Podwójny wpływ czynników pochodzących z komórek czerniaka na różnicowanie adipocytów szpiku kostnego

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad przerzutami do kości, takie jak to, jakie zmiany są indukowane we wzroście adipocytów szpiku kostnego i ich rozwoju w mikrośrodowisku nowotworowym. Dużą zaletą tej techniki jest to, że jest łatwa do wykonania i że można szybko uzyskać cząsteczki kandydujące. Ta metoda może dostarczyć informacji na temat wzajemnych oddziaływań między adipocytami szpiku kostnego a komórkami czerniaka.

Może być również stosowany do innych typów komórek, takich jak osteoblasty. Zacznij od wysiewu dwóch razy 10 do piątych komórek czerniaka B16F10 w 100-milimetrowym naczyniu z 10 mililitrami DMEM uzupełnionymi 10% FBS, na 24-godzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Następnego dnia umyj około 80% zlewającą się hodowlę komórkową dwa razy pięcioma mililitrami PBS na mycie i zagłodź komórki 10 mililitrami pożywki hodowlanej bez surowicy w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 18 do 24 godzin.

Następnego dnia za pomocą pipety przenieś kondycjonowany supernatant do 50-mililitrowej stożkowej probówki do odwirowania i załaduj pożywkę do strzykawki wyposażonej w filtr porowy o średnicy 0,45 mikrona. Następnie przecedź roztwór do sterylnego pojemnika, aby usunąć wszelkie pozostałe resztki komórek, i przechowuj kondycjonowaną pożywkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez okres do jednego miesiąca. Aby indukować adipocyty szpiku kostnego, należy wyhodować komórki zrębu szpiku kostnego F14 1,1 myszy w 60-milimetrowym naczyniu z kompletnym DMEM do 80% konfluencji.

Na odpowiednim etapie hodowli zbierz komórki z 1,5 mililitra 0,25% roztworu trypsyny przez jedną do dwóch minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki się odłączą, zatrzymaj reakcję enzymatyczną za pomocą pięciu mililitrów pożywki uzupełnionej 10% FBS i dostosuj komórki do stężenia od jednego do dwóch razy od 10 do piątego stężenia komórek na mililitr za pomocą świeżej pożywki hodowlanej uzupełnionej surowicą. Wysiewaj pięć razy 10 do czwartych komórek w 0,5 mililitra adipogenicznej pożywki indukcyjnej na dołek na 24-dołkowej płytce i włóż komórki z powrotem do inkubatora hodowli komórkowych na kolejne dwa dni, aż osiągną około 90% konfluencji.

Następnie zastąp supernatant jednym mililitrem adipogennej pożywki podtrzymującej na dołek i kontynuuj hodowlę komórek aż do dojrzewania adipocytów. Kiedy komórki wyglądają jak małe lub duże bańki mydlane pod mikroskopem świetlnym, umyj te dojrzałe adipocyty dwa razy PBS, a następnie utrwal w 0,2 mililitra 3,7% formaldehydu przez godzinę. Opłucz utrwalone komórki w 60% izopropanolu i pozostaw studzienki do całkowitego wyschnięcia.

Dodaj 0,2 mililitra roztworu roboczego Oil Red O do komórek na 30 do 120 minut inkubacji w temperaturze pokojowej i umyj komórki wodą, aby usunąć niezwiązany barwnik do obrazowania adipocytów za pomocą mikroskopii świetlnej. Alternatywnie, po ich dojrzewaniu, dodaj 0,5 mililitra gotowego do użycia odczynnika do izolacji RNA do każdej kultury adipocytów i użyj odpowiednich starterów, aby potwierdzić specyficzną dla adipocytów sygnaturę genową komórek. Następnie uruchom reakcję w termocyklerze przy użyciu wskazanych ustawień.

Aby skonfigurować kohodowlę komórek czerniaka adipocytów pochodzących ze szpiku kostnego, najpierw dodaj 150 mikrolitrów DMEM bez surowicy do wewnętrznych komór wkładek membranowych o wielkości 0,4 mikrona i umieść każdą wkładkę w jednym dołku 24-dołkowej płytki zawierającej 500 mikrolitrów pożywki wolnej od surowicy na dołek. Rozcieńczyć komórki czerniaka B16F10 z 80% hodowli komórkowej do doświadczalnie odpowiedniego stężenia w świeżej pożywce bez surowicy i zastąpić pożywkę w wewnętrznej komorze każdej wkładki 150 mikrolitrami komórek. Następnie zastąp adipogenną pożywkę podtrzymującą supernatant w każdym dołku 90% zlewającej się dojrzałej kultury adipocytów szpiku kostnego 600 mikrolitrami kompletnego DMEM i przenieś wstawki zawierające komórki czerniaka do każdej studzienki płytki hodowli dojrzałych adipocytów.

Po przeniesieniu wszystkich wkładek umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po dwóch dniach wyjmij wkładki i umyj dno każdej studzienki dwa razy 500 mikrolitrami PBS na pranie. Następnie wybarwić adipocyty roztworem roboczym Oil Red O lub przeanalizować ekspresję genu adipocytów za pomocą ilościowego PCR, jak pokazano.

Dojrzałe adipocyty zróżnicowane w pożywce kondycjonowanej przez nowotwór zawierają kropelki lipidów, co pozwala na łatwą identyfikację zróżnicowanych adipocytów za pomocą barwienia czerwienią olejową O. Specyficzną dla adipocytów sygnaturę genową tych komórek można również potwierdzić za pomocą ilościowego PCR. W adipocytach hodowanych jednocześnie w obecności dużej liczby komórek czerniaka obserwuje się zmniejszenie magazynowania lipidów, a także dedyferencjację fenotypu adipocytów, o czym świadczy zmniejszona ekspresja genów specyficznych dla adipocytów w tych wcześniej dojrzałych komórkach.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zaprojektować i skonfigurować system kohodowli 2D do badania interakcji między dwoma różnymi typami komórek.