Name: Podwójny wpływ czynników pochodzących z komórek czerniaka na różnicowanie adipocytów szpiku kostnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Poznaj dwuwymiarowy system ko-kultury do badania interakcji między komórkami czerniaka a adipocytami szpiku kostnego. Ta metoda umożliwia analizę mechanizmów przerzutów kostnych i różnicowania adipocytów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy uprzejmie Dov Zipori (The Weizmann Institute of Science, Rehovot, Izrael) za dostarczenie nam mysiej linii komórek zrębu szpiku kostnego 14F1.1. Badanie to było wspierane przez granty z Chińskiej Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych (nr 81771729) i Szpitala Yongchuan Uniwersytetu Medycznego w Chongqing (nr YJQN201330; YJZQN201527).

UWAGA: Wszystkie komórki używane w tym protokole powinny być hodowane przez co najmniej trzy pokolenia po rozmrożeniu z zamrożonych komórek podstawowych.
1. Żniwa Czynniki komórkowe czerniaka
<ol>
	<li>Preparaty
	<ol>
		<li>Uzyskaj komórki B16F10 i linię komórkową czerniaka myszy. 
		UWAGA: Na potrzeby tego protokołu linię komórkową czerniaka myszy uzyskano z Banku Komórek Macierzystych Chińskiej Akademii Nauk.</li>
		<li>Przygotować kompletną pożywkę do hodowli komórek B16F10 (100 ml). Użyj zmodyfikowanej pożywki Dulbecco Eagle's (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 50 U/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny.</li>
		<li>Przygotuj pożywkę bez surowicy do głodzenia komórek B16F10 (50 ml). Użyj pożywki DMEM bez FBS, 50 U/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować pożywkę kondycjonowaną czerniakiem (CM)
	<ol>
		<li>Nasiona 2,0 x 105 komórek B16F10 w naczyniu 100 mm z 10 ml 10% FBS DMEM. Następnie inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
		<li>Gdy komórki osiągną około 80% konfluencji, usuń pożywkę hodowlaną, umyj komórki dwukrotnie 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (1x, pH 7,4) i zastąp pożywkę 10 ml pożywką bez surowicy na głodówkę.</li>
		<li>Umieść komórki z powrotem w inkubatorze na 18–24 godziny.</li>
		<li>Po zagłodzeniu zebrać kondycjonowaną pożywkę (CM) za pomocą pipety i przenieść ją do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. 
		UWAGA: Kondycjonowana pożywka jest supernatantem kultur komórkowych B16F10. Upewnij się, że komórki B16F10 są w dobrym stanie przed pobraniem CM.</li>
		<li>Odwirować CM przez 5 minut przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odpipetować supernatant i przenieść go do świeżej sterylnej probówki lub butelki. 
		UWAGA: Unikaj pipetowania granulek na dnie probówki.</li>
		<li>Aby usunąć resztki komórek, przefiltruj CM, przepuszczając go przez podłączony do strzykawki filtr 0,45 μm na sterylnej butelce lub probówce. 
		UWAGA: Filtry 0,22 μm są optymalne do filtrowania CM.</li>
		<li>Przefiltrowany supernatant należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. 
		UWAGA: Najlepiej nie przechowywać supernatantu w temperaturze -20 °C dłużej niż jeden miesiąc. Alternatywnie, należy przechowywać CM w temperaturze -80 °C przez dłuższy czas w celu różnicowania adipocytów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Indukcja adipocytów szpiku kostnego przez czynniki pochodzące z komórek czerniaka
<ol>
	<li>Preparaty
	<ol>
		<li>Przygotuj 100 ml adipogenicznej pożywki indukcyjnej28. Użyj kompletnego DMEM uzupełnionego 5 μg/ml insuliny, 0,5 mM 3-izobutylo-1-metyloksantyny i 1 μM deksametazonu. Przechowywać do dwóch tygodni w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotuj 100 ml adipogennej pożywki podtrzymującej. Użyj kompletnego DMEM lub zmieszanego z 50% czerniakiem CM uzupełnionego 5 μg / ml insuliny.</li>
		<li>Przygotuj roztwór podstawowy Oil Red O. Rozpuść 30 mg proszku Oil Red O w 10 ml izopropanolu (≥ 99,5%) i dobrze wymieszaj je za pomocą vortex. 
		UWAGA: Przechowywać do 1 roku w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotuj roztwór roboczy Oil Red O. W dygestorium rozcieńczyć roztwór podstawowy czerwieni olejowej O (z kroku 2.1.3) wodą dejonizowaną w stosunku 3:2. Mieszaninę inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej i przed użyciem przefiltrować przez filtr 0,22 μm. 
		UWAGA: Świeży roztwór roboczy należy zużyć dopiero w ciągu 2 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Różnicowanie adipocytów
	<ol>
		<li>Hodowla linii komórek zrębu 14F1.1 ze szpiku kostnego myszy 29 w naczyniu o średnicy 60 mm z kompletnym DMEM przy 80% konfluencji w inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2, 
