Analiza utraty funkcji za pośrednictwem CRISPR w komórkach ziarnistych móżdżku przy użyciu transferu genów opartego na elektroporacji in utero

Ogólnym celem tego opartego na elektroporacji podejścia do transferu genów in vivo jest ocena roli genów będących przedmiotem zainteresowania w różnicowaniu komórek ziarnistych móżdżku za pomocą analiz utraty funkcji za pośrednictwem CRISPR. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w neuronaukach rozwojowych i neuroonkologiach, takich jak identyfikacja cząsteczek ważnych dla prawidłowego rozwoju móżdżku i powstawania guzów mózgu. Procedura elektroporacji wewnątrzmacicznej zostanie zademonstrowana przez dr Lenę Herbst, doktora habilitowanego z laboratorium profesora Petera Lichtera, a następnie następująca immunohistochemia zostanie przeprowadzona przez dr Weijun Feng, doktora habilitowanego z laboratorium dr Haikun Di.

Główną zaletą tej metody jest dążenie do praktycznego wyeliminowania interesujących genów w komórkach móżdżku przy użyciu technologii CRISPR-cas9, zamiast generowania kombinacji zwierząt z nokautem. Chociaż metoda ta może dać wgląd w funkcje genów podczas normalnego rozwoju móżdżku, może być również stosowana do innych systemów, takich jak rozwój innych fizycznych obszarów mózgu i modelowanie guza mózgu. Zacznij od załadowania kapilary ze szkła borokrzemianowego do ściągacza do mikropipet i pociągnięcia, aby uzyskać cienką końcówkę.

Oznacz końcówkę kapilary czarnym tuszem, aby uzyskać lepszą wizualizację podczas wstrzykiwania, a następnie narysuj skalę na szkle. Pracując pod mikroskopem stereoskopowym, użyj linijki i ostrej pęsety igłowej, aby przyciąć końcówkę na długość około sześciu milimetrów i stworzyć ostrą, jednostronnie ściętą krawędź. Przefiltruj 1% szybki zielony roztwór podstawowy przez filtr punktu zerowego o średnicy 22 mikronów, aby usunąć cząsteczki barwnika z roztworu.

Wymieszaj plazmidy RNA z pojedynczym przewodnikiem w równych częściach z plazmidem reporterowym lucyferazy do końcowego stężenia co najmniej jednego mikrograma na mililitr dla każdego plazmidu. Pokoloruj roztwór plazmidu szybką zielenią o końcowym stężeniu 0,5%Po znieczuleniu ciężarnej myszy CD-1 izofluranem, połóż mysz na plecach na poduszce grzewczej i podaj środek przeciwbólowy. Zastosuj maść do oczu, aby zapobiec suchości oczu podczas zabiegu.

Przymocuj soczewkę taśmą i wysterylizuj brzuch środkiem dezynfekującym. Przykryj mysz gazą, pozostawiając odsłonięte tylko obszar chirurgiczny. Po wykonaniu nacięcia skóry o długości około dwóch centymetrów zlokalizuj linea alba i użyj nożyczek do tkanek, aby wykonać nieco mniejsze drugie nacięcie przez otrzewną.

Zwilż otwartą jamę brzuszną wstępnie podgrzanym sterylnym PBS. Następnie za pomocą kleszczy pierścieniowych ostrożnie wyciągnij rogi macicy z jamy brzusznej. Chwyć ścianę macicy w szczelinie między woreczkami żółtkowymi dwóch sąsiednich zarodków i delikatnie pociągnij.

Unikaj wywierania nacisku na zarodek podczas przeciągania go przez nacięcie. Po usunięciu rogów macicy odessać około 10 do 15 mikrolitrów kolorowego roztworu plazmidu za pomocą przygotowanej szklanej kapilary. Podczas tego procesu unikaj pęcherzyków powietrza.

Delikatnie przytrzymaj zarodek kleszczami pierścieniowymi i zlokalizuj obszar szyi. Powoli penetruj grzbietową tyłomózgowie czubkiem szklanej naczynia włosowatego i przejdź do czwartej komory. Wstrzyknąć około jednego mikrolitra mieszanki plazmidów.

