Name: Protokół badania ostrej i przewlekłej ekotoksyczności turkusowej Killifish Nothobranchius furzeri (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Poznaj metodę badania ostrej i przewlekłej ekotoksyczności u Nothobranchius furzeri. Oceniaj śmiertelność, wzrost i płodność w krótkim czasie dzięki szybkiemu cyklowi życiowemu tego modelowego organizmu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni grupie SPHERE z UAntwerpen i Departamentowi Ochrony Roślin Ugent za analizę próbek wody. Wsparcia w realizacji tego projektu udzieliło Centrum Doskonałości "Dynamika ekologiczna i społeczno-ewolucyjna" (PF/10/007) Funduszu Badawczego ALK Leuven. AFG (11Q0516N) i ESJT (FWO-SB151323) były finansowane jako doktorat, a TP (12F0716N) jako stażysta podoktorski przez FWO Flanders (Fonds Wetenschappelijk Onderzoek).

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki KULeuven.
1. Wylęg i ogólna pielęgnacja N. furzeri 
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę rybną (pH 7) w temperaturze 14 °C i dodać oczyszczoną wodę typu II z dodatkiem standaryzowanych soli do przewodności 600 μS/cm (24 °C).</li>
	<li>Wybierz jaja z linii laboratoryjnej GRZ (Gona-Rhe-Zhou), które były przechowywane w standardowych warunkach13. Wybierz jaja w fazie DIII (tj. gotowe do wyklucia), rozpoznawalne po obecności golden eyes9 i delikatnie przenieś je miękką pęsetą do plastikowego zbiornika o pojemności 2 litrów (nie więcej niż około 30 jaj na zbiornik). 
	UWAGA: Aby mieć wystarczającą liczbę zdrowych organizmów testowych, należy wykluć dwa razy więcej jaj niż wymagana liczba larw ryb.</li>
	<li>Dodać 1 cm podłoża rybnego w temperaturze 12 °C i pozwolić, aby temperatura wody stopniowo zbliżała się do temperatury pokojowej (24 °C)9. Ryby wyklują się w ciągu pierwszych 12 godzin.</li>
	<li>Po 24 godzinach nakarm pisklęta skoncentrowaną dawką świeżo wyklutych Artemianauplii (więcej szczegółów na temat częstotliwości i ilości pokarmu można znaleźć w protokole hodowlanym Polačika i in. 20169) i zwiększ głębokość wody do 5 cm, dodając podłoże dla ryb.</li>
	<li>Po 36 godzinach nakarm pisklęta kolejną skoncentrowaną dawką świeżo wyklutych naupliów artemii i dodaj pożywkę rybną, aby zwiększyć głębokość wody do 10 cm.</li>
	<li>Pojemniki na ryby należy inkubować w warunkach stałej temperatury (np. w inkubatorze, pomieszczeniu klimatycznym lub w podgrzewanej łaźni wodnej) w reżimie 14 h:10 h światło:ciemność.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem doświadczenia należy umieścić złożone pojemniki na ryby (bez ryb) w związku ekspozycyjnym, napełniając je medium o najwyższym stężeniu i pozostawiając je na noc w celu ograniczenia przenoszenia substancji toksycznych do pojemnika w rzeczywistym doświadczeniu.</li>
	<li>48 godzin po wykluciu wybierz zdrowe, pływające larwy, aby rozpocząć eksperyment ekspozycji. Pozbądź się tzw. brzuszków, które nie były w stanie napełnić pęcherza pławnego i w konsekwencji mają upośledzoną pływalność (ciągle opadają na dno).</li>
</ol>
2. Protokół krótkotrwałej ekspozycji
UWAGA: Badacze powinni dążyć do co najmniej 20 powtórzeń (20 ryb w oddzielnych słoikach) na zabieg. Oprócz pełnego leczenia kontrolnego, należy włączyć kontrolę rozpuszczalnika, jeśli roztwór podstawowy związku jest przygotowywany przy użyciu rozpuszczalnika. Kontrola rozpuszczalnika powinna zawierać ilość rozpuszczalnika równą stężeniu rozpuszczalnika w najwyższym stężeniu ekspozycji.
<ol>
	<li>Przygotować pojemniki doświadczalne (szklane słoiki o pojemności 0,5 l), etykietując je i napełniając odpowiednim medium ekspozycyjnym (różne stężenia substancji toksycznych). Dodaj związek, aby uzyskać odpowiednie stężenie.</li>
	<li>Larwy (48 godzin po wykluciu) przenieść pojedynczo do pojemników (1 ryba na pojemnik do indywidualnego monitorowania). 
	UWAGA: Ryby są wystawiane indywidualnie, aby zminimalizować potencjalne zakłócające skutki interakcji społecznych, takie jak rywalizacja o pożywienie i agresja. Ryby mogą jednak wchodzić w interakcje wzrokowe zgodnie z normami etycznymi dotyczącymi wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych.</li>
	<li>Obserwuj tę ostrą ekspozycję przez okres do 2 tygodni. W tym czasie karm ryby ad libitum naupliami artemii dwa razy dziennie, 7 dni w tygodniu.</li>
	<li>Odświeżaj podłoże co drugi dzień, aby utrzymać jakość wody i zminimalizować potencjalne skutki degradacji związku. Monitoruj kluczowe zmienne wody (poziom rozpuszczonego tlenu powinien przekraczać 80%, przewodność powinna mieścić się w zakresie od 600 do 700 μS/cm, pH od 7,8 do 8,2, a twardość (jakoCaCO3) między 350 a 450 mg/L, co leży w zakresie optymalnych warunków hodowli dla N. furzeri 9). Pobrać próbki wody przed i po odświeżeniu pożywki w celu określenia rzeczywistych stężeń związków.</li>
	<li>Punkty końcowe
	<ol>
		<li>Codziennie (rano, wieczorem) sprawdzaj ryby pod kątem śmiertelności, stresu (np. nieprawidłowego zachowania: pływania do góry nogami) lub chorób. Zapoznaj się z publikacją Shedd et al. (1999)12, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat obserwacji śmiertelności, stresu lub choroby.</li>
		<li>Oblicz wartości LC50 na podstawie śmiertelności przy użyciu krzywych dawka-odpowiedź (Ritz i Streibig, 2005) w różnych punktach czasowych. Użyj funkcji drm w pakiecie drc w języku R 3.2.3 (R Development Core Team, 2016) lub podobnych podejść statystycznych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Protokół chronicznego narażenia
UWAGA: Celuj w minimum 25 ryb/kondycję na początku eksperymentu, aby zminimalizować szanse na wypaczenie proporcji płci i uwzględnić potencjalną śmiertelność tła z przyczyn naturalnych (np. śmiertelność związaną z wiekiem).
<ol>
	<li>Wylęg (patrz sekcja 1)</li>
	<li>Faza I (2 dni po wykluciu - 16 dni po wykluciu)
	<ol>
		<li>Postępuj zgodnie z protokołem opisanym w 2.1 - 2.4</li>
		<li>Podobnie jak w drugiej fazie eksperymentu, podłoże będzie ulegać degradacji przez cały tydzień (bez odświeżania, patrz poniżej). Wymaganą ilość podłoża należy przechowywać przez tydzień w dużych obojętnych pojemnikach, aby umożliwić podobną degradację związku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Faza II (16 dni po wykluciu - koniec)
	<ol>
