Name: Implantacja elektroprzędzonych przeszczepów naczyniowych o zoptymalizowanej strukturze w modelu szczurzym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj metodę elektroprzędzenia do wytwarzania przeszczepów naczyniowych z PCL o zoptymalizowanej strukturze. Oceń ich wydajność in vivo w modelu szczura, badając regenerację naczyń krwionośnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana finansowo przez projekty NSFC (81522023, 81530059, 91639113, 81772000, 81371699 i 81401534).

Wykorzystanie zwierząt doświadczalnych zostało zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Nankai i przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych.
1. Produkcja elektroprzędzonych przeszczepów PCL
UWAGA: W tym przypadku technika elektroprzędzenia została wykorzystana do produkcji przeszczepów naczyniowych.
<ol>
	<li>Przygotować roztwory PCL o stężeniu 25% i 10% wag., rozpuszczając PCL w mieszaninie odpowiednio metanolu i chloroformu (stosunek objętościowy 1:5) w temperaturze pokojowej (RT) przez 12 godzin.</li>
	<li>Załaduj roztwór PCL do szklanej strzykawki o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Umieścić strzykawkę z igłą 21-G.</li>
	<li>Umieść trzpień ze stali nierdzewnej (o średnicy 2 mm, długości 25 cm) na przyrządzie do zbierania.</li>
	<li>W przypadku przeszczepów z grubszych włókien jako parametry elektroprzędzenia należy użyć roztworu PCL o stężeniu 25 % wag., odległości roboczej 17 cm od końcówki igły do kolektora, natężenia przepływu 8 ml / h i napięcia 11 kV. W przypadku przeszczepów z cieńszych włókien jako parametry elektroprzędzenia należy użyć roztworu PCL o stężeniu 10 % wag., odległości roboczej 20 cm od końcówki igły do kolektora, natężeniu przepływu 2 ml / h i napięciu 18 kV.</li>
	<li>Upewnij się, że uzyskane przeszczepy są umieszczane w próżni przez noc w celu usunięcia pozostałości rozpuszczalnika. Wysterylizuj wszystkie narzędzia przed zabiegiem i utrzymuj aseptyczną technikę przez cały czas.</li>
	<li>Przed implantacją należy zdezynfekować przeszczepy, zanurzając je w 10 ml 75% etanolu na 30 minut, a następnie wystawiając je na działanie światła UV przez noc.</li>
	<li>Pomiary wielkości włókien i porów: Oblicz średnią średnicę włókna za pomocą oprogramowania ImageJ na podstawie obrazów ze skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM).</li>
	<li>Badania mechaniczne rusztowań:
	<ol>
		<li>Pokrój rusztowania rurowe na odcinki o długości 3 mm za pomocą żyletki. Zmierz grubość rusztowań za pomocą mikrometru.</li>
		<li>Rusztowania rurowe należy umieścić na maszynie wytrzymałościowej o nośności 100 N.</li>
		<li>Zacisnąć rusztowania z zachowaniem odległości między zaciskami 1 mm i ciągnąć wzdłużnie z prędkością 10 mm/min aż do pęknięcia. Zmierz wytrzymałość na rozciąganie i wydłużenie końcowe przy zerwaniu. Obliczyć moduł Younga z początkowego obszaru liniowego (do 5% odkształcenia) krzywej naprężenie-odkształcenie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Model implantacji aorty brzusznej u szczura
UWAGA: Wszystkie materiały i narzędzia używane w chirurgii są sterylne. Podczas zabiegu należy upewnić się, że operator nosi maskę z gazy i sterylne rękawiczki, aby uniknąć infekcji. Upewnij się, że temperatura w pomieszczeniu jest utrzymywana na poziomie 27 - 30 °C, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia. Postępuj zgodnie z lokalnymi wytycznymi IACUC dotyczącymi analgezji. 
<ol>