		UWAGA: Alternatywnie, zastąp 14F1.1 pierwotnymi komórkami mezenchymalnymi pochodzącymi ze szpiku kostnego30.</li>
		<li>Trypsynizować komórki 1,5 ml 0,25% roztworu trypsyny w inkubatorze przez 1–2 minuty.</li>
		<li>Dodaj 5 ml 10% pożywki FBS do komórek i policz liczbę komórek za pomocą szklanego hemocytometru; następnie dostosuj gęstość komórek do około 1-2 x 105/ml.</li>
		<li>Zasiew 5 x 104 komórek 14F1.1 na dołek na 24-dołkowej płytce z 0,5 ml adipogennej pożywki indukcyjnej. Po dwóch dniach inkubacji komórki osiągają około 90% konfluencji. 
		UWAGA: Ten krok jest bardzo krytyczny. Komórki zrębu szpiku kostnego nie mogą być indukowane do adipocytów bez pożywki indukcyjnej adipogennej.</li>
		<li>Usunąć pożywkę indukcyjną i przemyć komórki dwukrotnie 1 ml PBS za każdym razem.</li>
		<li>Zmienić na 1 ml adipogennej pożywki podtrzymującej i kontynuować hodowlę komórek aż do dojrzewania adipocytów. 
		UWAGA: Pod mikroskopem adipocyty wyglądają jak małe lub duże bańki mydlane i są bardzo łatwe do rozpoznania. Zwykle dojrzałe adipocyty są obecne w 6 lub 8 dniu.</li>
		<li>Wybarwić dojrzałe adipocyty czerwoną olejem O lub zebrać adipocyty do ilościowej analizy reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie adipocytów
	<ol>
		<li>Umyj zróżnicowane komórki 14F1.1 2x PBS i utrwal je w 3,7% formaldehydzie przez 1 godzinę.</li>
		<li>Opłucz komórki w 60% izopropanolu i pozostaw do całkowitego wyschnięcia.</li>
		<li>Dodać 0,2 ml roztworu roboczego czerwieni olejowej O do studzienek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 0,5 do 2 godzin.</li>
		<li>Umyj komórki wodą, aby usunąć niezwiązane barwniki.</li>
		<li>Sfotografuj barwione adipocyty pod mikroskopem świetlnym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Współkultura adipocytów szpiku kostnego z komórkami czerniaka
<ol>
	<li>Preparaty
	<ol>
		<li>Przygotuj dojrzałe adipocyty szpiku kostnego: indukuj komórki 14F1.1 do dojrzałych adipocytów BM na 24-dołkowych płytkach z pożywką do indukcji adipogennej przez 2 dni, a następnie utrzymuj je w pożywce podtrzymującej adipogeny przez dodatkowe 6–8 dni.</li>
		<li>Przygotuj komórki B16F10: hoduj komórki B16F10 w szalkach o średnicy 60 mm z 5 ml pożywki DMEM.</li>
		<li>Zwilżyć wkładkę membranową (np. transwell): dodać 150 μl pożywki DMEM wolnej od FBS do wkładek membranowych o wielkości porów 0,4 μm i zanurzyć je w dołkach 24-dołkowych płytek wypełnionych 500 μl pożywki DMEM wolnej od FBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otoczenie kokulturowe
	<ol>
		<li>Powoli odpipetować pożywkę z każdej wkładki. 
		UWAGA: Nie niszcz membrany podczas usuwania medium.</li>
		<li>Zasiej komórki B16F10 (0/103/105/106) we wkładkach porów 0,4 μm z kroku 3.2.1.</li>
		<li>Zastąp adipogenną pożywkę podtrzymującą w studzienkach dojrzałymi adipocytami szpiku kostnego z kroku 3.1.1. 600 μl kompletnej pożywki DMEM.</li>
		<li>Przenieść wkładki wypełnione komórkami B16F10 (z kroku 3.2.2) na studzienki z dojrzałymi adipocytami szpiku kostnego (z kroku 3.2.3) w celu przeprowadzenia doświadczeń związanych z kokulturą.</li>
		<li>Inkubować kokultury w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 dni.</li>
		<li>Po 48 godzinach inkubacji usunąć wkładki kokultury, a następnie umyć adipocyty 2x 500 μL 1x PBS. 
		UWAGA: Opcjonalnie zbierz komórki B16F10 we wkładkach do analizy, jeśli to konieczne.</li>
		<li>Wybarwić adipocyty roztworem roboczym Oil Red O lub zebrać adipocyty do analizy qPCR. 
		UWAGA: Zobacz procedurę barwienia w kroku 2.3.</li>
		<li>Sfotografuj barwione adipocyty pod mikroskopem świetlnym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza qPCR sygnatury genu specyficznego dla adipocytów
<ol>
	<li>Dodaj 0,5 ml gotowego do użycia odczynnika do izolacji RNA na dołek do 24-dołkowej płytki, w której dojrzałe adipocyty są gotowe do wykrycia.</li>
	<li>Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem ekstrakcji RNA i syntezy cDNA31.</li>
	<li>Użyj startera dla 18S i GAPDH jako kontroli oraz CEBPα / β, PPARγ, FABP4, leptyny, Pref-1 lub adiponektyny dla sygnatury genu specyficznego dla adipocytów (Tabela 1).</li>
	<li>Przeprowadź następującą reakcję w termocyklerze: 95 °C przez 20 s, następnie 40 cykli po 95 °C przez 1 s i 60 °C przez 20 s.</li>
