Name: Analiza utraty funkcji za pośrednictwem CRISPR w komórkach ziarnistych móżdżku przy użyciu transferu genów opartego na elektroporacji in utero (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj metodę CRISPR z elektroporacją in utero do analizy funkcji genów w komórkach ziarnistych móżdżku. Technika ta umożliwia badanie rozwoju móżdżku i modelowanie nowotworów mózgu u myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Laurze Sieber, Annie Neuerburg, Yassinowi Harimowi i Petrze Schroeter za pomoc techniczną. Dziękujemy również doktorom K. Reifenbergowi, K. Dellowi i P. Prücclowi za pomocną pomoc w eksperymentach na zwierzętach w DKFZ; Centra Obrazowania DKFZ i Centrum Obrazowania Carl Zeiss w DKFZ do obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej. Prace te były wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft, KA 4472/1-1 (do D.K.).

<ol><li>Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput%2C+High-Resolution+Mapping+of+Protein+Localization+in+Mammalian+Brain+by+In+Vivo+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing.</a> Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).</li>
<li>Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+CRISPR%2FCas9-mediated+tumour+suppressor+disruption+enables+versatile+brain+tumour+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling.</a> Nat Commun. 6, 7391(2015).</li>
<li>Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+and+transforming+neocortical+progenitors+by+CRISPR%2FCas9+gene+targeting+and+piggyBac+transposase+lineage+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling.</a> Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+nucleogenesis+by+precerebellar+neurons%3A+involvement+of+ventricle-directed%2C+radial+fibre-associated+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration.</a> Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).</li>
<li>Kawauchi, D., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+cascade+from+Math1+to+Mbh1+and+Mbh2+is+required+for+cerebellar+granule+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation.</a> Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).</li>
<li>Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+BarH1+confers+commissural+neuron+identity+on+dorsal+cells+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord.</a> Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).</li>
<li>Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+expression+in+postmitotic+neurons+by+an+in+vivo+electroporation-based+tetracycline+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system.</a> J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).</li>
<li>Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+MYC-driven+medulloblastoma+models+from+multiple+embryonic+cerebellar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells.</a> Oncogene. , (2017).</li>
<li>Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chd7+is+indispensable+for+mammalian+brain+development+through+activation+of+a+neuronal+differentiation+programme%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme.</a> Nat Commun. 8, 14758(2017).</li>
<li>Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
<li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).</li>
<li>Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mutant+mice+by+pronuclear+injection+of+circular+plasmid+expressing+Cas9+and+single+guided+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA.</a> Scientific Reports. 3, 3355(2013).</li>
<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Baumgart, J., Baumgart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortex-%2C+Hippocampus-%2C+Thalamus-%2C+Hypothalamus-%2C+Lateral+Septal+Nucleus-+and+Striatum-specific+In+Utero+Electroporation+in+the+C57BL%2F6+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse.</a> J Vis Exp. (107), e53303(2016).</li>
<li>Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+basis+of+cerebellar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular basis of cerebellar development.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Korzystając z elektroporacji egzomacicznej , wcześniej opisaliśmy analizy funkcjonalne in vivo Atoh1 oparte na siRNA na wczesnym etapie różnicowania komórek ziarnistych móżdżku8. Ze względu na rozcieńczenie/degradację siRNA i odsłonięcie zarodków poza ścianą macicy, analiza fenotypowa elektroporowanych komórek ziarnistych była ograniczona do stadiów embrionalnych. Obecna metoda umożliwiła jednak analizę fenotypu zwierząt po urodzeniu.
Nasze poprzednie ...

