka warstwa smaru zazwyczaj wytwarza mniejsze tarcie niż gruba warstwa, a lepkie smary nie są zalecane, ponieważ zanieczyszczają silikon i utrudniają przepływ światła podczas mikroskopii. Rzeczywista amplituda przemieszczenia stopnia może być znacznie niższa od zalecanej amplitudy przemieszczenia, gdy stosuje się wiele wgłębników, a zalecana amplituda przemieszczenia stopnia jest duża (> 3 mm). Jednakże, chociaż rzeczywiste przemieszczenie jest mniejsze niż zalecane przemieszczenie przy dużych amplitudach, pozostaje powtarzalne (rysunek 2B). W związku z tym duże, rzeczywiste amplitudy przemieszczeń można niezawodnie uzyskać, wprowadzając określoną wartość przekraczającą wartość pożądaną. Amplituda przemieszczenia ma znaczenie tylko dlatego, że jest to łatwy do zarejestrowania wskaźnik zastępczy dla szczytowego odkształcenia błony, który bezpośrednio mierzy mechaniczne uszkodzenie, które wywołuje patologię. W związku z tym opisana procedura określania odkształcenia membrany na podstawie przemieszczenia stopnia ma kluczowe znaczenie. Proces ten należy powtórzyć, jeśli w systemie zostaną wprowadzone jakiekolwiek poważne zmiany, które wpływają na interakcję między płytką a wgłębnikami, na przykład, jeśli stosowane są wgłębniki o różnych średnicach, różne materiały lub powłoki wgłębnika lub różne rodzaje płytek z silikonowym dnem. Proces ustawiania bloku wgłębnika i wyznaczania pozycji zerowej należy powtórzyć na początku każdego eksperymentu. Schemat urządzenia rozciągającego pokazano na rysunku 1. Modele CAD wymagane do odtworzenia urządzenia są dostarczane jako materiały dodatkowe: "Urządzenie do urazów - PEŁNY MONTAŻ - Ogólne 3D. KROK"; powiązany zestawienie materiałów dostarczone jako "Tabela uzupełniająca 1: Urządzenia zbudowane na zamówienie - BOM.xlsx. Patrz również Tabela uzupełniająca 2 96 Płytka studzienkowa _loader - Okablowanie z wyprowadzeniami Diagram.xlsx, która opisuje połączenia okablowania łączące różne elementy systemów. "Interconnector_circuit_board.dip" opisuje płytkę drukowaną, która łączy kable.
Jeśli urządzenie zostanie dezaktywowane ze stopniem znajdującym się w pobliżu środka jego ruchu, stage przesunie się po odcięciu zasilania, ponieważ jest obciążony sprężyną. Po przywróceniu zasilania pętla sprzężenia zwrotnego wykryje dużą różnicę między ostatnią znaną zalecaną pozycją a rzeczywistą pozycją. Spowoduje to, że stage nagle przesunie się do pozycji, w której znajdował się, gdy urządzenie zostało dezaktywowane. Ten nagły ruch może powodować błędy w wyjściu enkodera, dlatego należy zachować ostrożność, aby dezaktywować urządzenie tylko wtedy, gdy znajduje się ono w pozycji spoczynkowej bez zasilania na szczycie swojego skoku.
Zacisk produkcyjny został zaprojektowany tak, aby połączyć korpus płytki i silikonowe dno w sposób umożliwiający optymalne połączenie. W tym celu w projekcie przedstawiono trzy kluczowe cechy przedstawione w pliku uzupełniającym "Press Die - Generic 3D. KROK". Po pierwsze, uchwyt korpusu płyty zaciskowej jest równoległy do silikonowego dna. Jeśli jest on prawidłowo zbudowany, nie będzie wymagał żadnej regulacji po początkowej konfiguracji. Po drugie, warstwa gumy piankowej w zacisku zapewnia niewielką podatność pod płytą, ponieważ całkowicie sztywny system teoretycznie doświadczyłby nagłego wzrostu od zerowej siły zacisku do nieskończonej siły zacisku, gdy zacisk był zamknięty. Położenie poprzeczki i dociskowej zacisku można regulować, dzięki czemu można precyzyjnie dostroić odległość między dwiema stronami zacisku.
Należy dołożyć wszelkich starań, aby zapewnić jasne, białe tło za kropką na dnie studni podczas eksperymentów z charakteryzacją szczepów. Im lepszy kontrast na tych obrazach, tym łatwiej będzie zautomatyzować proces pomiaru wysokości i szerokości kropki, który może stać się żmudny dla operatora analizującego duży eksperyment. Szybkie filmowanie dna studni w 96-dołkowej płycie stanowi wyzwanie, ponieważ ściany studni mają tendencję do rzucania cieni. Zastosowanie światła kopułkowego lub rozproszonego światła osiowego, które może oświetlać wzdłuż linii wzroku kamery bez zasłaniania obrazu, eliminuje cienie lub odbicia lustrzane, które powstałyby przy konwencjonalnym źródle światła. Należy używać najjaśniejszego dostępnego źródła światła, ponieważ jasne oświetlenie pozwala na uzyskanie obrazów przy krótkim czasie naświetlania. Krótkie czasy naświetlania minimalizują rozmycie ruchu. Ulepszenie diod elektroluminescencyjnych (LED) w rozproszonym świetle osiowym pozwala na skrócenie czasu naświetlania podczas szybkiej akwizycji wideo. Diody LED można zmodernizować, otwierając rozproszone światło osiowe, wyjmując standardowe diody LED, montując 4 matryce LED dużej mocy na tylnej szybie za pomocą uchwytów diod LED, podłączając je do zasilacza prądu stałego i ponownie montując rozproszone światło osiowe (numery katalogowe znajdują się w Tabeli materiałów ). Wadą modernizacji diod LED jest to, że pasywnie chłodzone diody LED nie mogą być włączone dłużej niż kilka sekund ze względu na ryzyko przegrzania. Dlatego do wyrównania bloku pocztowego i regulacji kamery potrzebne jest inne światło.
Przedstawiona metoda ilościowego określania odkształcenia membrany poprzez pomiar dylatacji kropki wybitej na membranie jest stosunkowo prymitywna, ale można ją skalować do wielu dołków w solidny sposób. Pole odkształceń na dnie odwiertu można scharakteryzować bardziej szczegółowo za pomocą cyfrowej korelacji obrazu. Technika ta polega na natryskiwaniu nakrapianego wzoru na podstawę studni, a następnie obrazowaniu go z dużą prędkością podczas deformacji. Komercyjne oprogramowanie może być następnie wykorzystane do ilościowego określenia odkształcenia w każdym punkcie obrazu poprzez śledzenie ewolucji nakrapianego wzoru.