	<li>Użyj metody 2-ΔΔCt, aby obliczyć zmiany zagięcia32.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenic+niches+for+melanoma+cell+colonization+and+growth+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adipogenic niches for melanoma cell colonization and growth in bone marrow.</a> Laboratory Investigation. 97 (6), 737-745 (2017).</li>
<li>Trotter, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte-Lineage+Cells+Support+Growth+and+Dissemination+of+Multiple+Myeloma+in+Bone%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Adipocyte-Lineage Cells Support Growth and Dissemination of Multiple Myeloma in Bone.</a> The American Journal of Pathology. 186 (11), 3054-3063 (2016).</li>
<li>Morris, E. V., Edwards, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bone+marrow+adipocytes+in+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+Oncology%22%5BJournal%5D)">The role of bone marrow adipocytes in bone metastasis.</a> Journal of Bone Oncology. 5 (3), 121-123 (2016).</li>
<li>Diedrich, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+adipocytes+promote+the+Warburg+phenotype+in+metastatic+prostate+tumors+via+HIF-1alpha+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Bone marrow adipocytes promote the Warburg phenotype in metastatic prostate tumors via HIF-1alpha activation.</a> Oncotarget. 7 (40), 64854-64877 (2016).</li>
<li>Chkourko Gusky, H., Diedrich, J., MacDougald, O. A., Podgorski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omentum+and+bone+marrow%3A+how+adipocyte-rich+organs+create+tumour+microenvironments+conducive+for+metastatic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+Reviews%22%5BJournal%5D)">Omentum and bone marrow: how adipocyte-rich organs create tumour microenvironments conducive for metastatic progression.</a> Obesity Reviews. 17 (11), 1015-1029 (2016).</li>
<li>Chen, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+diet+increases+melanoma+cell+growth+in+the+bone+marrow+by+inducing+osteopontin+and+interleukin+6%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High fat diet increases melanoma cell growth in the bone marrow by inducing osteopontin and interleukin 6.</a> Oncotarget. 7 (18), 26653-26669 (2016).</li>
<li>Balaban, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+lipolysis+links+obesity+to+breast+cancer+growth%3A+adipocyte-derived+fatty+acids+drive+breast+cancer+cell+proliferation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipocyte lipolysis links obesity to breast cancer growth: adipocyte-derived fatty acids drive breast cancer cell proliferation and migration.</a> Cancer & Metabolism. 5, 1(2017).</li>
<li>Huang, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+malignant+growth+of+breast+tumours+with+monocarboxylate+transporter+2+expression+via+beta-hydroxybutyrate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote malignant growth of breast tumours with monocarboxylate transporter 2 expression via beta-hydroxybutyrate.</a> Nature Communications. 8, 14706(2017).</li>
<li>Wang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+adipocytes+stimulate+breast+cancer+invasion+through+metabolic+remodeling+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells.</a> JCI Insight. 2 (4), 87489(2017).</li>
<li>Wang, C., Gao, C., Meng, K., Qiao, H., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipocytes+stimulate+invasion+of+breast+cancer+MCF-7+cells+by+secreting+IGFBP-2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human adipocytes stimulate invasion of breast cancer MCF-7 cells by secreting IGFBP-2.</a> PLoS One. 10 (3), 0119348(2015).</li>
<li>Nieman, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+ovarian+cancer+metastasis+and+provide+energy+for+rapid+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).</li>
<li>Herroon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+adipocytes+promote+tumor+growth+in+bone+via+FABP4-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Bone marrow adipocytes promote tumor growth in bone via FABP4-dependent mechanisms.</a> Oncotarget. 4 (11), 2108-2123 (2013).</li>
<li>Tabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow+Adipocytes+Facilitate+Fatty+Acid+Oxidation+Activating+AMPK+and+a+Transcriptional+Network+Supporting+Survival+of+Acute+Monocytic+Leukemia+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow Adipocytes Facilitate Fatty Acid Oxidation Activating AMPK and a Transcriptional Network Supporting Survival of Acute Monocytic Leukemia Cells.</a> Cancer Research. 77 (6), 1453-1464 (2017).</li>
