Oznaczanie titracji ELISA jako metoda wyznaczania stałej dysocjacji oddziaływań ligand-receptor
15 lutego 2018
Opisano szczegółowe protokoły wykonywania titracji ELISA. Ponadto przedstawiono nowy algorytm do oceny titracji ELISA i uzyskania stałej dysocjacji wiązania rozpuszczalnego ligandu z receptorem unieruchomionym na płytce mikrotytlacyjnej.
Całkowitym celem tej titracji ELISA jest określenie stałej afinicji dwóch partnerów wiązujących w sposób powtarzalny i wydajny za pomocą nowego algorytmu. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania nie tylko w dziedzinie interakcji ligand-białko i badań nad receptorami, ale również w stosowanych naukach przyrodniczych, takich jak badania farmaceutyczne i farmakologia. Główną zaletą tej techniki jest to, że stała afinicji interakcji ligand-receptor może być łatwo określona poprzez tytulację receptora ligandem na płytce ELISA i za pomocą nowego algorytmu oceny.
Rozpocznij tę procedurę przez rozcieńczenie roztworu początkowego domen Integryny Alfa 2 A do końcowej koncentracji pięciu mikrogramów na mililitr w buforze chlorku magnezu TBS. Zarówno dzika forma jak i mutant domen Integryny Alfa 2 A zostaną użyte w tej demonstracji. Napełnij każde pole wiersza na półpłytce mikrotytratorowej 50 mikrolitami roztworu powlekającego domen Integryny Alfa 2 A.
Wykonaj każdą tytulację wiersza przynajmniej w dwóch powtórzeniach. W tym przykładzie każda tytulacja wiersza jest wykonywana w czwórkach. Uszczelnij płytkę folią i pozostaw ją na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Na następny dzień, usuń roztwór powlekający i napełnij każde pole 15 mikrolitami buforu chlorku magnezu TBS. Usuń roztwór do mycia i napełnij pola nowym roztworem do mycia. Mycie usuwa rozpuszczalne cząsteczki receptora, które nie zostały unieruchomione na powierzchni plastikowej poprzez absorpcję fizyczną.
Następnym krokiem jest zablokowanie niespecyficznych miejsc wiązania poprzez dodanie 50 mikrolitrów jednoprocentowego roztworu BSA w buforze chlorku magnezu TBS do każdego pola. Uszczelnij ponownie płytkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Podczas gdy pola mikrotytratorowej płytki są blokowane przez BSA, przygotuj szereg rozcieńczeń ligandu Rodocetyna.
W tym przypadku stosuje się stężenie początkowe 243 emalii z erozyjnym Rodocetynem i współczynnik rozcieńczenia 2,3. Przygotuj 920 mikrolitrów roztworu Rodocetyna w najwyższym stężeniu w jednoprocentowej BSA w TBS chlorku magnezu w probówce numer jeden. Napipetuj 520 mikrolitrów jednoprocentowego roztworu BSA w TBS chlorku magnezu do każdej z pozostałych dziesięciu probówek oznaczonych od dwóch do jedenastu.
Przenieś 400 mikrolitrów roztworu Rodocetyna z probówki do probówki dwie. Mieszaj obie roztwory przez chutter-a-tion i następnie przenieś 400 mikrolitrów z tej mieszaniny do probówki trzy. Kontynuuj tę serię rozcieńczeń aż do probówki jedenaście.
Aby zapewnić sukces tej procedury, ważne jest, aby zawsze szybko napełniać każde pole roztworem, aby upewnić się, że pola nie wyschną. Po zakończeniu godzinnej inkubacji, usuń roztwór blokujący z pól mikrotytratorowej płytki. Natychmiast dodaj 50 mikrolitrów roztworu Rodocetyna z probówki jeden do pól kolumny jeden, roztwór z probówki dwie do pól kolumny dwie i kontynuuj do kolumny jedenascie.
Dodaj 50 mikrolitrów jednoprocentowej BSA i TBS chlorku magnezu jako kontrolę bez ligandu do pól kolumny dwunaste. Uszczelnij ponownie płytkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez półtorej godziny. Aby usunąć niezwiązane cząsteczki ligandu, usuń roztwór wiązania i napełnij każde pole 50 mikrolitami buforu chlorku magnezu HBS.
