Gel-seq: metoda jednoczesnego przygotowania biblioteki sekwencjonowania DNA i RNA przy użyciu matryc hydrożelowych
March 26th, 2018
Gel-seq umożliwia badaczom jednoczesne przygotowanie bibliotek dla sekwencji DNA i RNA przy znikomych dodatkowych kosztach, zaczynając od 100 - 1000 komórek za pomocą prostego urządzenia hydrożelowego. W artykule przedstawiono szczegółowe podejście do wytwarzania urządzenia, a także protokół biologiczny do generowania sparowanych bibliotek
.Ogólnym celem tego eksperymentu jest wygenerowanie bibliotek sekwencjonowania nowej generacji zarówno z DNA, jak i RNA małych populacji komórek bez dzielenia próbki w dowolnym momencie. Metoda ta zapewnia naukowcom nowe podejście do badania strukturalnych zmian DNA w ekspresji genów. Kiedy po raz pierwszy wymyśliliśmy Gel-seq, nie było żadnych protokołów jednoczesnego sekwencjonowania zarówno DNA, jak i RNA z tej samej próbki.
Na szczęście obecnie istnieją trzy opublikowane podejścia, które rozwiązują ten problem. Główną zaletą tej techniki jest to, że zarówno informacje genomiczne, jak i transkryptomiczne można uzyskać z tego samego zestawu komórek przy znikomych kosztach dodatkowych. Gel-seq został pierwotnie opracowany z kasetami pionowymi, jednak protokół ten można dostosować do pracy z dowolną standardową kasetą do elektroforezy żelowej.
Przygotuj wypełniacz, mieszaniny prekursorów o wysokiej i niskiej gęstości w trzech probówkach. Dodaj odczynniki w opisanej kolejności i zmieszaj mieszaninę. Nie dodawaj przedwcześnie ani APS, ani Temed.
Poczekaj, aż zostaniesz skierowany. Następnie odgazuj każdy roztwór monomeru żelowego, najpierw wprowadzając igłę przez nasadkę. Następnie podłączamy igłę do domowej linii próżniowej i zanurzamy ten zespół w kąpieli ultradźwiękowej.
Odczekaj około minuty, aż z płynu nie pojawią się już bąbelki. Następnie do mieszaniny prekursorów wypełniacza dodać Temed i APS i krótko odwirować. W ciągu trzech minut użyj pipety o długości jednego milimetra, aby dodać sześć milimetrów do każdej kasety z żelem bez rozlewania.
Upewnij się, że płyn jest wypoziomowany, ustawiając kasety pionowo na równym stole. Następnie stopniowo uzupełniaj kasety odgazowaną, zjonizowaną wodą, uważając, aby zminimalizować mieszanie się mieszaniny polimeryzującej z wodą. Następnie pozostaw polimer do utwardzenia przez godzinę lub noc.
Po utwardzeniu polimeru wylej nakładkę wodną i z odległości sześciu cali użyj delikatnego strumienia sprężonego powietrza, aby wysuszyć powierzchnię żelu. Następnie dodaj Temed i APS do prekursora żelu o wysokiej gęstości i krótko wiruj. W ciągu trzech minut przenieś 320 mikrolitrów do każdej kasety i rozprowadź ją na warstwie żelu wypełniającego, kilkakrotnie kołysząc kasetą w przód iw tył.
Następnie uzupełnij kasety dejonizowaną, odgazowaną wodą i pozwól polimerowi utwardzić się przez około godzinę. Po utwardzeniu wysuszyć polimer jak poprzednio. Na koniec dodaj Temed i APS do mieszaniny prekursorów żelu o niskiej gęstości i zwiruj.
Następnie szybko napełnij pozostałą część kaset tą mieszanką i włóż grzebienie żelowe, zanim zacznie się utwardzać. Teraz dodaj nadmiar prekursora rezerwowego na grzebień, który ma być zaadsorbowany podczas polimeryzacji. Po utwardzeniu kaseta jest gotowa do użycia.
Po przekształceniu RNA w cDNA użyj żelu, aby odzyskać interesującą frakcję. Najpierw dokładnie wyczyść komorę elektroforezy za pomocą kilku mililitrów produktu do usuwania DNA i niestrzępiącej się chusteczki. Następnie napełnij komorę czystym XTBE w punkcie zerowym i umieść całe urządzenie w 254-nanometrowym piecu sieciującym UV i sterylizuj przez 15 minut.
Teraz włóż kasetę Gel-seq do komory elektroforezy i zablokuj ją na miejscu. Następnie powoli wyjmij grzebień żelowy, delikatnie pociągając do góry, nie rozrywając żelu. Teraz załaduj próbki za pomocą pipety.
