Name: Oznaczanie titracji ELISA jako metoda wyznaczania stałej dysocjacji oddziaływań ligand-receptor (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Poznaj metodę titracji ELISA do wyznaczania stałych dysocjacji oddziaływań ligand-receptor z wykorzystaniem nowego algorytmu. Technika ta umożliwia precyzyjne badanie powinowactwa białek w neurobiologii i farmakologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Protokół i algorytm zostały opracowane w ramach projektu sfinansowanego przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (dofinansowanie SFB1009 A09 i EB177/13-1). Autor dziękuje Barbarze Schedding i Felixowi Schmalbein za wsparcie techniczne oraz dr. Niland za krytyczne przeczytanie rękopisu.

1. Stock Solutions
<ol>
	<li>Aby przygotować 100 mL 10x TBS pH 7.4, rozpuść 6,06 g TRIS i 8,77 g NaCl w 90 mL zdejonizowanej wody, dostosuj pH do 7,4 za pomocą 37% roztworu HCl, uzupełnij objętość do 100 mL zdejonizowaną wodą i przefiltruj roztwór.</li>
	<li>Aby przygotować 100 mL 1 M HEPES/NaOH, pH 7.4, rozpuść 23,83 g HEPES w 90 mL zdejonizowanej wody, dostosuj pH do 7,4 za pomocą 1,5 M NaOH, uzupełnij objętość do 100 mL zdejonizowaną wodą i przefiltruj roztwór.</li>
	<li>Aby przygotować 100 mL 5 M NaCl, rozpuść 29,2 g NaCl w 90 mL zdejonizowanej wody. Uzupełnij objętość do 100 mL zdejonizowaną wodą i przefiltruj roztwór.</li>
	<li>Aby przygotować 100 mL 1 M MgCl2 roztworu, rozpuść 20,33 g MgCl2 · 6H2O w 90 mL zdejonizowanej wody. Uzupełnij objętość do 100 mL zdejonizowaną wodą i przefiltruj roztwór.</li>
	<li>Aby przygotować 5% wyłączonej termicznie BSA w wodzie, odważyć 2,5 g BSA (frakcja V, pH 7,0) w 50 mL probówce i rozpuścić w 45 mL zdejonizowanej wody. Uzupełnić roztwór do 50 mL zdejonizowaną wodą i podgrzać w kąpieli wodnej w temperaturze 68 °C przez 45 min. Ochłodzić w łaźni lodowej i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować wodny 25% roztwór glutaraldehydu. 
	OSTRZEŻENIE: Glutaraldehyd jest szkodliwy w przypadku połknięcia, toksyczny przy inhalacji i powoduje oparzenia. Należy nosić odzież ochronną, rękawiczki i ochronę oczu/twarzy.</li>
	<li>Wytwarzać królicze antysera jak opisano wcześniej19. Tytuł antyseru został określony zgodnie ze standardowymi protokołami20.</li>
	<li>Przygotować przeciwkrólicze immunoglobulinowe przeciwciała od kozy sprzężone z fosfatazą alkaliczną.</li>
	<li>Aby przygotować 100 mL 0,1 M glicyny, rozpuść 0,75 g glicyny w 90 mL zdejonizowanej wody. Dostosuj pH do 10,4 za pomocą 1,5 M NaOH, uzupełnij objętość do 100 mL zdejonizowaną wodą i przefiltruj roztwór.</li>
	<li>Aby przygotować 100 mL 0,5 M Zn(II)-octanu, rozpuść 10,98 g Zn(II)-octanu · 2H2O w 90 mL zdejonizowanej wody. Uzupełnij objętość do 100 mL zdejonizowaną wodą i przefiltruj roztwór.</li>
	<li>Aby przygotować 100 mL 1,5 M NaOH, rozpuść 6,0 g NaOH w 90 mL zdejonizowanej wody. Uzupełnij objętość do 100 mL zdejonizowaną wodą i przefiltruj roztwór.</li>
</ol>
2. Prepare Buffers and Working Solutions
<ol>
	<li>Rozcieńcz 5 mL 10x TBS pH 7.4, z 45 mL zdejonizowanej wody i dodaj 100 µL 1 M MgCl2 roztworu stockowego. Przechowuj w temperaturze pokojowej. TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 roztwór służy do imobilizowania receptora i mycia płytki mikrotytrowań.</li>
	<li>Rozcieńcz 10 mL 5% wyłączonej termicznie BSA w wodzie i 5 mL 10x TBS, pH 7.4 z zdejonizowaną wodą do 50 mL. Dodaj 100 µL 1 M MgCl2 stock solution i dobrze wymieszaj roztwór. Przechowuj na lodzie i składuj na dalsze eksperymenty w temperaturze -20 °C. Należy zauważyć, że 2,5 mL 1% BSA w TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 są wymagane dla każdej krzywej tytulacji.</li>
	<li>Rozcieńcz 2,5 mL 1 M HEPES/NaOH, pH 7.4 i 1,5 mL 5 M NaCl do 50 mL zdejonizowaną wodą, dodaj 100 µL 1 M MgCl2 roztworu i dobrze wymieszaj roztwór, aby przygotować 50 mL HBS, pH 7.4: 50 mM HEPES/NaOH, 150 mM NaCl.</li>
	<li>Dodaj 5 µL 1M MgCl2 stock solution i 2 µL 0,5 M Zn(II)-octanu stock solution do 5 mL 0,1 M glicyny roztworu, pH 10,4, aby przygotować bufor fosfatazy alkalicznej (AP) (0,1 M glicyny roztwór, pH 10,4, 1 mM MgCl2, 0,2 mM Zn(II)-octanu).</li>
</ol>
3. Imobilization of the Receptor (Integrin α2A-Domain) to a Microtiter Plate
<ol>
	<li>Rozcieńcz stock solution integrinu α2A-domain w TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 do końcowej koncentracji 5 µg/mL. 
	UWAGA: Objętość roztworu powłokowego wynosi 650 µL dla jednej krzywej tytulacji obejmującej rząd 12 komórek półpłytki mikrotytrowań.</li>
	<li>Wypełnij każdą komórkę rzędu na półpłytce mikrotytrowań 50 µL/komórka 5 µg/mL roztworu powłokowego integrinu α2

