Implantacja elektroprzędzonych przeszczepów naczyniowych o zoptymalizowanej strukturze w modelu szczurzym
27 czerwca 2018
Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę elektroprzędzenia do wytwarzania przeszczepów naczyniowych PCL z grubymi włóknami i dużymi porami, oraz opisujemy protokół oceny wydajności in vivo w szczurzym modelu wymiany aorty brzusznej.
Ogólnym celem tej interwencji chirurgicznej jest przeszczepienie elektroprzędzonego przeszczepu naczyniowego do aorty brzusznej szczura i ocena długoterminowej wydajności przeszczepu. Metoda ta została opracowana przez profesora Deling Konga i innych kolegów z naszej grupy i może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach elektroprzędzonych przeszczepów naczyniowych, takie jak wpływ struktury i właściwości powierzchni przeszczepu na regenerację naczyń. Główną zaletą tej techniki jest dobra powtarzalność i wysoka przeżywalność zwierząt.
Poza tym model zwierzęcy jest łatwy w zarządzaniu przy niskich kosztach. Prace te będą prowadzone przez naszego kolegę, doktora Wanga. Na początek przygotuj roztwór polimeru, rozpuszczając polikaprolakton w mieszaninie 1 do 5 metanolu i chloroformu i mieszając w temperaturze pokojowej przez 12 godzin.
Załaduj roztwór polimeru do szklanej strzykawki o pojemności 10 mililitrów i wyposaż ją w igłę o rozmiarze 21. Następnie umieść trzpień ze stali nierdzewnej na przyrządzie do zbierania i upewnij się, że jest on prawidłowo uziemiony. Dostosuj odległość roboczą od końcówki igły do kolektora do 17 centymetrów dla 25% roztworu polikaprolaktonu.
Następnie ustaw natężenie przepływu na pompie strzykawkowej na osiem mililitrów na godzinę. Następnie ustaw napięcie na zasilaczu na 11 kilowoltów i rozpocznij wirowanie trzpienia z prędkością 40 obr./min w celu zebrania elektroprzędzonych włókien w celu odpowiedniego rozprowadzenia włókien. Gdy wszystko jest już skonfigurowane, włącz zasilanie i pompę strzykawkową, aby rozpocząć zbieranie elektroprzędzonych włókien.
Po 4,5 minuty wyłącz pompę strzykawkową, zasilanie i silnik trzpienia. Pozostaw przeszczep do wyschnięcia w kapturze na godzinę. Następnie usuń przeszczep z trzpienia za pomocą alkoholu bezwodnego i umieść go w próżni na noc, aby usunąć resztki rozpuszczalnika.
Wysterylizuj przeszczep tlenkiem etylenu i pozostaw do wyschnięcia w sterylnym biologicznym kapturze zabezpieczającym. Korzystając ze standardowych technik, uzyskaj obrazy SEM światła przeszczepów i zaimportuj je do ImageJ. Użyj narzędzi pomiarowych, aby zmierzyć zarówno średnicę włókna, jak i średnią wielkość porów na każdym obrazie, aby zapewnić spójność między próbkami.
Aby uzyskać informacje na temat właściwości mechanicznych materiału do szczepienia, najpierw pokrój rusztowanie rurowe na trzymilimetrowe odcinki za pomocą żyletki. Następnie użyj suwmiarki, aby zmierzyć grubość rusztowań. Następnie załaduj rusztowania do uchwytów maszyny do prób rozciągania, tak aby między uchwytami był jeden milimetr.
Trzymaj rusztowania osiowo, z prędkością 10 milimetrów na minutę, aż pękną. Należy pamiętać o zapisaniu zarówno wytrzymałości na rozciąganie, jak i wydłużenia końcowego przy zerwaniu dla próbek. Przed zabiegiem szybkie samce szczurów Sprague Dawley, o wadze od 240 do 270 gramów, przez 24 godziny przed zabiegiem implantacji.
Znieczulij szczura i przygotuj go do operacji zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Potwierdź odpowiednie znieczulenie, upewniając się, że szczur ma rozluźnione mięśnie i stabilny oddech. Następnie umieść szczura pod mikroskopem operacyjnym w pozycji leżącej.
Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie laparotomii w linii środkowej o długości od czterech do pięciu centymetrów i odsłoń jamę brzuszną. Ostrożnie wycofaj i owiń jelita gazą zwilżoną roztworem soli fizjologicznej. Patrząc przez mikroskop operacyjny, oderwij aortę brzuszną od sąsiednich tkanek.