Choroby mózgu są jedną z najstraszniejszych chorób śmiertelnych. Często wynikają one z mutacji genetycznych i późniejszej dysregulacji. Aby zrozumieć molekularne mechanizmy chorób mózgu, nieustanne wysiłki zmierzające do rozszyfrowania genomów ludzkich pacjentów doprowadziły do odkrycia wielu potencjalnych genów sprawczych. Do tej pory genetycznie modyfikowane modele zwierzęce linii zarodkowej były wykorzystywane do analiz in vivo wzmocnienia funkcji (GOF) i utraty funkcji (LOF) takich genów kandydujących. Ze względu na przyspieszony rozwój funkcjonalnych badań walidacyjnych pożądany jest bardziej wykonalny i elastyczny system testów genowych in vivo do badania funkcji genów.
Zastosowanie systemu transferu genów opartego na elektroporacji in vivo do rozwijającego się mózgu myszy jest odpowiednie do tego celu. W rzeczywistości kilka badań wykorzystujących elektroporację in utero wykazało ich potencjał do przeprowadzania analiz funkcjonalnych w rozwijającym się mózgu1,2,3. W rzeczywistości kilka regionów mózgu myszy, takich jak kora mózgowa4, retina5, diencephalon6, hindbrain7, cerebellum8 i rdzeń kręgowy9 były do tej pory celem somatycznych metod dostarczania genów.
Rzeczywiście, przejściowa ekspresja genów metodą elektroporacji in vivo na embrionalnych mózgach myszy od dawna jest wykorzystywana do analizy GOF. Najnowsze technologie integracji genomowej oparte na transpozonach umożliwiły dalszą długoterminową i/lub warunkową ekspresję genów będących przedmiotem zainteresowania10,11, co jest korzystne dla analizy funkcji genów w sposób przestrzenny i czasowy podczas rozwoju. W przeciwieństwie do analizy GOF, analiza LOF była bardziej wymagająca. Chociaż przeprowadzono przejściową transfekcję siRNA i plazmidów przenoszących shRNA, długoterminowe efekty LOF genów nie są gwarantowane ze względu na ostateczną degradację egzogennie wprowadzonych kwasów nukleinowych, takich jak plazmidy i dsRNA. Jednak technologia CRISPR/Cas stanowi przełom w analizach LOF. Geny kodujące białka fluorescencyjne (np. GFP) lub białka bioluminescencyjne (np. lucyferaza świetlika) zostały połączone z CRISPR-Cas9 i sgRNA w celu znakowania komórek narażonych na mutacje somatyczne za pośrednictwem CRISPR-Cas9. Niemniej jednak podejście to może mieć ograniczenia w badaniach funkcjonalnych nad proliferującymi komórkami, ponieważ egzogenne geny markerowe są rozcieńczane i degradowane po długotrwałej proliferacji. Podczas gdy transfekowane komórki i ich komórki potomne przechodzą mutacje wywołane przez CRISPR w swoich genomach, ich ślady mogą z czasem zaginąć. W związku z tym metody znakowania genetycznego byłyby odpowiednie do przezwyciężenia tego problemu.
Niedawno opracowaliśmy metodę LOF opartą na CRISPR w komórkach ziarnistych móżdżku, które ulegają długotrwałej proliferacji podczas różnicowania12. Aby genetycznie znakować transfekowane komórki, skonstruowaliśmy plazmid przenoszący sgRNA wraz z Cre i wprowadziliśmy plazmid do móżdżku myszy Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP myszy13 za pomocą elektroporacji w macicy. W przeciwieństwie do zwykłych wektorów plazmidowych kodujących EGFP, podejście to z powodzeniem znakowało transfekowane prekursory neuronów ziarnistych (GNP) i ich komórki potomne. Metoda ta stanowi duże wsparcie w zrozumieniu funkcji in vivo genów będących przedmiotem zainteresowania w proliferacji komórek w prawidłowym rozwoju mózgu i tle podatnym na nowotwory.