		<li>Przygotuj eksperymentalne szklane słoiki o pojemności 2 l, mieszając je ze związkiem. Napełnij słoiki odpowiednim medium ekspozycyjnym i dodaj rurkę powietrzną, aby napowietrzyć słoik. Trzymaj ryby pojedynczo w tych słoikach przez pozostałą część eksperymentu. Pozwól na interakcję wizualną, aby dostosować się do standardów etycznych.</li>
		<li>Odświeżaj podłoże raz w tygodniu. Przenieść rybę z siatką do nowego słoika zawierającego to samo podłoże ekspozycyjne. Pobieraj próbki wody codziennie przez tydzień, aby monitorować degradację związku w każdym stężeniu. Należy obliczyć krzywą degradacji dla każdego zabiegu, jeżeli badanych jest wiele czynników stresogennych (np. toksyczność związku w różnych reżimach temperaturowych). Mierz parametry abiotyczne (pH, temperatura, % rozpuszczonego tlenu, przewodność) trzy razy w tygodniu.</li>
		<li>Od 2 dni po wykluciu (dph) do 23 dph karmić ryby dwa razy dziennie, 7 dni w tygodniu ad libitum Artemia nauplii. Od 24 dph - 37 dph uzupełnij dietę ad libitumArtemia posiekanymi larwami Chironomus. Od 38 dph karm ryby dwa razy dziennie, 7 dni w tygodniu ad libitum mrożone larwy Chironomus.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Punkty końcowe
	<ol>
		<li>Codziennie sprawdzaj ryby pod kątem śmiertelności, stresu lub choroby12.</li>
		<li>Aby określić wzrost, mierz wielkość ciała co tydzień (9 dph - 16 dph - 21 dph - ...), przenosząc ryby na szalkę Petriego wypełnioną pożywką z ich zbiornika. Zrób 4 - 5 skalibrowanych zdjęć ryb z góry (na ustalonej wysokości) i przeanalizuj je cyfrowo za pomocą programu do pomiarów przestrzennych (np. ImageJ). 
		UWAGA: W przypadku dorosłych ryb należy używać wyższej szalki Petriego, aby zminimalizować stres związany z obsługą, utrzymując wszystkie ryby zanurzone podczas całego procesu pomiaru.</li>
		<li>W przypadku dojrzewania samców należy codziennie sprawdzać wzrokowo ryby pod kątem wybarwienia od 15 dph. Sprawdź płetwy pod kątem pierwszych oznak ubarwienia godowego (drugorzędna cecha płciowa). Użyj pierwszego dnia, w którym jest to widoczne, jako wskaźnika czasu dojrzewania samców.</li>
		<li>Ryby bez płci należy łączyć w pary z samcami z tej samej grupy poddanej działaniu substancji lub samcami nieeksperymentalnymi trzy razy w tygodniu od 30 dph w celu określenia czasu dojrzewania samicy (dzień złożenia pierwszego jaja). W tym celu należy skorzystać z protokołu tarła opisanego w 3.4.5.</li>
		<li>W celu uzyskania płodności należy łączyć dojrzałe samice z dojrzałymi samcami 3 razy w tygodniu od 30 dph wzwyż, w ramach ich zabiegów przy użyciu schematu krzyżowania.
		<ol>
			<li>Przygotuj zbiornik tarłowy (1 l) dla każdej pary, używając pożywki ekspozycyjnej z akwarium męskiego uzupełnionej podłożem tarłowym (drobny piasek <500 μm).</li>
			<li>Przenieś zarówno samca, jak i samicę do zbiornika tarłowego i pozwól im się tarlić przez dwie godziny. Podczas tego procesu zminimalizuj aktywność człowieka lub zakłócenia wokół pojemników tarłowych.</li>
			<li>Następnie należy delikatnie przenieść ryby z powrotem do ich pierwotnych pojemników, bez zbędnego mieszania wody, która spowodowałaby zawirowanie ikry w podłożu tarłowym.</li>
			<li>Odfiltruj jaja, wylewając podłoże tarłowe na siatkę o wielkości 500 μm. Policz jajka i przenieś je (za pomocą miękkiej pęsety) na wilgotny mech torfowy na szalkach Petriego9,14.</li>
			<li>Codziennie usuwaj martwe jaja. Po tygodniu zamknąć szalkę Petriego folią uszczelniającą i przechowywać ją w inkubatorze o kontrolowanej temperaturze w temperaturze 28 °C i w cyklu 14:10 godzina światło:ciemność w celu natychmiastowego przejścia do fazy DIII (tj. gotowości do wyklucia po około trzech tygodniach). W przypadku długotrwałego przechowywania jaja należy przechowywać w temperaturze 17 °C w stałej ciemności, po której jaja wchodzą w fazę spoczynku i zachowują żywotność przez wiele lat. Podczas rekrutacji ryb z tych uśpionych jaj do eksperymentów, przenieś uśpione jaja do warunków 28 °C z cyklem światło:ciemność 14:10 h przez około trzy tygodnie, aby umożliwić rozwój do fazy DIII.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zmierz krytyczne maksimum termiczne (CTmax) (miara wydajności15) dorosłych ryb.
		<ol>
			<li>Używać łaźni wodnej, która jest podgrzewana ze stałą prędkością 0,33 °C/min i w której woda jest stale cyrkulowana. Dodaj kilka akwariów o pojemności 1 l dla każdej ryby. 
			UWAGA: Ze względu na ograniczenia przestrzenne w kąpieli wodnej konieczna jest praca w kilku seriach. Potencjalne różnice w warunkach między seriami powinny być brane pod uwagę przy przeprowadzaniu analizy statystycznej poprzez włączenie "serii" jako czynnika losowego.</li>
			<li>Rozpocznij próbę od dodania ryby do akwarium, gdy woda w akwarium osiągnie eksperymentalną temperaturę hodowli ryb (zwykle 28 °C). Monitoruj temperaturę w akwariach o pojemności 1 l wanny CTmax co 5 minut za pomocą termometru cyfrowego (skala 0,1 °C).</li>
			<li>Zakończ próbę, gdy ryba nie utrzyma pozycji grzbietowo-brzusznej pionowej lub zacznie mocno drgać16,17. Zmierz temperaturę w akwarium o pojemności 1 l, co jest krytyczną temperaturą maksymalną. Przenieś rybę z powrotem do jej eksperymentalnego pomieszczenia w celu odzyskania.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zmierz wagę (z dokładnością do 0,1 mg) ryby w ostatnim dniu eksperymentu, osuszając ją i przenosząc na łódkę wagową. UWAGA: Wszystkie ryby należy zmierzyć cztery godziny po ostatnim karmieniu, aby ujednolicić masę pokarmu w przewodzie pokarmowym.</li>
		<li>Poddaj rybę eutanazji za pomocą 0,1% trikainy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Protokół ekspozycji międzypokoleniowej
UWAGA: Aby zmierzyć międzypokoleniowy wpływ zanieczyszczeń na N. furzeri, postępuj zgodnie z protokołem chronicznego narażenia opisanym powyżej dla pierwszej generacji.
<ol>
	<li>Dwa razy w tygodniu sprawdzaj rozwój wyprodukowanych jaj (tj. drugiego pokolenia) przechowywanych w temperaturze 28 °C 14:10h w cyklu światło-ciemność, sprawdzając szalki Petriego pod kątem zarodków w fazie DIII (zob. Polačik i wsp. 20169). Gdy w pełni rozwinie się więcej niż 50 powtórzeń każdego leczenia rodzicielskiego, należy je wykluć zgodnie z protokołem opisanym w ppkt 1.1.</li>
	<li>Wystaw zdrowe, wyporne ryby na dokładnie taką samą konfigurację i traktowanie, jak ryby rodzicielskie.</li>
</ol>

