Name: Przygotowanie, oczyszczanie i stosowanie liposomów zawierających kwasy tłuszczowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Poznaj metodę przygotowania i oczyszczania liposomów z kwasami tłuszczowymi do badań nad sztucznymi protokomórkami i pochodzeniem życia. Protokół umożliwia wydajną produkcję jednorodnych wodniczek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

J.W.S. jest badaczem Instytutu Medycznego Howarda Hughesa. Praca ta była częściowo wspierana przez grant (290363) Fundacji Simonsa dla J.W.S. Zarówno A.E.E., jak i K.P.A. potwierdzają wsparcie ze strony funduszy start-upowych University of Minnesota.

<ol><li>Hanczyc, M. M., Fujikawa, S. M., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Models+of+Primitive+Cellular+Compartments%3A+Encapsulation%2C+Growth%2C+and+Division%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Experimental Models of Primitive Cellular Compartments: Encapsulation, Growth, and Division.</a> Science. 302, 618-622 (2003).</li>
<li>Mansy, S. S., Schrum, J. P., Krishnamurthy, M., Tobé, S., Da Treco,, Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template-directed+synthesis+of+a+genetic+polymer+in+a+model+protocell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Template-directed synthesis of a genetic polymer in a model protocell.</a> Nature. 454 (7200), 122-125 (2008).</li>
<li>Apel, C. L., Deamer, D. W., Mautner, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+vesicles+of+monocarboxylic+acids+and+alcohols%3A+conditions+for+stability+and+for+the+encapsulation+of+biopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Self-assembled vesicles of monocarboxylic acids and alcohols: conditions for stability and for the encapsulation of biopolymers.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1559 (1), 1-9 (2002).</li>
<li>Walde, P., Wick, R., Fresta, M., Mangone, A., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja00105a004">Autopoietic Self-Reproduction of Fatty Acid Vesicles.</a> J. Am. Chem. Soc. 116 (26), 11649-11654 (1994).</li>
<li>Sulston, J., Lohrmann, R., Orgel, L. E., Todd Miles, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC224735/">Nonenzymatic Synthesis of Oligoadenylates on a Polyuridylic Acid Template.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 59 (3), 726-733 (1967).</li>
<li>Adamala, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonenzymatic+template-directed+RNA+synthesis+inside+model+protocells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nonenzymatic template-directed RNA synthesis inside model protocells.</a> Science. 342 (6162), Science. New York, N.Y. 1098-1100 (2013).</li>
<li>Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+catalytic+oligoribonucleotide%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small catalytic oligoribonucleotide.</a> Nature. 328 (6131), 596-600 (1987).</li>
<li>Chen, I. A., Salehi-Ashtiani, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+catalysis+in+model+protocell+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">RNA catalysis in model protocell vesicles.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (38), 13213-13219 (2005).</li>
<li>Adamala, K. P., Engelhart, A. E., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaboration+between+primitive+cell+membranes+and+soluble+catalysts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Collaboration between primitive cell membranes and soluble catalysts.</a> Nat. Commun. 7, 1-7 (2016).</li>
<li>Joyce, G. F., Inoue, T., Orgel, L. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6205154">RNA Template-directed Synthesis on Random Copolymers.</a> J. Mol. Biol. 176, 279-306 (1984).</li>
<li>Adamala, K., Engelhart, A. E., Kamat, N. P., Jin, L., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+liposome+dialyzer+for+the+preparation+of+high-value%2C+small-volume+liposome+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Construction of a liposome dialyzer for the preparation of high-value, small-volume liposome formulations.</a> Nat. Protoc. 10 (6), 927-938 (2015).</li>
