Name: Oświetlanie szlaków aktywacji kaspazy za pomocą bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Poznaj metodę BiFC do wizualizacji aktywacji kaspaz w żywych komórkach w czasie rzeczywistym. Technika ta wykorzystuje fragmenty białka Venus do badania złożonych aktywacyjnych kaspaz i mechanizmów apoptozy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować wszystkim poprzednim członkom laboratorium Bouchier-Hayes, którzy przyczynili się do rozwoju tej techniki. Praca ta została częściowo sfinansowana z nagrody Texas Children's Hospital Pediatric Pilot dla LBH. Dziękujemy Joyi Chandra (MD Anderson, Houston, Teksas) za zgodę na włączenie danych opublikowanych we współpracy z jej zespołem. Opracowanie opisanych odczynników było wspierane przez Cytometry and Cell Sorting Core w Baylor College of Medicine dzięki finansowaniu z NIH (NIAID P30AI036211, NCI P30CA125123 i NCRR S10RR024574) oraz pomocy Joela M. Sederstroma

1. Przygotowanie komórek i naczyń hodowlanych
UWAGA: Wykonaj Kroki 1-3 w okapie z przepływem laminarnym do hodowli tkankowej. Nosić rękawice.
<ol>
	<li>Jeśli używasz naczyń ze szklanym dnem, pokryj szklankę fibronektyną. Przejdź do kroku 1.2, jeśli używasz plastikowych naczyń.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór fibronektyny o stężeniu 0,1 mg/ml: rozcieńczyć 1 ml roztworu fibronektyny o stężeniu 1 mg/ml w 9 ml roztworu 1 X PBS.</li>
		<li>Przykryj szklane dno każdej studzienki 0,5-1 ml fibronektyny i inkubuj przez 1-5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Za pomocą pipety zebrać roztwór fibronektyny i przechowywać w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Roztwór fibronektyny może być wielokrotnie używany.</li>
		<li>Umyj szklankę raz 1-2 ml 1 X PBS i odessaj PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Płytka 1 x 105 komórek na basenik na płytkę 6-dołkową w 2 ml odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych (patrz Tabela 1 dla numerów komórek do użycia dla dołków o różnych rozmiarach). Jeśli używasz linii komórkowej, która stabilnie wyraża składniki kaspazy BiFC (patrz Dyskusja), płytki 2 x 105 komórek i przejdź do etapu leczenia (Krok 3).</li>
	<li>Pozostawić komórki do przylegania do naczynia przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych.</li>
</ol>
2. Transfekcja komórek w celu wprowadzenia składników kaspazy BiFC
<ol>
	<li>Komórki transfekcyjne z odpowiednim odczynnikiem do transfekcji. 
	UWAGA: Niniejszy protokół zawiera instrukcje dotyczące Lipofectamine 2000, która została zoptymalizowana pod kątem minimalnej toksyczności. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany w komórkach Hela, komórkach MCF7 i komórkach LN18. W przypadku używania dodatkowych odczynników do transfekcji postępuj zgodnie z instrukcjami producenta i optymalizuj w razie potrzeby.
	<ol>
		<li>Dodać 12 μl odczynnika do transfekcji do 750 μl zredukowanej pożywki surowicy w sterylnej probówce.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Dodać 10 ng plazmidu reporterowego (plazmidu kodującego białko fluorescencyjne, np. białko czerwonej fluorescencji [RFP], które oznaczy transfekowane komórki) do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml dla każdej studzienki, która ma być transfekowana.</li>
		<li>Dodać 20 ng każdego plazmidu BiFC kaspazy (np. 20 ng prodomeny kaspazy-2 [C2 Pro]-VC i 20 ng C2 Pro-VN) do każdej probówki (Tabela 2).</li>
		<li>Doprowadzić każdą probówkę do całkowitej objętości 100 μl, dodając zredukowaną pożywkę surowicy.</li>
		<li>Za pomocą pipety p200 dodać kroplami 100 μl roztworu odczynnika do transfekcji z kroku 2.1.2 do mieszaniny plazmidowej.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę odczynnika do transfekcji plazmidu przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odessać pożywkę z komórek za pomocą pipety lub z odsysaniem, a następnie, za pomocą pipety p1000, delikatnie odpipetować 800 μl pożywki wolnej od surowicy w dół po boku studzienki.</li>
		<li>Za pomocą pipety p200 dodaj kroplami 200 μl kompleksu DNA-lipid do każdej studzienki.</li>
		<li>Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.</li>
		<li>Uważając, aby nie naruszyć monowarstwy, usunąć pożywkę wolną od surowicy zawierającą kompleksy DNA-lipid przez aspirację za pomocą odsysania lub pipety.</li>
		<li>Delikatnie odpipetować 2 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) kompletnej pożywki wzrostowej w dół po boku każdej studzienki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 24-48 godzin w celu uzyskania optymalnej ekspresji białka.</li>
</ol>
3. Indukcja aktywacji kaspazy
<ol>
	<li>Leczyć lekiem lub bodźcem, który indukuje aktywację kaspazy około 24 godziny po transfekcji.
	<ol>