<table><tbody><tr><td>Alexa 488 Koza anty-kurczak</td><td>ThermoFisher</td><td>A11039</td><td>1:400 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Alexa 568 Donkey anti-Mouse</td><td>Life Technologies</td><td>A-10037</td><td>1:400 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Alexa 594 Donkey anty-Rabbit</td><td>ThermoFisher</td><td>A21207</td><td>1:400 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Alexa 647 Donkey anti-Rabbit</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td>1:400 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Alkaliczne Fosfataza (FastAP)</td><td>ThermoFisher</td><td>EF0654</td><td></td></tr><tr><td>Taśma autoklawu</td><td>Kisker Biotech</td><td>150262</td><td></td></tr><tr><td>BamHI (HF)</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>BbsI (FastDigest)</td><td>ThermoFisher</td><td>FD1014</td><td></td></tr><tr><td>Celulozowa bibuła filtracyjna (Whatman)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10347525</td><td></td></tr><tr><td>Tkanina</td><td>Tork</td><td>530378</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>biovision</td><td>7903-1</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>Jednorazowe formy plastikowe (Tissue-Tek Cyromold)</td><td>VWR</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Glutamax</td><td>ThermoFisher</td><td>31966047</td><td></td></tr><tr><td>Serum</td> <td>osłaSigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI (HF)</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Electro Square Porator</td><td>BTX</td><td>ECM830</td><td></td></tr><tr><td>Endofree Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>107017</td><td></td></tr><tr><td>Maść do oczu (Bepanthen)</td><td>Bayer</td><td>81552983</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Merck</td><td>104022</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10270-016</td><td></td></tr><tr><td>Filtr (0,22 &mikro; m)</td> <td>Merck</td><td>F8148</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny aparat do obrazowania komórek (ZOE)</td><td>Biorad</td><td>1450031</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze proste</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Gaza (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15387311</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>1:1000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611S Szklana</td><td></td></tr><tr><td>kapilara z żarnikiem</td><td>Narishige</td><td>GD1-2</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>ThermoLux</td><td>463265 / -67</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu (ImageJ i Fidżi)</td><td></td>Strzykawka <td>insulinowa NIH</td><td></td></tr> <tr><td>(B. Braun OMNICAN U-100)</td><td>Carl Roth</td><td>AKP0.1</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Zoetis</td><td>TU061219</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina LT Series III Suwmiarka</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS136331</td><td></td></tr><tr><td>Igły do szwów Kalt</td><td>Narzędzia do nauki</td> precyzyjnej <td>12050-02</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HIFI HOTSTART READY mix</td><td>Przeciwciało Kapa Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>1:500 Rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Wskaźnik świetlny</td><td>Photonic</td><td>PL3000</td><td></td></tr><tr><td>Długopis blokujący ciecz</td><td>Kisker Biotech</td><td>MKP-1</td><td></td></tr><tr><td>Metamizol</td><td>WDT-Microgrinder</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Narishige</td><td>EG-45</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz</td><td>Narishige</td><td>IM300</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument Co.</td>Oprogramowanie mikroskopu <td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>ZEN</td><td></td><td></td> Zeiss-Niesterylna <td></td></tr><tr><td>nić do szwów jedwabnych (0,12 mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>Związek O.C.T. (Tissue-Tek)</td><td>VWR</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>p27 przeciwciało</td><td>BD bioscience</td><td>610241</td><td>Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Roth</td><td>335,3</td><td></td></tr><tr><td>PBS ( 1x)</td> <td>Life Technologies</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-EGxxFP</td><td>Addgene</td><td>50716</td><td></td></tr><tr><td>Polietyleninica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>plazmid pX330</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do szybkiego podwiązywania NEB</td><td></td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze pierścieniowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Slajdy (SuperFrost)</td><td>ThermoFisher</td><td>10417002</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do biostatystyki (Prism 7)</td><td>Oprogramowanie GraphPad,</td> <td>Inc-Spitacid</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>EcoLab</td><td>3003840</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>C-PS</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne z końcówką</td><td>Fine Science Tools</td><td>14072-10</td><td></td></tr><tr><td>Szew (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0))</td><td>SMI</td><td>220340</td><td></td></tr><tr><td>T4 Bufor do ligacji DNA</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do tkanek Blunt (11,5 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14072-10</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało TOP2B</td><td>Santa Cruz</td><td>sc13059</td><td>Trypsyna w rozcieńczeniu 1:200</td></tr><tr><td>(2,5%)</td><td>Pęseta ThermoFisher</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>z elektrodami dyskowymi 5 mm i Oslash Platinum</td><td>Xceltis GmbH</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>Waporyzator</td><td>Dr&auml; gerwerk AG</td><td>GS186</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

analiza utraty funkcji za pośrednictwem crispr w komórkach ziarnistych móżdżku przy użyciu transferu genów opartego na elektroporacji in utero