	<li>Jako biorców przeszczepu naczyniowego należy użyć samców szczurów Sprague Dawley o wadze 240 - 270 g. Upewnij się, że szczur był na czczo 24 godziny przed operacją. Celem poszczenia szczurów przez 24 godziny jest wystarczające opróżnienie kału w przewodzie pokarmowym, a tym samym poszerzenie horyzontu operatora.</li>
	<li>Chwyć za tylną szyję szczura i trzymaj głowę w dół, włóż igłę sprężynową do jamy brzusznej dolnej części brzucha. Skłonić szczura do znieczulenia hydratem chloralu (330 mg/kg) za pomocą wstrzyknięcia dootrzewnowego.</li>
	<li>Potwierdź odpowiednie znieczulenie, upewniając się, że szczur ma rozluźnione mięśnie i stabilny oddech. Umieść szczura pod mikroskopem operacyjnym w pozycji leżącej.</li>
	<li>Nałóż wazelinę okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Przed zabiegiem należy podać lek przeciwzakrzepowy (100 UI/kg) z heparynizowanym roztworem soli fizjologicznej (50 UI/ml) we wstrzyknięciu do żyły ogonowej.</li>
	<li>Zgol sierść w przedniej ścianie brzucha za pomocą żyletki i oczyść skórę roztworem jodu i roztworem alkoholu medycznego.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie laparotomii w linii środkowej nożyczkami chirurgicznymi i upewnij się, że nacięcie ma około 4 - 5 cm długości, a następnie odsłoń jamę brzuszną.</li>
	<li>Cofnij i owiń jelita gazą zwilżoną najlepiej roztworem soli fizjologicznej.</li>
	<li>Dokładnie wypreparuj aortę brzuszną.</li>
	<li>Zidentyfikuj i podwiąż wszystkie małe gałęzie za pomocą nylonowych szwów 9-0 z monofilamentu.</li>
	<li>Zacisnąć izolowany odcinek (do 1 cm długości) aorty za pomocą dwóch zacisków naczyniowych. Aorta może pozostać zaciśnięta przez 20-30 minut.</li>
	<li>Przeciąć aortę brzuszną między dwoma zaciskami za pomocą mikronożyczek, aby utworzyć miejsca zespolenia.</li>
	<li>Przepłukać oba końce aorty roztworem soli fizjologicznej w postaci heparynizacji (50 UI/ml) w celu usunięcia resztek krwi.</li>
	<li>Odklej przydankę za pomocą mikronożyczek.</li>
	<li>Zespolej przeszczep o średnicy wewnętrznej 2 mm i długości 1 cm z aortą brzuszną szczura za pomocą wzoru szwów ósemkowych za pomocą nylonowych szwów 9-0 z monofilamentu.</li>
	<li>Najpierw wykonaj cztery zespolenia zgodnie z kolejnością godzin 9, 3, 12 i 6 po stronie bliższej, a następnie zespol przycięte krawędzie w 4 szwach między dwoma szwami. Po wykonaniu szwu proksymalnego należy zszyć stronę dystalną tą samą metodą. 
	UWAGA: Każdy ścieg jest wymagany, aby upewnić się, że strona natywna jest lekko osadzona w przeszczepie.</li>
	<li>Zdejmij dystalny zacisk, aby krew mogła przepływać do przeszczepu, a następnie usuń proksymalny zacisk.</li>
	<li>Dociśnij końce szwu, aby zatrzymać krwawienie, za pomocą sterylnego wacika lub małej gąbki z gazy. Naciskaj przez około 3 minuty, aż do hemostazy.</li>
	<li>Wróć jelita do jamy brzusznej.</li>
	<li>Przepłukać jamę brzuszną ciepłym roztworem soli fizjologicznej z gentamycyną (320 j./ml).</li>
	<li>Zszyj ścianę brzucha za pomocą nylonowego szwu 3-0 odpowiednio w warstwie mięśniowej i skórnej.</li>
	<li>Umieść szczura w czystej i suchej klatce i umieść poduszkę grzewczą pod klatką, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia, a następnie poczekaj, aż szczur dojdzie do siebie po znieczuleniu. Opiekuj się zwierzęciem, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.</li>
	<li>Po odzyskaniu przytomności umieść szczura w pojedynczej klatce z jedzeniem i wodą. Nałóż jod na ranę, aby zapobiec infekcji po zabiegu. Zwróć szczura do towarzystwa innych zwierząt, aż w pełni wyzdrowieje.</li>
	<li>Eutanazja szczurów zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi w określonych z góry punktach czasowych.</li>
</ol>