		<li>Dodać pożądane stężenie leku do wstępnie ogrzanych (37 °C) pożywki do obrazowania (kompletna pożywka wzrostowa uzupełniona Hepes [20 mM, pH 7,2-7,5] i 2-merkaptoetanolem [55 μM]) i delikatnie wymieszać (Tabela 3).</li>
		<li>Odessać pożywkę z komórek za pomocą pipety lub z odsysaniem, a następnie, za pomocą pipety, delikatnie odpipetować 2 ml roztworu z 3.1.1 w dół po ściance studzienki.</li>
		<li>Dodaj pożywkę obrazową bez leku do jednego dołka jako nieleczoną kontrolę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C lub przejść do kroku 4.3 w celu przeprowadzenia eksperymentu poklatkowego.</li>
</ol>
4. Akwizycja danych kaspazy BiFC
<ol>
	<li>Kaspaza BiFC do pozyskiwania pojedynczego punktu czasowego
	<ol>
		<li>Włącz mikroskop i fluorescencyjne źródło światła zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Znajdź komórki pod filtrem RFP i skup się na fluorescencji genu reporterowego.</li>
		<li>Korzystając z ręcznego licznika zliczania, policz wszystkie komórki z dodatnim wynikiem zapytania ofertowego w polu widzenia. Zapisz liczbę.</li>
		<li>Zachowując to samo pole widzenia, przełącz się na filtr GFP (lub filtr YFP, jeśli jest dostępny) i, korzystając z ręcznego licznika liczenia, policz liczbę czerwonych krwinek, które są również zielone (Wenus-dodatnia). Przełączaj się między dwoma filtrami, aby upewnić się, że tylko czerwone krwinki są oceniane pod kątem pozytywności Wenus. Zapisz liczbę (Rysunek 3).</li>
		<li>Policz co najmniej 100 komórek z dodatnim wynikiem zapytania ofertowego z każdego z trzech indywidualnych obszarów płytki.</li>
		<li>W każdym obszarze oblicz procent transfekowanych komórek transfekowanych Wenus (tj. krwinek czerwonych, które są również zielone). Uśrednij otrzymane wartości procentowe, aby uzyskać odchylenie standardowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trójwymiarowe obrazowanie kaspazy BiFC
	<ol>
		<li>Włącz mikroskop zgodnie z instrukcjami producenta i uruchom oprogramowanie do akwizycji.</li>
		<li>Wybierz obiektyw olejowy 60x lub 63x i umieść kroplę oleju na obiektywie</li>
		<li>Umieść naczynie hodowlane na stoliku mikroskopu, używając odpowiedniego uchwytu na płytkę.</li>
		<li>Korzystając ze źródła światła epifluorescencyjnego i okularu mikroskopu lub laserów konfokalnych i ekranu komputera, przejdź do interesującego Cię pola.</li>
		<li>Skoncentruj się na fluorescencji reporterowej za pomocą lasera lub filtra RFP.</li>
		<li>Jeśli do tego momentu stosowano epifluorescencję, przełącz źródło światła na lasery konfokalne i wizualizuj obraz komórek na żywo uzyskany przez kamerę i wyświetlany przez oprogramowanie akwizycyjne na ekranie komputera.</li>
		<li>Za pomocą joysticka i pokrętła ostrości dostosuj ostrość i położenie komórek tak, aby znajdowały się na środku wizjera. Wybierz komórki, które są oddzielone od siebie i nie nakładają się na siebie.</li>
		<li>Wprowadź procentową moc lasera do 50% i czas ekspozycji na 100 ms zarówno dla Wenus, jak i zapytania ofertowego jako punkt wyjścia do określenia optymalnych ustawień do wykorzystania w eksperymencie.</li>
		<li>Włącz przechwytywanie na żywo i sprawdź wynikowy obraz oraz towarzyszące mu histogramy wyświetlania dla obu kanałów.</li>
		<li>Jeśli sygnał jest słaby, a obraz jest trudny do odczytania, zwiększaj procentową moc lasera i/lub czas naświetlania w krokach, aż sygnał na obrazie będzie wyglądał dobrze.</li>
		<li>Upewnij się, że sygnał nie osiąga nasycenia. Sprawdź histogram wyświetlacza, aby upewnić się, że dla każdego fluoru widoczny jest wyraźny pik. Jeśli pik obejmuje cały wyświetlany histogram, wprowadź niższe ustawienia mocy lasera i ekspozycji (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
		<li>Wizualizuj komórki kontrolne (nieleczone lub nietransfekowane) w tych samych warunkach, aby upewnić się, że sygnał jest specyficzny. 
		UWAGA: Jednokolorowe transfektanty mogą być również używane do kontroli krzyżowania, ale jeśli sygnały są przestrzennie odrębne (np. mitochondrialne kontra cytozolowe), nie jest to konieczne.</li>
		<li>Wybierz lub otwórz moduł stosu Z w oprogramowaniu mikroskopu.</li>
		<li>Za pomocą pokrętła ostrości ustaw w przybliżeniu pozycję ogniskowej odpowiadającą środkowi komórki.</li>
		<li>Dostosuj ostrość w jednym kierunku, aż komórka przestanie być widoczna, wybierz tę pozycję jako górną pozycję.</li>
		<li>Dostosuj ostrość w przeciwnym kierunku, aż komórka przestanie być widoczna, i wybierz ją jako dolną pozycję.</li>
		<li>Wybierz optymalny rozmiar kroku (zwykle około 20 μm) i rozpocznij akwizycję, aby poinstruować kamerę, aby automatycznie wykonała pojedynczy obraz w każdym kanale w każdym z 20 μm kroku między górną i dolną pozycją.</li>
		<li>Użyj oprogramowania do renderowania 3D, aby zrekonstruować obraz 3D (Rysunek 4, Film 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie poklatkowe kaspazy BiFC
	<ol>