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Wady rozwojowe mózgu są często spowodowane mutacjami genetycznymi. Rozszyfrowanie mutacji w tkankach pochodzących od pacjentów pozwoliło zidentyfikować potencjalne czynniki sprawcze chorób. Aby potwierdzić wkład dysfunkcji zmutowanych genów w rozwój choroby, jednym z oczywistych podejść jest generowanie modeli zwierzęcych zawierających mutacje. Chociaż genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM) są popularnymi narzędziami biologicznymi i dają powtarzalne wyniki, są ograniczone czasem i kosztami. Tymczasem GEMM niepochodzące od linii zarodkowej często umożliwiają badanie funkcji genów w bardziej realny sposób. Ponieważ niektóre choroby mózgu (np. guzy mózgu) wydają się wynikać z mutacji somatycznych, ale nie mutacji linii zarodkowej, chimeryczne modele myszy niezwiązane z linią zarodkową, w których współistnieją normalne i nieprawidłowe komórki, mogą być pomocne w analizie istotnej dla choroby. W tym badaniu przedstawiamy metodę indukcji mutacji somatycznych w móżdżku, w których pośredniczy CRISPR. W szczególności wykorzystaliśmy warunkowe myszy knock-in, w których Cas9 i GFP są przewlekle aktywowane przez promotor CAG (wzmacniacz CMV / ß-aktyna kurczaka) po rekombinacji genomu za pośrednictwem Cre. Samodzielnie zaprojektowane jednoprzewodnikowe RNA (sgRNA) i sekwencja rekombinazy Cre, obie zakodowane w pojedynczym konstrukcie plazmidowym, zostały dostarczone do komórek macierzystych / progenitorowych móżdżku w stadium embrionalnym za pomocą elektroporacji in utero. W związku z tym transfekowane komórki i ich komórki potomne znakowano zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP), co ułatwiło dalsze analizy fenotypowe. W związku z tym metoda ta nie tylko pokazuje dostarczanie genów do embrionalnych komórek móżdżku w oparciu o elektroporację, ale także proponuje nowatorskie podejście ilościowe do oceny fenotypów utraty funkcji, w których pośredniczy CRISPR.

W przypadku funkcjonalnej analizy in vivo kluczowe jest zidentyfikowanie komórek, do których wprowadzono egzogenne geny. Choć ekspresję markera, takiego jak GFP w komórkach nieproliferujących, można śledzić przez długi czas, sygnał ten jest stopniowo tracony w komórkach proliferujących. Ilustracja tego efektu została przedstawiona na Rysunku 1. Aby zapobiec utracie śladu komórek przetransfekowanych w analizach LOF, opracowaliśmy nowatorskie podejście...

Konwencjonalne badania utraty funkcji genów przy użyciu zwierząt nokautujących często były kosztowne i czasochłonne. Mutageneza somatyczna oparta na CRISPR oparta na elektroporacji jest potężnym narzędziem do zrozumienia funkcji genów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy metodę analizy fenotypów nokautu w proliferujących komórkach móżdżku.

Analiza utraty funkcji za pośrednictwem CRISPR w komórkach ziarnistych móżdżku przy użyciu transferu genów opartego na elektroporacji in utero