Zidentyfikuj i podwiąż wszystkie małe gałęzie aorty zstępującej za pomocą nylonowych szwów 9-0 z monofilamentu. Następnie użyj zacisków naczyniowych, aby zacisnąć do jednego centymetra izolowanego odcinka aorty. Następnie użyj mikronożyczek, aby przeciąć aortę brzuszną między zaciskami.
Przepłukać dwa końce aorty za pomocą heparynizowanego roztworu soli fizjologicznej, aby usunąć resztki krwi. Odklej przydankę zaciśniętej aorty za pomocą mikronożyczek. Następnie umieść jednocentymetrowy fragment wysterylizowanego przeszczepu w szczelinie utworzonej przez usunięty fragment aorty.
Używając nici nylonowych z monofilamentu 9-0, skonstruuj cztery zespolenia, używając wzoru szwów ósemkowych na godzinie dziewiątej, trzeciej, dwunastej, a następnie szóstej po stronie bliższej. Następnie skonstruuj pozostałe cztery zespolenia między każdym ze szwów po stronie bliższej. Umieść przeszczep pionowo, aby pokazać równy odstęp między ośmioma szwami pod mikroskopem operacyjnym.
Po wykonaniu szwu proksymalnego powtórz proces po stronie dystalnej. Po założeniu przeszczepu zdejmij dystalny zacisk, aby umożliwić przepływ krwi do przeszczepu, a następnie zdejmij zacisk proksymalny. Za pomocą sterylnego wacika uciskaj, aby zatrzymać obserwowane krwawienie w miejscach szwów.
Naciskaj przez około trzy minuty, aż wystąpi hemostaza. Następnie należy wprowadzić jelita z powrotem do jamy brzusznej i przepłukać jamę brzuszną ciepłym roztworem soli fizjologicznej zawierającym gentamycynę. Następnie zszyj ścianę brzucha za pomocą nylonowego szwu 3-0 w warstwach mięśni i skóry.
Użyj jodu na nacięciu po operacji tylko raz. Zwróć szczura do towarzystwa innych, gdy w pełni wyzdrowieje. Stężenie polikaprolaktonu w roztworze do elektroprzędzenia może wpływać zarówno na średnicę włókien, jak i na właściwości mechaniczne przeszczepów.
Roztwór o wyższym stężeniu 25% wytwarza przeszczepy naczyniowe z grubszymi włóknami i większymi porami niż roztwór 10%. Po trzech miesiącach in vivo barwienie histologiczne ujawniło warstwę nowej tkanki utworzoną na świetle przeszczepu i znaczną ilość odkładającego się kolagenu w samym przeszczepie. Ta nowa warstwa tkanki jest wyłożona komórkami śródbłonka, poniżej których znajduje się warstwa zarówno komórek mięśni gładkich, jak i obwodowo wyrównanej elastyny.
Po 12 miesiącach in vivo nowa tkanka wydawała się dobrze zintegrowana, a warstwy śródbłonka i mięśni gładkich pozostały nienaruszone. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednej do dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można wykonać inne pomiary, takie jak ultrasonografia z kolorowym dopplerem, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać elektroprzędzone przeszczepy naczyniowe i oceniać ich działanie in vivo w modelu wymiany tętnicy brzusznej u szczurów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia zmodyfikowaną metodę elektroprzędzenia do wytwarzania graftów naczyniowych z polikaprolaktonu (PCL) o grubych włóknach i dużych porach. Protokół obejmuje również ocenę wydajności tych graftów in vivo w modelu szczurzym po zastąpieniu aorty brzusznej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria biomedyczna
- Inżynieria tkanki naczyniowej
- Techniki elektroprzędzenia
Wstęp
- Elektroprzędzone przeszczepy naczyniowe mają kluczowe znaczenie dla regeneracji naczyń.
- Celem badania jest zrozumienie wpływu struktury i właściwości powierzchniowych przeszczepu.
- Poprzednie metody charakteryzowały się brakiem spójności w działaniu przeszczepów.
- Model szczurzy jest kosztowo efektywny i odpowiedni do prowadzenia długoterminowych badań.
Cel badania
- Przeszczepienie elektroprzędzonego graftu naczyniowego do aorty brzusznej szczura.
- Ocena długoterminowej wydajności graftu.
- Ocena powtarzalności oraz wskaźników przeżywalności zastosowanej techniki chirurgicznej.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworu polimeru z wykorzystaniem polikaprolaktonu.
- Rozpuszczanie PCL w mieszaninie metanolu i chloroformu w stosunku 1:5.
- Mieszanie roztworu w temperaturze pokojowej przez 12 godzin.
- Przeszczepienie graftu do modelu szczurzego.
Główne wyniki
- Zmodyfikowana metoda elektroprzędzenia pozwoliła na otrzymanie przeszczepów o pożądanych właściwościach.
