Name: Gel-seq: metoda jednoczesnego przygotowania biblioteki sekwencjonowania DNA i RNA przy użyciu matryc hydrożelowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Poznaj metodę Gel-seq do jednoczesnego przygotowania bibliotek sekwencjonowania DNA i RNA z małych populacji komórek przy użyciu hydrożelowych matryc. Ta technika umożliwia badanie związku między wariacjami strukturalnymi DNA a ekspresją genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tej pracy zostało zapewnione przez University of San Diego, National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program, grant NIH R01-HG007836, oraz przez koreańskie Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości.
Wcześniejsze wersje kilku figur zostały po raz pierwszy opublikowane w "Hoople, G. D. et al. Gel-seq: sekwencjonowanie całego genomu i transkryptomu poprzez jednoczesne przygotowanie biblioteki DNA i RNA o niskim nakładzie wejściowym przy użyciu półprzepuszczalnych barier hydrożelowych. Lab on a Chip 17, 2619-2630, doi:10.1039/c7lc00430c (2017)." Lab on a Chip usankcjonowało ponowne wykorzystanie figurek w tej publikacji.

<ol><li>Mawy, T. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nmeth/journal/v11/n1/full/nmeth.2771.html">Single-cell sequencing.</a> Nat Methods. 11 (1), 18(2014).</li>
<li>Gole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+polymerase+cloning+and+genome+sequencing+of+single+cells+using+nanoliter+microwells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells.</a> Nat Biotech. 31 (12), 1126-1132 (2013).</li>
<li>Sasagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/gb-2013-14-4-r31">Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA-Seq reveals non-genetic gene expression heterogeneity.</a> Genome Biol. 14 (4), 31(2013).</li>
<li>Ramsköld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).</li>
<li>Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing-based+technologies+will+revolutionize+whole-organism+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science.</a> Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).</li>
<li>Navin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li>
<li>Hoople, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-seq%3A+whole-genome+and+transcriptome+sequencing+by+simultaneous+low-input+DNA+and+RNA+library+preparation+using+semi-permeable+hydrogel+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Gel-seq: whole-genome and transcriptome sequencing by simultaneous low-input DNA and RNA library preparation using semi-permeable hydrogel barriers.</a> Lab Chip. 17, 2619-2630 (2017).</li>
<li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%26T-seq%3A+parallel+sequencing+of+single-cell+genomes+and+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">G&T-seq: parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.</a> Nat Methods. 12 (6), 519-522 (2015).</li>
<li>Dey, S. S., Kester, L., Spanjaard, B., Bienko, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genome+and+transcriptome+sequencing+of+the+same+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrated genome and transcriptome sequencing of the same cell.</a> Nat Biotechnol. 33 (3), 285-289 (2015).</li>
<li>Gopal, A., Zhou, Z. H., Knobler, C. M., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+large+RNA+molecules+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Visualizing large RNA molecules in solution.</a> RNA. 18 (2), 284-299 (2012).</li>
<li>SDS-PAGE Gel. <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2015/7/pdb.rec087908.full?text_only=true">Cold Spring Harb Protoc</a>. 2015 (7), 087908(2015).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), at http://science.sciencemag.org/content/352/6293/1586 (2016).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>Qubit 3.0 Fluorometer Manual. MAN0010866. Life Technologies. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pd">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pd</a> (2017).</li>
<li>Vitak, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+thousands+of+single-cell+genomes+with+combinatorial+indexing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Sequencing thousands of single-cell genomes with combinatorial indexing.</a> Nat Methods. 14 (3), 302-308 (2017).</li>
<li>A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040 Rev B. Bio Rad. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf">http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf</a> (2017).</li>
<li>Illumina. <a target="_blank" href="https://www.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html">Nextera ® XT DNA Library Preparation Kit</a>. , (2017).</li>
<li>Takara Bio USA Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SMART-Seq+v4+Ultra+Low+Input+RNA+Kit+for+Sequencing+User+Manual%22">SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing User Manual</a>. , (2016).</li>
<li>Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+single-cell+cDNA+amplification+to+provide+a+template+for+representative+high-density+oligonucleotide+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis.</a> Nat Protoc. 2 (3), 739-752 (2007).</li>
</ol>

KZ jest współzałożycielem i doradcą naukowym Singlera Genomics Inc.