Protokół ten tworzy wieloaspektowy, klinicznie istotny fenotyp urazu rozciągającego w hiPSCN. Śmierć komórki, zwyrodnienie neurytów i perełkowanie neurytów są dobrze udokumentowanymi następstwami TBI u ludzi i modeli zwierzęcych15. Kluczem do sukcesu w tym modelu jest ustanowienie i utrzymanie zdrowych kultur. Ogólnie rzecz biorąc, protokół hodowli komórkowej opracowany przy użyciu konwencjonalnych sztywnych płytek jest wartościowym punktem wyjścia dla rozciągliwej hodowli płytkowej. Należy jednak zawsze brać pod uwagę możliwość, że dane ogniwa mogą inaczej reagować na silikon. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku hiPSCN, które są bardzo wrażliwe na warunki hodowli. Niektóre przykłady optymalizacji gęstości komórek i stężenia lamininy znajdują się w sekcji Reprezentatywne wyniki (Rysunek 3, Rysunek 4). Aktywacja silikonu za pomocą obróbki plazmowej jest niezbędna. Silikon jest hydrofobowy i niereaktywny; W stanie naturalnym nie wiąże się z lamininą ani innymi cząsteczkami używanymi do promowania przyczepiania komórek. Obróbka plazmowa sprawia, że powierzchnia staje się hydrofilowa i odsłania grupy reaktywne. Zmiany te umożliwiają cząsteczkom adhezyjnym wiązanie się z silikonem i promowanie przyczepiania komórek. Należy zauważyć, że efekt obróbki plazmowej rozprasza się w ciągu kilku minut, chyba że powierzchnia jest zanurzona w cieczy, dlatego zabiegi polegające na osuszaniu aktywowanej powierzchni powinny być wykonywane tak szybko, jak to możliwe. Prostym sposobem sprawdzenia, czy efekt obróbki plazmowej już minął, jest umieszczenie kropli wody na powierzchni. Na nieleczonym silikonie kropla będzie się skraplać, podczas gdy na silikonie poddanym obróbce plazmowej rozprzestrzeni się. W przypadku zastosowanych przez nas hiPSCN (patrz Tabela materiałów), producent zaleca dodawanie lamininy do zawiesiny komórek, a nie wstępne powlekanie. Ten protokół z powodzeniem włączył to podejście. Chociaż segmentację można teoretycznie przeprowadzić za pomocą oprogramowania open source lub języków programowania ogólnego przeznaczenia, do uzyskania dobrych wyników wymagany jest wysoki stopień biegłości w posługiwaniu się tymi narzędziami. Neuryty są często trudne do odróżnienia od sygnału tła, ponieważ są tak smukłe. Dlatego zalecamy korzystanie z komercyjnych narzędzi programowych dystrybuowanych przez firmy zajmujące się mikroskopią o wysokiej zawartości z dedykowanymi modułami do segmentacji i kwantyfikacji neuronów, jeśli są one dostępne. Nawet w przypadku oprogramowania komercyjnego rozsądnie jest eksportować obrazy segmentacji, aby wizualnie zweryfikować dokładność.
Istnieją pewne ograniczenia związane z pracą w płytach rozciągliwych w porównaniu z pracą z konwencjonalnymi, sztywnymi płytami. Rozciągliwe płyty można obrazować w normalny sposób za pomocą obiektywów pneumatycznych. Jednak obrazowanie z obiektywami immersyjnymi jest bardzo trudne. Olej do soczewek może uszkodzić silikon. Dodatkowo obiektyw wywiera nacisk na membranę silikonową, gdy porusza się ona w górę. Ciśnienie to przesuwa membranę w pionie, co utrudnia ustawienie ostrości próbki. Membrany silikonowe stosowane obecnie do produkcji płyt mają grubość około 250 μm. Grubość ta przekracza odległość ogniskową wielu obiektywów zanurzeniowych o dużej mocy. Należy zwrócić szczególną uwagę, aby przed zaciśnięciem membrany były idealnie płaskie, aby uzyskać płaskość wymaganą do mikroskopii. Systemy autofokusa mogą w pewnym stopniu kompensować odchylenia w płaskości gotowej płyty. Przyszłe wersje protokołu mogą wstępnie naprężać membranę przed jej połączeniem z górną częścią płyty, aby zapewnić płaskość. Bezklejowa procedura klejenia membrany silikonowej z blatem płyty14 jest uważana za ważną zaletę obecnego protokołu. Eliminuje to ryzyko neurotoksyczności kleju, a także wszelkie odchylenia płaskości spowodowane niejednolitą grubością warstwy kleju.
Matryce wieloelektrodowe są powszechnie stosowane w eksperymentach z hiPSCN w celu oceny ich dojrzałości i funkcjonalności. Niestety, systemy te są niekompatybilne z tym modelem, ponieważ podłoże hodowli komórkowej jest sztywne. Możliwe jest stworzenie rozciągliwego układu wieloelektrodowego, chociaż do tej pory wykazano to tylko w formaciepojedynczej studzienki 16,17. Należy pamiętać, że wgłębniki można usuwać pojedynczo z bloku wgłębnika, tak aby niektóre studzienki nie były wgłębione i mogły służyć jako pozory. Usunięcie wgłębnika zapobiega wgnieceniom, ale nie eliminuje całkowicie obciążenia mechanicznego, ponieważ podczas ruchu stolika w studzienkach nadal występuje ruch bezwładnościowy. Warto porównać te studnie do studni w płytach, które nigdy nie były poddawane ruchowi scenicznemu, aby zmierzyć jakikolwiek patologiczny wpływ ruchu płynów. Ponadto układ wgłębników w bloku powinien być dwusymetryczny (symetryczny od przodu do tyłu i z boku na bok). Ten środek ostrożności zapewnia, że płyta jest równomiernie obciążona podczas wgłębienia, dzięki czemu stolik nie przechyla się na boki i nie powoduje zakleszczenia prętów w łożyskach.
Jednym z głównych wyzwań związanych z innowacjami terapeutycznymi w neurotraumie jest złożoność i niejednorodność tego schorzenia. Trauma stosuje stres multimodalny do każdego typu komórek w ośrodkowym układzie nerwowym jednocześnie. Neurony zostały niezawodnie wygenerowane z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) i są obecnie szeroko dostępne u dostawców komercyjnych. Innowacje w tej dziedzinie postępują szybko, a inne typy komórek nerwowych, takie jak astrocyty18 i mikroglej19 , również pochodzą z hiPSC. Wkrótce być może uda się wyizolować autonomiczne reakcje komórkowe każdego z tych typów komórek na traumę in vitro , a następnie wspólnie hodować różne typy komórek, aby zrozumieć, w jaki sposób komunikują się po traumie. W ten sposób może się ostatecznie zdarzyć, że uda się odtworzyć wyzwanie kliniczne od podstaw, aby dokładnie je zrozumieć w ludzkim systemie. Podejście to różni się od podejścia konwencjonalnego opartego na modelach gryzoni i ma potencjał do generowania nowych informacji, które doprowadzą do pierwszych terapii tego powszechnego, wyniszczającego i trudnego do opanowania schorzenia.