<ol><li>European-Chemicals-Bureau. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22TAPIR+Three+point+three-A+Project+for+the+Information+Requirements+of+REACH.+Final+Report-2+August+2005.+Scoping+study+on+the+development+of+a+Technical+Guidance+Document+on+information+requirements+on+intrinsic+properties+of+substances+%28RIP+3.3-1%29%22">TAPIR Three point three-A Project for the Information Requirements of REACH. Final Report-2 August 2005. Scoping study on the development of a Technical Guidance Document on information requirements on intrinsic properties of substances (RIP 3.3-1)</a>. , (2005).</li>
<li>Philippe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+sensitivity+to+copper+of+a+promising+ecotoxicological+model+species%2C+the+annual+killifish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicol+Environ+Saf%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri.</a> Ecotoxicol Environ Saf. , 26-35 (2017).</li>
<li>Noyes, P. D., Lema, S. C. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/cz/article/61/4/669/1803158">Forecasting the impacts of chemical pollution and climate change interactions on the health of wildlife.</a> Current Zoology. 61 (4), 669-689 (2015).</li>
<li>Consommateurs, S. S. d <a target="_blank" href="https://yosemite.epa.gov/oa/EAB_Web_Docket.nsf/Attachments%20By%20ParentFilingId/7B39B959EEFC9DEE85257FD20046C85C/$FILE/PBNX%20047.pdf">Health & Consumer Protection Directorate-General European Commission</a>. 4, Brussels (BE). SANCO/3268/2001 rev. 4 (final) (2002).</li>
<li>Commission, E. E. <a target="_blank" href="https://yosemite.epa.gov/oa/EAB_Web_Docket.nsf/Attachments%20By%20ParentFilingId/7B39B959EEFC9DEE85257FD20046C85C/$FILE/PBNX%20047.pdf">Guidance document on aquatic ecotoxicology. Under Council directive 91/414/EEC.</a> SANCO/3268/2001 Rev 4. 2002b. , (2002).</li>
<li>EPA. Ecological Effects Test Guidelines, OPPTS 850.1500 Fish life cycle toxicity. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/850-1500.pdf">https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/850-1500.pdf</a> (1996).</li>
<li>Philippe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+sensitivity+to+copper+of+a+promising+ecotoxicological+model+species%2C+the+annual+killifish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicol+Environ+Saf%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri.</a> Ecotoxicol Environ Saf. , (2017).</li>
<li>Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fathead+minnow+in+aquatic+toxicology%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future.</a> Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).</li>
<li>Polačik, M., Blažek, R., Reichard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+breeding+of+the+short-lived+annual+killifish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri.</a> Nature Protocols. 11 (8), 1396-1413 (2016).</li>
<li>Reichwald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Sex+Chromosome+Evolution+and+Aging+from+the+Genome+of+a+Short-Lived+Fish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish.</a> Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).</li>
<li>Valenzano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+Turquoise+Killifish+Genome+Provides+Insights+into+Evolution+and+Genetic+Architecture+of+Lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan.</a> Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).</li>
<li>Shedd, T. R., Widder, M. W., Toussaint, M. W., Sunkel, M. C., Hull, E. <a target="_blank" href="https://setac.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/etc.5620181020">Evaluation of the annual killifish Nothobranchius guentheri as a tool for rapid acute toxicity screening.</a> Environ. Toxicol. Chem. 18 (10), 2258-2261 (1999).</li>
<li>Platzer, M., Englert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nothobranchius+furzeri%3A+a+model+for+aging+research+and+more%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Nothobranchius furzeri: a model for aging research and more.</a> Trends Genet. 32 (9), 543-552 (2016).</li>
<li>Watters, B. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/285885125_The_ecology_and_distribution_of_Nothobranchius_fishes">The ecology and distribution of Nothobranchius fishes.</a> J Am Killifish Assoc. 42, 58-61 (2009).</li>
<li>Op de Beeck, L., Verheyen, J., Stoks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+magnifies+the+impact+of+a+pesticide+in+a+warming+world+by+reducing+heat+tolerance+and+increasing+autotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Pollut%22%5BJournal%5D)">Competition magnifies the impact of a pesticide in a warming world by reducing heat tolerance and increasing autotomy.</a> Environ Pollut. 233, 226-234 (2018).</li>
<li>Patra, R. W., Chapman, J. C., Lim, R. P., Gehrke, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+three+organic+chemicals+on+the+upper+thermal+tolerances+of+four+freshwater+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The effects of three organic chemicals on the upper thermal tolerances of four freshwater fishes.</a> Environ. Toxicol. Chem. 26 (7), 1454-1459 (2007).</li>
<li>Beitinger, T. L., Bennett, W. A., McCauley, R. W. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1007676325825">Temperature tolerances of North American freshwater fishes exposed to dynamic changes in temperature.</a> Environ Biol Fishes. 58 (3), 237-275 (2000).</li>
<li>Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+bush+to+the+bench%3A+the+annual+Nothobranchius+fishes+as+a+new+model+system+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Reviews%22%5BJournal%5D)">From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology.</a> Biological Reviews. , (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Praca ta opisuje nowy test biologiczny wykorzystujący Nothobranchius furzeri, wyłaniający się organizm modelowy, do badania indywidualnych i połączonych długoterminowych skutków substancji toksycznych i innych czynników stresogennych. Przedstawione protokoły z powodzeniem zastosowano do pomiaru wrażliwości gatunku na szereg substancji toksycznych (miedź, kadm, 3,4-dichloroanilina i chloropiryfos). Ze względu na szybki cykl życiowy ten model kręgowców pozwala na ocenę skutków subletalnych i międzypokoleniowych w ...