<ol><li>Klotz, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+the+law+of+mass+action+to+binding+by+proteins%3B+interactions+with+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem%22%5BJournal%5D)">The application of the law of mass action to binding by proteins; interactions with calcium.</a> Arch Biochem. 9, 109-117 (1946).</li>
<li>Klotz, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-receptor+complexes%3A+origin+and+development+of+the+concept%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Ligand-receptor complexes: origin and development of the concept.</a> J Biol Chem. 279 (1), 1-12 (2004).</li>
<li>Bisswanger, H. Ch. 1: Multiple Equilibria, Principles and Derivations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBisswanger%2C+H+%22Enzyme+Kinetics%3A+Principles+and+Methods%22">Enzyme Kinetics: Principles and Methods</a>. , Wiley VCH Verlag GmbH. 1-26 (2017).</li>
<li>Shimura, K., Kasai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+gel+titration%3A+quantitative+analysis+of+the+binding+equilibrium+between+immobilized+protein+and+free+ligand+by+a+continuous+titration+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Affinity gel titration: quantitative analysis of the binding equilibrium between immobilized protein and free ligand by a continuous titration procedure.</a> Anal Biochem. 149 (2), 369-378 (1985).</li>
<li>Gong, M., Nikcevic, I., Wehmeyer, K. R., Limbach, P. A., Heineman, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-aptamer+binding+studies+using+microchip+affinity+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Protein-aptamer binding studies using microchip affinity capillary electrophoresis.</a> Electrophoresis. 29 (7), 1415-1422 (2008).</li>
<li>Hanes, M. S., Ratcliff, K., Marqusee, S., Handel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+binding+affinities+by+pulse+proteolysis%3A+application+to+TEM-1%2FBLIP+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein-protein binding affinities by pulse proteolysis: application to TEM-1/BLIP protein complexes.</a> Protein Sci. 19 (10), 1996-2000 (2010).</li>
<li>Latour, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Langmuir+isotherm%3A+a+commonly+applied+but+misleading+approach+for+the+analysis+of+protein+adsorption+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">The Langmuir isotherm: a commonly applied but misleading approach for the analysis of protein adsorption behavior.</a> J Biomed Mater Res A. 103 (3), 949-958 (2015).</li>
<li>Stockell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+binding+of+diphosphopyridine+nucleotide+by+yeast+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The binding of diphosphopyridine nucleotide by yeast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.</a> J Biol Chem. 234 (5), 1286-1292 (1959).</li>
<li>Heyn, M. P., Weischet, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+dichroism+and+fluorescence+studies+on+the+binding+of+ligands+to+the+%CE%B1+subunit+of+tryptophan+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Circular dichroism and fluorescence studies on the binding of ligands to the α subunit of tryptophan synthase.</a> Biochem. 14 (13), 2962-2968 (1975).</li>
<li>Campbell, I. D., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3039929/">Integrin structure, activation, and interactions.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (3), (2011).</li>
<li>Zeltz, C., Gullberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+integrin-collagen+connection--a+glue+for+tissue+repair%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The integrin-collagen connection--a glue for tissue repair?</a> J Cell Sci. 129 (4), 653-664 (2016).</li>
<li>Kanchanawong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+architecture+of+integrin-based+cell+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions.</a> Nature. 468 (7323), 580-584 (2010).</li>
<li>Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+integrin+regulation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Structural basis of integrin regulation and signaling.</a> Annu Rev Immunol. 25, 619-647 (2007).</li>