Istnieje kilka krytycznych kroków związanych z produkcją urządzenia Gel-seq, a także z samym protokołem. Podczas produkcji zalecamy rozpoczęcie od zalecanych grubości warstw dla różnych obszarów żelu. Poświęciliśmy dużo czasu na testowanie różnych opcji produkcyjnych, a opisany tutaj protokół zapewnia najlepsze urządzenia dla kaset wymienionych w Tabeli materiałów i odczynników. Jeśli badacze korzystają z alternatywnego systemu kasetowego, mogą uznać za konieczne dostosowanie głośności używanej podczas t...

Sekwencjonowanie następnej generacji (NGS) wywarło ogromny wpływ na sposób prowadzenia badań genetycznych. Podczas gdy niegdyś badacze koncentrowali się na sekwencjonowaniu genomu całego gatunku, obecnie możliwe jest zsekwencjonowanie genomu pojedynczego guza, a nawet pojedynczej komórki w ramach jednego eksperymentu.1 Dzięki NGS kosztowo opłacalne stało się również sekwencjonowanie transkryptów RNA występujących w komórce, co tworzy zbiór danych znany jako transkryptom. Zdolność do amplifikacji i sekwencjonowania DNA lub RNA z niewielkich próbek wyjściowych została osiągnięta dopiero w ciągu ostatnich pięciu lat.2,3,4 Niestety standardowe protokoły są ze sobą niekompatybilne, przez co badacze muszą zdecydować, czy dla danej próbki zsekwencjonować DNA, czy RNA. Gdy próbka wyjściowa jest wystarczająco duża, można ją podzielić na pół. Jednak w mniejszej skali utrata materiału wynikająca z podziału próbek może wpłynąć na jakość biblioteki, a łączenie próbek (pooling) może doprowadzić do uśrednienia interesujących wariacji między komórkami.5 Co więcej, badacze są coraz bardziej zainteresowani analizą próbek, których nie można podzielić, takich jak pojedyncze komórki czy niewielkie, heterogeniczne biopsje guzów.6
Aby rozwiązać ten problem, opracowano niedawno trzy protokoły sekwencjonowania zarówno DNA, jak i RNA z tej samej próbki wyjściowej: Gel-seq7, G&amp;#38;T-seq8 oraz DR-seq9. Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół Gel-seq, który może być wykorzystany do jednoczesnego generowania bibliotek DNA i RNA z tak małej liczby jak 100 komórek przy znikomim koszcie dodatkowym. Nowatorskim aspektem metody Gel-seq jest możliwość oddzielenia DNA od RNA wyłącznie na podstawie wielkości przy użyciu tanich matryc hydrożelowych. Kluczową innowacją protokołu Gel-seq jest fizyczna separacja DNA od RNA. Rozdzielenie to odbywa się elektroforetycznie przy użyciu kombinacji membran poliakryloamidowych, które wykorzystują różnice w wielkości tych cząsteczek. Aby lepiej zobrazować te różnice w skali, warto rozważyć sposób obrazowania DNA i RNA: podczas gdy DNA występuje w skali mikronowej i może być obserwowane za pomocą tradycyjnych mikroskopów, RNA występuje w skali nanometrowej i musi być obrazowane przy użyciu złożonych technik, takich jak krio-mikroskopia elektronowa.10
Podejście do rozdzielania DNA i RNA w niniejszym protokole przedstawiono na Rysunku 1. Panel lewy pokazuje DNA i RNA swobodnie unoszące się w roztworze w pobliżu membrany. Po przyłożeniu pola elektrycznego, jak pokazano na panelu prawym, DNA i RNA podlegają sile elektroforetycznej, która indukuje ich migrację przez membranę. Poprzez dostrojenie właściwości membrany stworzyliśmy membranę półprzepuszczalną, która rozdziela DNA od RNA. Cząsteczki DNA są pchane w stronę membrany, ale ze względu na swój duży rozmiar zaplątują się na jej krawędzi. Z kolei małe cząsteczki RNA mogą zmieniać swoją konfigurację i przedostawać się przez membranę. Proces ten, znany jako reptacja, przypomina sposób, w jaki wąż porusza się w trawie. Ostatecznie cząsteczki RNA są zatrzymywane przez drugą, gęstą membranę, przez którą zbyt trudno jest prześlizgnąć się nawet mniejszym polimerom (&gt;200 par zasad). Po fizycznym rozdzieleniu DNA i RNA mogą zostać odzyskane i poddane dalszej obróbce w celu uzyskania informacji o genomie oraz transkryptomie. Choć możliwe jest rozdzielenie DNA i RNA, stwierdzono, że lepsze wyniki uzyskuje się, gdy RNA zostanie poddane odwrotnej transkrypcji do cDNA przed rozdzieleniem. Hybrydy cDNA/RNA są bardziej stabilne niż samo RNA i nadal mogą przenikać przez membranę o niskiej gęstości.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig1.jpg" /> 