<li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19347043">Preparation of large monodisperse vesicles.</a> PloS one. 4 (4), e5009(2009).</li>
<li>Zhu, T. F., Budin, I., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+extrusion+through+polycarbonate+track-etched+membranes+using+a+hand-held+mini-extruder%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzym%22%5BJournal%5D)">Vesicle extrusion through polycarbonate track-etched membranes using a hand-held mini-extruder.</a> Methods Enzym. 533, Elsevier Inc. (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Liposomy utworzone z kwasów tłuszczowych są przez wielu sugerowane jako potencjalne modele dla komórek prymitywnych ze względu na ich wysoką przepuszczalność i właściwości dynamiczne. Karboksylowa grupa główna jednołańcuchowych kwasów tłuszczowych pozwala na samoorganizację w błony tylko w ograniczonym zakresie pH, a powstałe błony są dość wrażliwe na obecność soli. W rezultacie pęcherzyki kwasów tłuszczowych wymagają innych metod przygotowania i obchodzenia się z pęcherzykami fosfolipidowymi.
W tym protokole, chociaż używamy kwasu oleinowego jako przykładu tworzenia liposomów, inne długołańcuchowe nienasycone kwasy tłuszczowe (C14) i ich pochodne (ok. kwas mirystoleinowy, kwas palmitynowy i odpowiadające im alkohole i estry glicerolu) również tworzą pęcherzyki zgodnie z metodą rehydratacji cienkowarstwowej, o ile całkowite stężenie lipidów jest powyżej cmc, a pH buforu hydratacyjnego jest zbliżone do pKa kwasu tłuszczowego w błonie. Poza buforem tris-HCl stosowanym w tym protokole, doniesiono, że inne systemy buforowe (ca. bicyna, fosforan, boran) wspierają tworzenie pęcherzyków kwasów tłuszczowych, chociaż pęcherzyki utworzone w buforze fosforanowym lub boranowym są zwykle dość nieszczelne13. Powstałe pęcherzyki kwasów tłuszczowych po ponownym uwodnieniu są polidyspersyjne i wielopłytkowe, ale łatwo przekształcają się w małe monodyspersyjne pęcherzyki jednowarstwowe przez wytłaczanie, jak opisano. W porównaniu z sonikacją jako alternatywną metodą generowania małych pęcherzyków, ekstruzja zapewnia więcej możliwości kontroli wielkości pęcherzyków poprzez zastosowanie membran o różnej wielkości porów. Pęcherzyki po ekstruzji są zwykle nieco większe niż rozmiar porów błony, ale zwiększając liczbę cykli ekstruzji, można uzyskać pęcherzyki o węższym rozkładzie wielkości i średniej wielkości zbliżonej do wielkości porów błony.
Aby zsyntetyzować funkcjonalne protokomórki, pęcherzyki kwasów tłuszczowych muszą być gospodarzami określonych reakcji biochemicznych wynikających z enkapsulacji RNA lub innych elementów budulcowych. Metoda rehydratacji cienkowarstwowej zapewnia łatwy sposób tworzenia pęcherzyków zawierających pożądane zamknięte materiały. Jednak skuteczność enkapsulacji jest stosunkowo niska, a duża część cennych materiałów, takich jak RNA, jest zwykle tracona podczas procesu oczyszczania. W niektórych przypadkach wydajność hermetyzacji można nieznacznie poprawić poprzez powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania przed wytłaczaniem. Mikroprzepływowe metody wysokowydajnego otrzymywania liposomów fosfolipidowych pozwalają na uzyskanie niemal 100% skuteczności enkapsulacji, jednak analogiczne metody nie zostały jeszcze opracowane dla pęcherzyków kwasów tłuszczowych.
W przypadku pracy z protokomórkami chelatowanymi lub wolnymiMg2+, oczyszczanie po dodaniu roztworu magnezu i ponowne oczyszczanie przed każdym punktem czasowym zapewnia usunięcie nieszczelnego materiału zamkniętego w kapsułkach, który może wpływać na dokładność pomiarów szybkości reakcji wewnątrz pęcherzyków. Ponieważ każde oczyszczanie trwa co najmniej 10 minut, aby osiągnąć dobrą separację i zebrać frakcje pęcherzyków, analiza szybkich reakcji jest trudna, a reakcję należy zatrzymać przed ponownym oczyszczeniem kolumny.
Przedstawiony przez nas protokół doskonale nadaje się do budowy liposomów kwasów tłuszczowych, w których przeprowadzane są reakcje naśladujące te, które mogą zachodzić w prymitywnych komórkach. Nasze protokoły umożliwiają również potencjalne zastosowania w rozwoju biomedycznych systemów dostarczania i bioreaktorów dla innych reakcji biochemicznych.