<li>Luo, B. H., Springer, T. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1618925/">Integrin structures and conformational signaling.</a> Curr Opin Cell Biol. 18 (5), 579-586 (2006).</li>
<li>Ricard-Blum, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3003457/">The collagen family.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a004978(2011).</li>
<li>Eble, J. A., Tuckwell, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B12%CE%B21+integrin+inhibitor+rhodocetin+binds+to+the+A-domain+of+the+integrin+%CE%B12+subunit+proximal+to+the+collagen-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The α2β1 integrin inhibitor rhodocetin binds to the A-domain of the integrin α2 subunit proximal to the collagen-binding site.</a> Biochem J. 376 (Pt 1), 77-85 (2003).</li>
<li>Eble, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B12%CE%B21+integrin-specific+antagonist+rhodocetin+is+a+cruciform%2C+heterotetrameric+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The α2β1 integrin-specific antagonist rhodocetin is a cruciform, heterotetrameric molecule.</a> FASEB J. 23 (9), 2917-2927 (2009).</li>
<li>Eble, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+and+concerted+conformational+changes+enable+rhodocetin+to+block+%CE%B12%CE%B21+integrin+selectively%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Dramatic and concerted conformational changes enable rhodocetin to block α2β1 integrin selectively.</a> PLoS Biol. 15 (7), e2001492(2017).</li>
<li>Bracht, T., Figueiredo de Rezende, F., Stetefeld, J., Sorokin, L. M., Eble, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+reveal+the+alteration+of+the+rhodocetin+structure+upon+%CE%B12%CE%B21+integrin+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies reveal the alteration of the rhodocetin structure upon α2β1 integrin binding.</a> Biochem J. 440 (1), 1-11 (2011).</li>
<li>Harlow, E., Lane, D. Chapter 5: Immunizations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Antibodies%2C+a+laboratory+manual%22">Antibodies, a laboratory manual</a>. 5, Cold Spring Harbor Laboratory. 53-138 (1988).</li>
<li>Lu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+interactions+between+SSB+and+proteins+by+the+use+of+fluorescence+anisotropy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analyzing interactions between SSB and proteins by the use of fluorescence anisotropy.</a> Methods Mol Biol. 922, 155-159 (2012).</li>
<li>Fielding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+methods+for+the+determination+of+protein-ligand+dissociation+constants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">NMR methods for the determination of protein-ligand dissociation constants.</a> Curr Top Med Chem. 3 (1), 39-53 (2003).</li>
<li>Leavitt, S., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+protein+binding+energetics+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry.</a> Curr Opin Struct Biol. 11 (5), 560-566 (2001).</li>
<li>McDonnell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance%3A+towards+an+understanding+of+the+mechanisms+of+biological+molecular+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance: towards an understanding of the mechanisms of biological molecular recognition.</a> Curr Opin Chem Biol. 5 (5), 572-577 (2001).</li>
<li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+surface+plasmon+resonance+biosensor+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 11 (1), 54-61 (2000).</li>
<li>Pesquero, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+and+kinetic+parameter+estimation+of+the+affinity+interaction+of+jArtinM+and+rArtinM+with+peroxidase+glycoprotein+by+the+electrogravimetric+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring and kinetic parameter estimation of the affinity interaction of jArtinM and rArtinM with peroxidase glycoprotein by the electrogravimetric technique.</a> Biosens Bioelectron. 26 (1), 36-42 (2010).</li>
<li>Scheuermann, T. H., Padrick, S. B., Gardner, K. H., Brautigam, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+acquisition+and+analysis+of+microscale+thermophoresis+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">On the acquisition and analysis of microscale thermophoresis data.</a> Anal Biochem. 496, 79-93 (2016).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do ujawnienia.