		<li>Co najmniej 1 godzinę przed eksperymentem włączyć mikroskop i ustawić temperaturę na 37 °C.</li>
		<li>Wybierz obiektyw olejowy 40x, 60x lub 63x i umieść kroplę oleju na obiektywie.</li>
		<li>Umieść naczynie hodowlane na stoliku mikroskopu, używając odpowiedniego uchwytu na płytkę.</li>
		<li>Jeśli dostępne jest źródło CO2 , umieść urządzenie dostarczające CO2 (zwykle pokrywę z pleksiglasu przymocowaną do rurki dostarczającej CO2 ) na uchwycie płyty. Ustaw poziom CO2 na 5% i włącz regulator CO2 z poziomu oprogramowania. Jeśli źródło CO2 nie jest dostępne, dołącz 20 mM Hepes do buforowania nośnika.</li>
		<li>Przejdź do pola transfekowanych komórek i wizualizuj obraz komórek na żywo, uzyskany przez kamerę i wyświetlany przez oprogramowanie akwizycyjne na ekranie komputera za pomocą lasera RFP.</li>
		<li>Wykonując kroki 4.2.8-4.2.12, wprowadź ustawienia procentowej mocy lasera i czasu ekspozycji dla lasera RFP. Utrzymuj te wartości na jak najniższym poziomie, zachowując jednocześnie możliwość wykrycia sygnału fluorescencyjnego.</li>
		<li>Korzystając z pozytywnej próbki kontrolnej (zob. przykłady w tabeli 3), wykonaj kroki 4.2.8-4.2.12, aby wprowadzić ustawienia procentowej mocy lasera i czasu ekspozycji dla światła lasera YFP. Utrzymuj te wartości na jak najniższym poziomie, jednocześnie będąc w stanie wykryć sygnał Wenus.</li>
		<li>Dla każdego dołka płytki wybierz kilka różnych pozycji, które zawierają jedną lub więcej komórek wyrażających reportera.</li>
		<li>Wprowadź odstęp czasu między każdą klatką filmu poklatkowego i całkowitą liczbę klatek do zrobienia. Upewnij się, że jest czas na zajęcie wszystkich wybranych pozycji przed wykonaniem następnej klatki.</li>
		<li>Ponownie przyjrzyj się każdej pozycji i w razie potrzeby popraw i zaktualizuj ostrość.</li>
		<li>Aby skorygować dryft ogniskowej, który może wynikać ze zmian temperatury lub wibracji zewnętrznych, włącz system korekcji dryfu ostrości (jeśli jest dostępny).</li>
		<li>Rozpocznij tworzenie filmu poklatkowego i zapisz dane.</li>
		<li>Przeanalizuj dane za pomocą dostępnego oprogramowania do obrazowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 5, Film 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Salvesen, G. S., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Caspase mechanisms.</a> Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).</li>
<li>Boatright, K. M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+caspase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of caspase activation.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).</li>
<li>Luthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CASBAH%3A+a+searchable+database+of+caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">The CASBAH: a searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).</li>
<li>Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemical+mechanism+of+caspase-2+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">The biochemical mechanism of caspase-2 activation.</a> Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).</li>
<li>Boatright, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unified+model+for+apical+caspase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A unified model for apical caspase activation.</a> Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).</li>
<li>Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+domains+of+death%3A+evolution+of+the+apoptosis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">The domains of death: evolution of the apoptosis machinery.</a> Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).</li>
<li>Salvesen, G. S., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+activation%3A+the+induced-proximity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Caspase activation: the induced-proximity model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 10964-10967 (1999).</li>
<li>Oberst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+dimerization+and+inducible+cleavage+reveal+a+requirement+for+both+processes+in+caspase-8+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation.</a> J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).</li>
<li>Riedl, S. J., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+apoptosome%3A+signalling+platform+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The apoptosome: signalling platform of cell death.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).</li>
<li>Kischkel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity-dependent+APO-1+%28Fas%2FCD95%29-associated+proteins+form+a+death-inducing+signaling+complex+%28DISC%29+with+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.</a> EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).</li>
<li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasome%3A+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li>
