Protokół badania ostrej i przewlekłej ekotoksyczności turkusowej Killifish Nothobranchius furzeri
April 24th, 2018
W tej pracy opisujemy ostry, przewlekły i wielopokoleniowy test biologiczny, aby zbadać wpływ pojedynczych i połączonych stresorów na turkusową karpię Nothobranchius furzeri. Protokół ten ma na celu badanie cech historii życia (śmiertelność, wzrost, płodność, waga) i krytycznego maksimum termicznego.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest zbadanie wpływu substancji toksycznych na turkusową karpię Nothobranchius furzeri. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie ekotoksykologii, takie jak długoterminowy wpływ stresorów na ważne cechy historii życia, takie jak czas dojrzewania, wzrost czy płodność. Główną zaletą tego eksperymentu jest to, że używamy kręgowców o bardzo szybkim cyklu życia, co skutkuje eksperymentami efektywnymi czasowo i kosztowo.
Te karpiowate są idealnymi modelami do badania wpływu długoterminowych i wielopokoleniowych skutków stresorów. W ostatecznym rozrachunku przyczynią się one do lepszego zrozumienia wpływu substancji toksycznych na środowisko. Chociaż metoda ta może dostarczyć nowych informacji na temat połączonego wpływu substancji toksycznych i temperatury, można ją również zastosować do innych czynników stresogennych, takich jak promieniowanie UV, niedobór pożywienia i zmiany pH.
Praca z Killifish jest trudna, ponieważ są nowym systemem modelowym w ekotoksykologii, a ich wrażliwość na wiele zanieczyszczeń jest nadal nieznana. Pomysł na tę eksperymentalną metodę opracowaliśmy, gdy po raz pierwszy dowiedzieliśmy się o wyjątkowo krótkiej żywotności karpiowatych i ich zdolności do produkcji uśpionych jaj, które mogą być przechowywane przez lata na półce. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ rodzaj eksperymentu, a także postępowanie z osobami, mogą zmienić wyniki.
Na początek wybierz gona ray zoo lub jaja GRZ w stadium D3, które można rozpoznać po obecności złotych oczu. I użyj miękkiej pęsety, aby delikatnie przenieść je do plastikowego dwulitrowego zbiornika. Dodaj jeden centymetr pożywki wylęgowej o temperaturze 12 stopni Celsjusza i pozwól, aby temperatura wody stopniowo dostosowywała się do temperatury pokojowej.
Po 24 godzinach nakarm pisklęta skoncentrowaną dawką świeżo wyklutych naupliów artemii i zwiększ głębokość wody do pięciu centymetrów, dodając pożywkę rybną. 48 godzin po wykluciu przenieś zdrowe, pływające larwy do indywidualnych pojemników z pożywką ekspozycyjną i stężeniami toksycznymi zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Każdego ranka i wieczoru sprawdzaj ryby pod kątem śmiertelności, stresu i chorób oraz obliczaj wartości LC50 zgodnie z protokołem tekstowym.
Wykonaj próbę przewlekłej ekspozycji, napełniając poszczególne pojemniki odpowiednim medium ekspozycyjnym i dodaj rurkę powietrzną, aby napowietrzyć słoik. Przenieś ryby do słoików na pozostałą część eksperymentu. Od dwóch do 23 dni po wykluciu lub DPH karm ryby naupliami artemii dwa razy dziennie ad libitum.
Następnie, po uzupełnieniu posiekanymi larwami chironomus do 37 DPH, użyj zamrożonych larw chironomus do karmienia ryb ad libitum dwa razy dziennie, codziennie, posuwając się naprzód. Aby określić wzrost, mierz wielkość ciała co tydzień, przenosząc ryby na szalkę Petriego wypełnioną pożywką ze zbiornika. Zrób od czterech do pięciu skalibrowanych pod kątem rozmiaru zdjęć grzbietowych ryb na ustalonej wysokości.
I użyj programu do pomiarów przestrzennych, aby je cyfrowo przeanalizować. Począwszy od 15 DPH, należy wzrokowo sprawdzić samce ryb pod kątem ubarwienia, aby określić ich dojrzałość. Sprawdź płetwy pod kątem pierwszych oznak ubarwienia godowego i użyj dnia, w którym ubarwienie pięści było widoczne, jako wskaźnika czasu dojrzewania samca.
