Przygotowanie, oczyszczanie i stosowanie liposomów zawierających kwasy tłuszczowe

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie, oczyszczenie i wykorzystanie liposomów składających się częściowo lub w całości z kwasów tłuszczowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii syntetycznej i badaniach nad pochodzeniem życia, takie jak definiowanie minimalnych komórek i konstruowanie sztucznych protokomórek. Główną zaletą tego protokołu jest to, że wprowadza łatwy i niedrogi sposób wytwarzania wysokowydajnych monorozproszonych pęcherzyków kwasów tłuszczowych i obchodzenia się z nimi w różnych warunkach eksperymentalnych.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ pęcherzyki kwasów tłuszczowych są delikatniejsze niż pęcherzyki fosfolipidowe, zwłaszcza w obecności Aby przygotować cienkie warstwy wysuszonych lipidów, użyj gazoszczelnych strzykawek, aby przenieść określoną ilość lipidu w chloroformie do szklanej fiolki. Odparować chloroform pod strumieniem azotu lub argonu w dygestorium. Powstałą cienką warstwę należy poddać próżni domowej przez co najmniej dwie godziny, aby usunąć wszelkie pozostałości chloroformu.

W tym momencie lipid można pozostawić na noc w próżni. Aby ponownie nawodnić pęcherzyki, należy odpipetować 250 mikrolitrów buforu hydracyjnego do pustej probówki, a następnie dodać 1,875 mikrolitra 10-molowego wodorotlenku sodu, aby uzyskać ostateczną 75-milimolową zasadę. Przenieś roztwór do cienkiej warstwy suchego lipidu, aby utworzyć pęcherzyki o całkowitym stężeniu kwasów tłuszczowych 0,15 mola, a następnie użyj wirownika o dużej prędkości, aby wirować powstałą mieszaninę przez cztery do pięciu sekund.

Mieszaj mieszaninę lipidowych na wolnoobrotowej wytrząsarce w celu nawodnienia przez noc. Aby wygenerować pęcherzyki o jednolitym rozmiarze, użyj pęsety, aby nałożyć jedną podporę filtra na każdą wewnętrzną powierzchnię portów strzykawkowych wytłaczarki do liposomów. Zwilż każdy wspornik filtra 250 milimolowym Tris-HCL pH 8.

Za pomocą pęsety nałóż jedną ścieżkę wytrawiania na membranę poliwęglanową 100 nanometrów na jeden z o-ringów ekstrudera i wsporników filtra. Uważając, aby nie rozerwać ani nie przebić membrany, delikatnie wepchnij membranę w o-ring, aby zapewnić dobry kontakt między dwiema powierzchniami. Następnie zmontuj ekstruder, uważając, aby nie przesunąć membrany i wsporników filtra.

Napełnij strzykawkę ekstrudera około 0,5 mililitra 250 milimolowego Tris-HCL pH 8. Włóż tę strzykawkę po jednej stronie ekstrudera. Włóż pustą strzykawkę po drugiej stronie ekstrudera.

Powoli ręcznie wcisnąć tłok i bufor zawierający strzykawkę i sprawdzić, czy wyczuwalny jest opór wskazujący, że membrana z wytrawionymi ścieżkami jest na swoim miejscu i jest nienaruszona. Pomocne jest przećwiczenie tego kroku bez założonej membrany, aby ocenić oczekiwany poziom oporu. Wyjąć i opróżnić obie strzykawki.

Na tym etapie nie jest konieczne czyszczenie obu strzykawek, ponieważ zawierają one bufor o identycznym składzie jak preparat liposomowy. Następnie załaduj preparat liposomowy do jednej z dwóch strzykawek. Zmontuj ekstruder ze strzykawką zawierającą próbkę pęcherzyków po lewej stronie i pustą strzykawką po prawej stronie.

Następnie bardzo powoli ręcznie wcisnąć tłok strzykawki zawierającej próbkę pęcherzyka. Uważnie obserwuj strzykawkę po prawej stronie ekstrudera. Przezroczysty bufor początkowo wejdzie po prawej stronie ekstrudera ze względu na wewnętrzną martwą objętość ekstrudera, a następnie mały pióropusz wytłaczanych liposomów.

W tym momencie natychmiast przestań naciskać. Wyjmij strzykawkę po prawej stronie ekstrudera i wyrzuć roztwór. Wymień strzykawkę po prawej stronie ekstrudera i wytłaczaj, aż lewa strzykawka będzie pusta.

Odwróć orientację ekstrudera i powtórz wymianę strzykawki. Kontynuuj przez żądaną liczbę cykli. Nieparzysta liczba jest zawsze używana, aby upewnić się, że liposomy nie są pobierane ze strzykawki pierwotnie zawierającej niewytłaczane liposomy.

Na koniec delikatnie dozować zawartość prawej strzykawki do probówki Eppendorf. Umieść probówkę na wolnoobrotowej wytrząsarce na około 30 minut. Aby przygotować ruchomą fazę oczyszczania pęcherzyków, przygotuj pięć mililitrów 250-milimolowego buforu hydratacyjnego Tris-HCL pH 8 w 15-mililitrowej probówce Falcona.

Następnie dodaj 37,5 mikrolitrów 10 molowego wodorotlenku sodu do buforu hydratacyjnego. Odpipetować 235 mikrolitrów czystego kwasu oleinowego do probówki Falcon, otrzymując roztwór pęcherzyków o całkowitej zawartości lipidów 0,15 mola. Następnie użyj wirownika o dużej prędkości, aby wirować mieszaninę przez cztery do pięciu sekund.