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Ogólnym celem tego opartego na elektroporacji podejścia do transferu genów in vivo jest ocena roli genów będących przedmiotem zainteresowania w różnicowaniu komórek ziarnistych móżdżku za pomocą analiz utraty funkcji za pośrednictwem CRISPR. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w neuronaukach rozwojowych i neuroonkologiach, takich jak identyfikacja cząsteczek ważnych dla prawidłowego rozwoju móżdżku i powstawania guzów mózgu. Procedura elektroporacji wewnątrzmacicznej zostanie zademonstrowana przez dr Lenę Herbst, doktora habilitowanego z laboratorium profesora Petera Lichtera, a następnie następująca immunohistochemia zostanie przeprowadzona przez dr Weijun Feng, doktora habilitowanego z laboratorium dr Haikun Di.Główną zaletą tej metody jest dążenie do praktycznego wyeliminowania interesujących genów w komórkach móżdżku przy użyciu technologii CRISPR-cas9, zamiast generowania kombinacji zwierząt z nokautem. Chociaż metoda ta może dać wgląd w funkcje genów podczas normalnego rozwoju móżdżku, może być również stosowana do innych systemów, takich jak rozwój innych fizycznych obszarów mózgu i modelowanie guza mózgu. Zacznij od załadowania kapilary ze szkła borokrzemianowego do ściągacza do mikropipet i pociągnięcia, aby uzyskać cienką końcówkę.Oznacz końcówkę kapilary czarnym tuszem, aby uzyskać lepszą wizualizację podczas wstrzykiwania, a następnie narysuj skalę na szkle. Pracując pod mikroskopem stereoskopowym, użyj linijki i ostrej pęsety igłowej, aby przyciąć końcówkę na długość około sześciu milimetrów i stworzyć ostrą, jednostronnie ściętą krawędź. Przefiltruj 1% szybki zielony roztwór podstawowy przez filtr punktu zerowego o średnicy 22 mikronów, aby usunąć cząsteczki barwnika z roztworu.Wymieszaj plazmidy RNA z pojedynczym przewodnikiem w równych częściach z plazmidem reporterowym lucyferazy do końcowego stężenia co najmniej jednego mikrograma na mililitr dla każdego plazmidu. Pokoloruj roztwór plazmidu szybką zielenią o końcowym stężeniu 0,5%Po znieczuleniu ciężarnej myszy CD-1 izofluranem, połóż mysz na plecach na poduszce grzewczej i podaj środek przeciwbólowy. Zastosuj maść do oczu, aby zapobiec suchości oczu podczas zabiegu.Przymocuj soczewkę taśmą i wysterylizuj brzuch środkiem dezynfekującym. Przykryj mysz gazą, pozostawiając odsłonięte tylko obszar chirurgiczny. Po wykonaniu nacięcia skóry o długości około dwóch centymetrów zlokalizuj linea alba i użyj nożyczek do tkanek, aby wykonać nieco mniejsze drugie nacięcie przez otrzewną.Zwilż otwartą jamę brzuszną wstępnie podgrzanym sterylnym PBS. Następnie za pomocą kleszczy pierścieniowych ostrożnie wyciągnij rogi macicy z jamy brzusznej. Chwyć ścianę macicy w szczelinie między woreczkami żółtkowymi dwóch sąsiednich zarodków i delikatnie pociągnij.Unikaj wywierania nacisku na zarodek podczas przeciągania go przez nacięcie. Po usunięciu rogów macicy odessać około 10 do 15 mikrolitrów kolorowego roztworu plazmidu za pomocą przygotowanej szklanej kapilary. Podczas tego procesu unikaj pęcherzyków powietrza.Delikatnie przytrzymaj zarodek kleszczami pierścieniowymi i zlokalizuj obszar szyi. Powoli penetruj grzbietową tyłomózgowie czubkiem szklanej naczynia włosowatego i przejdź do czwartej komory. Wstrzyknąć około jednego mikrolitra mieszanki plazmidów.Upewnij się, że zabarwione DNA nie wyciekło z mózgu i jest widoczne jako struktura w kształcie rombu. Tutaj najważniejsze jest wypełnienie roztworem plazmidu całego obszaru czwartej komory, aby dostarczyć DNA również do dystalnej części zawiązka móżdżku. Jednocześnie upewnij się, że podczas tego procesu nie spowoduje to krwawienia.Umieść platynową pęsetę, wyposażoną w płytki elektrodowe o średnicy pięciu milimetrów, bocznie nad głową zarodka, tak aby biegun ujemny zakrywał ucho, a biegun dodatni znajdował się w zawiązku móżdżku nad ścianą macicy i zastosuj elektryczne impulsy kwadratowe. Kiedy wszystkie zarodki zostaną poddane elektroporacji, ostrożnie umieść rogi macicy z powrotem w jamie brzusznej i wypełnij sterylnym PBS. Pozwól rogom macicy przesunąć się do naturalnej pozycji.Wyłącz znieczulenie i umieść zwierzę brzuchem w dół w nowej klatce, aby mogło dojść do siebie. Przed kriosekcją utrwal móżdżek przez noc w pięciu mililitrach 4% PFA w PBS na mózg, w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieś utrwaloną móżdżek do dziesięciu mililitrów 30% sacharozy w PBS na mózg i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia, po opadnięciu tkanki na dno probówki, usuń mózgi z sacharozy i zanurz pozostały roztwór sacharozy w kawałku celulozowej bibuły filtracyjnej. Następnie zanurz każdy móżdżek w związku o optymalnej temperaturze cięcia w jednorazowej plastikowej formie i zamroź na suchym lodzie. Pokrój blok kriogeniczny na sekcje o grubości 10 mikronów za pomocą kriostatu i utrzymuj sekcje w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu użycia.Gdy szkiełka będą gotowe do przejścia do barwienia immunologicznego, najpierw wysusz je w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie umyj je dwukrotnie przez 10 minut, za każdym razem w PBS. Zakreślić skrawki płynnym pisakiem blokującym i inkubować skrawki w roztworze blokującym przez godzinę w temperaturze pokojowej. Dodaj pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko cząsteczkom będącym przedmiotem zainteresowania w roztworze blokującym i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Umyć szkiełka preparatem 0,1% Triton zawierającym PBS trzy razy przez 10 minut każde. Następnie dodać przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem rozcieńczone w roztworze blokującym zawierającym DAPI i inkubować skrawki przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Umyj szkiełka w PBS-T trzy razy przez 10 minut za każdym razem, a następnie zamontuj szkiełka i utrzymuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu obrazowania.Komórki hek293T stabilnie eksprymujące streptococcus pyogenes cas9 transfekowano plazmidami eksprymującymi i celującymi w sgRNA. Ekspresję GFP w żywych komórkach monitorowano za pomocą fluorescencyjnego aparatu do obrazowania komórek 48 godzin po transfekcji. Ten obraz przedstawia dotkniętą sekwencję sgRNA opartą na ekspresji GFP.Obraz ten pokazuje brak ekspresji GFP wynikający z nieefektywnej sekwencji sgRNA. Obrazy te pokazują barwienie immunologiczne GFP, Ki67 i p27 w móżdżku z myszy knock-in p7-rosa26-LSL-cas9 z klapką kasetą zatrzymującą i dalszymi bicystronicznymi sekwencjami cas9 i EGFP, które poddano elektroporacji w E13.5 z kontrolnym sgRNA eksprymującym plazmid Cre. Przekrój jest barwiony przeciw DAPI.Zauważ, że komórki wykazujące ekspresję GFP w zewnętrznej warstwie komórek ziarnistości oznaczone przez Ki67. Po opanowaniu tej operacji można ją wykonać w mniej niż 30 minut na mysz. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o bardzo ostrożnym obchodzeniu się z zarodkiem, zawsze używaniu naczyń włosowatych z ostrymi końcami oraz ustawieniu elektrod pod precyzyjnym kątem, aby zapewnić dostarczenie impulsów elektrycznych do dachu czwartej komory.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie nauk medycznych do zbadania czynników przyczynowych zaburzeń neurologicznych, w tym guzów mózgu w móżdżku myszy.