<li>Wen, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+activate+mitochondrial+fatty+acid+oxidation+and+autophagy+to+promote+tumor+growth+in+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Adipocytes activate mitochondrial fatty acid oxidation and autophagy to promote tumor growth in colon cancer.</a> Cell Death & Differentiation. 8 (2), 2593(2017).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+adipocytes+in+bone+marrow+protect+myeloma+cells+against+chemotherapy+through+autophagy+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mature adipocytes in bone marrow protect myeloma cells against chemotherapy through autophagy activation.</a> Oncotarget. 6 (33), 34329-34341 (2015).</li>
<li>Ye, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemic+Stem+Cells+Evade+Chemotherapy+by+Metabolic+Adaptation+to+an+Adipose+Tissue+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Leukemic Stem Cells Evade Chemotherapy by Metabolic Adaptation to an Adipose Tissue Niche.</a> Cell Stem Cell. 19 (1), 23-37 (2016).</li>
<li>Templeton, Z. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer+Cell+Colonization+of+the+Human+Bone+Marrow+Adipose+Tissue+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer Cell Colonization of the Human Bone Marrow Adipose Tissue Niche.</a> Neoplasia. 17 (12), 849-861 (2015).</li>
<li>Daquinag, A. C., Souza, G. R., Kolonin, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+engineering+in+three-dimensional+levitation+tissue+culture+system+based+on+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue engineering in three-dimensional levitation tissue culture system based on magnetic nanoparticles.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (5), 336-344 (2013).</li>
<li>Emont, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+3D+Culture+System+to+Differentiate+Visceral+Adipocytes+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Using a 3D Culture System to Differentiate Visceral Adipocytes In Vitro.</a> Endocrinology. 156 (12), 4761-4768 (2015).</li>
<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Tumor+Models%3A+Advantages%2C+Disadvantages%2C+Variables%2C+and+Selecting+the+Right+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).</li>
<li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li>
<li>Herroon, M. K., Diedrich, J. D., Podgorski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+3D-Culture+Approaches+to+Study+Interactions+of+Bone+Marrow+Adipocytes+with+Metastatic+Prostate+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">New 3D-Culture Approaches to Study Interactions of Bone Marrow Adipocytes with Metastatic Prostate Cancer Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 84(2016).</li>
<li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+microenvironment+alters+protein+expression+and+chemosensitivity+of+epithelial+ovarian+cancer+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro.</a> Laboratory Investigation. 93 (5), 528-542 (2013).</li>
<li>Imamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+2D-+and+3D-culture+models+as+drug-testing+platforms+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer.</a> Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).</li>
<li>Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+perturbation+in+vitro--a+growing+case+for+three-dimensional+%283D%29+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene expression perturbation in vitro--a growing case for three-dimensional (3D) culture systems.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+spheroid+culture+system+on+micropatterned+substrates+for+improved+differentiation+efficiency+of+multipotent+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).</li>
<li>Dirat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+adipocytes+exhibit+an+activated+phenotype+and+contribute+to+breast+cancer+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion.</a> Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).</li>
<li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+of+adipogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li>
<li>Zipori, D., Toledo, J., von der Mark, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+among+stromal+cell+lines+from+mouse+bone+marrow+disclosed+in+their+extracellular+matrix+composition+and+interactions+with+normal+and+leukemic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity among stromal cell lines from mouse bone marrow disclosed in their extracellular matrix composition and interactions with normal and leukemic cells.</a> Blood. 66 (2), 447-455 (1985).</li>