<ol><li>Coombs, K. E., Leonard, A. T., Rush, M. N., Santistevan, D. A., Hedberg-Dirk, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+effect+of+material+stiffness+on+valvular+interstitial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Isolated effect of material stiffness on valvular interstitial cell differentiation.</a> J Biomed Mater Res A. 105 (1), 51-61 (2017).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sandwich+tubular+scaffold+derived+from+chitosan+for+blood+vessel+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">A sandwich tubular scaffold derived from chitosan for blood vessel tissue engineering.</a> J Biomed Mater Res A. 77 (2), 277-284 (2006).</li>
<li>Thottappillil, N., Nair, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolds+in+vascular+regeneration%3A+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Vasc+Health+Risk+Manag%22%5BJournal%5D)">Scaffolds in vascular regeneration: current status.</a> Vasc Health Risk Manag. 11, 79-91 (2015).</li>
<li>Pektok, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19029464">Degradation and healing characteristics of small-diameter poly (e-caprolactone) vascular grafts in the rat systemic arterial circulation.</a> Circulation. 118 (24), 2563-2570 (2008).</li>
<li>Innocente, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel-eluting+biodegradable+synthetic+vascular+prostheses%3A+a+step+towards+reduction+of+neointima+formation%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel-eluting biodegradable synthetic vascular prostheses: a step towards reduction of neointima formation?</a> Circulation. 120 (11 Suppl), S37-S45 (2009).</li>
<li>de Valence, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+bilayered+vascular+grafts+for+surgical+applicability+and+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Advantages of bilayered vascular grafts for surgical applicability and tissue regeneration.</a> Acta Biomater. 8 (11), 3914-3920 (2012).</li>
<li>Assmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+autologous+in+vivo+recellularization+of+decellularized+aortic+conduits+by+fibronectin+surface+coating%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Acceleration of autologous in vivo recellularization of decellularized aortic conduits by fibronectin surface coating.</a> Biomaterials. 34 (25), 6015-6026 (2013).</li>
<li>Hasan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+scaffolds+for+tissue+engineering+of+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts.</a> Acta Biomater. 10 (1), 11-25 (2014).</li>
<li>Baker, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+to+improve+cell+infiltration+in+composite+fiber-aligned+electrospun+scaffolds+by+the+selective+removal+of+sacrificial+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers.</a> Biomaterials. 29 (15), 2348-2358 (2008).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+macropores+in+electrospun+silk+fibroin+scaffolds+using+sacrificial+PEO-microparticles+to+enhance+cellular+infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Creation of macropores in electrospun silk fibroin scaffolds using sacrificial PEO-microparticles to enhance cellular infiltration.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (12), 3474-3481 (2013).</li>
<li>Lee, B. L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+ablation+enhances+cell+infiltration+into+three-dimensional+electrospun+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser ablation enhances cell infiltration into three-dimensional electrospun scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 8 (7), 2648-2658 (2012).</li>
<li>Rnjak-Kovacina, J., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+pore+size+of+electrospun+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Increasing the pore size of electrospun scaffolds.</a> Tissue Eng Part B Rev. 17 (5), 365-372 (2011).</li>
<li>Zhong, S., Zhang, Y., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+large+pores+in+electrospun+nanofibrous+scaffolds+for+cellular+infiltration%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Fabrication of large pores in electrospun nanofibrous scaffolds for cellular infiltration: a review.</a> Tissue Eng Part B Rev. 18 (2), 77-87 (2012).</li>
<li>Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+poly%28epsilon-caprolactone%29+microfiber+and+multilayer+nanofiber%2Fmicrofiber+scaffolds%3A+characterization+of+scaffolds+and+measurement+of+cellular+infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration.</a> Biomacromolecules. 7 (10), 2796-2805 (2006).</li>
<li>Rnjak-Kovacina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+the+porosity+and+pore+size+of+electrospun+synthetic+human+elastin+scaffolds+for+dermal+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tailoring the porosity and pore size of electrospun synthetic human elastin scaffolds for dermal tissue engineering.</a> Biomaterials. 32 (28), 6729-6736 (2011).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+thick+fibers+and+large+pores+of+electrospun+poly%28epsilon-caprolactone%29+vascular+grafts+on+macrophage+polarization+and+arterial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of thick fibers and large pores of electrospun poly(epsilon-caprolactone) vascular grafts on macrophage polarization and arterial regeneration.</a> Biomaterials. 35 (22), 5700-5710 (2014).</li>
<li>Hutcheson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genesis+and+growth+of+extracellular-vesicle-derived+microcalcification+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques.</a> Nat Mater. 15 (3), 335-343 (2016).</li>
<li>Tara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well-organized+neointima+of+large-pore+poly%28L-lactic+acid%29+vascular+graft+coated+with+poly%28L-lactic-co-epsilon-caprolactone%29+prevents+calcific+deposition+compared+to+small-pore+electrospun+poly%28L-lactic+acid%29+graft+in+a+mouse+aortic+implantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Well-organized neointima of large-pore poly(L-lactic acid) vascular graft coated with poly(L-lactic-co-epsilon-caprolactone) prevents calcific deposition compared to small-pore electrospun poly(L-lactic acid) graft in a mouse aortic implantation model.</a> Atherosclerosis. 237 (2), 684-691 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów finansowych.