TBI jest główną przyczyną śmiertelności i zachorowalności w Stanach Zjednoczonych, powodując około 52 000 zgonów i 275 000 hospitalizacji rocznie1. Przeprowadzono ponad 30 badań klinicznych nad potencjalnymi terapiami TBI, ale nie przeprowadzono ani jednego sukcesu2. Ta jednolita awaria sugeruje, że procesy specyficzne dla człowieka oddzielają ludzkie TBI od patofizjologii obserwowanej w powszechnie stosowanych przedklinicznych modelach gryzoni.
Pojawienie się hiPSCN stworzyło możliwość badania neurotraumy w ludzkim modelu in vitro. Badania przesiewowe leków z wykorzystaniem modeli opartych na hiPSCN mogą dostarczyć wyników, które są bardziej predykcyjne dla sukcesu klinicznego niż modele wykorzystujące komórki gryzoni. Ponadto hiPSCN mogą być genetycznie modyfikowane w celu wyizolowania i zbadania wpływu poszczególnych wariantów genetycznych człowieka na patologię3.
Metoda opisana w tym manuskrypcie ma na celu wykorzystanie unikalnych zalet modelowania chorób opartych na hiPSCN do neurotraumy. Modele urazów neurourazowych metodą rozciągania in vitro są dobrze znane4,5,6 z pierwotnymi komórkami gryzoni i ludzkimi liniami komórkowymi raka nerwowego. Większość z tych modeli generuje rozciągliwość poprzez pneumatyczne obciążenie membrany silikonowej. To podejście jest skuteczne w formacie pojedynczego dołka, ale okazało się trudne do skalowania do formatu wielodołkowego7. W rezultacie, nigdy nie było wysokoprzepustowego badania przesiewowego dla środków do leczenia uszkodzonych neuronów rozciągających.
W tym modelu membrana rozciąga się z powodu wgłębienia od spodu za pomocą sztywnego wgłębnika. Wielokrotnie wykazano, że podejście to generuje klinicznie istotną patologię in vitro w systemach jednostudziennych8,9,10. Nasze ostatnie prace wykazały, że łatwo skaluje się do formatu 96 dołków, zachowując czas trwania impulsu rzędu dziesiątek milisekund11, który jest dziedziną czasu zdarzeń zamkniętego uderzenia głową12,13.
Podsumowując, kluczowymi zaletami tego modelu leczenia in vitro są format 96 dołków, użycie hiPSCN oraz klinicznie istotna dziedzina czasowa zniewagi.