<li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Culture%2C+and+Differentiation+of+Bone+Marrow+Stromal+Cells+and+Osteoclast+Progenitors+from+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56750(2018).</li>
<li>Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+Quantification+of+Plasma+MicroRNA+Levels+in+Cynomolgus+Monkeys%2C+Using+Quantitative+Real-time+Reverse+Transcription+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56850(2018).</li>
<li>Bozec, A., Hannemann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Regulation+of+Adipocyte+Numbers+in+Adult+Organisms+Through+Differentiation+and+Apoptosis+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e53822(2016).</li>
<li>Shafat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemic+blasts+program+bone+marrow+adipocytes+to+generate+a+protumoral+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemic blasts program bone marrow adipocytes to generate a protumoral microenvironment.</a> Blood. 129 (10), 1320-1332 (2017).</li>
<li>Gazi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+lipid+translocation+between+adipocytes+and+prostate+cancer+cells+with+imaging+FTIR+microspectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of lipid translocation between adipocytes and prostate cancer cells with imaging FTIR microspectroscopy.</a> The Journal of Lipid Research. 48 (8), 1846-1856 (2007).</li>
<li>Brown, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+omega-6+PUFA+arachidonic+acid+and+bone+marrow+adipocytes+on+metastatic+spread+from+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Influence of omega-6 PUFA arachidonic acid and bone marrow adipocytes on metastatic spread from prostate cancer.</a> British Journal of Cancer. 102 (2), 403-413 (2010).</li>
<li>Hardaway, A. L., Herroon, M. K., Rajagurubandara, E., Podgorski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow+adipocyte-derived+CXCL1+and+CXCL2+contribute+to+osteolysis+in+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Marrow adipocyte-derived CXCL1 and CXCL2 contribute to osteolysis in metastatic prostate cancer.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 32 (4), 353-368 (2015).</li>
<li>Aebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+metastasis+in+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22European+Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">Spinal metastasis in the elderly.</a> European Spine Journal. 12, Suppl 2 202-213 (2003).</li>
<li>Wagner, M., Bjerkvig, R., Wiig, H., Dudley, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+adipocyte+specification+and+necrosis+augment+tumor-associated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Loss of adipocyte specification and necrosis augment tumor-associated inflammation.</a> Adipocyte. 2 (3), 176-183 (2013).</li>
<li>Bochet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+adipocytes+promotes+breast+tumor+radioresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated adipocytes promotes breast tumor radioresistance.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 411 (1), 102-106 (2011).</li>
<li>Hirano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+adipogenesis+induction+by+conditioned+media+obtained+from+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Enhancement of adipogenesis induction by conditioned media obtained from cancer cells.</a> Cancer Letters. 268 (2), 286-294 (2008).</li>
<li>Gordeev, A. A., Chetverina, H. V., Chetverin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+arrangement+of+eukaryotic+cells+in+merged+hydrogels+combines+the+advantages+of+3-D+and+2-D+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Planar arrangement of eukaryotic cells in merged hydrogels combines the advantages of 3-D and 2-D cultures.</a> Biotechniques. 52 (5), 325-331 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Kokultury z wstawkami są szeroko stosowane do badania interakcji międzykomórkowych. System kokultury 2D jest skutecznym sposobem obserwacji, w jaki sposób dwie części przesłuchują się in vitro, dzięki czemu pokazaliśmy tutaj dwa różne efekty napędzane komórkami rakowymi na adipocyty szpiku kostnego. Wiele laboratoriów wykorzystało tę metodę do zbadania wzajemnych oddziaływań między adipocytami a komórkami rakowymi 6,12,27,39.<sup class="xref"...

