Oświetlanie szlaków aktywacji kaspazy za pomocą bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej

Ogólnym celem tej metodologii jest wizualizacja jednego z pierwszych kroków w aktywacji kaspaz inicjatora. Ten etap nazywa się indukowaną bliskością i występuje, gdy cząsteczki kaspazy łączą się, tworząc aktywne dimery podczas apoptotycznej śmierci komórki. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie kaspazy, takie jak kiedy, gdzie i jak skutecznie można aktywować określone kaspazy inicjujące.

Główną zaletą tej techniki jest to, że można wizualizować składanie kompleksów aktywacyjnych kaspazy w żywych komórkach w czasie rzeczywistym. Ta metoda biomolekularnej komplementacji fluorescencji wykorzystuje fragmenty białka tyroksyny, Venus, które zostały winstalowane do kaspazy. Fragmenty same w sobie nie są fluorescencyjne, ale kiedy kaspaza ulega indukowanej bliskości, zbliża to dwie połówki Wenus do siebie i zapalają się.

Aby przetoczyć komórki, najpierw dodaj 12 mikrolitrów odczynnika do transfekcji do 750 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy w sterylnej probówce. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie dodaj 10 nanogramów plazmidu reporterowego do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra dla każdej studzienki, która ma być transfekowana.

Dodaj 20 nanogramów każdego osocza kaspazy BiFC do każdej probówki. Doprowadzić każdą probówkę do całkowitej objętości 100 mikrolitrów, dodając zredukowaną pożywkę surowicy. Za pomocą pipety P200 dodać 100 mikrolitrów roztworu odczynnika do transfekcji do mieszaniny plazmidu w sposób kroplowy.

Po inkubacji odczynnika do transfekcji plazmidu przez 20 minut w temperaturze pokojowej, należy odessać pożywkę z komórek za pomocą pipety lub z odsysaniem. Następnie za pomocą pipety P1000 delikatnie odpipetuj 800 mikrolitrów pożywki bez surowicy w dół po ścianie studzienki. Za pomocą pipety P200 dodaj kroplami 200 mikrolitrów kompleksu lipidowego DNA do każdej studzienki.

Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Po inkubacji usunąć pożywkę pozbawioną surowicy zawierającą kompleksy lipidowe DNA przez aspirację za pomocą odsysania lub pipety, uważając, aby nie naruszyć monowarstwy. Delikatnie odpipetować dwa mililitry wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki wzrostowej z boku każdej studzienki przed inkubacją komórek, jak opisano w protokole tekstowym.

Przed akwizycją danych należy przeprowadzić indukcję aktywacji kaspazy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Włącz mikroskop zgodnie z instrukcjami producenta i uruchom oprogramowanie do akwizycji. Wybierz obiektyw olejowy 60x lub 63x i umieść kroplę oleju na obiektywie.

Następnie umieść naczynie hodowlane na stoliku mikroskopu, używając odpowiedniego uchwytu na płytkę. Włącz grzejnik i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza. Skoncentruj się na fluorescencji reporterowej za pomocą lasera lub filtra RFP.

Wprowadź procentową moc lasera na poziomie 50% i czas ekspozycji na 100 milisekund zarówno dla Wenus, jak i zapytania ofertowego jako punkt wyjścia do określenia optymalnych ustawień do wykorzystania w eksperymencie. Włącz przechwytywanie na żywo i sprawdź wynikowy obraz oraz wyświetlane histogramy dla obu kanałów. Jeśli sygnał jest słaby, a obraz jest trudny do odczytania, zwiększaj procentową moc lasera i/lub czas naświetlania w krokach, aż sygnał i obraz będą wyglądać dobrze.

Następnie wybierz lub otwórz moduł stosu Z w oprogramowaniu mikroskopu. Dostosuj ostrość w jednym kierunku, aż komórka przestanie być widoczna. Wybierz tę pozycję jako górną.

Dostosuj ostrość w przeciwnym kierunku, aż komórka przestanie być widoczna, i wybierz ją jako dolną pozycję. Wybierz optymalny rozmiar kroku i rozpocznij akwizycję. W razie potrzeby dostosuj histogram wyświetlacza, aby poprawić wizualny wygląd sygnału fluorescencyjnego.