Następnie usuń bufor HBS i dodaj nowy bufor HBS. Aby chemicznie unieruchomić receptor i związany ligand, napełnij każde pole mikrotytratorowej płytki 50 mikrolitami 2,5% roztworu glutaraldehydu w buforze chlorku magnezu HBS. Inkubuj mikrotytratorową płytkę w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut.
Usuń i inaktywuj nadmiar glutaraldehydu poprzez usunięcie roztworu fiksującego i napełnienie każdego pola 50 mikrolitami buforu chlorku magnezu TBS. Usuń bufor do mycia i dodaj nowy bufor do mycia do każdego pola. Aby rozpocząć tę analizę, usuń bufor do mycia ze wszystkich pól mikrotytratorowej płytki i dodaj do każdego pola 50 mikrolitrów roztworu pierwotnego przeciwciała, rozcieńczonego 1 do 2000 w jednoprocentowej BSA TBS chlorku magnezu.
Uszczelnij ponownie płytkę i inkubuj ją w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór pierwotnego przeciwciała ze wszystkich pól i dodaj do każdego pola 50 mikrolitrów buforu chlorku magnezu TBS. Myj trzy razy buforem chlorku magnezu TBS.
Następnie dodaj do każdego pola 50 mikrolitrów roztworu przeciwciała wtórnego, rozcieńczonego 1 do 2000 w jednoprocentowej BSA w TBS chlorku magnezu. Uszczelnij ponownie płytkę i pozostaw ją w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór przeciwciała wtórnego z pól i dodaj do każdego pola 50 mikrolitrów buforu chlorku magnezu TBS.
Myj trzy razy. Po trzecim myciu, delikatnie uderz mikrotytratorową płytkę o ściereczkę, aby usunąć wszystkie ślady płynu. Za pomocą wielokanałowej pipety, szybko dodaj 50 mikrolitrów roztworu wykrywającego fosfatazę alkaliczną do każdego pola mikrotytratorowej płytki, aby rozpocząć enzymatyczną konwers
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje szczegółowy protokół przeprowadzania miareczkowego testu ELISA w celu wyznaczenia stałej powinowactwa oddziaływań receptor-ligand. Przedstawiono nowy algorytm pozwalający na efektywną ocenę wyników, co wspomaga badania nad oddziaływaniami białek oraz farmakologię.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Farmakologia
Wprowadzenie
- Zrozumienie oddziaływań receptor-ligand jest kluczowe w wielu dziedzinach biologii.
- Tradycyjne metody mogą charakteryzować się niską wydajnością i powtarzalnością.
- Miareczkowy test ELISA oferuje systematyczne podejście do pomiaru powinowactwa wiązania.
- Nowy algorytm usprawnia ewaluację danych, zapewniając lepszą dokładność.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody wyznaczania stałych powinowactwa.
- Ułatwienie badań nad oddziaływaniami białko-ligand.
- Dostarczenie narzędzia do zastosowań farmaceutycznych.
Zastosowane metody
- Rozcieńczanie domeny A integryny alfa 2 w buforze TBS z chlorkiem magnezu.
- Powlekanie płytek mikrotitracyjnych roztworem receptora.
- Wykorzystanie nowego algorytmu oceny do analizy danych.
- Porównanie domeny A integryny alfa 2 typu dzikiego i zmutowanej.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia łatwe wyznaczenie stałych powinowactwa.
- Wyniki wykazują powtarzalność w różnych próbach.
- Nowy algorytm zapewnia dokładną ocenę oddziaływań wiążących.
- Uzyskane informacje mogą mieć wpływ na badania farmaceutyczne oraz studia nad receptorami.
Wnioski
- Metoda ELISA z miareczkowaniem jest skuteczna w badaniu oddziaływań receptor-ligand.
- Nowy algorytm znacząco zwiększa efektywność analizy danych.