Przerzuty do kości są powszechne wśród pacjentów z zaawansowanym rakiem, ale leczenie jest nadal niedostępne. Poza specjalizacją w magazynowaniu energii w postaci tłuszczu, adipocyty mogą wspierać wzrost guza i przerzuty do szpiku kostnego i innych narządów1,2,3,4,5,6. Co więcej, adipocyty odgrywają istotną rolę w regulacji biologii komórek nowotworowych7,8,9,10 i metabolizm4,11,12,13,14,15,16, a także w przerzutach do kości1,4,12. W niszy szpiku kostnego adipocyty mogą również wpływać na biologiczne zachowanie komórek nowotworowych4,6,17. Wzajemne oddziaływanie adipocytów szpiku kostnego i komórek nowotworowych z osteotropizmem jest istotne dla zrozumienia przerzutów do kości. Niewiele jednak wiadomo.
Na podstawie aktualnych badań, do adipocytów stosuje się różne metody, w tym dwu- lub trójwymiarowe (2/3D) oraz hodowle ex vivo17,18,19,20,21. Niedawno Herroon i in. zaprojektowali nowe podejście do hodowli 3D do badania interakcji adipocytów szpiku kostnego z komórkami nowotworowymi22. Chociaż kokultura 3D jest optymalna do naśladowania fizjologicznych interakcji między adipocytami a komórkami rakowymi in vivo, cierpi na słabą odtwarzalność22,23. W porównaniu z systemem kokultury 2D, system kokultury 3D może zapewniać różne fenotypy komórkowe, takie jak morfologia komórki21,22,24,25,26. Co więcej, hodowla ex vivo izolowanych fragmentów tkanki kości gąbczastej może prowadzić do silnego wzrostu adipocytów z hodowanych komórek szpiku kostnego17.
W przeciwieństwie do tych poprzednich modeli, model hodowli komórkowej 2D pozostaje klasyczną, niezawodną i łatwą techniką szybkiego skanowania potencjalnych cząsteczek i fenotypów zmienionych w adipocytach lub komórkach rakowych in vitro1,4,6,12,15,27. Aby lepiej zrozumieć wzajemne oddziaływanie między adipocytami szpiku kostnego a komórkami czerniaka, przedstawiamy szczegółowy protokół dla systemu kokultury 2D adipocytów szpiku kostnego z komórkami czerniaka.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen Inc.</td><td></td><td></td>11965092</tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>16000&ndash; 044</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>3-izobutylo-1-metyloksantyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Olej czerwony o</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Corning</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>Wkładka</td> <td>TranswellMillipore</td><td>MCHT24H48</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>izopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsyna</td><td></td><td>Hemocytometr Thermo Scientific</td> 25200056 <td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator Thermo</td><td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml falcon</td><td>Corning</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>Clean Bench</td><td>Thermo Mikroskopia naukowa</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td>Olympus-200</td><td></td></tr> <tr><td>&mu; Końcówki do pipet</td><td>BeyoGold</td><td>FTIP620</td><td></td></tr><tr><td>1 000 ml Końcówki do pipet</td><td>BeyoGold</td><td>FTIP628</td><td></td></tr></tbody></table>