<table><tbody><tr><td>.010" Arkusz silikonowy</td><td>Specialty Manufacturing, Inc#70P001200010</td><td></td> <td>Arkusz polidimetylosiloksanu (PDMS)</td></tr><tr><td>Sparkleen</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>#043204</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 256665</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>#12-565-600</td><td>Bezdenna 96-dołkowa płytka</td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>ULINE</td><td>S-8115</td><td></td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia plazmy</td><td>Harrick Plasma</td><td>#PDC-001-HC</td><td></td></tr><tr><td>(3-aminopropylo)trietoksysilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#440140</td><td></td></tr><tr><td>APTES Papier pergaminowy</td><td>Reynolds</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dome Light</td><td>CCS inc</td><td>LFX2-100SW</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz światła kopułkowego</td><td>CCS inc</td><td>PSB-1024VB</td><td></td></tr><tr><td>Osiowa jednostka oświetlenia dyfuzyjnego&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Siemens</td><td>Nerlite DOAL-75-LED</td><td>Rozproszone światło osiowe Matryca</td></tr><tr><td>LED dużej mocy&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>CREE</td><td>XLamp CXA2540</td><td>Matryca LED dużej mocy&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Oprawka LED</td><td>Molex</td><td>1807200001</td><td>Oprawka LED&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Zasilacz LED</td><td>Mean Well</td><td>HLG-320H-36B</td><td>Zasilacz prądu stałego&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie FastCam Viewer&nbsp;</td><td>Softeware do aparatu</td> <td>Photron</td><td></td></tr><tr><td>Fastcam Mini UX50</td><td>Szybki aparat fotograficzny Photron</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Micro-NIKKOR 105mm f/2.8</td><td>Nikon</td><td>#1455</td><td>Obiektyw do aparatu szybkotnącego</td></tr><tr><td>0,1 mg/mL Poli-L-Ornityna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P4597</td><td></td></tr><tr><td>iCells</td><td>Cellular Dynamics International</td><td>#NRC-100-010-001</td><td></td></tr><tr><td>Nośniki</td> <td>iCellMiędzynarodowa Dynamika Komórkowa</td><td>#NRM-100-121-001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Suplement iCell</td><td>Cellular Dynamics International</td><td>#NRM-100-031-001</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#L2020</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>#H3570</tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>#C3099</tr><tr><td>siłownik cewki drgającej&nbsp;</td><td>BEI Kimco</td><td>LA43-67-000A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Optyczny enkoder liniowy&nbsp;</td><td>Renishaw</td><td>T1031-30A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>serwonapęd</td><td>Copley Controls</td><td>Xenus XTL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler</td><td>National Instruments</td><td>cRIO 9024 Kontroler PowerPC w czasie rzeczywistym&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Obudowa cRIO</td><td>National Instruments</td><td>cRIO 9113</td><td></td></tr><tr><td>cyfrowy moduł wejściowy</td><td>National Instruments</td><td>NI 9411</td><td></td></tr><tr><td>obudowa do gromadzenia danych</td><td>National Instruments</td><td>NI 9113</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>Oprogramowanie do sterowania instrumentami</td><td>National Instruments</td><td></td></tr><tr><td>hiPSCNs</td><td>Cellular Dynamics International</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metoda szybkiego rozciągania indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych w formacie 96-dołkowym