<li>Tinel, A., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PIDDosome%2C+a+protein+complex+implicated+in+activation+of+caspase-2+in+response+to+genotoxic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress.</a> Science. 304 (5672), 843-846 (2004).</li>
<li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).</li>
<li>Bouchier-Hayes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cytoplasmic+caspase-2+activation+by+induced+proximity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity.</a> Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).</li>
<li>Manzl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-2+activation+in+the+absence+of+PIDDosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation.</a> J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).</li>
<li>Manzl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIDDosome-independent+tumor+suppression+by+Caspase-2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2.</a> Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).</li>
<li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NPM1+directs+PIDDosome-dependent+caspase-2+activation+in+the+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus.</a> J Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Sanders, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+imaging+of+inflammatory+caspase+dimerization+reveals+differential+recruitment+to+inflammasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes.</a> Cell Death Dis. 6, e1813(2015).</li>
<li>Aaronson, D. S., Horvath, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+road+map+for+those+who+don%27t+know+JAK-STAT%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A road map for those who don't know JAK-STAT.</a> Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).</li>
<li>Manton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cell+death+by+the+novel+proteasome+inhibitor+marizomib+in+glioblastoma+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo.</a> Sci Rep. 6, 18953(2016).</li>
<li>Fan, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+mCherry+as+a+new+red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+for+visualizing+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).</li>
<li>Chu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+far-red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+that+allows+for+efficient+visualization+of+protein+interactions+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions.</a> Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).</li>
<li>Karbowski, M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+mitochondrial+morphology+in+healthy+cells+and+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis.</a> Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).</li>
<li>Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CARD+plays+a+critical+role+in+ASC+foci+formation+and+inflammasome+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling.</a> Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).</li>
<li>Szymczak, A. L., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+2A+peptide-based+strategies+in+the+design+of+multicistronic+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.</a> Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).</li>
<li>Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdimer+processing+mechanism+of+procaspase-8+activation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation.</a> EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).</li>
<li>Stennicke, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-9+can+be+activated+without+proteolytic+processing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Caspase-9 can be activated without proteolytic processing.</a> J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).</li>
<li>Slee, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordering+the+cytochrome+c-initiated+caspase+cascade%3A+hierarchical+activation+of+caspases-2%2C+-3%2C+-6%2C+-7%2C+-8%2C+and+-10+in+a+caspase-9-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner.</a> J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).</li>
<li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases%3A+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W protokole tym omówiono zastosowanie podzielonych białek fluorescencyjnych do pomiaru bliskości indukowanej kaspazą. Split Venus została wybrana do tej techniki, ponieważ jest bardzo jasna, wysoce fotostabilna, a ponowne fałdowanie jest szybkie 13. Tak więc analiza ponownego fałdowania Wenus w pobliżu wywołanej kaspazą może dostarczyć szacunków dynamiki interakcji białek kaspazy w czasie zbliżonym do rzeczywistego. Wenus jest podzielona na dwa lekko zachodzące na siebie fragmenty, koniec N Wenus ...