Naciek komórkowy ma kluczowe znaczenie dla regeneracji i przebudowy przeszczepu naczyniowego in vivo16. Ograniczona infiltracja komórek jest często związana ze stosunkowo małymi porami przeszczepu, które utrudniają migrację komórek do ściany przeszczepu. Aby rozwiązać tę trudność, opracowaliśmy zmodyfikowaną metodę przygotowania elektroprzędzonych przeszczepów naczyniowych PCL o strukturze dużych porów. W szczegółach wielkość porów zwiększała się wraz ze wzrostem grubości włókien, którą m...

Przeszczepy naczyniowe wykonane z syntetycznych polimerów są szeroko stosowane w klinikach do terapii chorób sercowo-naczyniowych (CVD). Niestety, w przypadku przeszczepów naczyniowych o małej średnicy (D <6 mm) nie ma dostępnych skutecznych produktów ze względu na niską drożność wywołaną zmniejszoną prędkością przepływu krwi, co często prowadzi do zakrzepicy, przerostu błony wewnętrznej i innych powikłań1.
Inżynieria tkankowa dostarcza alternatywnej strategii realizacji długoterminowej drożności i homeostazy opartej na regeneracji i rekonstrukcji naczyń sterowanych przez rusztowanie. Mówiąc szczegółowo, przeszczep naczyniowy, jako trójwymiarowy szablon, może zapewniać mechaniczne wsparcie i wskazówki strukturalne podczas regeneracji tkanki naczyniowej oraz wpływać na funkcje komórkowe, w tym adhezję komórek, migrację, proliferację i wydzielanie macierzy zewnątrzkomórkowej2. Do tej pory różne polimery syntetyczne były oceniane pod kątem zastosowań w inżynierii tkanki naczyniowej. Wśród tych polimerów, poli(ε-kaprolakton) (PCL) był intensywnie badany ze względu na dobrą kompatybilność komórkową i powolną degradację trwającą od kilku miesięcy do dwóch lat3. W modelu aorty szczurzej4,5,6, przeszczepy naczyniowe PCL przetwarzane metodą elektroprzędzenia wykazywały doskonałą integralność strukturalną i drożność, a także stale zwiększoną inwazję komórek i neowaskularyzację w ścianie przeszczepu przez okres do 6 miesięcy. Jednak niekorzystną przebudowę tkanek, w tym regresję komórek i naczyń włosowatych oraz zwapnienie, obserwowano również w dłuższych punktach czasowych, do 18 miesięcy.
Celularyzacja przeszczepu naczyniowego jest kluczowym czynnikiem determinującym regenerację i remolding tkanek7. Elektroprzędzenie, jako wszechstronna technika, jest szeroko stosowane do przygotowania przeszczepów naczyniowych o strukturze nanowłóknistej8. Niestety, stosunkowo mała struktura porów często prowadzi do niewystarczającej infiltracji komórek w elektroprzędzonym przeszczepie naczyniowym, co ogranicza późniejszą regenerację tkanek. Aby rozwiązać ten problem, próbowano różnych technik zwiększania wielkości porów i ogólnej porowatości, w tym ługowania solą/polimerem9,10, modyfikacja aparatury kolektora, obróbka końcowa promieniowaniem laserowym11, itp. W rzeczywistości struktura przeszczepów elektroprzędzonych (w tym średnica włókna, wielkość porów i porowatość) jest ściśle związana z warunkami przetwarzania12,13. Podczas elektroprzędzenia średnicę włókna można łatwo kontrolować, zmieniając parametry, takie jak stężenie roztworu polimeru, natężenie przepływu, napięcie itp. 14,15, w związku z czym rozmiar porów i porowatość zostały odpowiednio zwiększone.
Niedawno opisaliśmy zmodyfikowany elektroprzędzony przeszczep PCL o strukturze makroporowatej (włókna o średnicy 5 - 7 μm i porach 30 - 40 μm). Implantacja in vivo poprzez wymianę aorty brzusznej szczura wykazała wysoki wskaźnik drożności, a także dobrą endotelializację i regenerację mięśni gładkich po 3 miesiącach od operacji16. Co ważniejsze, nawet po roku od implantacji nie można było zaobserwować niekorzystnej przebudowy tkanki, w tym zwapnienia i regresji komórek.