Rysunek 1. Zasada działania metody Gel-seq.&#160;Podstawowa zasada wykorzystywana do fizycznej separacji DNA i RNA. W przyłożonym polu elektrycznym małe cząsteczki RNA migrują przez membranę o niskiej gęstości, natomiast duże cząsteczki DNA zostają zatrzymane na jej powierzchni. Rysunek został powielony z Ref. 7 za zgodą Royal Society of Chemistry.&#160;<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57315/57315fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje zarówno konstrukcję urządzenia Gel-seq, jak i protokół biologiczny służący do generowania sparowanych bibliotek DNA i RNA. Przegląd obu elementów przedstawiono na Rysunku 2. Urządzenie jest wytwarzane poprzez nakładanie na siebie trzech żeli poliakryloamidowych o różnej gęstości w procesie podobnym do tworzenia standardowych żeli gradientowych.11 Protokół biologiczny rozpoczyna się od zawieszenia 100 - 1000 komórek w PBS. Komórki są lizowane, a RNA konwertowane do cDNA, zanim urządzenie zostanie wykorzystane do oddzielenia genomowego DNA od hybryd cDNA/RNA. Po separacji i odzyskaniu preparowane są biblioteki genomiczne i transkryptomiczne przy użyciu procesu ściśle zgodnego ze standardowym protokołem zestawu do przygotowania biblioteki całego genomu. Dalsze szczegóły dotyczące opracowania i walidacji metody Gel-seq można znaleźć w publikacji w Lab on a Chip &#34;Gel-seq: whole-genome and transcriptome sequencing by simultaneous low-input DNA and RNA library preparation using semi-permeable hydrogel barriers.&#34;7
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig2.jpg" /> 
Rysunek 2. Protokół Gel-seq.&#160;Przegląd etapów wytwarzania urządzenia Gel-seq oraz protokołu generowania sparowanych bibliotek DNA i RNA. Fragmenty tego rysunku zostały powielone z Ref. 7 za zgodą Royal Society of Chemistry.&#160;<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57315/57315fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Aby wygenerować biblioteki DNA i RNA z pojedynczych komórek, badacze powinni rozważyć zastosowanie metody G&amp;#38;T-seq lub DR-seq. Metoda G&amp;#38;T-Seq, podobnie jak Gel-seq, opiera się na fizycznej separacji RNA od genomowego DNA. Podejście to wykorzystuje 3′ koniec poliadenylowany matrycowego RNA (mRNA) jako cel wychwytu. mRNA jest wychwytywane na koralikach magnetycznych za pomocą biotynilowanego startera oligo-dT. Po wychwyceniu mRNA koraliki są unieruchamiane za pomocą magnesu, a supernatant zawierający genomowe DNA może zostać usunięty i przeniesiony do drugiej probówki. Po zakończeniu tej fizycznej separacji z mRNA i DNA można wygenerować oddzielne biblioteki.8 Podejście to sprawdza się, jeśli analizowany RNA jest poliadenylowany, jednak nie może być ono stosowane do badania transkryptów niepoliadenylowanych, takich jak rybosomalny RNA, tRNA lub RNA pochodzące od prokariontów.
Metoda DR-seq opiera się na etapie preamplifikacji, podczas którego zarówno DNA, jak i cDNA pochodzące z RNA są amplifikowane w jednej probówce. Następnie próbkę dzieli się na dwie części i przetwarza równolegle w celu przygotowania bibliotek do sekwencjonowania DNA i RNA. Aby odróżnić genomowe DNA od cDNA pochodzącego z RNA, w metodzie DR-seq stosuje się podejście obliczeniowe. Sekwencje, w których występują wyłącznie eksony, są obliczeniowo usuwane z danych genomowego DNA, ponieważ mogły one pochodzić zarówno z DNA, jak i z RNA.9 Zaletą tego podejścia jest to, że DNA oraz cDNA/RNA nie muszą być rozdzielane fizycznie, jak ma to miejsce w metodach Gel-seq i G&amp;#38;T-seq. Wadą jest jednak to, że DR-seq wymaga wiedzy a priori na temat genomu i transkryptomu (t.j. rozróżnienia eksonów i intronów) i może nie być idealna do zastosowań takich jak sekwencjonowanie jąder komórkowych, w których wiele transkryptów nie jest jeszcze w pełni splisowanych i nadal zawiera introny.12
Nowatorskim aspektem metody Gel-seq jest możliwość rozdzielania DNA i RNA w setkach komórek wyłącznie na podstawie wielkości. Metoda ta nie wymaga wiedzy a priori na temat genomu lub transkryptomu, jest odporna na niepełny splicing i nie ogranicza się do transkryptów poliadenylowanych. W zastosowaniach, w których badacz może rozpocząć pracę z co najmniej 100 komórkami, Gel-seq zapewnia prosty sposób z wykorzystaniem tanich i powszechnie dostępnych materiałów.