Podczas ładowania próbek należy całkowicie włożyć końcówkę do studzienek, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia między studzienkami. Zastosuj pole elektryczne o napięciu 250 woltów na kasecie Gel-seq przez 30 minut, aby oddzielić gDNA od hybryd cDNA / RNA. Po załadowaniu, uruchomieniu i zebraniu żelu użyj skalpela, aby przeciąć żel na pół tuż pod warstwą o dużej gęstości i wyrzuć połowę żelu wypełniającego.
Następnie delikatnie oderwij pozostały żel z kasety, ostrożnie używając narzędzia do skrobania. Po sprawdzeniu separacji za pomocą żelu doc, użyj transiluminatora do wycięcia pasm. GDNA powinno znajdować się na początku żelu o niskiej gęstości, a cDNA powinno znajdować się na styku regionów o niskiej i wysokiej gęstości.
Teraz użyj skalpela, aby wyciąć obszary żelu zawierającego gDNA i cDNA. Należy również usunąć te same sekcje z pasa kontroli ujemnej. Za pomocą pęsety delikatnie przenieś fragmenty żelu do tubek paskowych.
Jeśli żel pęknie, znajdź i przenieś wszystkie uszkodzone kawałki do tuby. Następnie zmiel każdy żel okrężnymi ruchami i dociskając końcówką pipety. Przed usunięciem końcówek dodaj 40 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do gDNA i 80 mikrolitrów do próbek cDNA.
Następnie ostrożnie wyjmij i wyrzuć końcówki. Teraz przymocuj probówki paskowe do mieszalnika wirowego w temperaturze 37 stopni Celsjusza i potrząsaj nimi przez osiem do 12 godzin. W ten sposób DNA wydostanie się z żelu.
Po wstrząśnięciu odpipetować próbki do płytki filtracyjnej o siatce ośmiu mikronów. Następnie obracać płytkę o masie 2 600 g przez pięć minut, aby odcedzić fragmenty żelu. Następnie podnieś siatkową płytkę filtracyjną z płytki obudowy i za pomocą pipety przenieś próbki bez żelu z płytki do nowych probówek paskowych o pojemności 200 mikrolitrów.
Do każdej próbki zawierającej gDNA dodaj jeden mikrolitr proteazy i pipetuj w górę iw dół, aby dobrze wymieszać. Następnie inkubować próbki w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie włącz ogrzewanie w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 15 minut.
Ten etap zubożenia nukleosomów ma kluczowe znaczenie. Następnie użyj igły o rozmiarze 18, aby zrobić otwór w nasadce każdej probówki z próbką. Następnie użyj próżni, aby zredukować próbki gDNA do pięciu mikrolitrów, a próbki cDNA do 10 mikrolitrów.
Jeśli objętość spadnie poniżej celu, w razie potrzeby dodaj wodę wolną od nukleaz. Hybrydy gDNA i cDNA/RNA zostały fizycznie oddzielone za pomocą urządzenia Gel-seq. Kontrola ujemna nie ma autofluorescencji żelu na granicy faz.
Drabinki DNA pokazują tylko ciemny pas na granicy faz między błonami o niskiej i wysokiej gęstości, ujawniając, że małe fragmenty mogą przechodzić przez żel o niskiej gęstości. Próbka biologiczna z 500 komórek PC3 wykazuje pożądaną separację genomowego DNA i hybryd cDNA/RNA. Ciemne pasmo na górze błony o niskiej gęstości to genomowe DNA w skali megazasadowej, podczas gdy hybrydy cDNA / RNA są ułożone na granicy regionów o niskiej i wysokiej gęstości.
Małe fragmenty par zasad poniżej 100 są produktami docelowymi generowanymi z oligonukleotydów starterowych podczas odwrotnej transkrypcji i należy się ich spodziewać. Biblioteki zostały wygenerowane z 500 komórek PC3 lub 750 ogniw HeLa. Dystrybucje fragmentów z dopasowanych bibliotek wygenerowanych za pomocą Gel-seq porównano z niedopasowanymi próbkami wygenerowanymi za pomocą standardowych protokołów.
Rozkład fragmentów nukleotydów był podobny w obu metodach. Wyniki sekwencjonowania biblioteki komórek PC3 porównano z tradycyjnymi metodami. Porównano wariacje liczby kopii w całym genomie.
Statystycznie obie metody przyniosły podobne wyniki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować sparowane biblioteki sekwencjonowania nowej generacji zarówno dla DNA, jak i RNA z tej samej próbki początkowej. Podobnie jak w przypadku każdego eksperymentu z sekwencjonowaniem przy niskich nakładach, należy pamiętać o utrzymaniu czystego środowiska pracy.
Należy zwrócić szczególną uwagę na probówki do sterylizacji i rękawice do czyszczenia. Nawet przy tych środkach ostrożności eksperymenty czasami kończą się niepowodzeniem z powodu zanieczyszczenia. Ważna uwaga, wszechobecność i bezpieczeństwo żeli poliakrylamidowych sprawia, że łatwo zapomnieć, że prekursory produkcji są niebezpiecznymi neurotoksynami.