Liposomy lub pęcherzyki - kompartmenty ograniczone dwuwarstwowymi błonami składającymi się z amfifilowych lipidów - znalazły zastosowanie w licznych zastosowaniach biomedycznych jako nośniki dla farmaceutyków, modeli błon komórkowych i do rozwoju komórek syntetycznych. My i inni wykorzystaliśmy również liposomy jako modele prymitywnych błon komórkowych we wczesnym okresie życia. 1,2,3,4 Zazwyczaj w takich systemach stosujemy jednołańcuchowe amfifile zawierające tylko jeden ogon węglowodorów lipidowych (np. kwas oleinowy), ponieważ cząsteczki te są łatwiejsze do syntezy bez korzystania z kodowanych enzymów białkowych, które wykorzystują nowoczesne komórki.
Liposomy składające się z jednołańcuchowych lipidów są podobne do tych utworzonych z diacylofosfolipidów (np. 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-fosfocholiny, lub POPC) w tym, że granica składa się z dwuwarstwowych błon. Liposomy utworzone z dowolnej klasy lipidów mogą zachować rozpuszczony ładunek i mogą być zmniejszane i oczyszczane różnymi technikami. Kilka istotnych różnic wynika z unikalnych właściwości chemicznych lipidów jednołańcuchowych. Pęcherzyki utworzone przez fosfolipidy są stabilne w szerokim zakresie pH, podczas gdy pęcherzyki kwasów tłuszczowych są stabilne tylko przy pH obojętnym do łagodnie zasadowego (ok. 7 - 9), co wymaga pewnego buforu pH do przygotowania pęcherzyków. W większości przypadków bufor ten może również zawierać specyficzne rozpuszczalne cząsteczki do enkapsulacji pęcherzyków, które mogą być materiałami funkcjonalnymi (np. RNA) do podzielonych na przedziały reakcji biochemicznych lub prostymi barwnikami fluorescencyjnymi (np. kalceiną) do charakterystyki pęcherzyków.
Obecność tylko jednego łańcucha węglowodorowego wytwarza membranę, która jest zarówno bardziej przepuszczalna dla substancji rozpuszczonych, jak i bardziej dynamiczna. Dodatkowo grupa głowy kwasu karboksylowego obecna w kwasach tłuszczowych powoduje, że pęcherzyki są bardziej wrażliwe na obecność soli i kationów dwuwartościowych (np. Mg2+). Magnez jest jednym z najważniejszych dwuwartościowych kationów katalizujących reakcje biochemiczne w protokomórkach do badań nad pochodzeniem życia. We wczesnym okresie życia, przed ewolucją wyrafinowanych enzymów białkowych, RNA mogło być dominującym polimerem, ze względu na jego podwójną zdolność do samoreplikacji i przeprowadzania katalizy. Jednym z reprezentatywnych przykładów reakcji związanej z RNA wymagającej magnezu jest nieenzymatyczne kopiowanie RNA, po raz pierwszy zademonstrowane w latach 1960.5 Gdy chemicznie aktywowane nukleotydy RNA (tj. nukleotydy 2-metyloimidazolidu) wiążą się z istniejącym wcześniej kompleksem starter-matryca, grupa 3'-hydroksylowa startera atakuje 5'-fosforan sąsiedniego aktywowanego monomeru, aby przemieścić grupę opuszczającą (tj. 2-metyloimidazol) i tworzy nowe wiązanie fosfodiestrowe. Ta chemia kopiowania RNA wymaga wysokiego stężenia Mg2+, który musi być chelatowany, aby był kompatybilny z protokomórkami kwasów tłuszczowych. 6 Inną zależną od Mg2+ reakcją jest ta katalizowana przez rybozym młota, który jest prawdopodobnie najlepiej scharakteryzowanym katalitycznym RNA. Ten rybozym, który można odtworzyć z dwóch krótkich oligonukleotydów, przeprowadza reakcję samorozszczepienia, która jest wygodna do monitorowania przez przesunięcie żelu. W związku z tym jest często stosowany jako rybozym modelowy w badaniach nad pochodzeniem życia. 7 Ze względu na zapotrzebowanie tego rybozymu na niezligandowany magnez, liposomy są zazwyczaj budowane przez mieszaninę kwasów tłuszczowych i estrów glicerolu kwasów tłuszczowych, które są bardziej stabilne dla magnezu. 8,9 W tym protokole prezentujemy opracowane przez nas techniki przygotowania, manipulacji, charakterystyki tych pęcherzyków i demonstrujemy zastosowanie tych pęcherzyków jako protokomórek do nieenzymatycznego kopiowania RNA i katalizy rybozymu młota.