<table><tbody><tr><td>Granulki poli(&epsilon;-kaprolaktonu) (PCL) (Mn=80 000)</td><td>Sigma</td><td>704067</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Tianjin Chemical Reagent Company</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol</td><td>Tianjin Chemical Reagent Company</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Tianjin Chemical Reagent Company</td><td>A1007</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Tianjin Fengchuan Firma</td><td>2296</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>Szczury Sprague Dawley</td><td>Laboratorium Centrum Zwierząt Akademii Wojskowych Nauk</td><td></td><td></td>Medycznych</tr><tr><td>Sól fizjologiczna</td> normalna <td>Hebei Tiancheng Firma</td><td></td><td></td>farmaceutyczna</tr><tr><td>Hydrat chloralu</td><td>Firma chemiczna Tianjin Ruijinte</td><td>2223</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sodu do wstrzykiwań</td><td>Tianjin Biochem Firma</td><td></td><td></td>farmaceutyczna</tr><tr><td>Siarczan gentamycyny do wstrzykiwań</td><td>Jiangsu Lianshui Firma</td><td></td><td></td>farmaceutyczna</tr><tr><td>Mysie przeciwciało pierwszorzędowe anty-&alfa;-SMA</td><td>Abcam</td><td>ab7817</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało pierwotne przeciw gładkiemu MYH</td><td>Abcam</td><td>ab683</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonalne przeciwciało przeciw elastynie szczurów</td><td>królika Abcam</td><td>ab23748</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko czynnikowi von Willebranda</td><td>Abcam</td><td>ab6994</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG (Alexa Fluor 488)</td> <td>Invitrogen</td><td>ab150117</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG (Alexa Fluor 488)</td> <td>Invitrogen</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>5% normalna surowica kozia</td><td>Zhongshan Golden bridge</td><td>ZLI9022</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina i eozyna (H& E)</td> <td>Beijing leagene biotech</td><td>DH0006</td><td></td></tr><tr><td>Trichrom</td><td>Massona Beijing leagene biotech</td><td>DC0032</td><td></td></tr><tr><td>Verhoeff-van Gieson (VVG)</td> <td>Beijing leagene biotech</td><td>DC0059</td><td></td></tr><tr><td>Von Kossa</td><td>Beijing leagene biotech</td><td>DS0003</td><td></td></tr><tr><td>Igły do szwów chirurgicznych z gwintem, jedwab 3-0</td><td>firma zajmująca się zaopatrzeniem medycznym Shanghai Jinhuan</td><td>G3002b</td><td></td></tr><tr><td>Igły do szwów chirurgicznych z nitką, jedwab 9-0</td><td>Shanghai Jinhuan firma medyczna</td><td>H901</td><td></td></tr></tbody></table>

implantacja elektroprzędzonych przeszczepów naczyniowych o zoptymalizowanej strukturze w modelu szczurzym

Implantation of Electrospun Vascular Grafts with Optimized Structure in a Rat Model

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania makroporowatego przeszczepu naczyniowego PCL i opisujemy protokół oceny za pomocą szczurzego modelu wymiany aorty brzusznej. Elektroprzędzone przeszczepy naczyniowe często mają stosunkowo małe pory, które ograniczają infiltrację komórek do przeszczepów i utrudniają regenerację i przebudowę tętnic nowo-czerwonych. W tym badaniu przeszczepy naczyniowe PCL z grubszymi włóknami (5 - 6 μm) i większymi porami (~30 μm) zostały wytworzone przy użyciu zmodyfikowanej techniki przetwarzania. Długoterminową wydajność przeszczepu oceniano poprzez implantację w modelu aorty brzusznej szczura. Analiza ultrasonograficzna wykazała, że przeszczepy pozostały nienaruszone, bez tętniaka czy zwężenia, które wystąpiły nawet po 12 miesiącach od implantacji. Makroporowata struktura poprawiła wrastanie komórek, a tym samym sprzyjała regeneracji tkanek po 3 miesiącach. Co ważniejsze, nie było oznak niekorzystnej przebudowy, takiej jak zwapnienie w obrębie ściany przeszczepu po 12 miesiącach. W związku z tym elektroprzędzone przeszczepy naczyniowe PCL ze zmodyfikowanym przetwarzaniem makroporowatym mają potencjał, aby stać się substytutem tętnicy dla długotrwałej implantacji.

Przeszczepy PCL usunięto z organizmu w 3. i 12. miesiącu po operacji, a następnie poddano analizie za pomocą standardowych technik histologicznych, stosując barwienie hematoksyliną i eozyną (H&amp;E), trichromem Massona, metodą Verhoeffa-van Giesona (VVG), metodą Von Kossy oraz immunofluorescencję dla α-SMA, MYH, vWF i elastyny. Zdjęcia histologiczne wykonano za pomocą mikroskopu pionowego, a zdjęcia immunofluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
<p class="jove_content"...