Upewnij się, że zabarwione DNA nie wyciekło z mózgu i jest widoczne jako struktura w kształcie rombu. Tutaj najważniejsze jest wypełnienie roztworem plazmidu całego obszaru czwartej komory, aby dostarczyć DNA również do dystalnej części zawiązka móżdżku. Jednocześnie upewnij się, że podczas tego procesu nie spowoduje to krwawienia.

Umieść platynową pęsetę, wyposażoną w płytki elektrodowe o średnicy pięciu milimetrów, bocznie nad głową zarodka, tak aby biegun ujemny zakrywał ucho, a biegun dodatni znajdował się w zawiązku móżdżku nad ścianą macicy i zastosuj elektryczne impulsy kwadratowe. Kiedy wszystkie zarodki zostaną poddane elektroporacji, ostrożnie umieść rogi macicy z powrotem w jamie brzusznej i wypełnij sterylnym PBS. Pozwól rogom macicy przesunąć się do naturalnej pozycji.

Wyłącz znieczulenie i umieść zwierzę brzuchem w dół w nowej klatce, aby mogło dojść do siebie. Przed kriosekcją utrwal móżdżek przez noc w pięciu mililitrach 4% PFA w PBS na mózg, w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieś utrwaloną móżdżek do dziesięciu mililitrów 30% sacharozy w PBS na mózg i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia, po opadnięciu tkanki na dno probówki, usuń mózgi z sacharozy i zanurz pozostały roztwór sacharozy w kawałku celulozowej bibuły filtracyjnej. Następnie zanurz każdy móżdżek w związku o optymalnej temperaturze cięcia w jednorazowej plastikowej formie i zamroź na suchym lodzie. Pokrój blok kriogeniczny na sekcje o grubości 10 mikronów za pomocą kriostatu i utrzymuj sekcje w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu użycia.

Gdy szkiełka będą gotowe do przejścia do barwienia immunologicznego, najpierw wysusz je w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie umyj je dwukrotnie przez 10 minut, za każdym razem w PBS. Zakreślić skrawki płynnym pisakiem blokującym i inkubować skrawki w roztworze blokującym przez godzinę w temperaturze pokojowej. Dodaj pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko cząsteczkom będącym przedmiotem zainteresowania w roztworze blokującym i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Umyć szkiełka preparatem 0,1% Triton zawierającym PBS trzy razy przez 10 minut każde. Następnie dodać przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem rozcieńczone w roztworze blokującym zawierającym DAPI i inkubować skrawki przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Umyj szkiełka w PBS-T trzy razy przez 10 minut za każdym razem, a następnie zamontuj szkiełka i utrzymuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu obrazowania.

Komórki hek293T stabilnie eksprymujące streptococcus pyogenes cas9 transfekowano plazmidami eksprymującymi i celującymi w sgRNA. Ekspresję GFP w żywych komórkach monitorowano za pomocą fluorescencyjnego aparatu do obrazowania komórek 48 godzin po transfekcji. Ten obraz przedstawia dotkniętą sekwencję sgRNA opartą na ekspresji GFP.

Obraz ten pokazuje brak ekspresji GFP wynikający z nieefektywnej sekwencji sgRNA. Obrazy te pokazują barwienie immunologiczne GFP, Ki67 i p27 w móżdżku z myszy knock-in p7-rosa26-LSL-cas9 z klapką kasetą zatrzymującą i dalszymi bicystronicznymi sekwencjami cas9 i EGFP, które poddano elektroporacji w E13.5 z kontrolnym sgRNA eksprymującym plazmid Cre. Przekrój jest barwiony przeciw DAPI.

Zauważ, że komórki wykazujące ekspresję GFP w zewnętrznej warstwie komórek ziarnistości oznaczone przez Ki67. Po opanowaniu tej operacji można ją wykonać w mniej niż 30 minut na mysz. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o bardzo ostrożnym obchodzeniu się z zarodkiem, zawsze używaniu naczyń włosowatych z ostrymi końcami oraz ustawieniu elektrod pod precyzyjnym kątem, aby zapewnić dostarczenie impulsów elektrycznych do dachu czwartej komory.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie nauk medycznych do zbadania czynników przyczynowych zaburzeń neurologicznych, w tym guzów mózgu w móżdżku myszy.