Titracja ELISA to wszechstronny system testowy do określania dysocjacji interakcji receptor-ligand. Ponieważ titracja ELISA omija konieczność efektywnego oddzielania wolnych i związanych ligandów oraz analizy ich stężeń ilościowo, znacznie więcej badań i publikacji zastosowało titrację ELISA zamiast rejestrowania krzywych wiązania. Co więcej, titracje ELISA są łatwe do wykonania i wymagają stosunkowo niewielkich ilości receptora i ligandu. Aby uzyskać dokładną analizę stałych dysocjacji, należy stosować czyste preparaty ...

Konstanta dysocjacji K jest kluczowym parametrem opisującym powinowactwo receptora (R) do jego ligandu (L). Na podstawie prawa działania mas, K jest zdefiniowane dla równowagi, w której kompleks receptor-ligand RL dysocjuje się na receptor R i ligand L:
<img alt="Równanie 1 " src="/files/ftp_upload/57334/57334eq1.jpg" />            Równanie 1
przy czym indeksy f oznaczają stan wolny/niezwiązany receptora i ligandu. Stężenie kompleksu receptor-ligand, RL, jest identyczne z stężeniem związanego ligandu Lb. Ponieważ całkowite stężenie receptora Rt jest sumą wolnego receptora Rf i związanego z ligandem receptora Rb = Lb, konstancie dysocjacji można także przypisać:
<img alt="Równanie 2 " src="/files/ftp_upload/57334/57334eq2.jpg" />         Równanie 2
Dlatego też wydajność nasycenia Y, zdefiniowana jako ułamek związanego ligandu Lb w odniesieniu do całkowitego stężenia receptora Rt,
<img alt="Równanie 3 " src="/files/ftp_upload/57334/57334eq3.jpg" />         Równanie 3
zależy od stężenia wolnego ligandu Lf:
<img alt="Równanie 4 " src="/files/ftp_upload/57334/57334eq4.jpg" />         Równanie 4
Ta hiperboliczna relacja opisuje krzywą wiązania receptora-ligandu, a jej wykres przedstawia stężenie związanego ligandu Lb jako funkcję stężenia wolnego ligandu Lf. Z krzywej wiązania można wyprowadzić stałą dysocjacji K jako stężenie wolnego ligandu przy połowie maksymalnej wydajności nasycenia. Co więcej, różne algorytmy liniaryzacji krzywych wiązania zostały ustanowione, takie jak podwójny wykres odwrotny Klotza1,2, lub transformacje według Scatcharda czy Hanesa (przegląd Bisswangera3). Jednakże wszystkie algorytmy cierpią na problem, że maksymalna wartość wydajności nasycenia, która jest osiągana asymptotycznie przy wysokich stężeniach wolnego ligandu na krzywej wiązania, musi być oszacowana w graficznej przed-ewaluacji i dlatego jest podatna na błędy.
Poza tym, oznaczanie krzywej wiązania wymaga ilościowego rozdzielenia wolnego i związanego ligandu podczas równowagi wiązania. W tym celu wolny ligand musi zostać oddzielony od związanego z receptorem ligandu i ilościowo określony. Dlatego też ligand i receptor muszą różnić się swoimi właściwościami, takimi jak niebiałkowy ligand w przeciwieństwie do białkowego receptora. Jeśli oba partnerzy wiązania są białkami, muszą być rozróżnialne pod względem ich wielkości, ładunków lub innych cech molekularnych. Niemniej jednak, ilościowe oznaczanie stężeń ligandu w małych skalach wiązania jest trudnym zadaniem. Radioaktywne oznaczanie ligandu było często konieczne, aby wykryć niską koncentrację związanego ligandu, szczególnie jeśli znaczne ilości receptorów nie były dostępne lub nie były przystępne cenowo. Co więcej, związany z receptorem ligand może się dysocjować w sposób niezaniedbywalny podczas i po izolacji. Dlatego też złożone metody, takie jak filtracja żelowa w równowadze4, elektroforeza kapilarna5 i impulsowa proteoliza6, są wymagane do ilościowego określania związanego z receptorem ligandu i jego oddzielania od wolnego ligandu.
W przeciwieństwie do tych badań wiązania, eksperymenty tytulacyjne nie wymagają ilościowego rozdzielenia związanego i wolnego ligandu. W tym celu receptor o stałym stężeniu jest titrowany różnymi stężeniami dodanego ligandu. Poprzez wiązanie się z receptorem, związany ligand ma właściwość biofizyczną, która odróżnia go od wolnego ligandu i jest mierzalna, np. przez fotometrię, fluorometrię lub wykrycie przeciwciał. Dlatego też sygnał S, który jest proporcjonalny do wydajności nasycenia Y i w konsekwencji także do stężenia związanego z receptorem ligandu (Lb), jest wykrywany jako funkcja całkowitego stężenia dodanego ligandu (Lt). Oba parametry, sygnał S i całkowite stężenie dodanego ligandu są określane w sposób bezpośredni i łatwiejszy niż stężenia związanego i wolnego ligandu. Szczególnie, wykrycie związanego z receptorem ligandu przez immunosorbujący test enzymatyczny (ELISA) pozwoliło na zmniejszenie objętości próbek poniżej 100 µL, jak również na równoległe pomiary kilku stężeń ligandu w płytkach mikrotytrowym. W titracji ELISA, receptor jest fizycznie adsorbowany na płytce mikrotytrowej w