<table><tbody><tr><td>sephorose 4B</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>4B200</td><td></td></tr><tr><td>calceina</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>C0875-10G</td><td></td></tr><tr><td>tris-HCl pH8.0 1M</td><td>LIFE TECHNOLOGIES CORP</td><td>AM9851</td><td></td></tr><tr><td>kwas cytrynowy</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>251275-500G</td><td></td></tr><tr><td>wodorotlenek sodu</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>71690-250G</td><td></td></tr><tr><td>wodorotlenek potasu</td><td>Sigma</td><td>30614</td><td></td></tr><tr><td>kwas oleinowy</td><td>Nu-Chek</td><td>U-46-A</td><td></td></tr><tr><td>monooleinian glicerolu</td><td>Nu-Chek</td><td>M-239</td><td></td></tr><tr><td>Liss Rhodamine-PE</td><td>LIFE TECHNOLOGIES CORP</td><td>L1392</td><td></td></tr><tr><td>chlorek magnezu</td><td>Fisher/Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>koncentrat sequagel</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-830</td><td></td></tr><tr><td>sequagel DILUENT</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-840</td><td></td></tr><tr><td>15% TBE-UREA GEL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC68852BOX</td><td></td></tr><tr><td>mocznik</td><td>Sigma</td><td>Aldrich U6504-500G</td><td></td></tr><tr><td>titon-100x</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>T9284-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Podkład RNA</td><td>IDT</td><td>5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG</td><td></td></tr><tr><td>RNA szablon</td><td>IDT</td><td>5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC</td><td></td></tr><tr><td>nić podłoża młotkowatego</td><td>IDT</td><td>5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC</td><td></td></tr><tr><td>pasmo rybozymu młotka</td><td>IDT</td><td>5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG</td><td></td></tr><tr><td>zestaw wytłaczarek pęcherzykowych</td><td>AVANTI POLAR LIPIDS</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>kolektor frakcji</td><td>Gilson, Inc.</td><td></td><td></td>171041</tr><tr><td>96-dołkowe płytki</td><td>Czytnik</td> płytek Fisher <td>NC9995941/675</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Urządzenia molekularne</td> Mikroskop konfokalny <td>SpectraMax i3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon Nikon</td><td>A1R MP Skaner żelowy konfokalny</td><td></td></tr><tr><td></td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>Skaner</td><td></td> Typhoon 9410</tr></tbody></table>

przygotowanie, oczyszczanie i stosowanie liposomów zawierających kwasy tłuszczowe