Rodzina proteaz kaspazy znana jest ze swojej kluczowej roli w apoptozie i odporności wrodzonej 1. Ze względu na ich znaczenie, określenie, kiedy, gdzie i jak skutecznie aktywowane są określone kaspazy, może dostarczyć kluczowych informacji na temat mechanizmów szlaków aktywacji kaspazy. Opisany tutaj protokół oparty na obrazowaniu umożliwia wizualizację najwcześniejszych etapów kaskady aktywacji kaspazy. Technika ta wykorzystuje dynamiczne interakcje białko-białko, które napędzają aktywację kaspazy.
Kaspazy można podzielić na dwie grupy: kaspazy inicjujące (kaspaza-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 i -12) oraz kaspazy egzekutorskie (kaspazy-3, -6 i -7). Kaspazy egzekutora są obecne w komórce jako wstępnie uformowane dimery i są aktywowane przez rozszczepienie między dużą i małą podjednostką 2. Po aktywacji rozszczepiają liczne białka strukturalne i regulatorowe, powodując apoptozę 3. Kaspazy inicjujące są pierwszymi kaspazami, które są aktywowane w ścieżce i na ogół wyzwalają aktywację kaspaz egzekucyjnych. W przeciwieństwie do kaspaz katów, kaspazy inicjatora są aktywowane przez dimeryzację 4,5. Ta dimeryzacja jest ułatwiona przez rekrutację nieaktywnych monomerów do określonych kompleksów o dużej masie cząsteczkowej, znanych jako platformy aktywacyjne. Tworzenie platform aktywacyjnych jest regulowane przez szereg specyficznych interakcji białko-białko. Są one pośredniczone przez konserwatywne motywy interakcji białkowych obecne w proformie kaspazy inicjującej i obejmują domenę śmierci (DD), domenę efektorową śmierci (DED) i domenę rekrutacji kaspazy (CARD) 6 (<silna klasa="xfig">Figura 1A). Platformy aktywacyjne zazwyczaj obejmują białko receptorowe i białko adaptorowe. Receptor jest zwykle aktywowany po związaniu liganda, indukując zmianę konformacyjną, która pozwala na oligomeryzację wielu cząsteczek. Receptor następnie albo rekrutuje kaspazę bezpośrednio, albo cząsteczki adaptorowe, które z kolei doprowadzają kaspazę do kompleksu. W ten sposób liczne cząsteczki kaspazy znajdują się w bliskim sąsiedztwie, co pozwala na dimeryzację. Jest to znane jako model indukowanej bliskości 7. Po dimeryzacji kaspaza jest poddawana automatycznemu przetwarzaniu, które służy do stabilizacji aktywnego enzymu 4,8. Na przykład składanie apoptosomu Apaf1 jest wyzwalane przez cytochrom c po jego uwolnieniu z mitochondriów w procesie zwanym przepuszczalnością mitochondrialnej błony zewnętrznej (MOMP). Apaf1 z kolei rekrutuje kaspazę-9 poprzez interakcję, w której pośredniczy CARD obecny w obu białkach 9. Podobne interakcje białkowe powodują składanie się kompleksu sygnalizacyjnego indukującego śmierć CD95 (DISC), który prowadzi do aktywacji kaspazy-8; PIDDosome, który może aktywować kaspazę-2; oraz różne kompleksy inflamasomów, które inicjują aktywację kaspazy-1 10,11,12. W ten sposób kaspazy inicjujące są rekrutowane do określonych platform aktywacji przez wspólny mechanizm skutkujący indukowaną bliskością i dimeryzacją, bez których aktywacja nie nastąpi.
Dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencji kaspazy (BiFC) to test oparty na obrazowaniu, który został opracowany w celu zmierzenia tego pierwszego kroku w aktywacji kaspaz inicjujących, umożliwiając bezpośrednią wizualizację bliskości indukowanej kaspazą po montażu platformy aktywacyjnej. Metoda ta wykorzystuje właściwości rozszczepionego białka fluorescencyjnego Venus. Wenus jest jaśniejszą i bardziej fotostabilną wersją białka żółtej fluorescencji (YFP), którą można rozdzielić na dwa niefluorescencyjne i lekko nakładające się fragmenty: N-koniec Wenus (Wenus N lub VN) i C-koniec Wenus (Wenus C lub VC). Fragmenty te zachowują zdolność do ponownego składania i fluorescencji, gdy znajdują się w bliskiej odległości 13. Każdy fragment Wenus jest połączony z prodomeną kaspazy, która jest minimalną częścią kaspazy, która wiąże się z platformą aktywacyjną. Gwarantuje to, że kaspazy nie zachowują aktywności enzymatycznej, a zatem możliwa jest jednoczesna analiza dalszych zdarzeń związanych ze zdarzeniami endogennymi. Fragmenty Wenus ponownie się składają, gdy prodomeny kaspazy są rekrutowane do platformy aktywacyjnej i ulegają indukowanej bliskości. (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Uzyskana fluorescencja Wenus może być wykorzystana do dokładnego i specyficznego monitorowania lokalizacji subkomórkowej, kinetyki i wydajności składania inicjacyjnych platform aktywacji kaspazy w pojedynczych komórkach. Dane obrazowe można uzyskać za pomocą mikroskopii konfokalnej lub standardowej mikroskopii fluorescencyjnej i można je dostosować do wielu różnych podejść mikroskopowych, w tym: obrazowania poklatkowego w celu śledzenia aktywacji kaspazy w czasie rzeczywistym; obrazowanie o wysokiej rozdzielczości do precyzyjnego określania lokalizacji subkomórkowej; i kwantyfikacja punktu końcowego skuteczności aktywacji.
Ta technika została po raz pierwszy opracowana do zbadania aktywacji kaspazy-214. Podczas gdy uważa się, że platformą aktywacji kaspazy-2 jest PIDDosom, składający się z receptora PIDD (białko indukowane przez p53 z domeną śmierci) i adaptora RAIDD (homologiczne białko ICH-1 / CAD-3 związane z RIP z domeną śmierci), odnotowano aktywację kaspazy-2 niezależną od PIDDosomów. Sugeruje to, że istnieją dodatkowe platformy aktywacji kaspazy-2 15,16. Pomimo nieznajomości wszystkich składników platformy aktywacji kaspazy-2, technika kaspazy BiFC pozwoliła na skuteczne zbadanie szlaków sygnałowych kaspazy-2 na poziomie molekularnym 14,17. Udało nam się również dostosować ten protokół do kaspaz zapalnych (kaspaza-1, -4, -5 i -12) 18 i w zasadzie to samo podejście powinno wystarczyć do podobnej analizy każdej z pozostałych kaspaz inicjujących. Protokół ten można również zaadaptować do badania innych szlaków, w których dimeryzacja jest głównym sygnałem aktywującym. Na przykład białka STAT są aktywowane przez dimeryzację po fosforylacji przez kinazę janusową (JAK) 19. W związku z tym system BiFC może być wykorzystany do wizualizacji aktywacji STAT, a także wielu innych szlaków regulowanych przez dynamiczne interakcje białek. Poniższy protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące wprowadzania reporterów do komórek, a także metodologie pozyskiwania i analizy obrazów.

