Metoda szybkiego rozciągania indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych w formacie 96-dołkowym

Ogólnym celem tego modelu jest stworzenie klinicznie istotnego fenotypu neurotraumatycznego w formacie 96 dołków, aby ułatwić efektywne i jednoczesne porównanie urazów odniesionych w wielu warunkach eksperymentalnych. Głównym celem tego modelu jest umożliwienie badań przesiewowych w poszukiwaniu leków fenotypowych o wysokiej zawartości w neurotraumach, z indukowanym przez człowieka pluripotencjalnym neuronem pochodzącym z komórek macierzystych. Płytki użyte w tym modelu zachowują standardową w branży 96-dołkową geometrię płytki, zachowując ich kompatybilność z istniejącymi maszynami do przesiewania o wysokiej zawartości, takimi jak ramiona robotyczne i mikroskopy automatyczne.

Na początek umieść 96-dołkową płytkę bez dna dnem do góry w 200-watowym odkurzaczu plazmowym na 60 sekund przy dużej mocy. Następnie umieść płytkę w 200 mililitrach świeżo przygotowanego 1,5% APTES w wodzie dejonizowanej, dnem do dołu, na 20 minut w dygestorium. Po 10 minutach inkubacji za pomocą kleszczy umieść membranę silikonową poddaną plazmie na prostokącie z pergaminu o wymiarach 7.5 na 11 centymetrów i wyrównaj aluminiową płytę o wymiarach 7.5 na 11.05 cm w dolnej części zacisku do produkcji płyty.

Następnie za pomocą kleszczy wyrównaj membranę silikonową i pergamin na płycie aluminiowej. Pod koniec okresu powlekania wyjmij płytkę bez dna z kąpieli APTES i strząśnij nadmiar roztworu. Zanurz płytkę bez dna w dwóch kolejnych 200-mililitrowych kąpielach dejonizowanych na pięć sekund każdego zanurzenia i strząśnij nadmiar wody.

Po całkowitym wyschnięciu sprężonym powietrzem umieść płytkę bez dna w górnej części zacisku do produkcji płyty i delikatnie zamknij zacisk, aby docisnąć do siebie płytkę bez dna i silikon. Aby wyrównać blok wgłębnika, użyj stage clamps przymocuj płytkę do stolika urządzenia rozciągającego pod kamerą z transmisją na żywo i umieść lampę kopułkową nad urządzeniem. Uruchom oprogramowanie sterujące instrumentem na komputerze podłączonym do urządzenia do uszkodzenia i kliknij okno Uruchom, aby uruchomić projekt neurotraumatyczny in vitro.

W oknie projektu kliknij dwukrotnie instrumenty wirtualne Motion Control i Position Tracker. Zamknij klatkę otaczającą urządzenie do zranienia i kliknij strzałkę w wirtualnym instrumencie sterowania ruchem, aby uruchomić instrument. Kliknij w pobliżu dołu, aby obniżyć stolik z dokładnością do dwóch milimetrów od styku z wgłębnikami, a następnie kliknij przycisk stop, aby zatrzymać instrument wirtualny.

W oknie projektu kliknij prawym przyciskiem myszy Oś pierwsza, a następnie kliknij Interaktywny panel testowy. Wprowadź 500 jednostek w polu Pozycja docelowa w wyświetlonym oknie, aby ustawić rozmiar kroku na 50 mikrometrów. Następnie klikaj przycisk Go kilkakrotnie, aż płyta najpierw zetknie się z jakimikolwiek wgłębnikami, sprawdzając, czy na obrazie na żywo wyświetlanym przez kamerę nie ma kontaktu.

Pozycja pionowej stołu montażowego zostanie podana w lewym górnym rogu okna interaktywnego panelu testowego. Opuść płytkę jeszcze bardziej, aż każda studzienka zetknie się z wgłębnikami, przesuwając kamerę i stolik w razie potrzeby, aby wyświetlić całą płytę. Zanotuj zgłoszone pionowe położenie stołu montażowego, gdy wszystkie słupki są w kontakcie, i zamknij interaktywny panel testowy.

Następnie uruchom instrument wirtualny sterowania ruchem i kliknij przycisk Góra, aby podnieść scenę, używając przycisku zatrzymania, aby zatrzymać instrument wirtualny, gdy stolik znajdzie się na swoim miejscu. Otwórz drzwi, aby dezaktywować urządzenie, a następnie poluzuj seth na rogu, który zetknął się jako pierwszy, aby obniżyć róg, i dokręć przeciwległą, aby podnieść róg, który zetknął się jako ostatni. Powtarzaj opuszczanie, obserwację i regulację bloku, aż płytka zetknie się ze wszystkimi wgłębnikami jednocześnie.