<table><tbody><tr><td>TRIS</td><td>neoFrox</td><td>1125KG001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Applichem</td><td>1,316,591,214</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Merck</td><td>172571</td><td></td></tr><tr><td>integrin a2A, dzikiego typu i mutantnego, rekombinowane</td><td></td><td>izolowane w laboratorium autora</td><td></td></tr><tr><td>NiNTA superflow column&nbsp;</td><td>Qiagen, Germany</td><td>30821</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie-Brilliant Blue R250</td><td>Serva</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>oznaczenie kwasu bicinchoninowego (BCA), zestaw do oznaczania stężenia białka</td><td>Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej (BSA), frakcja V</td><td>Applichem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>25 % roztwór glutaraldehydu</td><td>Merck</td><td>354400</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciała przeciw immunoglobulinom króliczym od kozy, sprzężone z fosfatazą zasadową</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9919</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Applichem</td><td>A1377</td><td></td></tr><tr><td>Zn(II)-acetate</td><td>Applichem</td><td>A4324</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Applichem</td><td>A1551</td><td></td></tr><tr><td>Tabletka podłoża do fosfatazy zasadowej (5 mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0942</td><td></td></tr><tr><td>Półpowierzchniowa płytka mikrotytrowcowa Costar</td><td>Thermo Scientific</td><td>Corning 3690</td><td></td></tr><tr><td>mikro probówki reakcyjne</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek ELISA</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td></td></tr></tbody></table>

oznaczanie titracji elisa jako metoda wyznaczania stałej dysocjacji oddziaływań ligand-receptor