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomy zawierające amfifile jednołańcuchowe, szczególnie kwasy tłuszczowe, wykazują odmienne właściwości w porównaniu do tych zawierających diacylofosfolipidy ze względu na unikalne właściwości chemiczne tych amfifilów. W szczególności liposomy kwasów tłuszczowych wzmacniają dynamiczny charakter, ze względu na stosunkowo wysoką rozpuszczalność amfifilów jednołańcuchowych. Podobnie liposomy zawierające wolne kwasy tłuszczowe są bardziej wrażliwe na sól i kationy dwuwartościowe, ze względu na silne oddziaływania między grupami głównymi kwasu karboksylowego a jonami metali. Poniżej przedstawiono techniki otrzymywania, oczyszczania i stosowania liposomów składających się w części lub w całości z amfifilów jednołańcuchowych (np. kwasów oleinowych).

Oczyszczanie liposomów przeprowadzamy zazwyczaj na kolumnach do chromatografii żelowej. Typowe preparaty liposomów zawierają fluorofor. Podczas tworzenia i ekstruzji liposomów substancje przeznaczone do enkapsulacji znajdują się zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz liposomów. Dzięki oczyszczaniu liposomów na żywicy do wykluczania molekularnego (Sepharose 4B), niezaenkapsulowane substancje rozpuszczone są zatrzymywane w porach żywicy, podczas gdy większe liposomy nie są zatrzymywane i eluują jako pierwsze (Rycina 1A). Zbieranie frakcji i wykreślenie zależności fluorescencji od numeru frakcji (Rycina 1B) zazwyczaj daje wykres z dwoma pikami, gdzie frakcje eluujące wcześniej odpowiadają liposom, które są następnie zbierane i wykorzystywane w dalszych zastosowaniach.
Często badamy nieenzymatyczne reakcje wydłużania starterów, które prawdopodobnie stanowiły sposób replikacji RNA przed pojawieniem się rybozymów i białkowych polimeraz RNA. W reakcjach tych zazwyczaj wykorzystuje się starter znakowany fluorescencyjnie (Rysunek 2A), który jest wydłużany przez aktywowane monomery. Przebieg tych reakcji można monitorować za pomocą elektroforezy żelowej (Rysunek 2B), a otrzymane elektrofereogramy poddać całkowaniu w celu wyznaczenia stałych szybkości dla określonych warunków reakcji (Rysunek 2C).
Aby wykazać, że RNA może funkcjonować wewnątrz protokomórek, wykorzystaliśmy samocięcie rybozymu typu hammerhead (Rysunek 3A) jako modelową reakcję katalityczną RNA. Reakcja ta wymaga wolnych jonów Mg2+ do wspomagania katalizy, dlatego zastosowano pęcherzyki OA/GMO, ponieważ są one stabilne w obecności 5 mM Mg2+. Podobnie jak w reakcjach wydłużania startera, reakcję samocięcia rybozymu typu hammerhead można monitorować za pomocą elektroforezy żelowej (Rysunek 3B), a następnie poddać analizie w celu wyznaczenia stałej szybkości reakcji w określonych warunkach (Rysunek 3C).
Obrazujemy liposomy, wykorzystując zarówno fluorescencję, jak i światło przechodzące. Liposomy można znakować za pomocą lipidów fluorescencyjnych, co pozwala na znakowanie błony (Rysunek 4A), lub za pomocą fluorescencyjnego substancji rozpuszczonej w ich wnętrzu (Rysunek 4B). Światło przechodzące może być również wykorzystane do obserwacji pęcherzyków (pokazane również na Rysunku 4B).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Tabela 1.1 czysty kwas oleinowy w chloroformie</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Komponent</td>
			<td>Zasób</td>
			<td>Ilość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Kwas oleinowy</td>
			<td>&gt;99%</td>
			<td>11.7 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Chloroform</td>
			<td></td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Tabela 1.2 kwas oleinowy i monooleinian glicerolu (9:1) w chloroformie</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Komponent</td>
			<td>Roztwór zapasowy</td>
			<td>Ilość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Kwas oleinowy</td>
			<td>&gt;99%</td>
			<td>10.5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Monooleinian glicerolu</td>
			<td>&gt;99%</td>
			<td>1.4 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Chloroform</td>
			<td></td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Tabela 1.3 kwas oleinowy z 0,2mol% rodaminy-PE w chloroformie</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Komponent</td>
			<td>Roztwór zapasowy</td>
			<td>Ilość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Kwas oleinowy</td>
			<td>&gt;99%</td>
			<td>1.6 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Rhodamina-PE w chloroformie</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>20 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Chloroform</td>
			<td></td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Chloroformowe roztwory kwasów tłuszczowych.
<img alt="Separacja pęcherzyków z kalceiną, schemat SDS-PAGE, wykres fluorescencji przedstawiający wyniki analizy piku." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1. Oczyszczanie pęcherzyków i charakterystyka fluorescencyjna frakcji oczyszczania. A. Oddzielanie pęcherzyków zawierających kalceinę od wolnej kalceiny na kolumnie z Sepharose 4B. B. Wykrywanie piku kalceiny w pęcherzykach oraz wolnej kalceiny poprzez wykreślenie fluorescencji w każdej studzience w funkcji numeru studzience po zebraniu frakcji. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57324/57324fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="proces elongacji DNA, elektroforeza żelowa, analiza rozpadu; eksperyment, wyniki w funkcji czasu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Nieenzymatyczna replikacja RNA wewnątrz pęcherzyków OA. A. Schemat nieenzymatycznej elongacji startera RNA. B. Obraz PAGE reakcji wydłużania startera wewnątrz czystych pęcherzyków kwasu oleinowego, w warunkach opisanych w sekcji 4. C. Regresja liniowa naturalnego logarytmu stosunku ilości primera pozostałego w danym punkcie czasowym do początkowej ilości primera w funkcji czasu w ciągu 30 h. Szybkość reakcji, obliczona na podstawie nachylenia ln(P/P0) w funkcji czasu wynosi 0,058 h-1. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57324/57324fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat cięcia RNA, elektroforeza żelowa, wykres analizy kinetycznej; przedstawia konwersję substratu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Cięcie przez rybozym typu hammerhead w pęcherzykach OA/GMO. A. Schemat cięcia fluorescencyjnie znakowanej nici substratu (góra) przez rybozym typu hammerhead. B. Obraz PAGE obrazujący cięcie rybozymu typu hammerhead wewnątrz pęcherzyków OA/GMO w obecności 5 mM Mg2+. C. Aktywność rybozymu wewnątrz pęcherzyków. Regresja liniowa naturalnego logarytmu stosunku ilości substratu pozostałego w danym punkcie czasowym do początkowej ilości substratu w funkcji czasu w ciągu pierwszych 4 h. Szybkość reakcji, obliczona na podstawie nachylenia ln(S/S0) w funkcji czasu wynosi 0,36 h-1. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57324/57324fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy, test fluorescencyjny porównujący markery czerwone i zielone w badaniach komórkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Gigantyczne pęcherzyki kwasów tłuszczowych do mikroskopii. A. Obraz z mikroskopii konfokalnej pęcherzyka kwasu oleinowego znakowanego Rodaminą PE, pasek skali 10 μm. B. Obraz z mikroskopii konfokalnej pęcherzyka kwasu oleinowego zawierającego RNA znakowane Alexa48 z membraną widoczną w kanale detektora transmitowanego (TD), pasek skali 5 μm.

