Charakterystyka komórek odpornościowych w tkance tłuszczowej człowieka za pomocą cytometrii przepływowej

Ogólnym celem tej procedury jest zastosowanie cytometrii przepływowej do wyizolowania frakcji naczyniowej zrębu z ludzkiej tkanki tłuszczowej w celu fenotypowania różnych populacji komórek odpornościowych znajdujących się w tkance tłuszczowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach metabolicznych, takie jak to, jakie komórki odpornościowe gromadzą się w tkance tłuszczowej osób otyłych i w jakim stopniu. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na jednoczesny pomiar wielu markerów na komórkach odpornościowych oraz identyfikację i kwantyfikację tych komórek odpornościowych w tkance tłuszczowej.

Chociaż technika ta może dostarczyć kluczowego wglądu w stan zapalny tkanki tłuszczowej, może być również stosowana do innych narządów i tkanek. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej technice będą głównie zmagać się z zanieczyszczeniem komórek naczyniowych zrębu i utratą komórek podczas procedury barwienia. Dwoje moich doktorantów, Suzan Wetzels i Mitchell Bijnen, będzie wykonywać protokół.

Zacznij od użycia skalpela do zmielenia jednego grama biopsji tkanki tłuszczowej na kawałki o powierzchni około dwóch milimetrów kwadratowych. Przenieś kawałki do 50-mililitrowej probówki wirówkowej i dodaj 10 mililitrów roztworu kolagenazy do próbek. Inkubuj fragmenty tkanek przez 60 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością 60 cykli na minutę.

Następnie następuje filtracja przez sitko o średnicy 200 mikrometrów do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Przed odwirowaniem przepłukać filtr siedmioma mililitrami PBS. Następnie użyj pipety, aby usunąć supernatant bez zanurzania całej końcówki pipety w roztworze.

Osad powinien być dobrze widoczny i usuwać prawie cały supernatant, aby uniknąć zanieczyszczenia frakcji naczyniowej zrębu komórkami tłuszczowymi. Zawieszamy osad komórek naczyniowych zrębu z pięcioma mililitrami świeżego PBS i filtrujemy frakcję naczyniową zrębu przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do nowej probówki. Po odwirowaniu zawiesiliśmy przemyty osad frakcji naczyniowej zrębu w trzech mililitrach buforu do lizy erytrocytów na pięć minut na lodzie.

Następnie zatrzymaj lizę za pomocą siedmiu mililitrów PBS i zagnieźdź komórki przez odwirowanie. Aby zabarwić frakcję naczyniową zrębu do analizy cytometrycznej przepływowej, ponownie zawieś osad w 90 mikrolitrach sortowania komórek aktywowanych fluorescencją o czterech stopniach Celsjusza lub buforze FACS i zablokuj niespecyficzne barwienie dziesięcioma mikrolitrami ludzkiej IgG. Podziel zawiesinę komórek między dwie studzienki 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V i umieść komórki na lodzie na 15 minut.

Pod koniec inkubacji przemyć każdą próbkę 100 mikrolitrami buforu FACS, obracając płytkę do góry nogami jednym płynnym ruchem bez stukania w celu odrzucenia supernatantów na końcu wirowania. Upewnij się, że wyraźnie widzisz osad na dnie płytki, zanim odwrócisz go do góry nogami, aby zapobiec utracie komórek podczas zabiegu. Zawiesić pierwszą osadkę w 29,5 mikrolitrze koktajlu przeciwciał dla pierwszego panelu FACS i drugą osadkę w 23 mikrolitrach koktajlu przeciwciał dla drugiego panelu FACS.

Po 30 minutach na lodzie w ciemności umyj komórki 150 mikrolitrami buforu FACS na studzienkę i utrwal granulki komórek w 150 mikrolitrach jednoprocentowego roztworu formaldehydu. Przenieść zawiesiny komórek z każdej studzienki do odpowiednich probówek FACS i umieścić próbki na lodzie. Przed ich analizą należy załadować niebarwioną, ujemną kontrolę do cytometru przepływowego, aby ustawić parametry rozproszenia do przodu i rozrzutu bocznego.

Następnie dostosuj napięcia cytometru przepływowego zgodnie z instrukcjami producenta, aż wszystkie interesujące nas populacje będą widoczne na wykresach rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego i będzie można dokonać rozróżnienia między szczątkami a żywymi komórkami. Po ustawieniu wszystkich parametrów należy wirować pierwszą próbkę doświadczalną z prędkością 800 obr./min, aby dokładnie zawiesić komórki i załadować próbkę do cytometru. Odczytaj co najmniej 50 000 zdarzeń w bramce na żywo, a następnie wiruj i załaduj drugą próbkę do analizy, jak pokazano poniżej.

Aby umożliwić analizę populacji makrofagów tkanki tłuszczowej w tym reprezentatywnym eksperymencie, wykluczono inne komórki odpornościowe, takie jak limfocyty T, limfocyty B, neutrofile i komórki NK w celu ujawnienia obecności makrofagów CD11b + CD11c, makrofagów CD11B + CD11C i komórek dendrytycznych CD11Blow-CD11C +. Kwantyfikacja głównej intensywności fluorescencji tych komórek ujawniła ekspresję komórek dendrytycznych cytoidu plazmy i generycznych markerów komórek dendrytycznych na komórkach CD11B + CD11C + i CD11Blow-CD11C +, z wyższą ekspresją obu markerów obserwowaną na komórkach CD11Blow-CD11C +, potwierdzając, że komórki CD11Blow-CD11C + były w rzeczywistości komórkami dendrytycznymi. Bramkowanie komórek CD45 dodatnich ujawniło populacje komórek T CD19 dodatnich B i CD3, z których te ostatnie można dalej podzielić na podgrupy limfocytów T CD3 + CD4 + T i CD3 + CD8 + cytotoksyczne limfocyty T oraz komórki NK CD3-CD56 +.

Następnie obliczono odsetek żywotnych komórek odpornościowych dla każdego pacjenta, ujawniając znaczny wzrost odsetka prozapalnych makrofagów CD11B+CD11C+ w trzewnej tkance tłuszczowej otyłych dorosłych mężczyzn. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby utrzymywać i frakcje komórkowe na lodzie, a podczas znakowania komórek przeciwciałami bardzo ważne jest, aby trzymać je w ciemności.

Po jej opracowaniu, technika ta pozwoliła naukowcom zajmującym się badaniami metabolicznymi na zbadanie zmian w komórkach odpornościowych w tkance tłuszczowej człowieka. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować komórki odpornościowe tkanki tłuszczowej i jak wykonać cytometrię przepływową na tych komórkach. Pamiętaj, że pracujesz z potencjalnie zakaźnym materiałem i substancjami ludzkimi, takimi jak formaldehyd, które mogą być niebezpieczne.

Zawsze zachowuj środki ostrożności, nosząc rękawice i okulary ochronne.