Opisano profile wrażliwości szeregu gatunków na strategicznie wybrane substancje toksyczne1 dla europejskiego prawodawstwa REACH (Rejestracja, Ocena, Autoryzacja i Ograniczenia Chemikaliów). W tym celu najczęściej stosowano badania toksyczności ostrej lub krótkookresowej, ponieważ dają one szybkie wskazanie wrażliwości gatunku. Jednak w swoim naturalnym środowisku organizmy są narażone przez znacznie dłuższe okresy i może to mieć wpływ na pełne cykle życiowe, a nawet kilka pokoleń2. Co więcej, organizmy w zanieczyszczonym środowisku są zazwyczaj narażone na więcej niż jeden stresor na raz, który może wchodzić ze sobą w interakcje, co może prowadzić do efektów synergicznych3. W związku z tym bezpieczne stężenia obliczone na podstawie badań ostrej toksyczności pojedynczego czynnika stresogennego mogą zaniżać rzeczywiste ryzyko, jakie stwarzają substancje toksyczne w środowisku naturalnym. W związku z tym wskazane jest również zbadanie przewlekłych i wielopokoleniowych skutków subletalnych stężeń substancji toksycznych w kontekście istotnym dla środowiska, zgodnie z zaleceniami Komisji Europejskiej4,5 i USEPA (Agencja Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych)6,7. Szczególnie w badaniach nad kręgowcami koszty pod względem pracy, pieniędzy i czasu są wysokie w przypadku wykonywania badań narażenia przewlekłego i wielopokoleniowego ze względu na stosunkowo długą żywotność kręgowców w porównaniu z modelowymi organizmami bezkręgowców. Dlatego wskazane jest, aby w zależności od pytania badawczego wybrać najbardziej odpowiedni organizm modelowy ryby. Ponadto powinien być dostępny szeroki wachlarz gatunków kręgowców w celu zbadania ogólności reakcji między gatunkami, aby móc dostosować przepisy w oparciu o najbardziej wrażliwe gatunki. Na razie istnieje potrzeba opracowania nowych, wydajnych protokołów z modelowymi gatunkami kręgowców charakteryzujących się krótkimi cyklami życiowymi, aby obniżyć koszty wykonywania przewlekłych i wielopokoleniowych ekspozycji na kręgowcach7,8.
Turkusowa karpia Nothobranchius furzeri jest interesującym modelem ryb do wykorzystania w takich długoterminowych eksperymentach ekspozycyjnych, ze względu na krótki czas dojrzewania i cykl życia (czas generacji krótszy niż 4 tygodnie9). Oznacza to, że istotne z ekologicznego punktu widzenia punkty końcowe, takie jak czas dojrzewania i płodność, mogą być badane w krótkim czasie w porównaniu z innymi modelami ryb7. Co więcej, ryby te wytwarzają odporne na suszę, uśpione jaja, które zachowują żywotność przez kilka lat, gdy są przechowywane w standardowych warunkach, eliminując w ten sposób potrzebę ciągłej hodowli9. W badaniach ekotoksykologicznych oznacza to również, że wszystkie replikowane ryby mogą wykluć się dokładnie w tym samym momencie, co skutkuje synchronizacją czasową dla wszystkich zwierząt, nawet między partiami jaj wyprodukowanych w różnym czasie. Zalecamy korzystanie z laboratoryjnego szczepu GRZ do przeprowadzania eksperymentów ekspozycyjnych. Szczep ten dobrze radzi sobie w warunkach laboratoryjnych, jest homozygotyczny (z wyjątkiem chromosomów płciowych), a genom jest dobrze scharakteryzowany10,11.
W badaniach ekotoksykologicznych ważne jest, aby wybrać odpowiedni zakres stężeń testowych. W tym celu można zastosować kilka uzupełniających się metod. Nominalny zakres stężeń może być oparty na czułości pokrewnego gatunku, takiego jak Nothobranchius guentheri12. Alternatywnie, zakres może być oparty na czułości standardowych modeli ryb, takich jak danio pręgowany (Danio rerio)2, które mają porównywalną czułość na większość substancji toksycznych (Philippe i wsp. (w trakcie przeglądu)). W połączeniu, z obiema tymi opcjami, należy przeprowadzić eksperyment ustalający zakres w celu wybrania nominalnego zakresu stężeń. W przypadku badań ostrych badacze powinni dążyć do leczenia stężeniem ze 100% śmiertelnością, śmiertelnością średnią i 0% śmiertelnością po 24 godzinach ekspozycji na substancję toksyczną. W przypadku badań przewlekłych zaleca się przeprowadzenie dwutygodniowego eksperymentu polegającego na ustaleniu zakresu stosowania w celu sprawdzenia, czy śmiertelność larw w stanie, w którym występują najwyższe stężenia testowe, nie przekracza 10 % w tym okresie referencyjnym.
Protokół może służyć jako punkt odniesienia do przeprowadzania ostrej i przewlekłej ekspozycji na zanieczyszczenia wodne na N. furzeri, badając potencjalne skutki stresorów zarówno na poziomie indywidualnym, jak i komórkowym. Można go również wykorzystać do prowadzenia badań nad wieloma czynnikami stresogennymi w celu uwzględnienia większego znaczenia ekologicznego, mieszania różnych związków toksycznych lub badania interaktywnych skutków między zanieczyszczeniem a innymi naturalnymi czynnikami stresogennymi (np. drapieżnictwo) lub stresorami antropogenicznymi (np. ocieplenie spowodowane zmianą klimatu).