Liposomy zawierające amfifile jednołańcuchowe, szczególnie kwasy tłuszczowe, wykazują odmienne właściwości w porównaniu do tych zawierających diacylofosfolipidy ze względu na unikalne właściwości chemiczne amfifilów jednołańcuchowych. Tutaj opisujemy techniki przygotowania, oczyszczania i stosowania liposomów składających się z części lub całości tych amfifilów.

Przygotowanie, oczyszczanie i stosowanie liposomów zawierających kwasy tłuszczowe

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie, oczyszczenie i wykorzystanie liposomów składających się częściowo lub w całości z kwasów tłuszczowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii syntetycznej i badaniach nad pochodzeniem życia, takie jak definiowanie minimalnych komórek i konstruowanie sztucznych protokomórek. Główną zaletą tego protokołu jest to, że wprowadza łatwy i niedrogi sposób wytwarzania wysokowydajnych monorozproszonych pęcherzyków kwasów tłuszczowych i obchodzenia się z nimi w różnych warunkach eksperymentalnych.Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ pęcherzyki kwasów tłuszczowych są delikatniejsze niż pęcherzyki fosfolipidowe, zwłaszcza w obecności Aby przygotować cienkie warstwy wysuszonych lipidów, użyj gazoszczelnych strzykawek, aby przenieść określoną ilość lipidu w chloroformie do szklanej fiolki. Odparować chloroform pod strumieniem azotu lub argonu w dygestorium. Powstałą cienką warstwę należy poddać próżni domowej przez co najmniej dwie godziny, aby usunąć wszelkie pozostałości chloroformu.W tym momencie lipid można pozostawić na noc w próżni. Aby ponownie nawodnić pęcherzyki, należy odpipetować 250 mikrolitrów buforu hydracyjnego do pustej probówki, a następnie dodać 1,875 mikrolitra 10-molowego wodorotlenku sodu, aby uzyskać ostateczną 75-milimolową zasadę. Przenieś roztwór do cienkiej warstwy suchego lipidu, aby utworzyć pęcherzyki o całkowitym stężeniu kwasów tłuszczowych 0,15 mola, a następnie użyj wirownika o dużej prędkości, aby wirować powstałą mieszaninę przez cztery do pięciu sekund.Mieszaj mieszaninę lipidowych na wolnoobrotowej wytrząsarce w celu nawodnienia przez noc. Aby wygenerować pęcherzyki o jednolitym rozmiarze, użyj pęsety, aby nałożyć jedną podporę filtra na każdą wewnętrzną powierzchnię portów strzykawkowych wytłaczarki do liposomów. Zwilż każdy wspornik filtra 250 milimolowym Tris-HCL pH 8.Za pomocą pęsety nałóż jedną ścieżkę wytrawiania na membranę poliwęglanową 100 nanometrów na jeden z o-ringów ekstrudera i wsporników filtra. Uważając, aby nie rozerwać ani nie przebić membrany, delikatnie wepchnij membranę w o-ring, aby zapewnić dobry kontakt między dwiema powierzchniami. Następnie zmontuj ekstruder, uważając, aby nie przesunąć membrany i wsporników filtra.Napełnij strzykawkę ekstrudera około 0,5 mililitra 250 milimolowego Tris-HCL pH 8. Włóż tę strzykawkę po jednej stronie ekstrudera. Włóż pustą strzykawkę po drugiej stronie ekstrudera.Powoli ręcznie wcisnąć tłok i bufor zawierający strzykawkę i sprawdzić, czy wyczuwalny jest opór wskazujący, że membrana z wytrawionymi ścieżkami jest na swoim miejscu i jest nienaruszona. Pomocne jest przećwiczenie tego kroku bez założonej membrany, aby ocenić oczekiwany poziom oporu. Wyjąć i opróżnić obie strzykawki.Na tym etapie nie jest konieczne czyszczenie obu strzykawek, ponieważ zawierają one bufor o identycznym składzie jak preparat liposomowy. Następnie załaduj preparat liposomowy do jednej z dwóch strzykawek. Zmontuj ekstruder ze strzykawką zawierającą próbkę pęcherzyków po lewej stronie i pustą strzykawką po prawej stronie.Następnie bardzo powoli ręcznie wcisnąć tłok strzykawki zawierającej próbkę pęcherzyka. Uważnie obserwuj strzykawkę po prawej stronie ekstrudera. Przezroczysty bufor początkowo wejdzie po prawej stronie ekstrudera ze względu na wewnętrzną martwą objętość ekstrudera, a następnie mały pióropusz wytłaczanych liposomów.W tym momencie natychmiast przestań naciskać. Wyjmij strzykawkę po prawej stronie ekstrudera i wyrzuć roztwór. Wymień strzykawkę po prawej stronie ekstrudera i wytłaczaj, aż lewa strzykawka będzie pusta.Odwróć orientację ekstrudera i powtórz wymianę strzykawki. Kontynuuj przez żądaną liczbę cykli. Nieparzysta liczba jest zawsze używana, aby upewnić się, że liposomy nie są pobierane ze strzykawki pierwotnie zawierającej niewytłaczane liposomy.Na koniec delikatnie dozować zawartość prawej strzykawki do probówki Eppendorf. Umieść probówkę na wolnoobrotowej wytrząsarce na około 30 minut. Aby przygotować ruchomą fazę oczyszczania pęcherzyków, przygotuj pięć mililitrów 250-milimolowego buforu hydratacyjnego Tris-HCL pH 8 w 15-mililitrowej probówce Falcona.Następnie dodaj 37,5 mikrolitrów 10 molowego wodorotlenku sodu do buforu hydratacyjnego. Odpipetować 235 mikrolitrów czystego kwasu oleinowego