<table><tbody><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monomer akryloamidu</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A8887-100G</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki Ampure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Określany w tekście jako kulki odwracalnego immobilizacji w fazie stałej (SPRI)</td></tr><tr><td>Barwnik ładujący żel DNA (6x)</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>R0611</td><td>Określany w tekście jako 6-krotny barwnik ładujący</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST Jednoetapowe zestawy qRT-PCR</td><td>Kapa BioSystems</td><td>7959613001</td><td>Określany w tekście jako mieszanina 2X qPCR</td></tr><tr><td>N,N&prime;-Metylenobis(akrylamid)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>146072-100G</td><td>Znany również jako bis-akryloamid</td></tr><tr><td>NexteraXT DNA Library Preparation Kit (określany w tekście jako zestaw do przygotowania biblioteki)</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Zawiera: TD (określany w tekście jako bufor transpozazy), ATM (określany w tekście jako transposase), NT (określany w tekście jako bufor zatrzymujący transpozę) i NPM (określany w tekście jako mieszanka PCR do przygotowania biblioteki)</td></tr><tr><td>Woda</td> <td>wolna od nukleazMillipore</td><td>3098</td><td></td></tr><tr><td>Proaza</td><td>Qiagen</td><td>19155</td><td></td></tr><tr><td>SMART-Seq v4 Kit (określany w tekście jako zestaw do amplifikacji całego transkryptu (WTA))</td><td>Takara/Clontech</td><td>634888</td><td>Zawiera: Bufor do lizy, inhibitor RNazy, 3' SMART-Seq CDS Primer II A (określany w tekście jako starter RT), 5X Ultra Low First Nici Buffer (określany w tekście jako bufor pierwszej nici), SMART-Seq v4 Oligonukleotyd (określany w tekście jako oligonukleotyd przełącznika matrycy (TSO)), odwrotna transkryptaza SMART-Scribe (określana w tekście jako odwrotna transkryptaza) i PCR Primer II A (określany w tekście jako starter cDNA PCR)</td></tr><tr><td>Losowy heksamer z adapterem WTA&nbsp;</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td>5&prime;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3&prime;</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>DNA AWAY Odkażacz powierzchniowy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>7010PK&nbsp; &nbsp;</td><td>Określany w tekście jako produkt do usuwania DNA</td></tr><tr><td>Bufor Tris-Boran-EDTA (stężenie 10X)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4415-1L</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Gel Stain (10 000X Koncentrat w DMSO)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11494</td><td>Określany w tekście jako barwnik żelowy</td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide&nbsp; igły strzykawkowe, rozmiar 18</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z192554</td><td>Dopuszczalne jest każde równoważne osprzęt</td></tr><tr><td>Kąpiel ultradźwiękowa Branson serii CPX</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z769363</td><td>Dopuszczalne jest dowolne równoważne osprzęt</td></tr><tr><td>Puste kasety na żel, mini, 1,0 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC2010</td><td>Każdy równoważny sprzęt jest dopuszczalny</td></tr><tr><td>Płyta filtracyjna siatkowa - Corning&nbsp; HTS Transwell 96 dobrze przepuszczalne podpory - 8,0 &mikro; m rozmiar porów</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3374</td><td>Określany w tekście jako płyta filtracyjna z siatką 8 um</td></tr><tr><td>Zasilacz PowerPac HC</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td>Dopuszczalny jest każdy równoważny sprzęt</td></tr><tr><td>Fluorometr kubitowy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td>Dopuszczalny jest każdy równoważny sprzęt</td></tr><tr><td>Koncentrator próżniowy</td><td>Eppendorf</td><td>22822993</td><td>Dopuszczalny jest każdy równoważny sprzęt</td></tr><tr><td>System XCell SureLock Mini-Cell</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td>Dopuszczalny jest dowolny równoważny sprzęt</td></tr><tr><td>Bio-Rad CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195&nbsp;</td><td>Każdy równoważny sprzęt jest dopuszczalny</td></tr><tr><td>Środek sieciujący ultrafioletem Amersham UVC 500</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>UVC500-115V</td><td>Wycofane, dopuszczalne są wszelkie równoważne urządzenia</td></tr><tr><td>System dokumentacji żelu Gel Doc XR+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td>Określany w tekście jako gel imager</td></tr><tr><td>Dark Reader Transilluminator</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR89</td><td>Określany w tekście jako transilluminator UV</td></tr><tr><td>&nbsp; Ultradźwiękowe&nbsp; Wanna</td><td>Bransonic</td><td>1207K35</td><td>Każda równoważna kąpiel ultradźwiękowa jest dopuszczalna.</td></tr></tbody></table>