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) jest poważnym wyzwaniem klinicznym o wysokiej zachorowalności i śmiertelności. Pomimo dziesięcioleci badań przedklinicznych nie opracowano żadnych sprawdzonych metod leczenia TBI. W artykule przedstawiono nowatorską metodę przedklinicznych badań neurotraumatycznych, która ma na celu uzupełnienie istniejących modeli przedklinicznych. Wprowadza ludzką patofizjologię poprzez wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSCN). Osiąga czas trwania impulsu obciążającego podobny do czasu trwania obciążenia w klinicznym zamkniętym urazie głowy. Wykorzystuje format 96 dołków, który ułatwia eksperymenty o wysokiej przepustowości i efektywnie wykorzystuje drogie komórki i odczynniki do hodowli. Membrany silikonowe są najpierw poddawane obróbce w celu usunięcia neurotoksycznego, nieutwardzonego polimeru, a następnie łączone z komercyjnymi korpusami płytek 96-dołkowych w celu utworzenia rozciągliwych płytek 96-dołkowych. Specjalnie skonstruowane urządzenie służy do wciskania niektórych lub wszystkich dna studni od spodu, wywołując równoosiowe naprężenia mechaniczne, które mechanicznie uszkadzają komórki w hodowli w studzienkach. Zależność między głębokością wgłębienia a odkształceniem mechanicznym jest określana empirycznie za pomocą szybkiego filmowania dna studni podczas wgłębienia. Komórki, w tym hiPSCN, mogą być hodowane na tych błonach silikonowych przy użyciu zmodyfikowanych wersji konwencjonalnych protokołów hodowli komórkowych. Fluorescencyjne obrazy mikroskopowe kultur komórkowych są pozyskiwane i analizowane po urazie w sposób półautomatyczny w celu ilościowego określenia poziomu uszkodzenia w każdym dołku. Prezentowany model jest zoptymalizowany pod kątem hiPSCN, ale teoretycznie może być stosowany do innych typów komórek.