<table><tbody><tr><td>woda oczyszczona Typ 1 (milli Q)</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sea Salt</td><td>Instant Ocean</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2L plastikowy zbiornik</td><td>SAVIC</td><td></td><td>Zawsze oddzielny materiał do kontroli i leczenia toksyczności</td></tr><tr><td>1L plastikowy zbiornik (tarło)</td><td>Avamoplast</td><td></td><td>Zawsze oddzielny materiał do kontroli i leczenia toksyczności</td></tr><tr><td>siatki</td><td>Aqua bilzen</td><td></td><td>Zawsze oddzielny materiał do kontroli i leczenia toksyczności</td></tr><tr><td>Słoiki szklane 2L</td><td>Sepac-Flacover</td><td></td><td>Zawsze oddzielny materiał do kontroli i leczenia toksyczności</td></tr><tr><td>0,5L słoiki szklane</td><td>Sepac-Flacover</td><td></td><td>Zawsze oddzielny materiał do leczenia kontroli i toksyczności</td></tr><tr><td>Jaja artemii</td><td>Ocean Nutrition</td><td></td><td></td></tr><tr><td>chironomus</td><td>Ocean Nutrition</td><td></td><td>mrożone</td></tr><tr><td>tricaine,</td><td>szalki Petriego Sigma, Aldrich</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td></td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td>, pipety <td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>,</td><td>MLS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, pęsety,</td><td>FST</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 i mikro; m sito siatkowe</td> <td>/</td><td></td> <td>samodzielnie wykonana</td></tr><tr><td>probówka do mikrowirówki (2 ml)</td> <td>MARKA</td><td></td><td>Do przechowywania ryb w</td></tr><tr><td>szklanych fiolkach</td><td>zamrażarki Sigma aldrich</td><td></td><td>Do analizy wody</td></tr><tr><td>łódź ważąca</td><td>MLS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jiffy 7c granulki</td> Kąpiel wodna <td>Jiffy</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gilac</td><td></td><td>do</td></tr><tr><td>ciekłego azotu Ctmax</td><td>Termometr cyfrowy Air Liquide</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Testo AG</td> Nagrzewnica <td>termiczna testo 926</td><td></td></tr><tr><td>HETO</td> Waga kalibrowana <td>Anker Schmitt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>platforma do kamery</td> <td>/</td><td></td> <td>samodzielnie wykonany</td></tr><tr><td>zestaw wielofunkcyjny</td><td>HACH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka (-80&deg; C)</td>Zamrażarka <td></td><td></td><td>niskotemperaturowa Panasonic Ultra</td></tr> <tr><td><silna>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Fysio</td><td></td><td></td><td></td></tr> bufor <tr><td>homogenizacyjny</td><td>VWR</td><td></td><td>0,1&nbsp; M TRIS&ndash; HCl, pH 8,5, 15&nbsp;% poliwinylopirolidon, 153&nbsp; &mikro; M MgSO4&nbsp; i 0,2&nbsp;% Triton X-100</td></tr><tr><td>chloroform: metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tripalmitynian glicerolu</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>amyloglukozydaza</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A7420</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik do oznaczania glukozy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3293</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik białkowy Biorad</td><td></td> 96-dołkowa płytka do mikromiareczkowania VWR <td></td><td></td></tr><tr><td></td>Płytki do mikromiareczkowania <td>Greiner Bio-one</td><td></td><td></td></tr><tr><td>384 Rurki</td> szklane <td>Greiner Bio-one</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml Fiers</td><td></td><td></td><td>Do analizy zawartości tłuszczu</td></tr><tr><td>2,5 ml probówki eppendorfa Homogenizator</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Fotospektrometr <td>Ultra-turrax TP 18/10</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Grzałka Infinite M200 TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>do szklanych probówek</td><td>Wirówka reaktorowa</td><td></td><td></td>ChZT</tr><tr><td></td><td>Eppendorf Wirówka 5415 R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Bumako</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protokół badania ostrej i przewlekłej ekotoksyczności turkusowej killifish nothobranchius furzeri