gel-seq: metoda jednoczesnego przygotowania biblioteki sekwencjonowania dna i rna przy użyciu matryc hydrożelowych

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

Zdolność do amplifikacji i sekwencjonowania zarówno DNA, jak i RNA z małych próbek wyjściowych została osiągnięta dopiero w ciągu ostatnich pięciu lat. Niestety, standardowe protokoły generowania bibliotek genomicznych lub transkryptomicznych są niekompatybilne i badacze muszą wybrać, czy sekwencjonować DNA, czy RNA dla określonej próbki. Gel-seq rozwiązuje ten problem, umożliwiając naukowcom jednoczesne przygotowanie bibliotek zarówno dla DNA, jak i RNA, zaczynając od 100 - 1000 komórek za pomocą prostego urządzenia hydrożelowego. W artykule przedstawiono szczegółowe podejście do wytwarzania urządzenia, a także protokół biologiczny do generowania sparowanych bibliotek. Zaprojektowaliśmy Gel-seq tak, aby mógł być łatwo wdrożony przez innych badaczy; wiele laboratoriów genetycznych posiada już niezbędny sprzęt do odtworzenia produkcji urządzenia Gel-seq. Nasz protokół wykorzystuje powszechnie używane zestawy zarówno do amplifikacji całego transkryptu (WTA), jak i przygotowania biblioteki, które prawdopodobnie będą również znane badaczom już zorientowanym w generowaniu bibliotek genomicznych i transkryptomicznych. Nasze podejście pozwala naukowcom wykorzystać moc sekwencjonowania zarówno DNA, jak i RNA na pojedynczej próbce bez podziału i przy znikomych dodatkowych kosztach.

Fizyczną separację gDNA oraz hybryd cDNA/RNA w urządzeniu Gel-seq można zwizualizować za pomocą obrazowania żelu fluorescencyjnego; reprezentatywny wynik przedstawiono na Rysunku 3. Panel A przedstawia wykonane urządzenie Gel-seq; dodano fałszywe kolory, aby odróżnić poszczególne obszary żelu. Panel B pokazuje zbliżenie czterech różnych separacji wykorzystanych do walidacji. Trzecia ścieżka, będąca kontrolą negatywną, reprezentuje tło i pokazuje brak autofluo...

Gel-seq umożliwia badaczom jednoczesne przygotowanie bibliotek dla sekwencji DNA i RNA przy znikomych dodatkowych kosztach, zaczynając od 100 - 1000 komórek za pomocą prostego urządzenia hydrożelowego. W artykule przedstawiono szczegółowe podejście do wytwarzania urządzenia, a także protokół biologiczny do generowania sparowanych bibliotek.

Gel-seq: metoda jednoczesnego przygotowania biblioteki sekwencjonowania DNA i RNA przy użyciu matryc hydrożelowych