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Stała dysocjacji opisuje interakcję między dwoma partnerami w równowadze wiązania i jest miarą ich powinowactwa. Jest to kluczowy parametr do porównania różnych ligandów, np., inhibitorów konkurencyjnych, izoform białkowych i mutantów, pod względem ich siły wiązania z partnerem wiązującym. Stałe dysocjacji są określane poprzez wykreślanie stężeń związanego wobec wolnego ligandu jako krzywych wiązania. Natomiast krzywe tytulacyjne, w których sygnał proporcjonalny do stężenia związanego ligandu jest wykreślany względem całkowitego stężenia dodanego ligandu, są znacznie łatwiejsze do zapisania. Sygnał może być wykrywany spektroskopowo i przez enzymowo-związany immunosorbentowy test (ELISA). Jest to przykładowe w protokole dla testu ELISA tytulacyjnego, który mierzy wiązanie pochodzącego od jadu węży rodocetyny do jego unieruchomionego domeny docelowej α2β1 integrinu. Testy ELISA tytulacyjne są wszechstronne i szeroko stosowane. Każda para oddziałujących białek może być użyta jako unieruchomiony receptor i rozpuszczalny ligand, pod warunkiem że oba białka są czyste, a ich stężenia są znane. Dotąd trudnością było określenie stałej dysocjacji na podstawie krzywej tytulacyjnej. W niniejszym badaniu, wprowadzona zostaje matematyczna funkcja leżąca u podstaw krzywych tytulacyjnych. Bez jakiejkolwiek błędnej graficznej oceny wydajności nasycenia, ten algorytm pozwala na przetwarzanie danych surowych (intensywności sygnału w różnych stężeniach dodanego ligandu) bezpośrednio przez matematyczną ocenę poprzez regresję nieliniową. Dlatego wiele krzywych tytulacyjnych może być zapisywanych jednocześnie i przekształcanych w zestaw charakterystycznych parametrów, w tym stałej dysocjacji i stężenia aktywnego wiązaniowo receptora, a następnie mogą być oceniane statystycznie. W połączeniu z tym algorytmem, testy ELISA tytulacyjne mają zaletę bezpośredniego prezentowania stałej dysocjacji. Dlatego mogą być używane bardziej efektywnie w przyszłości.

Po wykonaniu ELISA, żółty kolor przekonwertowanego substratu alkalicznej fosfatazy, para-nitrofenolanu, wskazuje, że ilość związanego ligandu rodocetyny maleje wraz ze zmniejszaniem się stężeń dodanej rodocetyny z kolumn 1 do 11 (Rysunek 1). Bezbarwne dołki w dołkach wolnych od rodocetyny w kolumnie 12 pokazują niski poziom sygnału tła.
Ilościowe pomiary fotometryczne przy 405 nm dostarczaj...

Opisano szczegółowe protokoły wykonywania titracji ELISA. Ponadto przedstawiono nowy algorytm do oceny titracji ELISA i uzyskania stałej dysocjacji wiązania rozpuszczalnego ligandu z receptorem unieruchomionym na płytce mikrotytlacyjnej.

Oznaczanie titracji ELISA jako metoda wyznaczania stałej dysocjacji oddziaływań ligand-receptor