Urządzenie rozciągające umożliwia powtarzalne przemieszczanie stolika z czasem trwania impulsu tak krótkim jak 10-15 ms, w zależności od amplitudy impulsu (Rysunek 2A). Amplitudy impulsów są wysoce powtarzalne, jednak czas trwania impulsu różni się o około 1 ms między powtórzeniami. Rzeczywista amplituda impulsu odbiega od amplitudy zadanej, gdy załadowana jest duża liczba studzienek, a zadana amplituda jest wysoka (patrz Rysunek 2B). Wraz ze zwiększaniem amplitudy przemieszczenia stolika powyżej 3 mm, rzeczywista amplituda przemieszczenia w coraz większym stopniu odbiega od amplitudy zadanej (patrz Rysunek 2B). Staranne wyrównanie bloku wsporników eliminuje jakąkolwiek tendencję zmian odkształcenia błony w rzędach lub kolumnach (Rysunek 2C). Przy zadanej amplitudzie przemieszczenia stolika 3,5 mm (rzeczywista amplituda przemieszczenia 3,3 mm) przy zagłębieniu 52 studzienek, średnie odkształcenie Lagrange'a we wszystkich lokalizacjach studzienek wynosiło 0,451 (odchylenie standardowe średnich dla wszystkich lokalizacji = 0,051, średnia odchyleń standardowych dla wszystkich lokalizacji = 0,065, n = 5 pomiarów na studzienkę). Wyniki te przedstawiono tutaj dla kompletności, mimo że niektóre z nich zostały już opisane11.
Optymalna, nieuszkodzona hodowla będzie zawierać niewiele lub żadnych skupisk liczących więcej niż 5 komórek. Neuryty będą pojedyncze, długie, cienkie i zakrzywione, bez widocznych oznak napięcia lub tworzenia się grudek (Rysunek 3A). W idealnych warunkach żywotność hodowli powinna być zbliżona do wartości określonej w arkuszu danych producenta (zazwyczaj 60-70%), a hodowle na silikonie powinny przypominać te utrzymywane na konwencjonalnych sztywnych podłożach hodowlanych (Rysunek 3B). Neuryty mogą być widoczne lub niepodatne na obserwację w mikroskopie świetlnym przy małym powiększeniu. Zarówno stężenie lamininy, jak i gęstość komórek wpływają na hodowle w stanie wyjściowym oraz po uszkodzeniu. Zwiększenie gęstości komórek zwiększyło liczbę i rozmiar skupisk tworzących się w hodowli. Zwiększenie stężenia lamininy często przeciwdziałało temu efektowi (Rysunek 3A). Jednakże zbyt duże zwiększenie stężenia lamininy osłabiło wrażliwość hodowli na uszkodzenia (Rysunek 4). Optymalne stężenie lamininy dla hodowli nieuszkodzonych wynosiło 50 µg/mL lamininy (Rysunek 3), ale optymalna różnica między populacją kontrolną (sham) a populacją z uszkodzeniem rozciąganiem została uzyskana przy stężeniu 10 µg/mL lamininy (Rysunek 4). Wyższe stężenia lamininy zmniejszały wrażliwość hodowli na uszkodzenia w krótkich odstępach czasu (Rysunek 4), ale poprawiały również bazową żywotność komórek w dłuższych odstępach czasu (np. 7 dni). Podsumowując, warto zoptymalizować stężenie lamininy dla każdego scenariusza eksperymentalnego.
Odkształcenie błony, czas obrazowania po urazie, stężenie lamininy oraz gęstość komórek wywarły wysoce istotny statystycznie główny efekt na długość neurytów na komórkę (ANOVA, p &#60;0,001). Efekt odkształcenia błony na długość neurytów na komórkę wykazał wysoce istotne statystycznie interakcje z czasem obrazowania po urazie oraz stężeniem lamininy (ANOVA, p &#60;0,001) oraz istotną statystycznie interakcję z gęstością komórek (ANOVA, p &#60;0,05). Podobnie odkształcenie błony, czas obrazowania po urazie, gęstość komórek oraz stężenie lamininy wywarły wysoce istotny statystycznie główny efekt na żywotność komórek (ANOVA, p &#60;0,001). Efekt odkształcenia błony na żywotność komórek wykazał wysoce istotną statystycznie interakcję z czasem obrazowania po urazie (ANOVA, p &#60;0,001) oraz istotną statystycznie interakcję z gęstością komórek (ANOVA, p &#60;0,05). Wyniki te dowodzą, że czas, gęstość komórek i stężenie lamininy wywierają istotny wpływ na zależność między zastosowanym bodźcem urazowym a wynikami eksperymentu, w związku z czym każdy z tych parametrów powinien zostać starannie zoptymalizowany.
Niska żywotność komórek i obecność perłowatych neurytów, wraz z zahamowanym wzrostem neurytów, wskazują na toksyczne warunki hodowli, które mogą wynikać z niewłaściwego przygotowania silikonu. Pominięcie lub skrócenie czasu moczenia w wodzie bądź suszenia w piecu może spowodować pozostanie w membranie odpowiednio wchłoniętego etanolu lub wody, które mogą dyfundować do pożywki i wywoływać stres komórkowy. W kulturach z silnym uszkodzeniem zaobserwuje się obniżoną żywotność komórek, skrócenie lub brak neurytów, neuryty perłowate oraz neuryty wyglądające na napięte lub rozciągnięte. Uszkodzenie może indukować agregację w kulturach komórkowych, które przed uszkodzeniem były dobrze rozproszone. Duże skupiska komórek mogą utrudniać analizę morfologiczną. W przypadku analizy morfologicznej poziom uszkodzenia powinien być tak dobrany, aby wystąpiły zauważalne zmiany, ale komórki nadal były obecne wraz z częścią neurytów.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Opisany schemat urządzenia do wywoływania urazów. (A) widok z góry, (B) widok izometryczny, (C) widok z przodu, (D) widok z prawej strony. Pasek skali odnosi się do widoków ortograficznych (A, B i D). <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig2.jpg" /> 
Rycina 2: Kinematyka bodźca mechanicznego. (A) Historia przemieszczeń platformy podczas 5 impulsów dla zakresu określonych amplitud (amplitudy określone są w legendzie) w przypadku niezaładowanych studni. (B) Historia przemieszczeń platformy podczas 10 impulsów dla zakresu określonych amplitud (amplitudy określone są w legendzie) przy załadowaniu 52 studni. (C) Średnie odkształcenie w każdej studni przy amplitudzie przemieszczenia platformy 3,3 mm (n = 5 pomiarów na studnię, średni błąd standardowy na studnię = 0,029). Należy zauważyć, że C4-F4 i C9-F9 to kontrolne studnie nierozciągane. Rycina zmodyfikowana na podstawie pracy Sherman et al.11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig3.jpg" /> 
Rycina 3: Optymalizacja warunków hodowli na silikonie. (A) Wpływ zmiennej gęstości komórek i stężenia lamininy na hodowle hiPSCN na silikonie. Agregacja komórek zwiększa się wraz ze wzrostem gęstości komórek i spadkiem stężenia lamininy. Gęstość komórek i stężenie lamininy muszą zostać zoptymalizowane, aby uzyskać kultury monodyspersyjne. Kultury monodyspersyjne są mniej podatne na artefakty podczas kwantyfikacji. Należy zauważyć, że zakres dynamiczny został dostosowany w celu optymalizacji wizualizacji neurytów. W konsekwencji znacznie jaśniejsze somaty są nasycone. Takiej prezentacji preferuje się nad alternatywę w postaci optymalizacji zakresu dynamicznego względem somatów, co czyni znacznie ciemniejsze neuryty niemal niewidocznymi. Warunki zaznaczone czerwonym kwadratem uznano za optymalne dla eksperymentów dotyczących urazów rozciągających in vitro. (B) W warunkach optymalnych hodowle na membranach silikonowych wyglądają podobnie do hodowli na konwencjonalnych sztywnych podłożach. Panel po lewej przedstawia hiPSCN hodowane w gęstości 33 750 cells/cm2 z zastosowaniem 3,3 µg/mL lamininy na konwencjonalnej, sztywnej płytce 96-dołkowej (podłożem hodowli komórkowych jest kopolimer cykliczny olefiny poddany obróbce do hodowli tkanek). Panel po prawej powiela panel obramowany na czerwono z części (A). Paski skali = 100 µm. <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig4.jpg" /> 
Rysunek 4: Fenotyp uszkodzenia i jego zależność od stężenia lamininy. (A) Zdrowa hodowla z zastosowaniem 10 µg/mL lamininy i gęstości 67 500 komórek/cm2. Neuryty są długie i nie wykazują obecności pęcherzyków. Stwierdzono niewielką liczbę martwych jąder oraz nieliczne skupiska. (B) Hodowla w tych samych warunkach, poddana uszkodzeniu przy maksymalnym odkształceniu 57% i obrazowana po 4 h. Neuryty są skrócone lub nieobecne, a niektóre wykazują pęcherzyki (wskazane strzałkami). Stwierdzono mniejszą liczbę komórek Calcein AM-dodatnich oraz więcej jąder Calcein AM-ujemnych (i.e., martwych). Uszkodzenie spowodowało zwiększenie skupiania się komórek przeżywających. (C) 4 h po uszkodzeniu długość neurytów na komórkę spada wraz ze wzrostem odkształcenia w sposób zależny od stężenia lamininy. (D) 4 h po uszkodzeniu żywotność komórek spada wraz ze wzrostem odkształcenia w sposób zależny od stężenia lamininy. (E) 24 h po uszkodzeniu długość neurytów na komórkę spada wraz ze wzrostem odkształcenia w sposób zależny od stężenia lamininy. (F) 24 h po uszkodzeniu żywotność komórek spada wraz ze wzrostem odkształcenia w sposób zależny od stężenia lamininy. (n = 4 na słupek, słupki błędów oznaczają ± 1 odchylenie standardowe, paski skali = 100 µm). Wartości odkształcenia wyznaczono na podstawie przemieszczenia platformy, korzystając z danych z wcześniejszej publikacji autorstwa Sherman et al.11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Rysunek techniczny indentora. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Figure_1.pdf" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę figurę.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Urządzenia budowane na zamówienie. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_1-Custom_Devices-Bill_of_Materials.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela uzupełniająca 2: Schemat połączeń pinów ładowarki płytek 96-dołkowych. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_2-96_Well_Plate_Loader.xlsx" target="_blank">Aby pobrać tę tabelę, kliknij tutaj.</a>
Plik uzupełniający z kodem 1: Rysunki wspomaganego komputerowo projektowania urządzenia do zadawania urazu. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_1-Injury_Device-FULL_ASSEMBLY-Generic_3D.STEP" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Uzupełniający plik z kodem 2: Rysunki wspomaganego komputerowo projektowania zacisku do wykonania płytki. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_2-Press_Die-Generic_3D.STEP" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Uzupełniający plik kodu 3: Reprezentacja 3D geometrii stempla, odpowiednia do wykorzystania w drukarce 3D. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_3-stamp.STL" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Dodatkowy plik kodu 4: SubVI dla MuStLiMo_si_initialize.vi, który jest SubVI dla motion_control.vi. Konwertuje wpisy w polach dialogowych na parametry ruchu. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_4-compute_init_param.vi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający z kodem 5: SubVI for Multiple Straight Line Moves_simplified.vi, który jest SubVI dla motion_control.vi. Przetwarza wpisy w oknach dialogowych na parametry ruchu. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_5-compute_parameters.vi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Uzupełniający plik kodu 6: SubVI dla position_tracker.vi. Licznik śledzi wejście przemieszczenia z enkodera liniowego. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_6-Counter-Continuous_Output.vi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający z kodem 7: Podstawowy projekt LabVIEW. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_7-in_vitro_neurotrauma.lvproj" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Uzupełniający plik kodu 8: Główny program VI sterujący ruchem urządzenia. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_8-motion_control.vi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Uzupełniający plik kodu 9: SubVI dla motion_control.vi. Wykonuje szybkie przemieszczenie, które rozciąga płytkę. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_9-Multiple_Straight_Line_Moves_simplified.vi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Uzupełniający plik kodu 10: SubVI dla motion_control.vi. Wykonuje powolne przemieszczenie, które porusza stolikiem. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_10-MuStLiMo_si_initialize.vi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Uzupełniający plik kodu 11: SubVI dla motion_control.vi. Wykreśla (zazwyczaj niedopróbkowaną) historię przesunięć w panelu sterowania motion_control.vi. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_11-plot_displacement.vi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Uzupełniający plik kodu 12: Instrument VI najwyższego poziomu rejestrujący historię przemieszczeń.<a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_12-position_tracker.vi" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik z dodatkowym kodem 13: Zawiera Variable2, służący do komunikacji między motion_control.vi a position_tracker.vi. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_13-Untitled_Library_2.lvlib" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający z kodem 14: Schemat płytki drukowanej. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_14-interconnector_circuit_board.dch" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający z kodem 15: Układ płytki drukowanej. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_15-interconnector_circuit_board.dip" target="_blank">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>