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wygenerowanie bibliotek sekwencjonowania nowej generacji zarówno z DNA, jak i RNA małych populacji komórek bez dzielenia próbki w dowolnym momencie. Metoda ta zapewnia naukowcom nowe podejście do badania strukturalnych zmian DNA w ekspresji genów. Kiedy po raz pierwszy wymyśliliśmy Gel-seq, nie było żadnych protokołów jednoczesnego sekwencjonowania zarówno DNA, jak i RNA z tej samej próbki.Na szczęście obecnie istnieją trzy opublikowane podejścia, które rozwiązują ten problem. Główną zaletą tej techniki jest to, że zarówno informacje genomiczne, jak i transkryptomiczne można uzyskać z tego samego zestawu komórek przy znikomych kosztach dodatkowych. Gel-seq został pierwotnie opracowany z kasetami pionowymi, jednak protokół ten można dostosować do pracy z dowolną standardową kasetą do elektroforezy żelowej.Przygotuj wypełniacz, mieszaniny prekursorów o wysokiej i niskiej gęstości w trzech probówkach. Dodaj odczynniki w opisanej kolejności i zmieszaj mieszaninę. Nie dodawaj przedwcześnie ani APS, ani Temed.Poczekaj, aż zostaniesz skierowany. Następnie odgazuj każdy roztwór monomeru żelowego, najpierw wprowadzając igłę przez nasadkę. Następnie podłączamy igłę do domowej linii próżniowej i zanurzamy ten zespół w kąpieli ultradźwiękowej.Odczekaj około minuty, aż z płynu nie pojawią się już bąbelki. Następnie do mieszaniny prekursorów wypełniacza dodać Temed i APS i krótko odwirować. W ciągu trzech minut użyj pipety o długości jednego milimetra, aby dodać sześć milimetrów do każdej kasety z żelem bez rozlewania.Upewnij się, że płyn jest wypoziomowany, ustawiając kasety pionowo na równym stole. Następnie stopniowo uzupełniaj kasety odgazowaną, zjonizowaną wodą, uważając, aby zminimalizować mieszanie się mieszaniny polimeryzującej z wodą. Następnie pozostaw polimer do utwardzenia przez godzinę lub noc.Po utwardzeniu polimeru wylej nakładkę wodną i z odległości sześciu cali użyj delikatnego strumienia sprężonego powietrza, aby wysuszyć powierzchnię żelu. Następnie dodaj Temed i APS do prekursora żelu o wysokiej gęstości i krótko wiruj. W ciągu trzech minut przenieś 320 mikrolitrów do każdej kasety i rozprowadź ją na warstwie żelu wypełniającego, kilkakrotnie kołysząc kasetą w przód iw tył.Następnie uzupełnij kasety dejonizowaną, odgazowaną wodą i pozwól polimerowi utwardzić się przez około godzinę. Po utwardzeniu wysuszyć polimer jak poprzednio. Na koniec dodaj Temed i APS do mieszaniny prekursorów żelu o niskiej gęstości i zwiruj.Następnie szybko napełnij pozostałą część kaset tą mieszanką i włóż grzebienie żelowe, zanim zacznie się utwardzać. Teraz dodaj nadmiar prekursora rezerwowego na grzebień, który ma być zaadsorbowany podczas polimeryzacji. Po utwardzeniu kaseta jest gotowa do użycia.Po przekształceniu RNA w cDNA użyj żelu, aby odzyskać interesującą frakcję. Najpierw dokładnie wyczyść komorę elektroforezy za pomocą kilku mililitrów produktu do usuwania DNA i niestrzępiącej się chusteczki. Następnie napełnij komorę czystym XTBE w punkcie zerowym i umieść całe urządzenie w 254-nanometrowym piecu sieciującym UV i sterylizuj przez 15 minut.Teraz włóż kasetę Gel-seq do komory elektroforezy i zablokuj ją na miejscu. Następnie powoli wyjmij grzebień żelowy, delikatnie pociągając do góry, nie rozrywając żelu. Teraz załaduj próbki za pomocą pipety.Podczas ładowania próbek należy całkowicie włożyć końcówkę do studzienek, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia między studzienkami. Zastosuj pole elektryczne o napięciu 250 woltów na kasecie Gel-seq przez 30 minut, aby oddzielić gDNA od hybryd cDNA / RNA. Po załadowaniu, uruchomieniu i zebraniu żelu użyj skalpela, aby przeciąć żel na pół tuż pod warstwą o dużej gęstości i wyrzuć połowę żelu wypełniającego.Następnie delikatnie oderwij pozostały żel z kasety, ostrożnie używając narzędzia do skrobania. Po sprawdzeniu separacji za pomocą żelu doc, użyj transiluminatora do wycięcia pasm. GDNA powinno