<table><tbody><tr><td>6-dołkowe niepowlekane naczynia ze szklanym dnem nr 1,5 20 mm</td><td>Mattek</td><td>P06G-1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>Osocze ludzkie Fibronektyna Oczyszczone białko</td><td>Millipore</td><td>FC010-10MG</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma</td><td>D8537-6x500ML</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>OPTI MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985088</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid C2-Pro VC</td><td>Addgene</td><td>49261</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid C2-Pro VN</td><td>Addgene</td><td>49262</td><td></td></tr><tr>Plazmidy <td></td><td></td><td>BiFC kaspazy zapalnej</td><td>dostępne na żądanie od komórek LBH</td></tr><tr><td>HeLa stabilnie eksprymujących składniki</td><td></td><td></td> C2-Pro BiFC <td>dostępne na żądanie od LBH</td></tr><tr><td>DsRed plazmid mito</td><td>Clontech</td><td>632421</td><td>podobne plazmidy, które mogą być używane jako reportery fluorescencyjne, można znaleźć na Addgene</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>2 Mercaptoethanol 1000X</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>q-VD-OPH</td><td>Apex Bio</td><td>A1901</td><td></td></tr></tbody></table>

oświetlanie szlaków aktywacji kaspazy za pomocą bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Rodzina proteaz kaspazy odgrywa kluczową rolę w apoptozie i odporności wrodzonej. Wśród nich podgrupa znana jako kaspazy inicjujące są pierwszymi, które są aktywowane w tych szlakach. Ta grupa obejmuje kaspazę-2, -8 i -9, a także kaspazy zapalne, kaspazę-1, -4 i -5. Wszystkie kaspazy inicjujące są aktywowane przez dimeryzację po rekrutacji do określonych kompleksów wielobiałkowych zwanych platformami aktywacyjnymi. Dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencji kaspazy (BiFC) to podejście oparte na obrazowaniu, w którym rozszczepione białka fluorescencyjne połączone z kaspazami inicjującymi są wykorzystywane do wizualizacji rekrutacji kaspaz inicjujących do ich platform aktywacyjnych i wynikającej z tego indukowanej bliskości. Ta fluorescencja zapewnia odczyt jednego z najwcześniejszych kroków wymaganych do aktywacji kaspazy inicjującej. Wykorzystując szereg różnych podejść opartych na mikroskopii, technika ta może dostarczyć danych ilościowych na temat skuteczności aktywacji kaspazy na poziomie populacji, a także kinetyki aktywacji kaspazy oraz wielkości i liczby kompleksów aktywujących kaspazę w przeliczeniu na komórkę.