Tutaj prezentujemy metodę dla ludzkiego modelu in vitro uszkodzenia rozciągającego w formacie 96-dołkowym w skali czasowej istotnej dla traumy uderzeniowej. Obejmuje to metody wytwarzania rozciągliwych płytek, ilościowego określania mechanicznej zniewagi, hodowli i uszkadzania komórek, obrazowania i analizy wysokiej zawartości w celu ilościowego określenia urazu.

Metoda szybkiego rozciągania indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych w formacie 96-dołkowym

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Ogólnym celem tego modelu jest stworzenie klinicznie istotnego fenotypu neurotraumatycznego w formacie 96 dołków, aby ułatwić efektywne i jednoczesne porównanie urazów odniesionych w wielu warunkach eksperymentalnych. Głównym celem tego modelu jest umożliwienie badań przesiewowych w poszukiwaniu leków fenotypowych o wysokiej zawartości w neurotraumach, z indukowanym przez człowieka pluripotencjalnym neuronem pochodzącym z komórek macierzystych. Płytki użyte w tym modelu zachowują standardową w branży 96-dołkową geometrię płytki, zachowując ich kompatybilność z istniejącymi maszynami do przesiewania o wysokiej zawartości, takimi jak ramiona robotyczne i mikroskopy automatyczne.Na początek umieść 96-dołkową płytkę bez dna dnem do góry w 200-watowym odkurzaczu plazmowym na 60 sekund przy dużej mocy. Następnie umieść płytkę w 200 mililitrach świeżo przygotowanego 1,5% APTES w wodzie dejonizowanej, dnem do dołu, na 20 minut w dygestorium. Po 10 minutach inkubacji za pomocą kleszczy umieść membranę silikonową poddaną plazmie na prostokącie z pergaminu o wymiarach 7.5 na 11 centymetrów i wyrównaj aluminiową płytę o wymiarach 7.5 na 11.05 cm w dolnej części zacisku do produkcji płyty.Następnie za pomocą kleszczy wyrównaj membranę silikonową i pergamin na płycie aluminiowej. Pod koniec okresu powlekania wyjmij płytkę bez dna z kąpieli APTES i strząśnij nadmiar roztworu. Zanurz płytkę bez dna w dwóch kolejnych 200-mililitrowych kąpielach dejonizowanych na pięć sekund każdego zanurzenia i strząśnij nadmiar wody.Po całkowitym wyschnięciu sprężonym powietrzem umieść płytkę bez dna w górnej części zacisku do produkcji płyty i delikatnie zamknij zacisk, aby docisnąć do siebie płytkę bez dna i silikon. Aby wyrównać blok wgłębnika, użyj stage clamps przymocuj płytkę do stolika urządzenia rozciągającego pod kamerą z transmisją na żywo i umieść lampę kopułkową nad urządzeniem. Uruchom oprogramowanie sterujące instrumentem na komputerze podłączonym do urządzenia do uszkodzenia i kliknij okno Uruchom, aby uruchomić projekt neurotraumatyczny in vitro.W oknie projektu kliknij dwukrotnie instrumenty wirtualne Motion Control i Position Tracker. Zamknij klatkę otaczającą urządzenie do zranienia i kliknij strzałkę w wirtualnym instrumencie sterowania ruchem, aby uruchomić instrument. Kliknij w pobliżu dołu, aby obniżyć stolik z dokładnością do dwóch milimetrów od styku z wgłębnikami, a następnie kliknij przycisk stop, aby zatrzymać instrument wirtualny.W oknie projektu kliknij prawym przyciskiem myszy Oś pierwsza, a następnie kliknij Interaktywny panel testowy. Wprowadź 500 jednostek w polu Pozycja docelowa w wyświetlonym oknie, aby ustawić rozmiar kroku na 50 mikrometrów. Następnie klikaj przycisk Go kilkakrotnie, aż płyta najpierw zetknie się z jakimikolwiek wgłębnikami, sprawdzając, czy na obrazie na żywo wyświetlanym przez kamerę nie ma kontaktu.Pozycja pionowej stołu montażowego zostanie podana w lewym górnym rogu okna interaktywnego panelu testowego. Opuść płytkę jeszcze bardziej, aż każda studzienka zetknie się z wgłębnikami, przesuwając kamerę i stolik w razie potrzeby, aby wyświetlić całą płytę. Zanotuj zgłoszone pionowe położenie stołu montażowego, gdy wszystkie słupki są w kontakcie, i zamknij interaktywny panel testowy.Następnie uruchom instrument wirtualny sterowania ruchem i kliknij przycisk Góra, aby podnieść scenę, używając przycisku zatrzymania, aby zatrzymać instrument wirtualny, gdy stolik znajdzie się na swoim miejscu. Otwórz drzwi, aby dezaktywować urządzenie, a następnie poluzuj seth na rogu, który zetknął się jako pierwszy, aby obniżyć róg, i dokręć przeciwległą, aby podnieść róg, który zetknął się jako ostatni. Powtarzaj opuszczanie, obserwację i regulację bloku, aż płytka zetknie się ze wszystkimi wgłębnikami jednocześnie.Staranne wyrównanie bloku wgłębnika jest ważne dla uzyskania równomiernego uszkodzenia we wszystkich dołkach płyty. Otwórz drzwiczki, aby ponownie wyłączyć urządzenie, i włóż mocujące w ich otwory w bloku wgłębnika. Następnie dokręć na miejscu i zanotuj pozycję stage zgłaszaną przez interaktywny panel testowy, gdy płyta się zetknie.Aby rozciągnąć płytę, zmień nazwę pliku w polu Ścieżka pliku w pozycji sprawdzania instrumentu wirtualnego na unikatową nazwę pliku, a następnie kliknij strzałkę Uruchom. Ustaw głębokość i czas trwania wcięcia oraz pola Uraz i Czas trwania urazu w instrumencie wirtualnym panelu sterowania ruchem. Gdy tabliczka znajduje się w pozycji zerowej, uruchom wirtualny instrument panelu sterowania ruchem i kliknij przycisk Zranij, aby wciąć płytę.Kliknij przycisk Góra, aby przesunąć scenę w górę, kliknij przycisk Zatrzymaj, gdy płyta znajduje się w górnym położeniu, i otwórz drzwiczki, aby dezaktywować urządzenie do urazu. Następnie sprawdź historię przemieszczeń etapu przedstawioną w wirtualnym instrumencie do śledzenia pozycji, aby potwierdzić, że zastosowano określone maksymalne przemieszczenie, i wyeksportuj dane do odpowiedniego programu arkusza kalkulacyjnego. Aby ocenić rozciągliwość membrany silikonowej, po obróbce plazmowej umieść płytkę na miękkiej powierzchni i zagruntuj mały występ na stemplu tuszem z markera permanentnego.Włóż stempel do pierwszego dołka, który ma być przetestowany, i stuknij, aby zapewnić dobry transfer atramentu. Po wytłoczeniu wszystkich studzienek umieść szybką kamerę na stojaku na wysięgniku nad urządzeniem do urazów z obiektywem ustawionym na najmniejszy ponumerowany przysłonę, tak aby pole widzenia zawierało 12 wgłębników w siatce trzy na cztery. Gdy miejsce znajduje się w pozycji punktu zerowego, kliknij przycisk nagrywania w oprogramowaniu aparatu, aby odczytał spust i włączył jasne, rozproszone światło osiowe.Następnie wciąć płytkę, jak pokazano, i wyłącz światło osiowe. Aby uszkodzić hodowlę komórkową, dodaj 100 mikrolitrów traktowanych lamininą, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych do każdego dołka płytki poddanej działaniu osocza i pozwól komórkom przyczepić się do dna płytki na 15 minut w temperaturze pokojowej przed umieszczeniem płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po dwóch do trzech dniach hodowli zaciśnij płytkę na etapie urządzenia do urazów i dostosuj położenie pokrywy, aby zabezpieczyć płytkę bez wystawiania kultur na działanie otaczającego powietrza.Następnie, gdy tabliczka znajduje się w pozycji punktu zerowego, wciąć płytkę, jak pokazano poniżej. Optymalna, nieuszkodzona kultura będzie miała niewiele, jeśli w ogóle, grudek więcej niż pięciu komórek, a neuryty będą indywidualne, długie, smukłe i zakrzywione, z niewielkimi lub żadnymi koralikami. W idealnych warunkach żywotność kultur powinna być zbliżona do żywotności określonej w karcie katalogowej producenta, a kultury na silikonie powinny przypominać te utrzymywane na konwencjonalnych sztywnych podłożach hodowlanych.Zwiększenie gęstości komórek zwiększa liczbę i wielkość grudek, które tworzą się w hodowli, podczas gdy zwiększenie stężenia lamininy zazwyczaj przeciwdziała temu efektowi. W kulturach uszkodzonych szczepem szczytowym 57%, cztery godziny po urazie, neuryty są skrócone lub ich brakuje, a niektóre mają koraliki z zlepianiem wykazywanym przez pozostałe żywotne komórki. Warto zauważyć, że leczenie wyższymi dawkami lamininy zmniejsza nasilenie uszkodzenia kultur komórkowych w sposób zależny od stężenia, o czym świadczy wzrost długości neurytów i żywotności komórek w kulturach traktowanych lamininą w wyższych dawkach.Próbując wykonać tę procedurę, należy wziąć pod uwagę czas realizacji. Na przykład detoksykacja membranowa trwa trzy dni, a wyprodukowane płytki powinny utwardzić się przez noc przed użyciem. Nie zapominaj, że urządzenie do urazów zawiera potężną cewkę drgającą, która napędza jego ruch, i zawsze należy trzymać się z dala od urządzenia, gdy jest aktywne, i wyłączać urządzenie tylko wtedy, gdy stage znajduje się na szczycie swojego ruchu.