do probówki Falcon, otrzymując roztwór pęcherzyków o całkowitej zawartości lipidów 0,15 mola. Następnie użyj wirownika o dużej prędkości, aby wirować mieszaninę przez cztery do pięciu sekund.Następnie bębnić na obrotowej wytrząsarce o niskiej prędkości przez co najmniej dwie godziny. W tym momencie preparat lipidowy można pozostawić na noc na obracającym się wytrząsarce. Przefiltruj fazę ruchomą przez strzykawkowy filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrona, aby usunąć wszelkie potencjalne agregaty.Aby oczyścić pęcherzyki, najpierw przygotuj kolumnę Sepharose 4B zgodnie z opisem w protokole tekstowym i zaciśnij ją na stojaku retortowym. Następnie połączyć końcówkę kolumny z króćcem kurka odcinającego i podłączyć rurkę do kolektora frakcji. Dodaj kolejną porcję buforu, aby przepłukać rurkę i zamknij kurek odcinający, gdy poziom cieczy w kolumnie zbliży się do górnej części żywicy.Następnie nałóż wytłaczane pęcherzyki na wierzch żywicy za pomocą pipetera o pojemności 200 mikrolitrów, uważając, aby nanieść preparat pęcherzykowy tak równomiernie, jak to możliwe, na żywicę, nie dotykając złoża żywicy lub ścianki kolumny. Otwórz kurek odcinający, aby rozpocząć przepływ i zacznij zbierać frakcje do 96-dołkowej płytki. Zastosuj ruchomą fazę oczyszczania pęcherzyków do górnej części złoża żywicy w porcjach od 0,5 do jednego mililitra w miarę wyczerpywania się buforu, uważając, aby nie dopuścić do wyschnięcia złoża żywicy.Następnie zbierz eluent we frakcjach pięciokroplowych, zbierając co najmniej 36 studzienek. Aby scharakteryzować frakcje oczyszczające, należy odczytać 96-dołkową płytkę na czytniku płytek. Wykreśl wynikowe dane fluorescencji jako fluorescencję w funkcji liczby frakcji.Najpierw eluują się pęcherzyki, a następnie frakcja niekapsułkowana. W przypadku stosowania zligandowanego magnezu należy wymieszać chlorek magnezu i cytrynian potasu w określonym stosunku w 250-milimolowym buforze Tris-HCL pH 8. Tutaj stosuje się stosunek od jednego do czterech dla stabilnych pęcherzyków kwasu oleinowego.Pamiętaj, aby zawsze wstępnie wymieszać magnez i roztwór liganda. Nigdy nie wystawiaj pęcherzyków kwasów tłuszczowych na działanie samego nieschelatowanego magnezu. Dodać wstępnie zmieszany roztwór cytrynianu magnezu do próbki pęcherzyków.Krótko zmieszaj mieszaninę. Pozostawić próbkę pęcherzyków na kubku na co najmniej 30 minut przed ponownym oczyszczeniem, jak opisano w protokole tekstowym. Należy pamiętać, aby dodać takie samo stężenie magnezu i cytrynianu, jak w próbce pęcherzyków, do ruchomej fazy oczyszczania.Wymieszać roztwór magnezu z oczyszczonymi pęcherzykami zgodnie z opisem w protokole tekstowym, aby zainicjować reakcję samorozszczepienia. W przypadku badań kinetycznych należy pobrać 100 mikrolitrów mieszaniny w każdym punkcie czasowym i bezpośrednio ponownie oczyścić tę podwielokrotność przez kolumnę wykluczającą Sepharose o wielkości 4B z 250 milimolami Tris-HCL pH 8 jako fazą ruchomą. Zbierz frakcję pęcherzyków.Przygotuj próbkę ładującą RNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieść komercyjnie odlany żel mocznikowy 15% TBE w pudełku żelowym i napełnij pudełko żelowe buforem 1X TBE do biegania po żelu. Po podgrzaniu próbek na bloku grzewczym o temperaturze 80 stopni Celsjusza przez jedną minutę, załaduj pięć mikrolitrów każdej próbki do dołka.Uruchom żel ze stałym napięciem 200 woltów przez około godzinę. Na koniec zeskanuj żel i określ ilościowo za pomocą programu do analizy. Aby zademonstrować, że RNA może funkcjonować wewnątrz protokomórek, jako modelową reakcję katalityczną RNA zastosowano samorozszczepienie rybozymu młotkowatego z fluorescencyjnie znakowaną nicią substratu.Ta reakcja wymaga wolnego magnezu, aby ułatwić katalizę. W związku z tym zastosowano pęcherzyki monooleinianu kwasu oleinowego/glicerolu, ponieważ są one stabilne w obecności pięciu milimolowych magnezów. Reakcję samorozszczepienia rybozymu młota można monitorować za pomocą elektroforezy żelowej.Po ilościowym określeniu obrazu strony generowane jest liniowe dopasowanie logarytmu naturalnego stosunku ilości substratu pozostałego w danym punkcie czasowym do początkowej ilości substratu w funkcji czasu. Wykres ten można wykorzystać do obliczenia aktywności rybozymu. Po opanowaniu liposomy kwasów tłuszczowych z kapsułkowanym barwnikiem lub RNA można przygotować i oczyścić w ciągu 24 godzin.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o tworzeniu liposomów kwasów tłuszczowych w odpowiednim zakresie pH i utrzymywaniu całkowitego stężenia lipidów powyżej krytycznego stężenia agregacji lipidów, aby uniknąć rozpuszczenia pęcherzyków. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować liposomy kwasów tłuszczowych i jak ich używać do przeprowadzania reakcji biochemicznych.