- W trakcie badania odnotowano wysoką przeżywalność zwierząt.
- Przeszczepy wykazały potencjał do skutecznej regeneracji naczyniowej.
- Wyniki wskazały na znaczenie charakterystyki strukturalnej i powierzchniowej.
Wnioski
- W ramach badania pomyślnie opracowano niezawodną metodę wytwarzania przeszczepów.
- Oceny in vivo wykazały obiecujące wyniki w zastosowaniach naczyniowych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu poprawy parametrów działania przeszczepów.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Elektroprzędzone grafty naczyniowe z optymalizowaną strukturą makroporowatą rozwiązują kluczowy problem w inżynierii tkanki naczyniowej: umożliwienie infiltracji komórek i regeneracji tkanki przy jednoczesnym zachowaniu długoterminowej drożności. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych, wykazując trwałą funkcjonalność graftu bez niepożądanej przebudowy w okresie 12 miesięcy. Metoda ta zapewnia powtarzalny i kosztowo efektywny model szczurzy do oceny substytutów tętnic, dostarczając danych niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac w procesach rozwoju graftów naczyniowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie zależności między strukturą a właściwościami biomateriałów, a konkretnie tego, jak średnica włókien i wielkość porów wpływają na regenerację naczyń krwionośnych.
- Wartość operacyjna: Oferuje standaryzowaną, powtarzalną technikę chirurgiczną z wysokim wskaźnikiem przeżywalności zwierząt, co zmniejsza zmienność w badaniach przedklinicznych.
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Pozwala na wytwarzanie przeszczepów o mierzalnych parametrach strukturalnych (grubość włókien ~5-6 μm, wielkość porów ~30 μm), które korelują z wynikami funkcjonalnymi, takimi jak przerastanie komórek i depozycja kolagenu.
- Wartość operacyjna: Ułatwia standaryzację wytwarzania i oceny przeszczepów, wspierając gotowość analityczną do porównawczego przesiewu biomateriałów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykazuje długoterminową drożność, integrację tkankową oraz brak zwapnień lub tworzenia tętniaków, co pozwala na mechanistyczne ograniczenie ryzyka dla potencjalnych kandydatów na protezy naczyniowe.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużną ocenę za pomocą ultradźwięków i histologii, wspierając decyzje o dalszym rozwoju projektów w fazie przedklinicznej w oparciu o analizę ryzyka.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, wspierając wczesną ewaluację biomateriałów poprzez długoterminowe badania implantacyjne w klinicznie istotnym modelu zastępowania tętnicy.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wpływu architektury przeszczepu na regenerację i przebudowę naczyń krwionośnych.
- Screening: Umożliwia standaryzowaną produkcję i ocenę graftów elektroprządlanych o regulowanych właściwościach strukturalnych w celu przeprowadzenia analizy porównawczej.
- Analityka: Dostarcza wyników ilościowych, w tym wytrzymałości na rozciąganie, średnicy włókien, wielkości porów, drożności w badaniu USG oraz integracji tkankowej w badaniu histologicznym.
- Badania translacyjne: Wykazuje ciągłość od momentu ostrego implantu do długoterminowej przebudowy tkanki, co jest zgodne z punktami końcowymi walidacji przedklinicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny różnych elektroprządlanych biomateriałów w zastosowaniach naczyniowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstw
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w zakresie wydajności przeszczepu dzięki wykazanej regeneracji tkanki i brakowi niekorzystnego przebudowania.
- Wartość operacyjna: Wysoka powtarzalność, niski koszt i łatwość prowadzenia modeli szczurzych wspierają skalowalne testy przedkliniczne.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań poprzez redukcję biologicznego ryzyka na późnych etapach dzięki długoterminowej walidacji funkcjonalnej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na przeszczepy naczyniowe z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o optymalizację strukturalną i trwałość in vivo.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie technik elektroprzędzenia, chirurgii naczyniowej oraz charakterystyki biomateriałów.
- Niezbędne jest zaplecze aparaturowe do elektroprzędzenia, badań wytrzymałości na rozciąganie, obrazowania SEM oraz monitorowania ultradźwiękowego.
- Wymagana jest standaryzacja procesów wytwarzania graftów, implantacji chirurgicznej oraz protokołów oceny pooperacyjnej.
- Konieczne jest uwzględnienie kwestii adaptacyjnych przy przejściu z modeli szczurzych na większe systemy przedkliniczne.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność przetwarzania w warunkach sterylnych, usuwania rozpuszczalników oraz sterylizacji tlenkiem etylenu w celu zapewnienia bezpieczeństwa graftu.