Następnie bębnić na obrotowej wytrząsarce o niskiej prędkości przez co najmniej dwie godziny. W tym momencie preparat lipidowy można pozostawić na noc na obracającym się wytrząsarce. Przefiltruj fazę ruchomą przez strzykawkowy filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrona, aby usunąć wszelkie potencjalne agregaty.

Aby oczyścić pęcherzyki, najpierw przygotuj kolumnę Sepharose 4B zgodnie z opisem w protokole tekstowym i zaciśnij ją na stojaku retortowym. Następnie połączyć końcówkę kolumny z króćcem kurka odcinającego i podłączyć rurkę do kolektora frakcji. Dodaj kolejną porcję buforu, aby przepłukać rurkę i zamknij kurek odcinający, gdy poziom cieczy w kolumnie zbliży się do górnej części żywicy.

Następnie nałóż wytłaczane pęcherzyki na wierzch żywicy za pomocą pipetera o pojemności 200 mikrolitrów, uważając, aby nanieść preparat pęcherzykowy tak równomiernie, jak to możliwe, na żywicę, nie dotykając złoża żywicy lub ścianki kolumny. Otwórz kurek odcinający, aby rozpocząć przepływ i zacznij zbierać frakcje do 96-dołkowej płytki. Zastosuj ruchomą fazę oczyszczania pęcherzyków do górnej części złoża żywicy w porcjach od 0,5 do jednego mililitra w miarę wyczerpywania się buforu, uważając, aby nie dopuścić do wyschnięcia złoża żywicy.

Następnie zbierz eluent we frakcjach pięciokroplowych, zbierając co najmniej 36 studzienek. Aby scharakteryzować frakcje oczyszczające, należy odczytać 96-dołkową płytkę na czytniku płytek. Wykreśl wynikowe dane fluorescencji jako fluorescencję w funkcji liczby frakcji.

Najpierw eluują się pęcherzyki, a następnie frakcja niekapsułkowana. W przypadku stosowania zligandowanego magnezu należy wymieszać chlorek magnezu i cytrynian potasu w określonym stosunku w 250-milimolowym buforze Tris-HCL pH 8. Tutaj stosuje się stosunek od jednego do czterech dla stabilnych pęcherzyków kwasu oleinowego.

Pamiętaj, aby zawsze wstępnie wymieszać magnez i roztwór liganda. Nigdy nie wystawiaj pęcherzyków kwasów tłuszczowych na działanie samego nieschelatowanego magnezu. Dodać wstępnie zmieszany roztwór cytrynianu magnezu do próbki pęcherzyków.

Krótko zmieszaj mieszaninę. Pozostawić próbkę pęcherzyków na kubku na co najmniej 30 minut przed ponownym oczyszczeniem, jak opisano w protokole tekstowym. Należy pamiętać, aby dodać takie samo stężenie magnezu i cytrynianu, jak w próbce pęcherzyków, do ruchomej fazy oczyszczania.

Wymieszać roztwór magnezu z oczyszczonymi pęcherzykami zgodnie z opisem w protokole tekstowym, aby zainicjować reakcję samorozszczepienia. W przypadku badań kinetycznych należy pobrać 100 mikrolitrów mieszaniny w każdym punkcie czasowym i bezpośrednio ponownie oczyścić tę podwielokrotność przez kolumnę wykluczającą Sepharose o wielkości 4B z 250 milimolami Tris-HCL pH 8 jako fazą ruchomą. Zbierz frakcję pęcherzyków.

Przygotuj próbkę ładującą RNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieść komercyjnie odlany żel mocznikowy 15% TBE w pudełku żelowym i napełnij pudełko żelowe buforem 1X TBE do biegania po żelu. Po podgrzaniu próbek na bloku grzewczym o temperaturze 80 stopni Celsjusza przez jedną minutę, załaduj pięć mikrolitrów każdej próbki do dołka.

Uruchom żel ze stałym napięciem 200 woltów przez około godzinę. Na koniec zeskanuj żel i określ ilościowo za pomocą programu do analizy. Aby zademonstrować, że RNA może funkcjonować wewnątrz protokomórek, jako modelową reakcję katalityczną RNA zastosowano samorozszczepienie rybozymu młotkowatego z fluorescencyjnie znakowaną nicią substratu.

Ta reakcja wymaga wolnego magnezu, aby ułatwić katalizę. W związku z tym zastosowano pęcherzyki monooleinianu kwasu oleinowego/glicerolu, ponieważ są one stabilne w obecności pięciu milimolowych magnezów. Reakcję samorozszczepienia rybozymu młota można monitorować za pomocą elektroforezy żelowej.

Po ilościowym określeniu obrazu strony generowane jest liniowe dopasowanie logarytmu naturalnego stosunku ilości substratu pozostałego w danym punkcie czasowym do początkowej ilości substratu w funkcji czasu. Wykres ten można wykorzystać do obliczenia aktywności rybozymu. Po opanowaniu liposomy kwasów tłuszczowych z kapsułkowanym barwnikiem lub RNA można przygotować i oczyścić w ciągu 24 godzin.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o tworzeniu liposomów kwasów tłuszczowych w odpowiednim zakresie pH i utrzymywaniu całkowitego stężenia lipidów powyżej krytycznego stężenia agregacji lipidów, aby uniknąć rozpuszczenia pęcherzyków. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować liposomy kwasów tłuszczowych i jak ich używać do przeprowadzania reakcji biochemicznych.