podwójny wpływ czynników pochodzących z komórek czerniaka na różnicowanie adipocytów szpiku kostnego

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

Wzajemne oddziaływanie adipocytów szpiku kostnego i komórek nowotworowych może odgrywać kluczową rolę w procesie przerzutów do kości. Dostępnych jest wiele metod badania znacznego przesłuchu; Jednak dwuwymiarowy system Transwell dla kokultury pozostaje klasycznym, niezawodnym i łatwym sposobem na to badanie przesłuchów. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który pokazuje kokulturę adipocytów szpiku kostnego i komórek czerniaka. Niemniej jednak taki system kohodowli może nie tylko przyczynić się do badania transdukcji sygnału komórkowego w komórkach nowotworowych indukowanych przez adipocyty szpiku kostnego, ale także do przyszłych badań mechanistycznych nad przerzutami do kości, które mogą ujawnić nowe cele terapeutyczne dla przerzutów do kości.

W szpiku kostnym adipocyty mogą pojawiać się w mikrośrodowisku guza1,13,33,34,35 na wczesnym etapie, wspierając progresję nowotworu poprzez czynniki rozpuszczalne lub aktywując osteoklastogenezę6,12,36, szczególnie w kontekście otyłośc...

Tutaj prezentujemy niezawodny i prosty dwuwymiarowy (2D) system kokultury do badania interakcji między komórkami nowotworowymi a adipocytami szpiku kostnego, który ujawnia podwójny wpływ czynników pochodzących z komórek czerniaka na różnicowanie adipocytów szpiku kostnego, a także stanowi klasyczną metodę mechanistycznego badania przerzutów do kości.

Podwójny wpływ czynników pochodzących z komórek czerniaka na różnicowanie adipocytów szpiku kostnego

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad przerzutami do kości, takie jak to, jakie zmiany są indukowane we wzroście adipocytów szpiku kostnego i ich rozwoju w mikrośrodowisku nowotworowym. Dużą zaletą tej techniki jest to, że jest łatwa do wykonania i że można szybko uzyskać cząsteczki kandydujące. Ta metoda może dostarczyć informacji na temat wzajemnych oddziaływań między adipocytami szpiku kostnego a komórkami czerniaka.Może być również stosowany do innych typów komórek, takich jak osteoblasty. Zacznij od wysiewu dwóch razy 10 do piątych komórek czerniaka B16F10 w 100-milimetrowym naczyniu z 10 mililitrami DMEM uzupełnionymi 10% FBS, na 24-godzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Następnego dnia umyj około 80% zlewającą się hodowlę komórkową dwa razy pięcioma mililitrami PBS na mycie i zagłodź komórki 10 mililitrami pożywki hodowlanej bez surowicy w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 18 do 24 godzin.Następnego dnia za pomocą pipety przenieś kondycjonowany supernatant do 50-mililitrowej stożkowej probówki do odwirowania i załaduj pożywkę do strzykawki wyposażonej w filtr porowy o średnicy 0,45 mikrona. Następnie prze

dual-effects-melanoma-cell-derived-factors-on-bone-marrow-adipocytes

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film pokazuje różnicowanie komórek zrębu szpiku kostnego (BMSC) w adipocyty. W dwuetapowym procesie, w obecności określonych czynników wzrostu i hormonów, niezróżnicowane BMSC najpierw różnicują się w preadipocyty. Drugi etap polegający na leczeniu glukozą i insuliną prowadzi do powstania dojrzałych adipocytów z wieloma kropelkami lipidów.

Różnicowanie komórek zrębu szpiku kostnego myszy in vitro w adipocyty

Tkanka tłuszczowa (AT) może wpływać na homeostazę całego organizmu, dlatego zrozumienie molekularnych mechanizmów różnicowania i funkcji adipocytów jest ważne. Udostępniamy protokół uzyskiwania nowych informacji na temat tych procesów poprzez analizę homeostazy, różnicowania i ekspozycji na niedotlenienie adipocytów jako modelu indukowanej apoptozy adipocytów.