znajdować się na początku żelu o niskiej gęstości, a cDNA powinno znajdować się na styku regionów o niskiej i wysokiej gęstości.Teraz użyj skalpela, aby wyciąć obszary żelu zawierającego gDNA i cDNA. Należy również usunąć te same sekcje z pasa kontroli ujemnej. Za pomocą pęsety delikatnie przenieś fragmenty żelu do tubek paskowych.Jeśli żel pęknie, znajdź i przenieś wszystkie uszkodzone kawałki do tuby. Następnie zmiel każdy żel okrężnymi ruchami i dociskając końcówką pipety. Przed usunięciem końcówek dodaj 40 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do gDNA i 80 mikrolitrów do próbek cDNA.Następnie ostrożnie wyjmij i wyrzuć końcówki. Teraz przymocuj probówki paskowe do mieszalnika wirowego w temperaturze 37 stopni Celsjusza i potrząsaj nimi przez osiem do 12 godzin. W ten sposób DNA wydostanie się z żelu.Po wstrząśnięciu odpipetować próbki do płytki filtracyjnej o siatce ośmiu mikronów. Następnie obracać płytkę o masie 2 600 g przez pięć minut, aby odcedzić fragmenty żelu. Następnie podnieś siatkową płytkę filtracyjną z płytki obudowy i za pomocą pipety przenieś próbki bez żelu z płytki do nowych probówek paskowych o pojemności 200 mikrolitrów.Do każdej próbki zawierającej gDNA dodaj jeden mikrolitr proteazy i pipetuj w górę iw dół, aby dobrze wymieszać. Następnie inkubować próbki w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie włącz ogrzewanie w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 15 minut.Ten etap zubożenia nukleosomów ma kluczowe znaczenie. Następnie użyj igły o rozmiarze 18, aby zrobić otwór w nasadce każdej probówki z próbką. Następnie użyj próżni, aby zredukować próbki gDNA do pięciu mikrolitrów, a próbki cDNA do 10 mikrolitrów.Jeśli objętość spadnie poniżej celu, w razie potrzeby dodaj wodę wolną od nukleaz. Hybrydy gDNA i cDNA/RNA zostały fizycznie oddzielone za pomocą urządzenia Gel-seq. Kontrola ujemna nie ma autofluorescencji żelu na granicy faz.Drabinki DNA pokazują tylko ciemny pas na granicy faz między błonami o niskiej i wysokiej gęstości, ujawniając, że małe fragmenty mogą przechodzić przez żel o niskiej gęstości. Próbka biologiczna z 500 komórek PC3 wykazuje pożądaną separację genomowego DNA i hybryd cDNA/RNA. Ciemne pasmo na górze błony o niskiej gęstości to genomowe DNA w skali megazasadowej, podczas gdy hybrydy cDNA / RNA są ułożone na granicy regionów o niskiej i wysokiej gęstości.Małe fragmenty par zasad poniżej 100 są produktami docelowymi generowanymi z oligonukleotydów starterowych podczas odwrotnej transkrypcji i należy się ich spodziewać. Biblioteki zostały wygenerowane z 500 komórek PC3 lub 750 ogniw HeLa. Dystrybucje fragmentów z dopasowanych bibliotek wygenerowanych za pomocą Gel-seq porównano z niedopasowanymi próbkami wygenerowanymi za pomocą standardowych protokołów.Rozkład fragmentów nukleotydów był podobny w obu metodach. Wyniki sekwencjonowania biblioteki komórek PC3 porównano z tradycyjnymi metodami. Porównano wariacje liczby kopii w całym genomie.Statystycznie obie metody przyniosły podobne wyniki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować sparowane biblioteki sekwencjonowania nowej generacji zarówno dla DNA, jak i RNA z tej samej próbki początkowej. Podobnie jak w przypadku każdego eksperymentu z sekwencjonowaniem przy niskich nakładach, należy pamiętać o utrzymaniu czystego środowiska pracy.Należy zwrócić szczególną uwagę na probówki do sterylizacji i rękawice do czyszczenia. Nawet przy tych środkach ostrożności eksperymenty czasami kończą się niepowodzeniem z powodu zanieczyszczenia. Ważna uwaga, wszechobecność i bezpieczeństwo żeli poliakrylamidowych sprawia, że łatwo zapomnieć, że prekursory produkcji są niebezpiecznymi neurotoksynami.Należy zawsze pracować z tymi odczynnikami w dygestoriach i natychmiast usunąć wszelkie rozlane płyny. Zaprojektowaliśmy Gel-seq tak, aby był łatwy do wdrożenia przez badaczy w ich własnych laboratoriach i mamy nadzieję, że ułatwi to szybkie przyjęcie tej technologii.