crispr-mediated-loss-function-analysis-cerebellar-granule-cells-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

In utero elektroporacja jest cenną metodą transfekcji neuronalnych komórek progenitorowych in vivo. W zależności od rozmieszczenia elektrod oraz momentu rozwojowego przeprowadzenia elektroporacji, można ukierunkować proces na określone podgrupy komórek kory mózgowej. Następnie komórki docelowe można analizować in vivo lub in vitro pod kątem efektów modyfikacji genetycznych.

Elektroporacja in utero z następującą po niej pierwotną hodowlą neuronów w celu badania funkcji genów w podzbiorze neuronów korowych

In utero elektroporacja umożliwia szybkie dostarczanie genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo do rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W niniejszej pracy opisujemy wysoce adaptowalny protokół elektroporacji in utero, który może być wykorzystany do dostarczania konstruktów ekspresyjnych do wielu embrionalnych domen OUN, w tym do telencefalonu, diencefalonu i siatkówki.

Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Ten film demonstruje dostarczanie plazmidowego DNA do komórek neuronalnych móżdżku mysich zarodków za pomocą elektroporacji in utero. Metoda ta jest przydatna do zrozumienia funkcji genów in vivo w prawidłowym rozwoju mózgu oraz zmian w ekspresji genów komórek neuronalnych podczas progresji guza.

Dostarczanie genów oparte na elektroporacji in utero: technika wstrzykiwania plazmidowego DNA do embrionalnych komórek móżdżku mysich zarodków

W tym filmie wykonujemy elektroporację wycinków móżdżku zarodka pisklęcia za pomocą plazmidów genu reporterowego. Technika ta ułatwia wizualizację rozwoju i migracji prekursorów komórek ziarnistych do postaci warstwy ziarnistej.