Staranne wyrównanie bloku wgłębnika jest ważne dla uzyskania równomiernego uszkodzenia we wszystkich dołkach płyty. Otwórz drzwiczki, aby ponownie wyłączyć urządzenie, i włóż mocujące w ich otwory w bloku wgłębnika. Następnie dokręć na miejscu i zanotuj pozycję stage zgłaszaną przez interaktywny panel testowy, gdy płyta się zetknie.

Aby rozciągnąć płytę, zmień nazwę pliku w polu Ścieżka pliku w pozycji sprawdzania instrumentu wirtualnego na unikatową nazwę pliku, a następnie kliknij strzałkę Uruchom. Ustaw głębokość i czas trwania wcięcia oraz pola Uraz i Czas trwania urazu w instrumencie wirtualnym panelu sterowania ruchem. Gdy tabliczka znajduje się w pozycji zerowej, uruchom wirtualny instrument panelu sterowania ruchem i kliknij przycisk Zranij, aby wciąć płytę.

Kliknij przycisk Góra, aby przesunąć scenę w górę, kliknij przycisk Zatrzymaj, gdy płyta znajduje się w górnym położeniu, i otwórz drzwiczki, aby dezaktywować urządzenie do urazu. Następnie sprawdź historię przemieszczeń etapu przedstawioną w wirtualnym instrumencie do śledzenia pozycji, aby potwierdzić, że zastosowano określone maksymalne przemieszczenie, i wyeksportuj dane do odpowiedniego programu arkusza kalkulacyjnego. Aby ocenić rozciągliwość membrany silikonowej, po obróbce plazmowej umieść płytkę na miękkiej powierzchni i zagruntuj mały występ na stemplu tuszem z markera permanentnego.

Włóż stempel do pierwszego dołka, który ma być przetestowany, i stuknij, aby zapewnić dobry transfer atramentu. Po wytłoczeniu wszystkich studzienek umieść szybką kamerę na stojaku na wysięgniku nad urządzeniem do urazów z obiektywem ustawionym na najmniejszy ponumerowany przysłonę, tak aby pole widzenia zawierało 12 wgłębników w siatce trzy na cztery. Gdy miejsce znajduje się w pozycji punktu zerowego, kliknij przycisk nagrywania w oprogramowaniu aparatu, aby odczytał spust i włączył jasne, rozproszone światło osiowe.

Następnie wciąć płytkę, jak pokazano, i wyłącz światło osiowe. Aby uszkodzić hodowlę komórkową, dodaj 100 mikrolitrów traktowanych lamininą, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych do każdego dołka płytki poddanej działaniu osocza i pozwól komórkom przyczepić się do dna płytki na 15 minut w temperaturze pokojowej przed umieszczeniem płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po dwóch do trzech dniach hodowli zaciśnij płytkę na etapie urządzenia do urazów i dostosuj położenie pokrywy, aby zabezpieczyć płytkę bez wystawiania kultur na działanie otaczającego powietrza.

Następnie, gdy tabliczka znajduje się w pozycji punktu zerowego, wciąć płytkę, jak pokazano poniżej. Optymalna, nieuszkodzona kultura będzie miała niewiele, jeśli w ogóle, grudek więcej niż pięciu komórek, a neuryty będą indywidualne, długie, smukłe i zakrzywione, z niewielkimi lub żadnymi koralikami. W idealnych warunkach żywotność kultur powinna być zbliżona do żywotności określonej w karcie katalogowej producenta, a kultury na silikonie powinny przypominać te utrzymywane na konwencjonalnych sztywnych podłożach hodowlanych.

Zwiększenie gęstości komórek zwiększa liczbę i wielkość grudek, które tworzą się w hodowli, podczas gdy zwiększenie stężenia lamininy zazwyczaj przeciwdziała temu efektowi. W kulturach uszkodzonych szczepem szczytowym 57%, cztery godziny po urazie, neuryty są skrócone lub ich brakuje, a niektóre mają koraliki z zlepianiem wykazywanym przez pozostałe żywotne komórki. Warto zauważyć, że leczenie wyższymi dawkami lamininy zmniejsza nasilenie uszkodzenia kultur komórkowych w sposób zależny od stężenia, o czym świadczy wzrost długości neurytów i żywotności komórek w kulturach traktowanych lamininą w wyższych dawkach.

Próbując wykonać tę procedurę, należy wziąć pod uwagę czas realizacji. Na przykład detoksykacja membranowa trwa trzy dni, a wyprodukowane płytki powinny utwardzić się przez noc przed użyciem. Nie zapominaj, że urządzenie do urazów zawiera potężną cewkę drgającą, która napędza jego ruch, i zawsze należy trzymać się z dala od urządzenia, gdy jest aktywne, i wyłączać urządzenie tylko wtedy, gdy stage znajduje się na szczycie swojego ruchu.