preparation-purification-and-use-of-fatty-acid-containing-liposomes

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy protokół opisuje metodę ekstruzji służącą do przygotowania pęcherzyków lipidowych o rozmiarach submikronowych i wysokim stopniu jednorodności. Metoda ta wykorzystuje system z kontrolą ciśnienia i regulowanym przepływem azotu do przygotowania liposomów. W opracowaniu przedstawiono przygotowanie lipidów1,2, ekstruzję liposomów oraz charakterystykę ich rozmiaru.

Metoda ekstruzji z kontrolowanym stałym ciśnieniem do przygotowania nano-rozmiarowych pęcherzyków lipidowych

Biochemicznie zdefiniowane duże jednowarstwowe pęcherzyki (LUVs) stanowią wygodny system modelowy do analizy oddziaływań białek z rodziny BCL-2, co ma bezpośrednie znaczenie dla lepszego zrozumienia mitochondrialnej ścieżki apoptozy. Przedstawiono metodę otrzymywania LUVs, wraz ze standardowymi kombinacjami białek z rodziny BCL-2 oraz kontrolami służącymi do badania permeabilizacji LUVs.

Badanie funkcji rodziny BCL-2 z wykorzystaniem dużych jednowarstwowych pęcherzyków lipidowych

Źródło: Ginies, C., et al. Identyfikacja kwasów tłuszczowych w Bacillus cereus. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia proces przygotowania estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) z próbek bakteryjnych poprzez traktowanie biomasy roztworem alkalicznym, a następnie separację faz i odparowanie rozpuszczalnika do dalszej analizy.

Otrzymywanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) z biomasy bakteryjnej

Przekształcanie funkcjonalnych białek błonowych w gigantyczne liposomy o określonym składzie jest potężnym podejściem w połączeniu z elektrofizjologią patch-clamp. Jednak konwencjonalna produkcja gigantycznych liposomów może być niezgodna ze stabilnością białka.  Opisujemy protokoły wytwarzania gigantycznych liposomów z czystych lipidów lub małych liposomów zawierających kanały jonowe.

Preparat liposomów olbrzymich do obrazowania i elektrofizjologii patch-clamp

Opisujemy protokół przygotowania dwuwarstw lipidowych i jego charakterystyki za pomocą mikroskopii sił atomowych i spektroskopii sił.

Obrazowanie mikroskopii sił atomowych i spektroskopia sił podpartych dwuwarstw lipidowych

Tutaj prezentujemy dwa ultraszybkie protokoły do rekonstytucji białek błonowych w fuzogenne proteoliposomy oraz fuzji takich proteoliposomów z docelowymi dwuwarstwami lipidowymi w celu bezdetergentowego dostarczania tych białek błonowych do dwuwarstwy pofuzyjnej. Połączenie tych podejść umożliwia szybki i łatwy w obsłudze montaż złożonych, wieloskładnikowych systemów membranowych.

Ultraszybka rekonstytucja białek błonowych w dwuwarstwach lipidowych bez użycia fusogenicznych proteoliposomów naładowanych komplementarnie.

Ta metoda dostarcza ram do badania inkorporacji egzogennych kwasów tłuszczowych z kompleksowych źródeł gospodarza do błon bakteryjnych, szczególnie Staphylococcus aureus. Aby to osiągnąć, opisano protokoły wzbogacania cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego i późniejszego profilowania fosfolipidów bakteryjnych za pomocą spektrometrii mas.

Izolacja cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego w celu zbadania włączenia kwasów tłuszczowych patogenów bakteryjnych do fosfolipidów błonowych

To badanie opisuje klasyczną hydratację przy użyciu metody cienkiego filmu lipidowego do przygotowania nanoliposomów, a następnie charakterystyki nanocząstek. Hydrofilowe i globularne białko o masie 47 kDa, taryna, jest z powodzeniem kapsułkowane jako strategia poprawiająca stabilność, unikająca szybkiego klirensu i promująca kontrolowane uwalnianie. Metoda może być dostosowana do enkapsulacji cząsteczek hydrofobowych.

Otrzymywanie i charakterystyka nanoliposomów do uwięzienia bioaktywnych hydrofilowych białek kulistych

Protokół przedstawia zoptymalizowane parametry przygotowania termoczułych liposomów za pomocą urządzenia mikrofluidycznego do mikromiksera w jodełkę. Umożliwia to również kokapsułkowanie doksorubicyny i zieleni indocyjaninowej do liposomów oraz fototermiczne uwalnianie doksorubicyny w celu kontrolowanego/wyzwalanego uwalniania leku.

Mikroprzepływowa produkcja liposomów wrażliwych na temperaturę zawierających lizolipidy

Celem tego protokołu jest synteza liposomów znakowanych fluorescencyjnie i wykorzystanie cytometrii przepływowej do identyfikacji lokalizacji liposomów in vivo na poziomie komórkowym.

Przygotowanie, podawanie i ocena specyficznego tkankowo wychwytu komórkowego in vivo liposomów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Poznaj metodę przygotowania i oczyszczania liposomów z kwasami tłuszczowymi do badań nad sztucznymi protokomórkami i pochodzeniem życia. Protokół umożliwia wydajną produkcję jednorodnych wodniczek.

Przygotowanie, oczyszczanie i stosowanie liposomów zawierających kwasy tłuszczowe

Przeglądaj więcej filmów