Od 30 DPH sprawdź płodność, zakładając litrowy zbiornik tarłowy dla dojrzałej pary samców i samic w ramach każdego zabiegu, używając pożywki ekspozycyjnej z akwarium samca i uzupełnij go substratem tarłowym. Przenieś zarówno samca, jak i samicę do zbiornika tarłowego. Minimalizując aktywność człowieka lub zakłócenia wokół pojemników tarłowych, pozwól im się odradzać przez dwie godziny.
Następnie, bez zbędnego mieszania wody, która wyrzuciłaby jaja w powietrze w podłożu tarłowym, należy delikatnie przenieść ryby z powrotem do ich pierwotnych pojemników. Odfiltruj jaja, wylewając podłoże tarłowe na siatkę o wielkości 500 mikrometrów. Policz jajka i za pomocą pipety przenieś je na wilgotny mech torfowy na szalkach Petriego.
Codziennie usuwaj martwe jaja. Po tygodniu użyj folii uszczelniającej, aby uszczelnić szalkę Petriego. I przechowuj go w inkubatorze o kontrolowanej temperaturze w temperaturze 28 stopni Celsjusza, z cyklem od 14 do 10 od światła do ciemności, w celu natychmiastowego rozwoju do fazy D3.
W celu długotrwałej konserwacji jaja należy przechowywać w ciągłej ciemności w temperaturze 17 stopni Celsjusza, po czym jaja wchodzą w fazę uśpienia i zachowują żywotność przez wiele lat. Aby pozyskać ryby z uśpionych jaj, przenieś jaja do temperatury 28 stopni Celsjusza i cyklu od 14 do 10 od światła do ciemności przez około trzy tygodnie, aby umożliwić im rozwój do fazy D3. Aby zmierzyć krytyczne maksimum termiczne lub CT max dorosłych ryb, zacznij od stale krążącej łaźni wodnej, podgrzewanej ze stałą szybkością 0,33 stopnia Celsjusza na minutę.
Dodaj kilka jednolitrowych akwariów dla każdej ryby. Rozpocznij szlak od dodania ryby do akwarium, gdy woda osiągnie eksperymentalną temperaturę hodowli ryb. Użyj termometru cyfrowego, aby monitorować temperaturę w jednolitrowych akwariach wanny CT max co pięć minut.
Kiedy ryba nie jest w stanie utrzymać grzbietowo-brzusznej pozycji pionowej lub zaczyna mocno drgać, zmierz temperaturę w jednolitrowym akwarium, która jest krytyczną temperaturą maksymalną. Następnie przenieś rybę z powrotem do jej eksperymentalnego pomieszczenia w celu odzyskania. Jak pokazano na tym wykresie, ostre narażenie enfurzeri na różne stężenia miedzi spowodowało wzrost śmiertelności wraz ze wzrostem stężenia substancji toksycznych.
Wartości LC50 zmniejszają się z czasem, co oznacza, że wraz ze spadkiem stężeń mija więcej czasu, zanim umrze 50% kontrprób. W teście przewlekłego narażenia, przy użyciu miedzi pochodzącej z wody, ryby są krótsze, mierzone po trzech tygodniach, gdy są hodowane w najwyższym badanym stężeniu. W tym eksperymencie z użyciem chloropiryfosu lub CPH na bazie wody, po wyhodowaniu w temperaturze 28 stopni Celsjusza, ryby produkowały mniej jaj po wystawieniu na najwyższe stężenie CPF, jednak w temperaturze 30 stopni Celsjusza ryby kontrolne produkowały więcej jaj niż ryby wystawione na którekolwiek stężenie CPF, co wskazuje, że połączenie CPF i wzrost temperatury wpływało na płodność bardziej niż każdy stresor z osobna.
Podano tutaj średni wiek, w którym pojawiły się pierwsze oznaki ubarwienia u samców enfurzeri, wystawionych na działanie CPF w temperaturze 28 i 30 stopni Celsjusza. Po ekspozycji na cztery mikrogramy na litr CPF, samce ryb potrzebowały o 18% więcej czasu na dojrzewanie niż ryby kontrolne. Pomiar CT max ryb hodowanych w temperaturze 24 lub 28 stopni Celsjusza oraz narażenie na zanieczyszczenie 3, 4-DCA ujawniło, że nieregularne pływanie, zwiększony ruch wieczkowy i utrata zdolności do pozostania w pozycji grzbietowo-brzusznej w pozycji pionowej występowały w niższej temperaturze, gdy ryby były hodowane w temperaturze 24 stopni Celsjusza.