Elektroporacja ex vivo wycinków móżdżku zarodka pisklęcia: metoda wprowadzania plazmidowego DNA kodującego zielone białko fluorescencyjne w celu wizualizacji rozwoju komórek ziarnistych

Morfogeneza i migracja neuronów są kluczowymi wydarzeniami leżącymi u podstaw prawidłowego rozwoju mózgu. W tym miejscu opisujemy metody genetycznej manipulacji hodowanymi neuronami ziarnistymi móżdżku i rozwijającym się móżdżkiem w celu oceny morfologii i cech migracyjnych neuronów.

Manipulacja genetyczna neuronów ziarnistych móżdżku in vitro i in vivo w celu zbadania morfologii i migracji neuronów

Migracja neuronów jest regulowana przez liczne czynniki autonomiczne i nieautonomiczne komórki.  Protokół ten pokazuje, w jaki sposób można wykorzystać elektroporację in utero do określenia, czy fenotyp u myszy transgenicznej jest spowodowany zakłóceniem wewnętrznego mechanizmu komórki lub upośledzeniem interakcji między neuronem a jego środowiskiem.

Indukcja delecji białka poprzez elektroporację in utero w celu zdefiniowania deficytów w migracji neuronów w modelach transgenicznych

Zewnętrzna warstwa granulatu móżdżku jest miejscem największego wzmocnienia tranzytu w rozwijającym się mózgu. W tym miejscu przedstawiamy protokół ukierunkowany na modyfikację genetyczną tej warstwy w szczycie proliferacji przy użyciu elektroporacji ex vivo i hodowli plastrów móżdżku z embrionalnych zarodków piskląt dnia 14.

Ex vivo Hodowla wycinków móżdżku piskląt i przestrzennie ukierunkowana elektroporacja prekursorów komórek ziarnistych

Okołokomorowa heterotopia guzkowa (PNH) jest najczęstszą formą wady rozwojowej kory mózgowej (MCD) w wieku dorosłym, ale jej podłoże genetyczne pozostaje nieznane w większości sporadycznych przypadków. Niedawno opracowaliśmy strategię identyfikacji nowych genów kandydujących do MCD i bezpośredniego potwierdzenia ich przyczynowej roli in vivo.

Nowatorska strategia łącząca macierz CGH, sekwencjonowanie całego eksomu i elektroporację in utero u gryzoni w celu identyfikacji genów odpowiedzialnych za wady rozwojowe mózgu

Autonomiczne funkcje genów w mózgu mogą być badane poprzez wywoływanie utraty lub utraty funkcji w rzadkich populacjach komórek. Tutaj opisujemy elektroporację in utero w celu dostarczenia rekombinazy Cre do rzadkich populacji rozwijających się neuronów korowych z floksowanymi genami, aby spowodować utratę funkcji in vivo.

Indukowanie rekombinacji Cre-lox w korze mózgowej myszy poprzez elektroporację in utero

Tutaj opisujemy metodę wizualizacji synaptogenezy ziarnistych neuronów w móżdżku myszy w trakcie poporodowego rozwoju mózgu, kiedy te komórki udoskonalają swoje struktury synaptyczne i tworzą synapsy, aby zintegrować się z ogólnym obwodem mózgu.

Wykorzystanie elektroporacji poporodowej in vivo do badania morfologii neuronów ziarnistych móżdżku i rozwoju synaps

Tutaj opisujemy prostą technikę przeznaczoną do efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy o nazwie CRISPR RNP Electroporation of Zygot (CRISPR-EZ). Metoda ta zapewnia edycję odczynników poprzez elektroporację do zarodków z wydajnością bliską 100%. Protokół ten jest skuteczny w przypadku mutacji punktowych, małych insercji genomowych i delecji w zarodkach ssaków.

Wydajna edycja genomu myszy za pomocą elektroporacji zygot CRISPR

Poznaj metodę CRISPR z elektroporacją in utero do analizy funkcji genów w komórkach ziarnistych móżdżku. Technika ta umożliwia badanie rozwoju móżdżku i modelowanie nowotworów mózgu u myszy.

Analiza utraty funkcji za pośrednictwem CRISPR w komórkach ziarnistych móżdżku przy użyciu transferu genów opartego na elektroporacji in utero (Wideo) | JoVE Journal

Analiza utraty funkcji za pośrednictwem CRISPR w komórkach ziarnistych móżdżku przy użyciu transferu genów opartego na elektroporacji in utero

Przeglądaj więcej filmów