Na koniec użyj oprogramowania do renderowania trójwymiarowego, aby zrekonstruować obraz 3D. Jeśli źródło dwutlenku węgla jest dostępne, umieść urządzenie doprowadzające dwutlenek węgla na uchwycie płytki. Ustaw poziom dwutlenku węgla na 5% i włącz kontroler dwutlenku węgla z poziomu oprogramowania.

Przejdź do pola transfekowanych komórek. Wizualizuj obraz komórek na żywo uzyskany przez kamerę i wyświetlany przez oprogramowanie akwizycyjne na ekranie komputera za pomocą lasera RFP. Następnie wprowadź ustawienia procentowej mocy lasera i czasu naświetlania lasera RFP.

Następnie wprowadź ustawienie procentowej mocy lasera i czasu ekspozycji dla światła lasera YFP. Dla każdego dołka płytki wybierz kilka różnych pozycji, które zawierają jedną lub więcej komórek wyrażających reportera. Wprowadź odstęp czasu między każdą klatką upływów czasu i całkowitą liczbę klatek do wykonania.

Wróć do każdej pozycji i w razie potrzeby popraw i zaktualizuj fokus. Rozpocznij upływ czasu i zapisz dane. Na koniec przeanalizuj dane za pomocą dostępnego oprogramowania do obrazowania, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Pokazany tutaj jest przykład kaspazy-2 BiFC po uszkodzeniu DNA. Komórki traktowano inhibitorem topoizomerazy one: kamptotecyną. Czerwone białko fluorescencyjne, mCherry, zostało użyte jako reporter, aby pokazać, że komórki wyrażają sondę BiFC i pomagają wizualizować całkowitą liczbę komórek.

Fluorescencja Wenus jest pokazana na zielono, a duża puncta reprezentuje bliskość indukowaną kaspazą-2. Aby zapewnić wizualizację w wysokiej rozdzielczości subkomórkowej lokalizacji kompleksu aktywacyjnego kaspazy, pojedyncze komórki można obrazować w trzech wymiarach. Aktywacja kaspazy-2 jest pokazana na zielono, a jądro jest pokazane na czerwono.

Pokazany jest widok wycinków ortogonalnych komórki, w którym płaszczyzna xy, płaszczyzna yz i płaszczyzna xz mogą być wizualizowane obok siebie. Trójwymiarowy obraz można również wyświetlić w filmie, w którym komórka jest obrócona wokół osi y. Aby uzyskać dane kinetyczne kaspazy, można zastosować obrazowanie poklatkowe BiFC.

Ten film pokazuje aktywację kaspazy-2 na zielono po leczeniu inhibitorem proteasomu: bortezomibem. Mitochondria są pokazane na czerwono. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać kaspazy BiFC do śledzenia montażu kompleksów aktywacyjnych kaspazy w czasie rzeczywistym i do wyraźnego określenia rozmiaru, kształtu i lokalizacji wytwarzanych kompleksów.

Protokół ten przedstawia kilka opartych na mikroskopie podejść do zbierania wyników eksperymentu BiFC z kaspazą; Należy jednak zauważyć, że wiele wariantów i kombinacji tych podejść można wykorzystać do kreatywnego badania szlaków aktywacji kaspazy. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o uwzględnieniu kontroli z artefaktów wywołanych mikroskopią, takich jak fototoksyczność i wybielanie zdjęć. Dołączony protokół tekstowy zawiera wskazówki, jak to zrobić.

Decyzja o tym, którą metodę akwizycji i analizy zastosować, będzie zależała od granic, które mają być zbadane, oraz dostępności oprzyrządowania i oprogramowania do obrazowania. Zgodnie z tą procedurą do interpretacji danych można zastosować podejścia do analizy obrazowej. Możesz mierzyć zmiany intensywności fluorescencji w czasie lub procent komórek fluorescencyjnych.

Można również obliczyć liczbę ognisk lub rozmiar obiektu.