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Całkowitym celem tej titracji ELISA jest określenie stałej afinicji dwóch partnerów wiązujących w sposób powtarzalny i wydajny za pomocą nowego algorytmu. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania nie tylko w dziedzinie interakcji ligand-białko i badań nad receptorami, ale również w stosowanych naukach przyrodniczych, takich jak badania farmaceutyczne i farmakologia. Główną zaletą tej techniki jest to, że stała afinicji interakcji ligand-receptor może być łatwo określona poprzez tytulację receptora ligandem na płytce ELISA i za pomocą nowego algorytmu oceny.Rozpocznij tę procedurę przez rozcieńczenie roztworu początkowego domen Integryny Alfa 2 A do końcowej koncentracji pięciu mikrogramów na mililitr w buforze chlorku magnezu TBS. Zarówno dzika forma jak i mutant domen Integryny Alfa 2 A zostaną użyte w tej demonstracji. Napełnij każde pole wiersza na półpłytce mikrotytratorowej 50 mikrolitami roztworu powlekającego domen Integryny Alfa 2 A.Wykonaj każdą tytulację wiersza przynajmniej w dwóch powtórzeniach. W tym przykładzie każda tytulacja wiersza jest wykonywana w czwórkach. Uszczelnij płytkę folią i pozostaw ją na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Na następny dzień, usuń roztwór powlekający i napełnij każde pole 15 mikrolitami buforu chlorku magnezu TBS. Usuń roztwór do mycia i napełnij pola nowym roztworem do mycia. Mycie usuwa rozpuszczalne cząsteczki receptora, które nie zostały unieruchomione na powierzchni plastikowej poprzez absorpcję fizyczną.Następnym krokiem jest zablokowanie niespecyficznych miejsc wiązania poprzez dodanie 50 mikrolitrów jednoprocentowego roztworu BSA w buforze chlorku magnezu TBS do każdego pola. Uszczelnij ponownie płytkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Podczas gdy pola mikrotytratorowej płytki są blokowane przez BSA, przygotuj szereg rozcieńczeń ligandu Rodocetyna.W tym przypadku stosuje się stężenie początkowe 243 emalii z erozyjnym Rodocetynem i współczynnik rozcieńczenia 2,3. Przygotuj 920 mikrolitrów roztworu Rodocetyna w najwyższym stężeniu w jednoprocentowej BSA w TBS chlorku magnezu w probówce numer jeden. Napipetuj 520 mikrolitrów jednoprocentowego roztworu BSA w TBS chlorku magnezu do każdej z pozostałych dziesięciu probówek oznaczonych od dwóch do jedenastu.Przenieś 400 mikrolitrów roztworu Rodocetyna z probówki do probówki dwie. Mieszaj obie roztwory przez chutter-a-tion i następnie przenieś 400 mikrolitrów z tej mieszaniny do probówki trzy. Kontynuuj tę serię rozcieńczeń aż do probówki jedenaście.Aby zapewnić sukces tej procedury, ważne jest, aby zawsze szybko napełniać każde pole roztworem, aby upewnić się, że pola nie wyschną. Po zakończeniu godzinnej inkubacji, usuń roztwór blokujący z pól mikrotytratorowej płytki. Natychmiast dodaj 50 mikrolitrów roztworu Rodocetyna z probówki jeden do pól kolumny jeden, roztwór z probówki dwie do pól kolumny dwie i kontynuuj do kolumny jedenascie.Dodaj 50 mikrolitrów jednoprocentowej BSA i TBS chlorku magnezu jako kontrolę bez ligandu do pól kolumny dwunaste. Uszczelnij ponownie płytkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez półtorej godziny. Aby usunąć niezwiązane cząsteczki ligandu, usuń roztwór wiązania i napełnij każde pole 50 mikrolitami buforu chlorku magnezu HBS.Następnie usuń bufor HBS i dodaj nowy bufor HBS. Aby chemicznie unieruchomić receptor i związany ligand, napełnij każde pole mikrotytratorowej płytki 50 mikrolitami 2,5% roztworu glutaraldehydu w buforze chlorku magnezu HBS. Inkubuj mikrotytratorową płytkę w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut.Usuń i inaktywuj nadmiar glutaraldehydu poprzez usunięcie roztworu fiksującego i napełnienie każdego pola 50 mikrolitami buforu chlorku magnezu TBS. Usuń bufor do mycia i dodaj nowy bufor do mycia do każdego pola. Aby rozpocząć tę analizę, usuń bufor do mycia ze wszystkich pól mikrotytratorowej płytki i dodaj do każdego pola 50 mikrolitrów roztworu pierwotnego przeciwciała, rozcieńczonego 1 do 2000 w jednoprocentowej BSA TBS chlorku magnezu.Uszczelnij ponownie płytkę i inkubuj ją w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór pierwotnego przeciwciała ze wszystkich pól i dodaj do każdego pola 50 mikrolitrów buforu chlorku magnezu TBS. Myj trzy razy buforem chlorku magnezu TBS.Następnie dodaj do każdego pola 50 mikrolitrów roztworu przeciwciała wtórnego, rozcieńczonego 1 do 2000 w jednoprocentowej BSA w TBS chlorku magnezu. Uszczelnij ponownie płytkę i pozostaw ją w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór przeciwciała wtórnego z pól i dodaj do każdego pola 50 mikrolitrów buforu chlorku magnezu TBS.Myj trzy razy. Po trzecim myciu, delikatnie uderz mikrotytratorową płytkę o ściereczkę, aby usunąć wszystkie ślady płynu. Za pomocą wielokanałowej pipety, szybko dodaj 50 mikrolitrów roztworu wykrywającego fosfatazę alkaliczną do każdego pola mikrotytratorowej płytki, aby rozpocząć enzymatyczną konwers

titration-elisa-as-method-to-determine-dissociation-constant-receptor

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiono ogólny protokół wykorzystania izotermicznej kalorymetrii miareczkowej do monitorowania termodynamiki wiązania w układach biologicznych o umiarkowanym powinowactwie wiązania.