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę elektroprzędzenia do wytwarzania przeszczepów naczyniowych PCL z grubymi włóknami i dużymi porami, oraz opisujemy protokół oceny wydajności in vivo w szczurzym modelu wymiany aorty brzusznej.

Implantacja elektroprzędzonych przeszczepów naczyniowych o zoptymalizowanej strukturze w modelu szczurzym

Here, we present a protocol to fabricate macroporous PCL vascular graft and describe an evaluation protocol by using a rat model of abdominal aorta ...

Ogólnym celem tej interwencji chirurgicznej jest przeszczepienie elektroprzędzonego przeszczepu naczyniowego do aorty brzusznej szczura i ocena długoterminowej wydajności przeszczepu. Metoda ta została opracowana przez profesora Deling Konga i innych kolegów z naszej grupy i może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach elektroprzędzonych przeszczepów naczyniowych, takie jak wpływ struktury i właściwości powierzchni przeszczepu na regenerację naczyń. Główną zaletą tej techniki jest dobra powtarzalność i wysoka przeżywalność zwierząt.Poza tym model zwierzęcy jest łatwy w zarządzaniu przy niskich kosztach. Prace te będą prowadzone przez naszego kolegę, doktora Wanga. Na początek przygotuj roztwór polimeru, rozpuszczając polikaprolakton w mieszaninie 1 do 5 metanolu i chloroformu i mieszając w temperaturze pokojowej przez 12 godzin.Załaduj roztwór polimeru do szklanej strzykawki o pojemności 10 mililitrów i wyposaż ją w igłę o rozmiarze 21. Następnie umieść trzpień ze stali nierdzewnej na przyrządzie do zbierania i upewnij się, że jest on prawidłowo uziemiony. Dostosuj odległość roboczą od końcówki igły do kolektora do 17 centymetrów dla 25% roztworu polikaprolaktonu.Następnie ustaw natężenie przepływu na pompie strzykawkowej na osiem mililitrów na godzinę. Następnie ustaw napięcie na zasilaczu na 11 kilowoltów i rozpocznij wirowanie trzpienia z prędkością 40 obr./min w celu zebrania elektroprzędzonych włókien w celu odpowiedniego rozprowadzenia włókien. Gdy wszystko jest już skonfigurowane, włącz zasilanie i pompę strzykawkową, aby rozpocząć zbieranie elektroprzędzonych włókien.Po 4,5 minuty wyłącz pompę strzykawkową, zasilanie i silnik trzpienia. Pozostaw przeszczep do wyschnięcia w kapturze na godzinę. Następnie usuń przeszczep z trzpienia za pomocą alkoholu bezwodnego i umieść go w próżni na noc, aby usunąć resztki rozpuszczalnika.Wysterylizuj przeszczep tlenkiem etylenu i pozostaw do wyschnięcia w sterylnym biologicznym kapturze zabezpieczającym. Korzystając ze standardowych technik, uzyskaj obrazy SEM światła przeszczepów i zaimportuj je do ImageJ. Użyj narzędzi pomiarowych, aby zmierzyć zarówno średnicę włókna, jak i średnią wielkość porów na każdym obrazie, aby zapewnić spójność między próbkami.Aby uzyskać informacje na temat właściwości mechanicznych materiału do szczepienia, najpierw pokrój rusztowanie rurowe na trzymilimetrowe odcinki za pomocą żyletki. Następnie użyj suwmiarki, aby zmierzyć grubość rusztowań. Następnie załaduj rusztowania do uchwytów maszyny do prób rozciągania, tak aby między uchwytami był jeden milimetr.Trzymaj rusztowania osiowo, z prędkością 10 milimetrów na minutę, aż pękną. Należy pamiętać o zapisaniu zarówno wytrzymałości na rozciąganie, jak i wydłużenia końcowego przy zerwaniu dla próbek. Przed zabiegiem szybkie samce szczurów Sprague Dawley, o wadze od 240 do 270 gramów, przez 24 godziny przed zabiegiem implantacji.Znieczulij szczura i przygotuj go do operacji zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Potwierdź odpowiednie znieczulenie, upewniając się, że szczur ma rozluźnione mięśnie i stabilny oddech. Następnie umieść szczura pod mikroskopem operacyjnym w pozycji leżącej.Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie laparotomii w linii środkowej o długości od czterech do pięciu centymetrów i odsłoń jamę brzuszną. Ostrożnie wycofaj i owiń jelita gazą zwilżoną roztworem soli fizjologicznej. Patrząc przez mikroskop operacyjny, oderwij aortę brzuszną od sąsiednich tkanek.Zidentyfikuj i podwiąż wszystkie małe gałęzie aorty zstępującej za pomocą nylonowych szwów 9-0 z monofilamentu. Następnie użyj zacisków naczyniowych, aby zacisnąć do jednego centymetra izolowanego odcinka aorty. Następnie użyj mikronożyczek, aby przeciąć aortę brzuszną między zaciskami.Przepłukać dwa końce aorty za pomocą heparynizowanego roztworu soli fizjologicznej, aby usunąć resztki krwi. Odklej przydankę zaciśniętej aorty za pomocą mikronożyczek. Następnie umieść jednocentymetrowy fragment wysterylizowanego przeszczepu w szczelinie utworzonej przez usunięty fragment aorty.Używając nici nylonowych z monofilamentu 9-0, skonstruuj cztery zespolenia, używając wzoru szwów ósemkowych na godzinie dziewiątej, trzeciej, dwunastej, a następnie szóstej po stronie bliższej. Następnie skonstruuj pozostałe cztery zespolenia między każdym ze szwów po stronie bliższej. Umieść przeszczep pionowo, aby pokazać równy odstęp między ośmioma szwami pod mikroskopem operacyjnym.Po wykonaniu szwu proksymalnego powtórz proces po stronie dystalnej. Po założeniu przeszczepu zdejmij dystalny zacisk, aby umożliwić przepływ krwi do przeszczepu, a następnie zdejmij zacisk proksymalny. Za pomocą sterylnego wacika uciskaj, aby zatrzymać obserwowane krwawienie w miejscach szwów.Naciskaj przez około trzy minuty, aż wystąpi hemostaza. Następnie należy wprowadzić jelita z powrotem do jamy brzusznej i przepłukać jamę brzuszną ciepłym roztworem soli fizjologicznej zawierającym gentamycynę. Następnie zszyj ścianę brzucha za pomocą nylonowego szwu 3-0 w warstwach mięśni i skóry.Użyj jodu na nacięciu po operacji tylko raz. Zwróć szczura do towarzystwa innych, gdy w pełni wyzdrowieje. Stężenie polikaprolaktonu w roztworze do elektroprzędzenia może wpływać zarówno na średnicę włókien, jak i na właściwości mechaniczne przeszczepów.Roztwór o wyższym stężeniu 25% wytwarza przeszczepy naczyniowe z grubszymi włóknami i większymi porami niż roztwór 10%. Po trzech miesiącach in vivo barwienie histologiczne ujawniło warstwę nowej tkanki utworzoną na świetle przeszczepu i znaczną ilość odkładającego się kolagenu w samym przeszczepie. Ta nowa warstwa tkanki jest wyłożona komórkami śródbłonka, poniżej których znajduje się warstwa zarówno komórek mięśni gładkich, jak i obwodowo wyrównanej elastyny.Po 12 miesiącach in vivo nowa tkanka wydawała się dobrze zintegrowana, a warstwy śródbłonka i mięśni gładkich pozostały nienaruszone. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednej do dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można wykonać inne pomiary, takie jak ultrasonografia z kolorowym dopplerem, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać elektroprzędzone przeszczepy naczyniowe i oceniać ich działanie in vivo w modelu wymiany tętnicy brzusznej u szczurów.