Przykład BiFC dla kaspazy-2 indukowanego uszkodzeniem DNA przedstawiono na Rysunku 3. Kamptotecyna, inhibitor topoizomerazy I, została użyta do indukowania uszkodzeń DNA i aktywacji kaspazy-2. Czerwone białko fluorescencyjne mCherry posłużyło jako reporter wykazujący ekspresję sondy BiFC w komórkach oraz pomagający w wizualizacji całkowitej liczby komórek. Fluorescencja białka Venus jest pokazana na zielono, a duże punkty reprezentują indukowane kaspazą-2 zbl...

Ten protokół opisuje dwumolekularną komplementację fluorescencji kaspazy (BiFC); metodę opartą na obrazowaniu, która może być użyta do wizualizacji indukowanej bliskości kaspaz inicjujących, co jest pierwszym krokiem w ich aktywacji.

Oświetlanie szlaków aktywacji kaspazy za pomocą bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Ogólnym celem tej metodologii jest wizualizacja jednego z pierwszych kroków w aktywacji kaspaz inicjatora. Ten etap nazywa się indukowaną bliskością i występuje, gdy cząsteczki kaspazy łączą się, tworząc aktywne dimery podczas apoptotycznej śmierci komórki. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie kaspazy, takie jak kiedy, gdzie i jak skutecznie można aktywować określone kaspazy inicjujące.Główną zaletą tej techniki jest to, że można wizualizować składanie kompleksów aktywacyjnych kaspazy w żywych komórkach w czasie rzeczywistym. Ta metoda biomolekularnej komplementacji fluorescencji wykorzystuje fragmenty białka tyroksyny, Venus, które zostały winstalowane do kaspazy. Fragmenty same w sobie nie są fluorescencyjne, ale kiedy kaspaza ulega indukowanej bliskości, zbliża to dwie połówki Wenus do siebie i zapalają się.Aby przetoczyć komórki, najpierw dodaj 12 mikrolitrów odczynnika do transfekcji do 750 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy w sterylnej probówce. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie dodaj 10 nanogramów plazmidu reporterowego do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra dla każdej studzienki, która ma

lighting-up-pathways-to-caspase-activation-using-bimolecular

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Subkomórkowa lokalizacja białek jest kluczowa dla określenia czasowo-przestrzennej regulacji sygnalizacji komórkowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy bimolekularną komplementację fluorescencji (BiFC) jako prostą metodę monitorowania przestrzennych oddziaływań białek w komórce.

Bimolekularna komplementacja fluorescencyjna

Ten film opisuje BiFC-PALM ― połączenie fotoaktywowanej mikroskopii lokalizacyjnej i dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji ― do oceny interakcji białko-białko. BiFC polega na fuzji dwóch fluorescencyjnych fragmentów białek z dwoma oddziałującymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Kiedy te dwa białka wchodzą w interakcję, fragmenty są zbliżane do siebie, co pozwala obu częściom połączyć się i odtworzyć funkcjonalne białko fluorescencyjne. Fluorescencja pojedynczego fluoroforu...

Mikroskopia lokalizacji fotoaktywowanej sprzężona z fluorescencją fluorescencji bimolekularnej

Ten film pokazuje aktywację białek kaspazy u ludzkich makrofagów za pomocą białek reporterowych dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Prodomeny kaspazy-1 są połączone z niefluorescencyjnymi fragmentami białek Wenus, które są rekrutowane do kompleksów inflamasomowych. Bliskość inflamasomów indukuje ponowne fałdowanie i fluorescencję fragmentów Wenus, potwierdzając aktywację kaspazy w makrofagach.