- Podejście to może przyczynić się do rozwoju badań w różnych dziedzinach stosowanych nauk o życiu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładne oznaczenie stałych dysocjacji receptor-ligand jest niezbędne do walidacji celu oraz optymalizacji związków wiodących w procesie odkrywania leków. Ta metoda miareczkowego testu ELISA, usprawniona przez nowy algorytm regresji nieliniowej, umożliwia powtarzalne pomiary powinowactwa bez konieczności szacowania graficznego, co wspiera podejmowanie decyzji go/no-go w oparciu o dane. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną we wczesnej fazie odkrywania poprzez kwantyfikację siły wiązania dla różnych wariantów ligandów i mutantów receptorów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofaraceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia ilościowe porównanie powinowactwa wiązania ligandu do receptorów typu dzikiego oraz zmutowanych, co wspiera weryfikację hipotez dotyczących relacji struktura-aktywność.
- Wartość operacyjna: Pozwala na bezpośrednie uzyskanie stałej dysocjacji z surowych danych sygnałowych, co zmniejsza zmienność w rankingu powinowactwa.
Przesiewanie i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Generuje standaryzowane krzywe miareczkowania dla wielu ligandów jednocześnie, umożliwiając równoległe przesiewanie bibliotek związków przeciwko unieruchomionym celom.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje detekcję kompatybilną z metodą ELISA, co pozwala na integrację z istniejącymi platformami do testów immunoenzymatycznych w celu skalowalnego profilowania powinowactwa.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Pozwala na pomiar stężenia receptorów aktywnych wiązania wraz z Kd, co dostarcza informacji niezbędnych do przewidywania stopnia zaangażowania celu w systemach istotnych dla danej choroby.
- Wartość operacyjna: Dostarcza parametrów poddających się ocenie statystycznej na podstawie powielonych krzywych miareczkowania, co wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, w którym ilościowe dane o powinowactwie służą do priorytetyzacji i ograniczania ryzyka mechanistycznego.
- Biologia odkrywcza: Wspomaga weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określanie, w jaki sposób mutacje lub modyfikacje zmieniają powinowactwo wiązania ligandów.
- Screening: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych sygnałów wiązania, które umożliwiają niezawodną ocenę związków w różnych zakresach stężeń.
- Analityka: Pozwala na wyznaczenie stałej dysocjacji oraz stężenia receptorów za pomocą regresji nieliniowej, zapewniając porównywalne odczyty do analizy zależności struktura-aktywność.
- Badania translacyjne: Łączy dane o wiązaniu in vitro z ciągłością przedkliniczną poprzez charakteryzację zmian powinowactwa w receptorach zmutowanych, istotnych w kontekście oporności na leki.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do profilowania powinowactwa dla różnorodnych par białko-ligand, ograniczając zależność od alternatywnych metod o niskiej przepustowości.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie oddziaływań cel-ligand dzięki precyzyjnemu wyznaczaniu Kd w oparciu o algorytmy.
- Wartość operacyjna: Poprawia odtwarzalność i standaryzację pomiarów powinowactwa pomiędzy laboratoriami i projektami.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie szybkiego rankingu powinowactwa ligandów i mutantów, co redukuje ryzyko niepowodzenia na późnych etapach badań.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację kandydatów na leki z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ilościowe dane dotyczące wiązania i potencjał zaangażowania receptora.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w oczyszczaniu białek, technikach ELISA oraz analizie regresji nieliniowej z wykorzystaniem oprogramowania takiego jak GraphPad Prism.
- Zależne od dostępu do czytników płytek mikrotytracyjnych, systemów pipetowania i kontroli inkubacji w celu zapewnienia powtarzalnego miareczkowania ligandów.
- Wymaga standaryzacji warunków buforowych, czynników blokujących i protokołów fiksacji w ramach zespołów w celu zminimalizowania zmienności.
- Wiąże się z koniecznością adaptacji metody przy zastosowaniu do różnych par receptor-ligand, szczególnie w odniesieniu do wydajności unieruchomienia i stabilności ligandu.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak potencjalne zaburzenie epitopów wskutek fiksacji glutaraldehydem, co musi zostać empirycznie zweryfikowane dla każdej pary docelowej.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:45
Immobilization of the Receptor (Integrin α2A-domain) to a Microtiter Plate
2:09
Preparation of a Serial Dilution Row of the Ligand (Rhodocetin)
3:25
Binding of Ligand at Different Concentrations to Immobilized Receptor
5:03
Quantification of Receptor-bound Ligand by ELISA
7:06
Evaluation of the Titration Signals
10:58
Conclusion
9:30
Results: Rhodocetin Binds with Lower Affinity to Mutant Integrin α2A-domain