implantation-electrospun-vascular-grafts-with-optimized-structure-rat

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy opisujemy procedurę chirurgii serca mającą na celu implantację inżynierowanej tkanki w bruzdę przedsionkowo-komorową (AV) dorosłego szczura szczepu Lewis.

Implantacja inżynieryjnej tkanki w sercu szczura

Aby poszerzyć naszą wiedzę na temat komórkowego i molekularnego tworzenia się nowotworów, niedawno opracowano mysi model TEVG. Przeszczepy wszczepiono jako przeszczepy z interpozycją żyły głównej podnerkowej u myszy C57BL/6. Model ten osiąga wyniki podobne do tych osiągniętych w naszym badaniu klinicznym, ale w znacznie krótszym czasie.

Implantacja przeszczepu interpozycji żyły głównej dolnej w modelu mysim

Tutaj prezentujemy protokół do generowania przeszczepów naczyń krwionośnych z inżynierii tkankowej, które są funkcjonalne do szczepienia myszom poprzez podwójne wysiewanie częściowo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (PiPSC) - pochodzących komórek mięśni gładkich i PiPSC - pochodzących komórek śródbłonka na bezkomórkowym bioreaktorze rusztowania naczyń krwionośnych.

Wytwarzanie i przeszczepianie naczyń krwionośnych metodą inżynierii tkankowej w modelu mysim

Modele zwierzęce są ważnymi narzędziami do oceny przeszczepów wytwarzanych metodą inżynierii tkankowej. W pracy przedstawiono protokół przygotowania elektroprzędzonego biodegradowalnego przeszczepu polimerowego do zastosowania w inżynierii tkankowej więzadła krzyżowego przedniego, a także protokół chirurgiczny implantacji w modelu szczurzym.

Atymiczny model szczura do oceny zmodyfikowanych przeszczepów więzadła krzyżowego przedniego

Opisujemy mikrochirurgiczne podejście do generowania pętli tętniczo-żylnej (AV) jako model do analizy unaczynienia in vivo w izolowanym i dobrze scharakteryzowanym środowisku. Model ten jest nie tylko przydatny do badania angiogenezy, ale jest również optymalnie przystosowany do inżynierii osiowo unaczynionych i przeszczepialnych tkanek.

Pętla tętniczo-żylna (AV) w małym modelu zwierzęcym do badania angiogenezy i inżynierii tkanek unaczynionych

Ten film demonstruje model do badania rozwoju przerostu mięśniowo-wewnętrznego, po operacji wstawiania żył u szczurów.

Model wstawiania żył: odpowiedni model do badania drożności przeszczepu bypassów

Rekonstrukcja przełyku jest wymagającą procedurą, a opracowanie inżynierii tkankowej przełyku, która umożliwia regenerację błony śluzowej i mięśni przełyku i która może być wszczepiona jako sztuczny przeszczep, jest konieczna. Tutaj przedstawiamy nasz protokół generowania sztucznego przełyku, w tym produkcję rusztowań, hodowlę bioreaktorów i różne techniki chirurgiczne.

Przeszczep inżynierii tkankowej do obwodowej rekonstrukcji przełyku u szczurów

Obecny protokół ma na celu eksperymentalne stworzenie przerostu żył wewnętrznych poprzez poddanie żył działaniu ciśnienia krwi tętniczej w celu opracowania strategii osłabienia przerostu żył wewnętrznych po operacji rewaskularyzacji za pomocą przeszczepów żyłowych.

Model wstawiania żył królika naśladujący operację rewaskularyzacji przy użyciu przeszczepów żył do oceny przerostu błony wewnętrznej pod ciśnieniem tętniczym krwi

Ta praca przedstawia zwierzęcy model zwłóknienia wywołanego przejściem śródbłonka do mezenchymalnego, obserwowanego w wrodzonych wadach serca, takich jak krytyczne zwężenie zastawki aortalnej lub zespół niedorozwoju lewego serca, co pozwala na szczegółową ocenę tkanki histologicznej, identyfikację regulacyjnych szlaków sygnałowych i testowanie opcji leczenia.

Noworodkowy heterotopowy model przeszczepu serca szczura do badania przejścia ze śródbłonka do mezenchymów

Tutaj przedstawiono protokół implantacji przeszczepu naczyniowego z wykorzystaniem inżynierii tkankowej do tętnicy szyjnej myszy za pomocą techniki mankietowej, dostarczając odpowiedniego modelu zwierzęcego do badania mechanizmów regeneracji tkanki naczyniowej.

Implantacja przeszczepu naczyniowego z wykorzystaniem inżynierii tkankowej w tętnicy szyjnej myszy za pomocą techniki mankietowej

W pracy przedstawiono model świni do oceny przeszczepów o małej średnicy w tętnicach udowych. Model naśladuje dynamikę naczyń krwionośnych człowieka i kompleksowo ocenia drożność przeszczepów, hemodynamikę i przebudowę naczyń. Stanowi cenną platformę do badania przeszczepów naczyniowych i monitorowania ich za pomocą ultrasonografii dopplerowskiej i angiografii.

Implantacja przeszczepu naczyniowego kości udowej w modelu trzody chlewnej w celu przetestowania przeszczepów naczyniowych o małej średnicy

Poznaj metodę elektroprzędzenia do wytwarzania przeszczepów naczyniowych z PCL o zoptymalizowanej strukturze. Oceń ich wydajność in vivo w modelu szczura, badając regenerację naczyń krwionośnych.

Implantacja elektroprzędzonych przeszczepów naczyniowych o zoptymalizowanej strukturze w modelu szczurzym

Przeglądaj więcej filmów