method-for-high-speed-stretch-injury-human-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Protokoły różnicowania neuronalnego pluripotencjalnych ludzkich komórek macierzystych (hPSCs) są często czasochłonne i wymagają zaawansowanych umiejętności w hodowli komórkowej. W niniejszej pracy dostosowaliśmy procedurę różnicowania opartą na małych cząsteczkach do formatu płytek wielodobojowych, co umożliwia prostą, szybką i wydajną generację ludzkich neuronów w sposób kontrolowany.

Szybka i wydajna generacja neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płyt wielodołkowych

Film demonstruje metodę generowania pobudzających neuronów korowych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Po indukcji doksycykliny hiPSC wykazują nadekspresję neurogeniny-2, czynnika transkrypcyjnego specyficznego dla neuronów. Dzięki zastosowaniu specyficznych pożywek i wspólnej hodowli z astrocytami, proces ten ułatwia różnicowanie się hiPSC w neurony z połączeniami synaptycznymi.

Różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w neurony na układach mikroelektrod

Ten film demonstruje ustanowienie kokultury ludzkich neuronów indukowanych (iN) i indukowanych komórek prekursorowych oligodendrocytów (iOPC). iN są mieszane z iOPC w kokulturze, a następnie inkubowane, aby wspierać dojrzewanie zarówno iN do neuronów, jak i iOPC do oligodendrocytów. Neurony tworzą połączenia synaptyczne z innymi neuronami i oligodendrocytami, podczas gdy oligodendrocyty rozwijają osłonki mielinowe wokół aksonów neuronów.

Metoda wspólnej hodowli do modelowania interakcji neuron-oligodendrocyty

Ten film pokazuje proces różnicowania ludzkich iPSC w neurony ruchowe. Uzasadnienie obejmuje wykorzystanie iPSC, które zostały genetycznie zmodyfikowane w celu ekspresji określonych czynników transkrypcyjnych. Po wyhodowaniu w pożywce zawierającej doksycyklinę, antybiotyk ten wyzwala ekspresję czynników transkrypcyjnych, promując w ten sposób różnicowanie iPSC w komórki progenitorowe neuronów ruchowych. Ostatecznie przodkowie są hodowani w pożywce neuronalnej, aby uzyskać dojrzałe i...

Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych w funkcjonalne neurony ruchowe

Ten film pokazuje proces wywoływania uszkodzeń rozciągających na ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych (hiPSCN). Komórki są pobierane na bezdennej płytce wielodołkowej z dołączoną membraną silikonową. Kontrolowane naprężenia mechaniczne są wywierane na błonę w celu wywołania rozerwania cytoszkieletu i uszkodzenia błony komórkowej, indukując fenotyp uszkodzenia rozciągającego w komórkach.

Model in vitro uszkodzeń rozciągających w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych

Dendrytyczne kolce neuronów piramidowych są miejscami najbardziej pobudzających synaps w korze mózgowej ssaków. Metoda ta opisuje ilościową analizę 3D morfologii kręgosłupa w ludzkich korowych piramidowych neuronach glutaminergicznym pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) są uważane za potężne narzędzie do badań przesiewowych leków i substancji chemicznych oraz do rozwoju nowych modeli in vitro do testowania toksyczności, w tym neurotoksyczności. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół różnicowania hiPSC w neurony i komórki glejowe.

Protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mieszane kultury neuronów i gleju do badań neurotoksyczności

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę ponownego zawieszania i hodowli neuronów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych, które wcześniej były odróżniane od progenitorów nerwowych in vitro przez wiele tygodni. Procedura ułatwia oparte na obrazowaniu testy neurytów, synaps i markerów neuronalnych o późnej ekspresji w formacie zgodnym z mikroskopią świetlną i badaniami przesiewowymi o wysokiej zawartości.

Powtórzenie po różnicowaniu ludzkich neuronów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu przeprowadzenia badań przesiewowych neurytogenezy i dojrzewania synaps o wysokiej zawartości

Prezentujemy tutaj protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych na każdą pochodną somitu (miotom, sklerotom, dermatom i syndetom) w chemicznie zdefiniowanych warunkach, który ma zastosowanie w przyszłym modelowaniu chorób i terapiach komórkowych w chirurgii ortopedycznej.

Wytwarzanie in vitro pochodnych somitów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten artykuł opisuje procedurę wytwarzania iTenocytów poprzez generowanie mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z iPSC z połączoną nadekspresją twardówki przy użyciu wektora lentiwirusowego i jednoosiowego rozciągania za pomocą bioreaktora 2D.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych iTenocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez połączoną nadekspresję twardówki i jednoosiowe napięcie 2D

Ten protokół ma na celu stabilne umieszczanie grzbietowo-brzusznych zrośniętych asembloidów na wieloelektrodowych układach do modelowania padaczki in vitro.

Wieloelektrodowa platforma matrycowa do modelowania padaczki przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych zespołów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Poznaj metodę szybkiego rozciągania neuronów pochodzących z ludzkich komórek iPSC w formacie 96-dołkowym. Technika umożliwia badanie neurotraumy i odkrywanie leków w modelu in vitro.

Metoda szybkiego rozciągania indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych w formacie 96-dołkowym (Wideo) | JoVE Journal

Metoda szybkiego rozciągania indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych w formacie 96-dołkowym

Przeglądaj więcej filmów