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa w pomiarach powinowactwa makrocząsteczek do ligandów

W tym filmie opisujemy test konkurencyjnego wiązania oparty na cytometrii przepływowej, który wykrywa interakcje między receptorem CXC Chemokine Receptor 4 (CXCR4) a jego fluorescencyjnie znakowanym naturalnym ligandem CXC Chemokine Ligand 12 (CXCL12), w obecności małej cząsteczki ukierunkowanej na CXCR4. Inkubacja komórek wykazujących ekspresję CXCR4 o niższych stężeniach małych cząsteczek umożliwia wiązanie CXCR4-CXCL12 do pewnego stopnia, które stopniowo zmniejsza się wraz ze stopniowym...

Konkurencyjny test wiązania w celu identyfikacji związków zakłócających interakcje receptor-ligand

Ten film demonstruje wykrywanie interakcji receptor-ligand za pomocą testu reporterowego. Udana interakcja receptor-ligand aktywuje dalszy szlak sygnałowy, powodując wytwarzanie i uwalnianie cytokin jako wydzielniczych cząsteczek reporterowych w roztworze, co potwierdza się za pomocą testu ELISA.

Test reporterowy oparty na teście ELISA do badania interakcji receptor-ligand w komórkach BW

Protokoły tutaj opisują kinetyczne testy interakcji białko-białko za pomocą interferometrii warstwy biologicznej. Syntaza ATP typu F, która bierze udział w metabolizmie energii komórkowej, może być hamowana przez swoją ε podjednostka u bakterii. Dostosowaliśmy interferometrię biowarstw do badania oddziaływań kompleksu katalitycznego z hamującą domeną C-końcową ε.

Interferometria biowarstwowa do pomiaru kinetyki oddziaływań białko-białko i efektów ligandów allosterycznych

Różnicowa fluorymetria skaningowa jest powszechnie stosowaną metodą badania bibliotek małych cząsteczek pod kątem interakcji z białkami. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę rozszerzenia tych analiz w celu oszacowania stałej dysocjacji między małą cząsteczką a jej białkiem partnera.

Oznaczanie oddziaływań białko-ligand za pomocą różnicowej fluorymetrii skaningowej

Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) to bezznacznikowa metoda wykrywania interakcji biomolekularnych w czasie rzeczywistym. W niniejszym artykule opisano protokół eksperymentu interakcji białko błona / receptor, omawiając jednocześnie zalety i wady tej techniki.

Pomiary w czasie rzeczywistym interakcji białko-receptor błonowy przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)

Prezentowane protokoły opisują dwie techniki oparte na enzymatycznym metodzie immunopochłaniania (ELISA) do szybkiego badania interakcji ligand-receptor: Pierwsza metoda pozwala na określenie stałej dysocjacji między ligandem a receptorem. Druga metoda umożliwia szybkie przesiewowe badanie peptydów blokujących interakcje ligand-receptor.

Metoda wiązania i konkurencji oparta na technice ELISA do szybkiego określania interakcji ligand-receptor

Metoda autoradiografii jest rutynowo stosowana do badania wiązania radioligandów z sekcjami tkanek w celu określenia jakościowej lub ilościowej farmakologii.

Autoradiografia jako prosta i skuteczna metoda wizualizacji i charakterystyki celów farmakologicznych

Opisujemy jednocząsteczkowe podejście do pomiarów powinowactwa antygenu i przeciwciała za pomocą fotometrii masowej (MP). Protokół oparty na MP jest szybki, dokładny, wykorzystuje bardzo małą ilość materiału i nie wymaga modyfikacji białek.

Szybkie oznaczanie powinowactwa przeciwciało-antygen za pomocą fotometrii masowej

Interakcja między kanałami HCN a ich podjednostką pomocniczą została zidentyfikowana jako cel terapeutyczny w dużym zaburzeniu depresyjnym. W tym artykule przedstawiono opartą na polaryzacji fluorescencyjnej metodę identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów tej interakcji białko-białko.

Metoda identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów oddziaływania białko-białko między HCN1 i TRIP8b

Poznaj metodę titracji ELISA do wyznaczania stałych dysocjacji oddziaływań ligand-receptor z wykorzystaniem nowego algorytmu. Technika ta umożliwia precyzyjne badanie powinowactwa białek w neurobiologii i farmakologii.

Oznaczanie titracji ELISA jako metoda wyznaczania stałej dysocjacji oddziaływań ligand-receptor

Przeglądaj więcej filmów