Protocol for Acute and Chronic Ecotoxicity Testing of the Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Ryba karpiowata Nothobranchius furzeri jest nowym organizmem modelowym w dziedzinie ekotoksykologii i wykazano jej przydatność w testach ekotoksyczności ostrej i przewlekłej. Ogólnie rzecz biorąc, wrażliwość gatunku na związki toksyczne mieści się w zakresie lub jest wyższa niż w przypadku innych gatunków modelowych.
Ta praca opisuje protokoły dla ostrych, przewlekłych i wielopokoleniowych testów biologicznych pojedynczych i połączonych efektów stresorowych na N. furzeri. Ze względu na krótki czas dojrzewania i cykl życiowy, ten model kręgowców umożliwia badanie punktów końcowych, takich jak czas dojrzewania i płodność, w ciągu czterech miesięcy. Międzypokoleniowe badania narażenia w pełnym cyklu życia można przeprowadzić już po 8 miesiącach. Ponieważ gatunek ten wytwarza jaja, które są odporne na suszę i pozostają żywotne przez lata, hodowla gatunku na miejscu nie jest potrzebna, ale w razie potrzeby można rekrutować osobniki. Protokoły mają na celu pomiar cech historii życia (śmiertelność, wzrost, płodność, waga) i krytycznego maksimum termicznego.