Należy zawsze pracować z tymi odczynnikami w dygestoriach i natychmiast usunąć wszelkie rozlane płyny. Zaprojektowaliśmy Gel-seq tak, aby był łatwy do wdrożenia przez badaczy w ich własnych laboratoriach i mamy nadzieję, że ułatwi to szybkie przyjęcie tej technologii.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Gel-seq to nowa metoda umożliwiająca jednoczesne przygotowanie bibliotek sekwencjonowania DNA i RNA z małych populacji komórek bez podziału próbki. Ta technika zapewnia opłacalny sposób badania związku między zmianami strukturalnymi DNA a ekspresją genów.
Kluczowe Składowe Badania
Dział Nauki
- Neurobiologia
- Genomika
- Transkryptomika
Wprowadzenie
- Gel-seq umożliwia generowanie sparowanych bibliotek z pojedynczej próbki.
- Wcześniej nie istniały protokoły do jednoczesnego sekwencjonowania DNA i RNA.
- Trzy opublikowane podejścia obecnie odpowiadają na to wyzwanie.
- Metodę można dostosować do różnych kaset do elektroforezy żelowej.
Cel Badania
- Opracowanie protokołu generowania bibliotek sekwencjonowania z małych populacji komórek.
- Zbadanie wpływu zmian strukturalnych DNA na ekspresję genów.
- Zapewnienie opłacalnego rozwiązania dla badań multi-omicznych.
Metody Użyte
- Wykorzystanie urządzenia hydrożelowego do przygotowania bibliotek.
- Jednoczesne wydobywanie DNA i RNA z tej samej próbki.
- Zastosowanie standardowych technik elektroforezy żelowej.
- Szczegółowy opis wytwarzania i protokołu biologicznego zawarty.
Główne Wyniki
- Pomyślne generowanie sparowanych bibliotek DNA i RNA z 100-1000 komórek.
- Demonstracja zaniedbywalnego dodatkowego kosztu jednoczesnego sekwencjonowania.
- Możliwość dostosowania protokołu do różnych konfiguracji elektroforezy.
- Wzmocnione zrozumienie regulacji ekspresji genów poprzez zmiany strukturalne.
Wnioski
- Gel-seq stanowi znaczący postęp w technologii sekwencjonowania.
- Metoda ułatwia kompleksową analizę genomową i transkryptomiczną.
- Otwiera nowe możliwości badawcze w dziedzinie ekspresji genów i zmian strukturalnych.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Gel-seq enables simultaneous DNA and RNA library preparation from small cell populations without sample splitting, addressing a key bottleneck in multi-omics discovery workflows. This capability supports target validation by linking genomic structural variations to transcriptional responses in disease-relevant systems, enhancing predictive confidence in early-stage R&D. The method’s compatibility with standard electrophoresis equipment and low input requirements (100–1000 cells) facilitates scalable adoption in preclinical screening and biomarker discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating DNA copy number variations with gene expression changes in the same cellular context.
- Operational Value: Eliminates sample splitting, reducing variability and preserving biological fidelity for target de-risking.
- Scientific Value: Supports functional validation of genomic targets through paired genomic-transcriptomic readouts from identical samples.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, quantitative nucleic acid outputs suitable for assay normalization and cross-platform comparison.
- Operational Value: Uses familiar WTA and library prep kits, minimizing training overhead and enabling rapid integration into existing genomics workflows.
- Scientific Value: Generates reproducible fragment distributions comparable to standard methods, ensuring data reliability for screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving native DNA-RNA relationships in disease models.
- Operational Value: Adaptable to standard gel cassettes, allowing seamless transfer across labs and core facilities without specialized equipment.
- Scientific Value: Provides mechanistic de-risking by enabling direct observation of how structural variants influence expression profiles in relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
Gel-seq fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven target validation and enabling scalable input into lead identification through multi-omic profiling.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by linking structural DNA alterations to transcriptional outcomes without sample division.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative DNA and RNA libraries with consistent fragmentation profiles for reliable compound screening.
- Analytics: Generates paired-end sequencing data allowing integrated analysis of copy number variation and expression changes.
- Translational Research: Preserves biological context from primary samples through preclinical models, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Leverages widely available electrophoresis infrastructure, positioning Gel-seq as a reusable, low-barrier capability across discovery teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in genotype-phenotype relationships.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized hydrogel-based separation and minimal hands-on variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by enabling earlier, more biologically grounded target prioritization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing multi-omic evidence from limited, precious samples.
Implementation Considerations
- Requires molecular biology expertise in nucleic acid handling and gel-based techniques.
- Depends on standard gel electrophoresis chambers, power supplies, and UV crosslinking equipment.
- Necessitates cross-team standardization of gel preparation and fractionation protocols.
- Involves handling neurotoxic acrylamide precursors, requiring fume hood use and safety training.
- Performance may vary with input quality and gel polymerization consistency, necessitating QC steps.