gel-seq-method-for-simultaneous-sequencing-library-preparation-dna

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Scharakteryzowanie społeczności mikrobiologicznej było od dawna celem w mikrobiologii środowiskowej. Metody sekwencjonowania nowej generacji pozwalają obecnie na scharakteryzowanie społeczności drobnoustrojów na niespotykanej dotąd głębokości przy minimalnych kosztach i nakładzie pracy. Szczegółowo opisujemy tutaj nasze podejście do sekwencjonowania bakteryjnych genów rybosomalnego RNA 16S za pomocą sekwenatora laboratoryjnego.

Sekwencjonowanie nowej generacji amplikonów genu rybosomalnego RNA 16S

Ten manuskrypt opisuje zautomatyzowane podejście do wyboru rozmiaru żelu do oczyszczania fragmentów DNA do sekwencjonowania nowej generacji. Technologia Ranger zapewnia pełną automatyzację całego procesu ładowania żelem agarozowym, analizy elektroforetycznej i odzyskiwania docelowych fragmentów DNA, co pozwala na uzyskanie wysokiej przepustowości i wysokiej jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji.

Zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych na podstawie próbek wody środowiskowej

Ten protokół opisuje metodę mapowania końcowych miejsc przetwarzania pre-mRNA 3'.

3' Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania końcowego za pomocą A-seq2

Próbki zatopione w parafinie w formalinie stanowią cenne źródło molekularnych biomarkerów chorób ludzkich. W tym miejscu przedstawiamy laboratoryjny protokół przygotowania biblioteki cDNA, początkowo zaprojektowany ze świeżo mrożonym RNA i zoptymalizowany do analizy zarchiwizowanych mikroRNA z tkanek przechowywanych do 35 lat.

Retrospektywne sekwencjonowanie mikroRNA: protokół przygotowania komplementarnej biblioteki DNA przy użyciu próbek RNA zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek ujawnia niejednorodność genotypową w systemach biologicznych, ale obecnym technologiom brakuje przepustowości niezbędnej do głębokiego profilowania składu i funkcji społeczności. W tym miejscu opisujemy mikroprzepływowy przepływ pracy do sekwencjonowania &gt;50 000 genomów jednokomórkowych z różnych populacji komórek.

Ultraprzepustowa platforma mikroprzepływowa do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki

Długie sekwencje znacznie ułatwiają tworzenie złożonych genomów i charakteryzację zmienności strukturalnej. Opisujemy metodę generowania ultradługich sekwencji za pomocą platform sekwencjonowania opartych na nanoporach. Podejście to wykorzystuje zoptymalizowaną ekstrakcję DNA, a następnie zmodyfikowane przygotowania biblioteczne w celu wygenerowania setek odczytów kilobazowych z umiarkowanym pokryciem z komórek ludzkich.

Sekwencjonowanie z bardzo długim odczytem do analizy całego genomu DNA

W tym artykule prezentujemy i omawiamy nowe osiągnięcia w syntezie i zastosowaniach mikromacierzy kwasów nukleinowych wytwarzanych in situ. W szczególności pokazujemy, w jaki sposób protokoły syntezy DNA można rozszerzyć na RNA i jak można wykorzystać mikromacierze do tworzenia pobieralnych bibliotek kwasów nukleinowych.

Mikromacierze DNA i RNA o dużej gęstości - synteza fotolitograficzna, hybrydyzacja i przygotowanie dużych bibliotek kwasów nukleinowych

Wąskim gardłem w cyklu "zaprojektuj-zbuduj-testuj" inżynierii mikrobiologicznej jest szybkość, z jaką możemy przeprowadzać funkcjonalne badania przesiewowe szczepów. Opisujemy wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych szczepów stosowaną do setek do tysięcy komórek drożdży na eksperyment, która wykorzystuje sekwencjonowanie RNA oparte na kropelkach.

Wysokowydajne fenotypowanie szczepów drożdży z sekwencjonowaniem RNA na bazie kropelek

Tutaj opisujemy etapy pobierania próbek i przygotowania do sekwencji RIBO u bakterii. Sekwencjonowanie bibliotek przygotowanych zgodnie z tymi wytycznymi daje wystarczające dane do kompleksowej analizy bioinformatycznej. Prezentowany przez nas protokół jest prosty, wykorzystuje standardowy sprzęt laboratoryjny i od lizy do uzyskania bibliotek mija siedem dni.

RIBO-seq w bakteriach: protokół pobierania próbek i przygotowania biblioteki do sekwencjonowania NGS

W tym filmie prezentujemy techniki eksperymentalne wykorzystywane do wytwarzania elastycznych podłoży powleczonych macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), które nadają się do hodowli komórkowej oraz pozwalają na zastosowanie mikroskopii sił trakcyjnych i obserwację wpływu sztywności ECM na zachowanie komórek.

Przygotowanie podatnych macierzy do ilościowego pomiaru skurczu komórkowego

Poznaj metodę Gel-seq do jednoczesnego przygotowania bibliotek sekwencjonowania DNA i RNA z małych populacji komórek przy użyciu hydrożelowych matryc. Ta technika umożliwia badanie związku między wariacjami strukturalnymi DNA a ekspresją genów.

Gel-seq: metoda jednoczesnego przygotowania biblioteki sekwencjonowania DNA i RNA przy użyciu matryc hydrożelowych

Przeglądaj więcej filmów