Wyniki ostrej ekspozycji N. furzeri na różne stężenia miedzi, obliczone zgodnie z sekcją 2.5.2, wykazują wyraźne zależności dawka-odpowiedź (Rycina 1). Odnotowano wzrost śmiertelności wraz ze wzrostem stężenia toksykantu. Wartości LC50 maleją w czasie, co oznacza, że przy niższych stężeniach upływa więcej czasu, zanim zginie 50% osobników w powtórzeniach. W celu uzyskania szczegółowych wyników dotyczących ostrej i przewlekłej ekspozycji <e...

W tej pracy opisujemy ostry, przewlekły i wielopokoleniowy test biologiczny, aby zbadać wpływ pojedynczych i połączonych stresorów na turkusową karpię Nothobranchius furzeri. Protokół ten ma na celu badanie cech historii życia (śmiertelność, wzrost, płodność, waga) i krytycznego maksimum termicznego.

Protokół badania ostrej i przewlekłej ekotoksyczności turkusowej Killifish Nothobranchius furzeri

The killifish Nothobranchius furzeri is an emerging model organism in the field of ecotoxicology and its applicability in acute and chronic ecotoxicity ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zbadanie wpływu substancji toksycznych na turkusową karpię Nothobranchius furzeri. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie ekotoksykologii, takie jak długoterminowy wpływ stresorów na ważne cechy historii życia, takie jak czas dojrzewania, wzrost czy płodność. Główną zaletą tego eksperymentu jest to, że używamy kręgowców o bardzo szybkim cyklu życia, co skutkuje eksperymentami efektywnymi czasowo i kosztowo.Te karpiowate są idealnymi modelami do badania wpływu długoterminowych i wielopokoleniowych skutków stresorów. W ostatecznym rozrachunku przyczynią się one do lepszego zrozumienia wpływu substancji toksycznych na środowisko. Chociaż metoda ta może dostarczyć nowych informacji na temat połączonego wpływu substancji toksycznych i temperatury, można ją również zastosować do innych czynników stresogennych, takich jak promieniowanie UV, niedobór pożywienia i zmiany pH.Praca z Killifish jest trudna, ponieważ są nowym systemem modelowym w ekotoksykologii, a ich wrażliwość na wiele zanieczyszczeń jest nadal nieznana. Pomysł na tę eksperymentalną metodę opracowaliśmy, gdy po raz pierwszy dowiedzieliśmy się o wyjątkowo krótki

protocol-for-acute-chronic-ecotoxicity-testing-turquoise-killifish

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Niniejsza praca dotyczy opracowania i standaryzacji wartościowego protokołu metodycznego służącego do określania długoterminowej (14-dniowej) toksyczności letalnej substancji chemicznych, ścieków przemysłowych lub komunalnych oraz ciekłych próbek środowiskowych wobec słonawodnego skorupiaka Artemia franciscana.