Mechanizm regulacji liczby adipocytów w organizmach dorosłych poprzez różnicowanie i homeostazę apoptozy

W organizmach wielokomórkowych wydzielane rozpuszczalne czynniki wywołują reakcje różnych typów komórek w wyniku sygnalizacji parakrynnej. Systemy kohodowli typu insert oferują prosty sposób oceny zmian, w których pośredniczą wydzielane czynniki rozpuszczalne przy braku kontaktu komórka-komórka.

Opracowanie systemu kohodowli inkubacyjnej dwóch typów komórek przy braku kontaktu komórka-komórka

Tutaj przedstawiamy metodę izolacji populacji komórek progenitorowych adipocytów (APC) z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej (PVAT) za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MCS). Metoda ta pozwala na zwiększoną izolację APC na gram tkanki tłuszczowej w porównaniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS).

Ekspansja i indukcja adipogenezy progenitorów adipocytów z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej izolowanej przez magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych

Tradycyjne metody oceny różnicowania adipogennego są tanie i łatwe w użyciu, ale nie są specyficzne dla zmian w ekspresji genów. Opracowaliśmy test do ilościowego określania różnicowania komórek mezenchymalnych w dojrzałe adipocyty przy użyciu markera specyficznego dla linii. Test ten ma różnorodne zastosowania w badaniach podstawowych i medycynie klinicznej.

Wizualizacja i kwantyfikacja potencjału różnicowania adipogennego komórek mezenchymalnych za pomocą markera specyficznego dla linii

Odróżnienie białych i beżowych adipocytów od komórek progenitorowych naczyń tkanki tłuszczowej niesie ze sobą potencjał do metabolicznej poprawy otyłości. Opisujemy protokoły izolacji komórek śródbłonka CD34 + CD31 + z ludzkiego tłuszczu oraz późniejszej ekspansji i różnicowania in vitro do białych i beżowych adipocytów. Omówiono kilka dalszych zastosowań.

Izolacja, ekspansja i indukcja adipogenna komórek śródbłonka CD34+CD31+ z ludzkiej tkanki tłuszczowej i podskórnej

Poniższa procedura opisuje metodę przestrzennej i czasowej kontroli inicjacji guza melanocytowego w skórze grzbietowej myszy, przy użyciu genetycznie zmodyfikowanego modelu myszy. Protokół ten opisuje makroskopową i mikroskopową inicjację czerniaka skóry.

Przestrzenna i czasowa kontrola inicjacji czerniaka myszy ze zmutowanych komórek macierzystych melanocytów

Protokół pozwala na generowanie czystej populacji adipocytów z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Kwas retinowy służy do różnicowania iPSC w mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), które są wykorzystywane do produkcji adipocytów. Następnie stosuje się podejście sortowania oparte na barwieniu czerwienią nilową w celu uzyskania czystych adipocytów.

Solidne różnicowanie ludzkich iPSC w czystą populację adipocytów w celu zbadania zaburzeń związanych z adipocytami

Ten protokół opisuje półautomatyczną izolację frakcji zrębu naczyniowego (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej w celu uzyskania preadipocytów i osiągnięcia różnicowania adipocytów in vitro. Użycie dysocjatora tkankowego do trawienia kolagenazy zmniejsza zmienność eksperymentalną i zwiększa odtwarzalność.

Półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego

Ten artykuł opisuje protokół namnażania komórek nowotworowych krążących w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF-CTC) pobranych od pacjentów z chorobą oponowo-rdzeniową związaną z czerniakiem (M-LMD) w celu opracowania modeli przedklinicznych do badania M-LMD.

Ex vivo Hodowla krążących komórek nowotworowych w płynie mózgowo-rdzeniowym od pacjentów z czerniakiem w celu zbadania choroby opon mózgowo-rdzeniowych związanej z czerniakiem

Poznaj dwuwymiarowy system ko-kultury do badania interakcji między komórkami czerniaka a adipocytami szpiku kostnego. Ta metoda umożliwia analizę mechanizmów przerzutów kostnych i różnicowania adipocytów.

Podwójny wpływ czynników pochodzących z komórek czerniaka na różnicowanie adipocytów szpiku kostnego

Przeglądaj więcej filmów