Po opanowaniu protokół ten, w tym wpływ na płodność, można zmierzyć w ciągu dwóch miesięcy. Aby zmierzyć wpływ na cały okres rozrodczy, a nawet na następne pokolenie, protokół może zostać przedłużony, ale nadal można go wykonać w ciągu sześciu miesięcy.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia biotest do zbadania wpływu czynników stresowych na rybę Turquoise killifish, Nothobranchius furzeri. Skupia się na cechach związanych z historią życia, takich jak śmiertelność, wzrost i płodność, dostarczając wglądu w ekotoksykologię.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Ekotoksykologia
- Nauki środowiskowe
- Biologia ryb
Tło
- Turquoise killifish ma szybki cykl życiowy, co sprawia, że nadaje się do badania wpływu czynników stresowych.
- Zrozumienie wpływu substancji toksycznych jest kluczowe dla oceny ryzyka środowiskowego.
- To badanie dotyczy zarówno ostrych, jak i przewlekłych efektów czynników stresowych.
- W badaniu uwzględniono również wielopokoleniowe skutki.
Cel badania
- Ocenić długoterminowe efekty substancji toksycznych na cechy związane z historią życia.
- Ocenić połączone efekty wielu czynników stresowych.
- Zgłębić zrozumienie wpływu środowiska na życie wodne.
Stosowane metody
- Ostre i przewlekłe biotesty z Nothobranchius furzeri.
- Ocenę śmiertelności, wzrostu i płodności.
- Ocenę krytycznej maksymalnej temperatury termicznej.
- Zastosowanie metody do różnych czynników stresowych, w tym promieniowania UV i zmian pH.
Główne wyniki
- Identyfikacja znaczących wpływów substancji toksycznych na wzrost i reprodukcję.
- Wgląd w odporność gatunku pod wpływem stresu.
- Dane wspierające wykorzystanie killifish jako organizmu modelowego w ekotoksykologii.
- Dowody wielopokoleniowych skutków czynników stresowych.
Wnioski
- Badanie zapewnia wartościową ramę dla badań ekotoksykologicznych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia wpływu zanieczyszczeń na środowisko.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych znaleziskach, aby zbadać dodatkowe czynniki stresowe.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The turquoise killifish model enables rapid assessment of toxicant effects on vertebrate life-history traits, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in environmental health research. Its short life cycle and dormant egg storage allow cost-efficient, scalable screening for predictive confidence in compound safety profiling. This approach aids portfolio triage by identifying biological risks associated with environmental exposures prior to downstream development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying impacts on maturation, growth, and fecundity as functional readouts of physiological stress.
- Operational Value: Enables biological de-risking through standardized measurement of mortality and sublethal endpoints across concentrations and time.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that disrupt critical life-history processes, informing go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing dose-response relationships for toxicant exposure.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through defined protocols for acute, chronic, and multigenerational testing.
- Scalability: Highlights screening readiness via dormant egg recruitment, eliminating need for continuous on-site culture and enabling platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance through assessment of combined stressor effects, such as toxicants and temperature, on fecundity and maturation.
- Preclinical Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation by measuring life-history traits predictive of population-level impacts.
- Risk-Adjusted Advancement: Addresses mechanistic de-risking by quantifying how stressors alter developmental timing and reproductive output.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification by providing quantitative, vertebrate-based readouts of stressor impact on conserved biological processes.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, or biological de-risking through measurement of maturation time, growth, and fecundity as integrative biomarkers of physiological status.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, or quantitative outputs via LC50 determination, size calibration, and egg counting under controlled exposure conditions.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions, including critical thermal maximum and coloration timing as proxies for physiological thresholds.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment by linking life-history disruptions to population fitness and multi-generational outcomes.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique through dormant egg banking and protocol adaptability across stressors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in vertebrate stress response.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability through defined exposure media, feeding regimens, and environmental controls.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by identifying hazards early in discovery.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative thresholds for mortality, growth inhibition, and fecundity reduction.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in vertebrate husbandry, ecotoxicology, and life-history trait measurement.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include temperature-controlled incubators, imaging systems for size calibration, and water baths for CT max assays.
- Cross-team standardization requirements for feeding schedules, exposure medium preparation, and blind scoring of maturation and fecundity endpoints.
- Adaptation considerations across model systems, including sensitivity to handling, water quality, and thermal history.
- Practical limitations supported by source material: challenges in working with a new model system, unknown sensitivity to many pollutants, and variability introduced by individual handling or environmental fluctuations.