Długoterminowy test toksyczności letalnej z wykorzystaniem skorupiaka Artemia franciscana

Mierzenie wpływu zanieczyszczeń środowiska na zachowanie ryb jest często subiektywne i trudne, szczególnie gdy mamy do czynienia z subletalnymi punktami końcowymi. Opisujemy metody, w tym technologię wideo, do ilościowego określania zachowania pływackiego jesiotra białego (Acipenser transmontanus) we wczesnym stadium życia podczas i po 96-godzinnej ostrej ekspozycji na różne stężenia miedzi.

Kwantyfikacja zachowań ryb podczas pływania w odpowiedzi na ostre narażenie na wodną zawartość miedzi przy użyciu wspomaganego komputerowo wideo i cyfrowej analizy obrazu

Związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC) stanowią poważne zagrożenie dla środowiska wodnego. Miejskie oczyszczalnie ścieków w znacznym stopniu przyczyniają się do estrogenowej siły działania wód powierzchniowych. Przedstawiona w artykule metodologia pozwala na ocenę skuteczności i przydatności procesów oczyszczania ścieków w odniesieniu do usuwania EDC.

Wykorzystanie zestawu metod chemicznych i ekotoksykologicznych do oceny skuteczności procesów oczyszczania ścieków w celu usunięcia siły działania estrogenów

To badanie obejmuje metody mające na celu ujawnienie wpływu na modelowego gospodarza ryb po zmianie składu społeczności mikrobiomu skóry i jelit przez antybiotyk.

Badanie fenotypów gospodarza w Gambusia affinis po leczeniu antybiotykami

Ta praca opisuje nowy protokół oceny ekotoksyczności zanieczyszczeń, w tym pojawiających się zanieczyszczeń, takich jak nanomateriały, przy użyciu morskiej bakterii Vibrio anguillarum. Metoda ta pozwala na określenie LC50, czyli śmiertelności, stężenia, które powoduje 50% spadek zdolności hodowli bakterii, po 6 godzinach ekspozycji.

Metoda ekotoksykologiczna z bakteriami morskimi Vibrio anguillarum do oceny ostrej toksyczności zanieczyszczeń środowiska

Pomieszczenia laboratoryjne turkusowych ryb mogą być skalowane do hodowli i efektywnego hodowania tysięcy pojedynczych ryb w centralnym systemie filtracji wody, wykorzystując tę samą infrastrukturę, która jest używana w standardowych obiektach dla danio pręgowanego. Poniżej przedstawiamy listę ustandaryzowanych procedur, które pozwalają na efektywną hodowlę karpiów.

Protokół przetrzymywania w laboratoriach turkusowych ryb (Nothobranchius furzeri)

W tym artykule przedstawiono znormalizowane metody ekotoksykologiczne do oceny biomarkerów u neotropikalnych gatunków bezogonowych. W szczególności w artykule tym szczegółowo opisano kilka metodologii w różnych skalach oceny ekotoksykologicznej, takich jak poziom genetyczny, komórkowo-histologiczny, biochemiczny, morfologiczny i indywidualny.

Metodologie ekotoksykologiczne do oceny biomarkerów w różnych skalach u anuranów neotropikalnych

Ten protokół przedstawia powszechnie stosowane testy cytotoksyczności (testy Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red i MTT) dostosowane do oceny cytotoksyczności w liniach komórkowych zarodka danio pręgowanego (ZEM2S) i wątroby (ZFL) na 96-dołkowych płytkach.

Testy cytotoksyczności z liniami komórkowymi danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy kompleksowy zestaw testów behawioralnych, w tym nowatorski zbiornik, Shoaling i testy preferencji społecznych, aby skutecznie określić potencjalne neurotoksyczne skutki chemikaliów (np. metamfetaminy i glifosatu) na dorosłe rybki danio pręgowane za pomocą jednego zbiornika. Metoda ta jest istotna dla badań neurotoksycznych i środowiskowych.

Ocena neurotoksyczności u dorosłych Danio rerio przy użyciu baterii testów behawioralnych w jednym zbiorniku

Ten protokół opisuje procedurę badania przesiewowego leków u larw danio pręgowanego 3-7 dni po zapłodnieniu, po której następuje ocena morfologiczna.

Badania przesiewowe małych cząsteczek i badania toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju

Poznaj metodę badania ostrej i przewlekłej ekotoksyczności u Nothobranchius furzeri. Oceniaj śmiertelność, wzrost i płodność w krótkim czasie dzięki szybkiemu cyklowi życiowemu tego modelowego organizmu.

Protokół badania ostrej i przewlekłej ekotoksyczności turkusowej Killifish Nothobranchius furzeri

Przeglądaj więcej filmów