Wizualizacja aktywacji kaspazy w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Opisana tutaj metoda jest używana do indukowania kaskady sygnalizacji apoptotycznej na określonych etapach w celu zbadania aktywności antyapoptotycznego bakteryjnego białka efektorowego. Metoda ta może być również stosowana do indukowalnej ekspresji białek proapoptotycznych lub toksycznych lub do analizowania interferencji z innymi szlakami sygnałowymi.

Zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową

Interakcje białko-białko są wizualizowane w komórkach z nanometrową rozdzielczością przestrzenną poprzez połączenie dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji (BiFC) z fotoaktywowaną mikroskopią lokalizacyjną (PALM). Opisano tutaj zastosowanie BiFC-PALM do obrazowania oddziaływań Ras-Raf w komórkach U2OS do wizualizacji klastrowania i dyfuzji w nanoskali poszczególnych kompleksów Ras-Raf.

Fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencji (BiFC-PALM)

Aby wykryć zdrowe komórki u całych zwierząt, które zawierają niski poziom aktywności kaspazy, dla Drosophila wygenerowano wysoce czuły biosensor o nazwie CaspaseTracker. Aktywność biosensora zależna od kaspazy jest wykrywana w długowiecznych zdrowych komórkach w narządach wewnętrznych dorosłych zwierząt hodowanych w zoptymalizowanych warunkach przy braku bodźców śmierci.

In vivo (in vivo) Biosensor śledzi nieapoptotyczną aktywność kaspazy u Drosophila

Anastasis jest technicznie trudne do wykrycia in vivo, ponieważ komórki, które odwróciły proces śmierci komórki, mogą być morfologicznie nie do odróżnienia od normalnych zdrowych komórek. Poniżej opisujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które ulegają anastazie u żywych zwierząt, przy użyciu naszego nowo opracowanego systemu biosensorów CaspaseTracker in vivo.

Wykrywanie anastazy in vivo za pomocą biosensora CaspaseTracker

Bioluminescencja - światło emitowane przez enzym lucyferazy utleniający substrat o małych cząsteczkach, lucyferynę - może być wykorzystane do aktywacji białek fotosensorycznych, dodając w ten sposób kolejny wymiar do stymulacji świetlnej i umożliwiając manipulowanie wieloma funkcjami zależnymi od światła w komórkach w skalach czasowych i przestrzennych.

Optogenetyka bioluminescencyjna 2.0: wykorzystanie bioluminescencji do aktywacji białek fotosensorycznych in vitro i in vivo

Ten protokół opisuje proces uzyskiwania makrofagów pochodzących z monocytów (MDM) z próbek ludzkiej krwi, prostą metodę skutecznego wprowadzania reporterów dwumolekularnej komplementacji fluorescencji kaspazy (BiFC) do ludzkiego MDM bez uszczerbku dla żywotności i zachowania komórek, oraz podejście oparte na obrazowaniu do pomiaru aktywacji kaspazy zapalnej w żywych komórkach.

Wizualizacja bliskości wywołanej zapalnymi kaspazami w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Ten protokół opisuje kompleksową metodę oceny aktywacji kaspazy (kaspaza-1, kaspaza-3, kaspaza-7, kaspaza-8, kaspaza-9 i kaspaza-11) w odpowiedzi na modele infekcji zarówno in vitro, jak i in vivo (u myszy) infekcji, sterylnych zniewag i raka w celu określenia inicjacji szlaków śmierci komórki, takich jak piroptoza, apoptoza, nekroptoza i PANoptosis.

Ocena aktywacji kaspazy w celu oceny wrodzonej śmierci komórek odpornościowych

Obecny protokół opisuje dwie metody pomiaru aktywności kaspazy za pomocą substratu fluorogenicznego za pomocą cytometrii przepływowej lub spektrofluorometru.

Pomiar aktywności kaspazy za pomocą testu fluorometrycznego lub cytometrii przepływowej

Poznaj metodę BiFC do wizualizacji aktywacji kaspaz w żywych komórkach w czasie rzeczywistym. Technika ta wykorzystuje fragmenty białka Venus do badania złożonych aktywacyjnych kaspaz i mechanizmów apoptozy.

Oświetlanie szlaków aktywacji kaspazy za pomocą bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów