Name: Izolacja naczyń włosowatych mózgu ze świeżej ludzkiej tkanki mózgowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Poznaj metodę izolacji naczyń włosowatych mózgu ze świeżej ludzkiej tkanki mózgowej do badań bariery krew-mózg. Technika umożliwia analizę fizjologicznie aktywnych naczyń i ścieżek sygnałowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy i wyrażamy uznanie dla dr Petera Nelsona i Sonyi Anderson z Banku Tkanek Mózgowych UK-ADC za dostarczenie wszystkich próbek ludzkiej tkanki mózgowej (numer grantu NIH: P30 AG028383 z National Institute on Aging). Dziękujemy Mattowi Hazzardowi i Tomowi Dolanowi, Information Technology Services, Academic Technology and Faculty Engagement, University of Kentucky za pomoc graficzną. Projekt ten był wspierany przez grant nr 1R01NS079507 z National Institute of Neurological Disorders and Stroke (dla B.B.) oraz przez grant nr 1R01AG039621 z National Institute on Aging (dla A.M.S.H.). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy Narodowego Instytutu Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu lub Narodowego Instytutu Starzenia się. Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Poniższe informacje są oparte na aktualnych standardach bezpieczeństwa i regulacji na Uniwersytecie Kentucky, Lexington, KY, USA. Jako środek ostrożności przed rozpoczęciem pracy z tkanką ludzką należy zapoznać się z programem bezpieczeństwa biologicznego instytucji oraz z najbardziej aktualnymi przepisami i zaleceniami.
UWAGA: Tkanka ludzka może być źródłem patogenów przenoszonych przez krew, w tym ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV), wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) i innych. Praca z tkanką ludzką stwarza ryzyko zakażenia patogenami przenoszonymi przez krew. Dlatego podczas pracy z tkankami ludzkimi konieczne są pewne względy regulacyjne i bezpieczeństwa w celu ochrony personelu laboratoryjnego. Praca z tkankami ludzkimi w USA wymaga laboratorium na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2, a także środków ostrożności i szkolenia zgodnie z sekcją NIH IV-B-7, ustawą OSHA z 1970 r., klauzulę 5(a)(1) oraz instytucjonalnym programem bezpieczeństwa biologicznego użytkownika. Ogólnie rzecz biorąc, zgoda Instytucjonalnego Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego i/lub Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej musi zostać uzyskana przed przeprowadzeniem jakichkolwiek badań z udziałem materiałów ludzkich (tkanki, płyny ustrojowe). Szkolenie jest wymagane od całego personelu pracującego z ludźmi i obejmuje podstawowe szkolenie w zakresie bezpieczeństwa laboratoryjnego, np. w zakresie higieny chemicznej i bezpieczeństwa laboratoryjnego, a także szkolenie specjalistyczne w zakresie bezpieczeństwa biologicznego, odpadów niebezpiecznych i patogenów przenoszonych przez krew u ludzi. Wszystkim pracownikom pracującym z ludźmi zaleca się szczepienie przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B przed rozpoczęciem pracy z ludźmi. Personel jest zobowiązany do noszenia specjalnych środków ochrony osobistej podczas pracy z materiałami ludzkimi, np. fartuch laboratoryjny z mankietami i osłoną twarzy, a także do noszenia rękawic przez cały czas. Wszystkie prace wykonywane są w komorze bezpieczeństwa biologicznego (klasa 2). Ze wszystkimi urządzeniami, które mają kontakt z materiałami ludzkimi i wszelkimi odpadami z materiałów ludzkich, należy obchodzić się w odpowiedni sposób, aby zapobiec skażeniu i/lub zakażeniu personelu. Wszystkie urządzenia i powierzchnie są czyszczone 10% wybielaczem i 75% etanolem po każdej procedurze z udziałem ludzi. Rozlany płyn z materiałami ludzkimi należy natychmiast uprzątnąć. Naczynia szklane są sterylizowane w autoklawie po każdym użyciu. Odpady, w tym nieutrwalone tkanki ludzkie, są zbierane w oznakowanym worku na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne i sterylizowane w autoklawie. Ostre narzędzia są zbierane w pojemniku odpornym na przebicie i przeciekanie oznaczonym jako niebezpieczne biologicznie. Wszystkie odpady z materiałów ludzkich są utylizowane zgodnie z przepisami instytucji dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.
UWAGA: Nasze laboratorium otrzymuje świeże próbki kory czołowej od zmarłych osób za pośrednictwem Sanders-Brown Center on Aging (IRB #B15-2602-M). Kryteria włączenia to: włączenie do badania kohortowego UK-ADC longitudinal autopsja oraz interwał pośmiertny (PMI) ≤4 h64. Autopsje przebiegają zgodnie ze standardowym protokołem, a wszystkie procedury są zgodne z wytycznymi NIH Biospecimen Best Practice Guidelines65. Krótki PMI wynoszący mniej niż 4 godziny ma ogromne znaczenie dla zapewnienia żywotności kapilarnej po izolacji. Można używać zarówno świeżej, jak i mrożonej tkanki. Jeśli konieczne jest zamrożenie, świeżo uzyskana ludzka tkanka mózgowa powinna zostać zamrożona szokowo w ciekłym azocie i przechowywana w temperaturze -80 °C. Świeża lub rozmrożona tkanka powinna być przechowywana w buforze izolacyjnym (patrz poniżej) i szybko przetworzona. Okazuje się, że 10 g świeżej tkanki ludzkiej daje około 100 mg naczyń włosowatych mózgu (mokra masa).
1. Konfiguracja
<ol>
	<li>Przygotowanie buforu 
	UWAGA: Potrzebna objętość buforu zależy od ilości tkanki. Wszystkie objętości w poniższym protokole są oparte na 10 g tkanki kory mózgowej człowieka.
	<ol>
		<li>L Bufor izolacyjny: Użyj 1,5 l soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco (DPBS; 2,7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136,9 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 0,9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2) i uzupełnij 5 mM D-glukozy (1,35 g) i 1 mM pirogronianu sodu (0,165 g). Po dodaniu glukozy i pirogronianu dostosuj do pH 7,4 za pomocą wodorotlenku sodu. Przed użyciem schłodzić i przechowywać bufor w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Albumina surowicy bydlęcej (BSA): Dodać 10 g proszku BSA do 1 l buforu izolacyjnego, aby uzyskać końcowe stężenie BSA wynoszące 1%. Mieszaj powoli, aby uniknąć pęcherzyków, dostosuj do pH 7,4 i przechowuj w temperaturze 4 °C przez noc. Bezpośrednio przed użyciem delikatnie wymieszaj; Unikaj tworzenia się pęcherzyków, aby uniknąć denaturacji albuminy.</li>
		<li>Pożywka o gradiencie gęstości: Odważyć 18 g pożywki o gradientu gęstości do szklanej butelki i dodać mieszadło magnetyczne. Dodać 60 ml buforu izolacyjnego i energicznie wstrząsać przez 5 minut, aż cały proszek zostanie zawieszony. Przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić rozpuszczenie podłoża o gradiencie gęstości. Mieszaj przez 10 minut bezpośrednio przed użyciem.</li>
		<li>Przechowywać wszystkie w temperaturze 4 °C; wszystkie narzędzia i przechowywać na lodzie podczas całej procedury izolacji. Wymieszaj wszystkie przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja eksperymentalna
	<ol>
		<li>Zamontuj tłuczek młynka do tkanek Potter-Elvehjem na elektronicznym mieszadle górnym. Umieść pod maską młynek do tkanek Potter-Elvehjem i homogenizator Dounce z tłuczkiem na lodzie pod maską. Przygotuj siatkę filtracyjną o grubości 300 μm (5 x 5 cm2), złóż ją w stożek, a następnie włóż i przymocuj do probówki Falcon o pojemności 50 ml za pomocą taśmy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Umieść pierścienie łączące i filtry odkształcające ogniwa (wielkość porów: 30 μm) na probówkach Falcon o pojemności 50 ml. Przygotuj worki na odpady niebezpieczne biologicznie. Umieść cały wymagany sprzęt w komorze bezpieczeństwa biologicznego (patrz tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki mózgu
UWAGA: Rysunek 1A pokazuje schemat przebiegu całej procedury izolacji opisanej poniżej. Ludzka tkanka mózgowa może pochodzić z dowolnej części kory mózgowej i może być używana świeża lub mrożona. Zamrożoną tkankę mózgową można rozmrozić w temperaturze pokojowej (bez buforu; ~30 min na 10 g). Aby osiągnąć porównywalne wyniki, tkanka mózgowa powinna być pobrana z tego samego obszaru mózgu dla każdego eksperymentu. Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem świeżej (PMI <4 h) ludzkiej kory mózgowej, która nie została zamrożona.
<ol>
	<li>Przygotowanie ludzkiej tkanki mózgowej: Udokumentuj wagę tkanki mózgowej. Wszystkie liczby w poniższym protokole są odpowiednie dla 10 g świeżej tkanki mózgowej człowieka. Umieść tkankę mózgową na szalce Petriego o średnicy 100 mm. Ostrożnie usuń wszystkie opony za pomocą kleszczy. Użyj skalpela, aby odciąć białą istotę.</li>
	<li>Mielenie ludzkiej tkanki mózgowej: Ostrożnie pokrój tkankę mózgową i zmiel ją skalpelem. Mielemy przez około 5 minut (kawałki 2–3 mm). Przenieś tkankę mózgową do młynka do tkanek Potter-Elvehjem. Dodać 30 ml buforu izolacyjnego. 
	UWAGA: Kawałki tkanki mielonej są trudne do zobaczenia, ponieważ tkanka mózgowa zamienia się w papkę w procesie mielenia.</li>
</ol>
3. Homogenizacja
<ol>
	<li>Młynek do tkanek Potter-Elvehjem (prześwit: 150–230 μm): Homogenizuj każdą próbkę za pomocą 100 pociągnięć przy prędkości homogenizatora 50 obr./min. Udokumentuj czas co 25 uderzeń i całkowity czas potrzebny na 100 ruchów. Patrz Tabela 1 dla proponowanego protokołu homogenizacji; Całkowity czas homogenizacji 10 g ludzkiej kory czołowej wynosi około 22 minut. Nie mieszaj powietrza, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków.</li>
	<li>Homogenizator Dounce (luz: 80–130 μm): Przenieść homogenat do homogenizatora Dounce na lodzie. Homogenizuj zawieszenie za pomocą 20 uderzeń (~6 s/suw, łącznie ~2 min). Unikaj bąbelków.</li>
</ol>
4. Wirowanie
<ol>
	<li>Rozprowadź równomiernie homogenat mózgu w czterech probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml i udokumentuj całkowitą objętość homogenatu. Rozprowadzić 50 ml buforu gradientu gęstości do probówek wirówkowych (12,5 ml na probówkę). Użyj 10 ml buforu izolacyjnego do przepłukania tłuczka i homogenizatora, a następnie rozprowadź w czterech probówkach wirówkowych (~2,5 ml na probówkę).</li>
	<li>Szczelnie zamknij probówki wirówkowe nakrętkami. Wymieszaj homogenat, pożywkę o gradiencie gęstości i buforuj, energicznie potrząsając probówkami. Wirować przy 5 800 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C (wirnik o stałym kącie nachylenia); Wybierz średnią prędkość zwalniania, aby pelety były przymocowane do rurki. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdą osadkę w 2 ml 1% BSA.</li>
</ol>
5. Filtracja
UWAGA: Aby oddzielić naczynia włosowate od czerwonych krwinek i innych resztek komórek, konieczne jest kilka etapów filtracji.
<ol>
	<li>Oczko 300 μm: Po ponownym zawieszeniu granulatu przefiltruj zawiesinę przez siatkę 300 μm. Kapilary są filtrowane przez siatkę, podczas gdy większe naczynia i większe szczątki mózgu pozostają na siatce. Ostrożnie umyj siatkę z objętością do 50 ml 1% BSA. Odrzuć siatkę. 
	UWAGA: Ten etap filtracji oczyszcza zawiesinę kapilarną z większych naczyń lub kawałków resztek mózgu.</li>
	<li>Filtr odkształceń komórkowych 30 μM 
	UWAGA: Ten etap filtracji oddziela naczynia włosowate od czerwonych krwinek i innych zanieczyszczeń mózgowych.
	<ol>
		<li>Rozprowadzić filtrat kapilarny z kroku 6.1 na pięciu filtrach odkształceń komórkowych 30 μm (około 10 ml filtratu kapilarnego na filtr odkształcenia komórkowego). Naczynia włosowate są zatrzymywane przez ten filtr, podczas gdy czerwone krwinki, inne pojedyncze komórki i małe szczątki mózgu przechodzą przez filtr i są zbierane w filtracie.</li>
		<li>Umyj każdy filtr 25 ml 1% BSA. Następnie wlej wszystkie filtraty na szósty filtr, aby zwiększyć wydajność. Umyj każdy filtr 50 ml 1% BSA; Utrzymuj filtry szczepu komórkowego z kapilarami i wyrzuć filtrat.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Kolekcja kapilarna
<ol>
	<li>Odwróć filtry do góry nogami i umyj naczynia włosowate 50 ml 1% BSA dla każdego filtra do probówek o pojemności 50 ml. Delikatnie uciskaj końcówką pipety o pojemności 5 ml i przesuwaj ją po filtrze, aby zmyć naczynia włosowate mózgu.</li>
	<li>Upewnij się, że zmyłeś wszystkie naczynia włosowate mózgu, zwłaszcza z krawędzi filtra. Unikaj pęcherzyków, ponieważ utrudnia to proces filtracji i zwiększa ryzyko utraty naczyń włosowatych.</li>
</ol>
7. Mycie
<ol>
	<li>Po zebraniu kapilar odwirować wszystkie próbki o masie 1 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C (wahliwy wirnik kubełkowy). Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w około 3 ml buforu izolacyjnego. Połącz wszystkie zawieszone granulki z jednej próbki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i napełnij ją buforem izolacyjnym. Ponownie odwirować przy 1.500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i umyć jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Udokumentuj czystość naczyń włosowatych za pomocą mikroskopu (100-krotne powiększenie) i kamery (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). 
	UWAGA: Wydajność naczyń włosowatych mózgu z 10 g ludzkiej tkanki mózgowej wynosi zwykle około 100 mg. Izolowane naczynia włosowate mózgu mogą być teraz wykorzystywane do eksperymentów, przetwarzane (np. lizat, izolacja błony) lub zamrażane błyskawicznie i przechowywane w temperaturze -80 °C w krioprobówkach przez co najmniej 6-12 miesięcy (unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejszy protokół opisuje izolację nienaruszonych i żywotnych naczyń włosowatych ludzkiego mózgu ze świeżej tkanki. W tej sekcji szczegółowo omawiamy następujące kwestie: 1) modyfikacje protokołu, 2) rozwiązywanie typowych błędów, 3) ograniczenia techniki, 4) znaczenie modelu w odniesieniu do istniejących i alternatywnych modeli bariery krew-mózg oraz 5) potencjalne zastosowania izolowanych naczyń włosowatych ludzkiego mózgu.
Opisany tutaj protokół jest zoptymalizowany dla 10 g świeżej tkanki...

Bariera krew-mózg to ściśle kontrolowany interfejs między krwią a mózgiem, który decyduje o tym, co wchodzi i wychodzi z mózgu. Anatomicznie komórki śródbłonka tworzą barierę krew-mózg i tworzą złożoną, ciągłą sieć naczyń włosowatych. Fizjologicznie ta sieć kapilarna zaopatruje mózg w tlen i składniki odżywcze, jednocześnie usuwając dwutlenek węgla i produkty przemiany materii. Co ważne, dowody potwierdzają, że zmiany bariery przyczyniają się do wielu patologii, w tym choroby Alzheimera, epilepsji i udaru mózgu1,2,3,4,5,6,7. Komórki śródbłonka mózgu służą również jako bariera dla leczenia, blokując wchłanianie leków do mózgu, np. chemioterapia glejaka wielopostaciowego po resekcji guza8,9,10. Pod tym względem izolowane naczynia włosowate ludzkiego mózgu stanowią unikalny model bariery krew-mózg ex vivo, który bardzo przypomina właściwości bariery in vivo, co pozwala na badanie funkcji bariery i dysfunkcji w zdrowiu i chorobie. W tym artykule przedstawiamy protokół izolowania naczyń włosowatych mózgu od ludzkiego mózgu przy niezmiennie wysokiej jakości naczyń włosowatych i wydajności w celu zbadania bariery krew-mózg.
W 1969 roku, Siakotos et al. 11 jako pierwsi poinformowali o izolacji naczyń włosowatych mózgu z tkanki mózgowej bydlęcej i ludzkiej za pomocą wirowania w gradiacji gęstości i separacji kolumn z kulkami szklanymi. Później Goldstein i wsp.12 ulepszył tę metodę, dodając wiele etapów filtracji, aby zmniejszyć ilość tkanki potrzebnej do badania naczyń włosowatych mózgu wyizolowanych od szczurów, przy jednoczesnym zachowaniu aktywności metabolicznej transportu glukozy. Od tego czasu naukowcy wielokrotnie optymalizowali procedurę izolacji naczyń włosowatych, ulepszając metodę i model naczyń włosowatych mózgu z każdą iteracją13,14,15. Na przykład Pardridge i wsp. 16 izolowało naczynia włosowate bydła za pomocą trawienia enzymatycznego, a nie mechanicznej homogenizacji, a następnie przepuściło zawiesinę kapilarną przez filtr siatkowy 210 μm i kolumnę z kulkami szklanymi. Modyfikacje te poprawiły plamę wykluczającą błękit trypanowy w izolowanych naczyniach włosowatych mózgu, a tym samym zwiększyły żywotność komórek śródbłonka. Na początku lat dziewięćdziesiątych Dallaire i wsp. 17 izolowane naczynia włosowate bydła i szczura, które były wolne od zanieczyszczeń neuronalnych i utrzymywały aktywność metaboliczną transpeptydazy γ-glutamylowej (γ-GTazy) i fosfatazy alkalicznej. W 2000 roku Miller i wsp. 18, użył izolowanych naczyń włosowatych mózgu szczura i świni w połączeniu z mikroskopią konfokalną, aby pokazać nagromadzenie substratów transportowych w świetle naczyń włosowatych. Następnie nasze laboratorium kontynuowało optymalizację procedury izolacji naczyń włosowatych mózgu i opracowaliśmy testy transportowe w celu określenia glikoproteiny P (P-gp)19,20,21, białko oporności na raka piersi (BCRP)22,23, oraz białko oporności wielolekowej 2 (Mrp2)24 działalności transportowej. W 2004 roku opublikowaliśmy dwa raporty, w których wykorzystaliśmy izolowane naczynia włosowate mózgu szczura do zbadania różnych szlaków sygnałowych. W Hartz i wsp. 21, odkryliśmy, że peptyd endothelin-1 szybko i odwracalnie redukuje funkcję transportu P-gp w naczyniach włosowatych mózgu, działając poprzez receptor receptora endoteliny B (ETB), syntazę tlenku azotu (NOS) i kinazę białkową C (PKC). W Bauer i wsp.19, wykazaliśmy ekspresję receptora jądrowego pregnanu X (PXR) i pokazaliśmy modulację PXR ekspresji i funkcji transportu P-gp w naczyniach włosowatych mózgu. W eksperymentach z transgenicznymi humanizowanymi myszami PXR rozszerzyliśmy tę linię badań i pokazaliśmy in vivo zaostrzenie bariery poprzez regulację w górę P-gp poprzez aktywację hPXR25. W 2010 r. Hartz i wsp. 26 użył tego podejścia do przywrócenia ekspresji i aktywności transportowej białka P-gp u transgenicznych myszy z ludzkim białkiem prekursorowym amyloidu (hAPP), u których występuje nadekspresja hAPP. Co więcej, przywrócenie P-gp u myszy hAPP znacznie obniżyło poziomy amyloidu beta (Aβ)40i Aβ42w mózgu.
Oprócz badania szlaków sygnałowych, izolowane naczynia włosowate mózgu mogą być używane do określania zmian w przepuszczalności naczyń włosowatych, które nazywamy przeciekaniem naczyń włosowatych. W szczególności test wycieku Texas Red służy do oceny wycieku barwnika fluorescencyjnego Texas Red ze światła kapilarnego w czasie, a dane te są następnie wykorzystywane do analizy szybkości wycieków. Zwiększone wskaźniki przeciekania naczyń włosowatych w porównaniu do tych z naczyń włosowatych kontrolnych wskazują na zmiany w fizycznej integralności bariery krew-mózg2. Jest to cenne, ponieważ istnieje wiele stanów chorobowych związanych z przerwaniem bariery, np. padaczka, stwardnienie rozsiane, choroba Alzheimera i urazowe uszkodzenie mózgu27,28,29,30. Inne grupy również wykorzystały izolowane naczynia włosowate do rozpoznania szlaków sygnałowych, które regulują ekspresję białek i aktywność transportową białek31,32,33,34,35,36,37. Wreszcie, kontynuowaliśmy optymalizację tej metody pod kątem izolacji naczyń włosowatych ludzkiego mózgu, a ostatnio wykazaliśmy zwiększoną ekspresję P-gp na ludzkiej barierze krew-mózg u pacjentów z padaczką w porównaniu z osobami kontrolnymi bez napadów38. Podsumowując, odkrycia te pokazują, że izolowane naczynia włosowate mózgu mogą służyć jako wszechstronny model do badania funkcji bariery.
W badaniach podstawowych i przemysłowych badaniach przesiewowych leków użyto różnych modeli bariery krew-mózg in vivo, ex vivo i in vitro, głównie w celu testowania dostarczania leków do mózgu39,40,41,42,43,44. Oprócz izolowanych naczyń włosowatych mózgu ex vivo, obecne modele bariery krew-mózg obejmują modele in silico, hodowlę komórkową in vitro izolowanych komórek śródbłonka naczyń włosowatych mózgu lub unieśmiertelnione linie komórkowe różnych gatunków, hodowlę in vitro ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), które różnicują się w komórki śródbłonka naczyń włosowatych mózgu, oraz modele mikroprzepływowe na chipie.
Modele in silico są najczęściej używane w rozwoju leków do wyboru kandydatów na leki na podstawie przewidywanych właściwości wchłaniania, dystrybucji, metabolizmu i wydalania (ADME). Metody takie jak ilościowe modele zależności struktura-właściwość (QSPR) i ilościowe modele zależności struktura-aktywność (QSAR) są popularnymi metodami stosowanymi w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych bibliotek do przewidywania penetracji mózgu przez kandydatów na leki45,46. Modele te są przydatne do badania molekuł pod kątem właściwości penetracji bariery.
Betz et al.47 ustanowił monowarstwy hodowanych komórek śródbłonka naczyń włosowatych mózgu jako system modelowy bariery krew-mózg in vitro. Modele hodowli komórkowych in vitro wykorzystujące świeże tkanki lub unieśmiertelnione linie komórkowe śródbłonka, takie jak ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyń mózgowych (hCMEC), mogą być kolejnym wysokowydajnym narzędziem przesiewowym do penetracji mózgu lub badań mechanistycznych. Jednak modele hodowli komórek śródbłonka naczyń włosowatych w mózgu nie mają fizjologicznego stresu ścinającego związanego z przepływem krwi wewnątrz światła naczyń włosowatych, są ograniczone pod względem ogólnej złożoności biologicznej i ulegają zmianom w ekspresji i lokalizacji ważnych składników bariery, takich jak białka połączeń ścisłych, receptory powierzchniowe, transportery, enzymy i kanały jonowe48,49,50. I odwrotnie, monowarstwy śródbłonka pochodzące z hPSC mają niską przepuszczalność sacharozy w porównaniu z kulturami hCMEC/D3 i zawierają spolaryzowaną ekspresję niektórych transporterów bariery krew-mózg, cząsteczek adhezyjnych i połączeń ścisłych51,52. Jednak komórki te podlegają również zmiennym właściwościom w hodowli, a system musi zostać zweryfikowany pod kątem rekapitulacji właściwości barierowych in vivo52.
Nowsze trendy w badaniach bariery krew-mózg obejmują wykorzystanie systemów hodowli tkanek 3D do tworzenia sztucznych naczyń włosowatych, wykorzystanie technologii organ-on-chip do generowania urządzeń mikroprzepływowych, lub wykorzystanie technologii pustych włókien53,54,55. Sztuczne naczynia włosowate mają jednak znacznie większe średnice (100–200 μm) niż naczynia włosowate mózgu (3–7 μm). W związku z tym siły tnące in vitro nie przypominają w pełni sytuacji in vivo. Jest to rozwiązanie w urządzeniach mikroprzepływowych typu "krew-mózg-bariera-w-chipie", w których sztuczne błony tworzą przedziały "krwi" i "mózg", a płyny są pompowane przez te urządzenia, generując mikroprzepływowe siły ścinające. Podobnie, kohodowle komórek śródbłonka w różnych kombinacjach z astrocytami i komórkami mięśni gładkich naczyń krwionośnych zostały również wykorzystane z technologią pustych włókien do odtworzenia parametrów reologicznych obecnych w warunkach in vivo56,57,58. Nie jest jednak jasne, jak dobrze model ten odzwierciedla inne właściwości bariery krew-mózg, takie jak transport, metabolizm, sygnalizacja i inne. Te sztuczne modele kapilarne i chipowe nadają się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, ale komórki używane do generowania tych modeli również podlegają zmianom podczas hodowli.
Zamrożone i utrwalone wycinki mózgu lub hodowle komórek śródbłonka naczyń włosowatych mózgu to dodatkowe modele, które mogą być użyte dobadania ludzkiego mikrokrążenia5,59,60,61. Na przykład immunohistochemia utrwalonej tkanki mózgowej służy do określenia lokalizacji i ekspresji białek w tkankach zdrowych w porównaniu z chorymi.
Oprócz wycinków tkanek i modeli in vitro opisanych powyżej, świeżo wyizolowane naczynia włosowate mózgu mogą być wykorzystane do badania funkcji bariery krew-mózg. Ograniczenia tego izolowanego modelu kapilarnego obejmują trudność w uzyskaniu świeżej ludzkiej tkanki mózgowej, brak astrocytów i neuronów oraz stosunkowo czasochłonny proces izolacji. Zaletą izolowanego modelu kapilarnego mózgu jest to, że model ten bardzo przypomina sytuację in vivo, a zatem może być wykorzystany do scharakteryzowania funkcji bariery i dysfunkcji. Co ważne, może być również używany do rozpoznawania mechanizmów sygnalizacyjnych przy użyciu wielu testów i technik molekularnych3,19,62,63.
Nasze laboratorium ma dostęp zarówno do świeżej, jak i mrożonej ludzkiej tkanki mózgowej za pośrednictwem Sanders-Brown Center on Aging (IRB #B15-2602-M)64. W tym kontekście autopsje przebiegają zgodnie ze standardowym protokołem, mózgi są uzyskiwane w ciągu <4 godzin, a wszystkie procedury są zgodne z wytycznymi NIH Biospecimen Best Practice Guidelines65. Biorąc pod uwagę ten wyjątkowy dostęp do ludzkiej tkanki mózgowej, opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy protokół izolowania naczyń włosowatych mózgu od ludzkiej tkanki mózgowej, co skutkuje wysoką wydajnością nienaruszonych, żywotnych naczyń włosowatych ludzkiego mózgu. Dwa powszechne punkty końcowe będące przedmiotem zainteresowania to określenie ekspresji i aktywności białka. W związku z tym wraz z innymi ustaliliśmy różne testy, które można stosować z izolowanymi naczyniami włosowatymi mózgu do badania ekspresji i poziomów aktywności białek. Testy te obejmują Western blot, prosty test zachodni, test immunoenzymatyczny (ELISA), reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR), ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (qPCR), zymografię, testy aktywności transportowej i testy nieszczelności kapilarnej. Testy te pozwalają naukowcom badać zmiany w funkcji bariery w stanach patologicznych człowieka, określać szlaki rządzące ekspresją i aktywnością białek oraz identyfikować cele farmakologiczne w leczeniu chorób związanych z barierą krew-mózg.
Razem wzięte, świeżo wyizolowane naczynia włosowate mózgu mogą służyć jako solidny i powtarzalny model bariery krew-mózg. W szczególności model ten można łączyć z wieloma różnymi testami w celu określenia szerokiego wachlarza punktów końcowych do badania funkcji bariery.

<table><tbody><tr><td>Środki ochrony osobistej (PPE)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rękawice lateksowe Diamond Grip Plus, Microflex Medium</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>32916-636</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe ochronne fartuchy laboratoryjne</td><td>PPE VWR, Radnor, PA, USA</td><td>470146-214</td><td>PPE; ze względu na charakter materiału pozyskiwanego przez człowieka zaleca się stosowanie jednorazowego fartucha laboratoryjnego</td></tr><tr><td>Osłona twarzy, jednorazowa</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>19460102</td><td>środki ochrony indywidualnej; Ze względu na charakter materiału pozyskiwanego przez człowieka zaleca się stosowanie jednorazowej osłony twarzy</td></tr><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td>bezpieczeństwa</tr><tr><td>Worki do autoklawu wysokotemperaturowego Clavies 8 x 12</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>01-815-6</td><td></td></tr><tr><td>Suchy papier ławkowy Versi 18" x 20"</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>14-206-32</td><td>do pokrycia obszarów roboczych</td></tr><tr><td>VWR Sharps Container Systems</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>75800-272</td><td>dla używanych skalpeli</td></tr><tr><td>Wybielacz 8,2% Clorox Bakteriobójczy 64 uncje.</td><td>Centrum Zaopatrzenia w Wielkiej Brytanii, Lexington, KY, USA</td><td>323775</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; C Lodówka</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>13-986-148</td><td></td></tr><tr><td>Miernik pH Accume BASIC AB15</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>AB15</td><td></td></tr><tr><td>Heidolph RZR 2102 Control</td><td>Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA</td><td>501-21024-01-3</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall LEGEND XTR</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny Leica L2</td><td>Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>używany do usuwania opon</td></tr><tr><td>mózgowych Homogenizator POLYTRON PT2500</td><td>Kinematica AG, Lucerna, Szwajcaria</td><td>9158168</td><td></td></tr><tr><td>Scale P-403</td><td>Denver Instrument, Bohemia, NY, USA</td><td>0191392</td><td></td></tr><tr><td>Standard mini Stir</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>1151050</td><td></td></tr><tr><td>Termosy Ciekły azot Dewar</td><td>Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA</td><td>11-670-4C</td><td>używane do zamrażania tkanki?</td></tr><tr><td>Waga analityczna Voyager Pro</td><td>OHAUS, Parsippany, NJ, Stany</td><td>Zjednoczone VP214CN</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axiovert Microcope</td><td>Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA</td><td></td> służy <td>do sprawdzania izolowanych naczynek</td></tr> <tr><td>Tools and Glassware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette II Pipeta 1-5 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>21377823T1</td><td>zmywać naczynka filtr</td></tr><tr><td>Finnpipette II Pipeta 100-1 000 &mikro; L</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>21377821T1</td><td>granulat do resuspend w BSA</td></tr><tr><td>Pipet Boy</td><td>Integra, Hudson, NH, USA</td><td>739658</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówek Falcon 25/stojak - 500/cs</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela EISCO</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>S95938C</td><td>do mielenia tkanki mózgowej</td></tr><tr><td>PARAFILM</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>52858-000</td><td>do przykrycia zlewki i kolby miarowej</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finntip Pipet Końcówki 5 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>21-377-304</td><td>do zmywania kapilar z filtra</td></tr><tr><td>Strzykawka 60 ml z Luer-Lok</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>BD309653</td><td>używana z pierścieniem łączącym do filtrowania kapilar</td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela #4</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>10060-13</td><td>używany do mielenia</td></tr><tr><td>Dumont Kleszczy #5</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>11251-10</td><td>używany do usuwania opon</td></tr><tr><td>mózgowych Potter-Elvehjem Tissue Grinder</td><td>Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA</td><td>3431E25</td><td>50 mL objętość, prześwit: 150-230 &mu; </td></tr><tr><td>m Homogenizator Dounce</td><td>VWR, Radnor PA USA</td><td>62400-642</td><td>Objętość 15 mL, prześwit: 80-130 &mu; m</td></tr><tr><td>Filtry tkane Spectra/Mesh (300 &mikro; m)</td> <td>Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA</td><td>146424</td><td>Służy do filtrowania zawiesiny kapilarnej w celu usunięcia wszelkich opon mózgowych, które mogą pozostać</td></tr><tr><td>pluriSitka (wielkość porów: 30 i mikro; m)</td><td>pluriSelect Life Science, Lipsk, Niemcy</td><td>43-50030-03</td><td></td></tr><tr><td>Pierścień łączący</td><td>pluriSelect Life Science, Lipsk, Niemcy</td><td>41-50000-03</td><td>wielokrotne użycie</td></tr><tr><td>1 L Kolba</td><td></td><td></td> miarowa <td>do przygotowania buforu izolacyjnego</td></tr><tr><td>1 L Zlewka</td><td></td><td></td><td>do przygotowania 1% BSA</td></tr><tr><td>Stir Bar</td><td></td><td></td><td>do przygotowania 1% BSA i Ficoll&reg; </td></tr><tr><td>Schott Butelka (60 ml)</td><td></td><td></td> <td>do przygotowania Ficoll&reg; </td></tr><tr><td>Wiadro</td><td></td><td></td> na lód, <td>aby wszystko było zimne</td></tr><tr><td>100 mm Szalka</td><td></td><td></td> Petriego <td>do mielenia tkanki mózgowej</td></tr><tr><td>Skrobak do komórek do hodowli tkankowych</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>89260-222</td><td>do usuwania supernatantu po odwirowaniu</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA Frakcja V, A-9647</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>A9647-500g</td><td>przygotować w DPBS z Ca2+ & Mg2+ dzień wcześniej. Unikaj bąbelków podczas przygotowywania. Przechowywać w lodówce. Powoli mieszaj przez 10 minut przed użyciem.</td></tr><tr><td>DPBS z Ca2+ & Mg2+</td><td>Hyclone</td><td>SH30264.FS</td><td>DPBS - część buforu izolacyjnego</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>F4375</td><td>Ważny jest tutaj dokładny pomiar. Odważyć w butelce z mieszadłem. Wstrząśnij wigojnie po dodaniu DPBS. Przechowywać w lodówce O/N. Rano będzie pogodnie. Mieszaj delikatnie przez 10-15 minut przed użyciem. Trzymaj na lodzie do czasu użycia.</td></tr><tr><td>Glukoza (D-(+) dekstroza)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>G7528</td><td>Stężenie glukozy (D-(+) dekstrozy): 5 mM</td></tr><tr><td>Roztwór wzorcowy wodorotlenku sodu</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>71474</td><td>w celu dostosowania pH DPBS</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>P2256</td><td>Stężenie: 1 mM</td></tr></tbody></table>

izolacja naczyń włosowatych mózgu ze świeżej ludzkiej tkanki mózgowej

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Zrozumienie funkcji bariery krew-mózg w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych jest kluczowe dla rozwoju nowych strategii terapeutycznych, które dają nadzieję na poprawę dostarczania leków do mózgu, poprawę ochrony mózgu i leczenie zaburzeń mózgu. Jednak badanie funkcji bariery krew-mózg człowieka jest trudne. W związku z tym istnieje pilne zapotrzebowanie na odpowiednie modele. W związku z tym naczynia włosowate mózgu wyizolowane z ludzkiej tkanki mózgowej stanowią unikalne narzędzie do badania funkcji bariery jak najbardziej zbliżonej do ludzkiej sytuacji in vivo. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolowania naczyń włosowatych z ludzkiej tkanki mózgowej z wysoką wydajnością oraz przy stałej jakości i czystości. Kapilary są izolowane ze świeżej ludzkiej tkanki mózgowej za pomocą homogenizacji mechanicznej, wirowania w gradiacji gęstości i filtracji. Po izolacji naczynia włosowate ludzkiego mózgu mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań, w tym do testów przecieków, obrazowania żywych komórek i testów immunologicznych w celu zbadania ekspresji i funkcji białek, aktywności enzymów lub sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Izolowane naczynia włosowate ludzkiego mózgu są unikalnym modelem wyjaśniającym regulację funkcji ludzkiej bariery krew-mózg. Model ten może dostarczyć informacji na temat patogenezy ośrodkowego układu nerwowego (OUN), co pomoże w opracowaniu strategii terapeutycznych w leczeniu zaburzeń OUN.

Izolacja z tkanki mózgu człowieka pozwala uzyskać zawiesinę wzbogaconą w naczynia włosowate mózgu człowieka (Rycyna 1B) z niewielkimi ilościami większych naczyń, erytrocytów, innych pojedynczych komórek oraz pewną ilością debris komórkowego. Niektóre naczynia włosowate są rozgałęzione, a w niektórych w świetle naczyń uwięzione są erytrocyty. Typowe naczynie włosowate ma średnicę 3–7 µm i długość około 100-200 µm z otwartym światłem; większość końców naczyń wł...

Izolowane naczynia włosowate mózgu z ludzkiej tkanki mózgowej mogą być użyte jako model przedkliniczny do badania funkcji bariery w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Tutaj przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolowania naczyń włosowatych mózgu od świeżej ludzkiej tkanki mózgowej.

Izolacja naczyń włosowatych mózgu ze świeżej ludzkiej tkanki mózgowej

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad barierą krew-mózg, takie jak dysfunkcja bariery krew-mózg, nieszczelność bariery i szlaki sygnałowe, które są specyficzne dla ludzkiej bariery krew-mózg. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na badanie nienaruszonych, fizjologicznie aktywnych naczyń włosowatych ludzkiego mózgu, które zostały wyizolowane ze świeżej ludzkiej tkanki mózgowej. Aby rozpocząć tę procedurę, udokumentuj wagę ludzkiej tkanki mózgowej, która powinna wynosić około 10 gramów.Pod mikroskopem ostrożnie usuń wszystkie opony mózgowe kleszczami i za pomocą skalpela odetnij istotę białą. Następnie ostrożnie pokrój tkankę mózgową i miel ją skalpelem przez około pięć minut. Przenieś tkankę mózgową do młynka do tkanek i dodaj 30 mililitrów buforu izolacyjnego.Następnie homogenizować każdą próbkę za pomocą 100 uderzeń przy 50 obr./min. Nie mieszaj powietrza, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków. Udokumentuj czas co 25 uderzeń i całkowity czas potrzebny na 100 ruchów.Następnie przenieś homogenat do homogenizatora Dounce na lodzie. Homogenizować zawiesinę przez około 20 ruchów i unikać pęcherzyków. Następnie rozprowadź równomiernie homogenat mózgu w czterech 50-mililitrowych probówkach wirówkowych.I udokumentować całkowitą objętość homogenatu. Upewnij się, że dodałeś odpowiednią objętość Ficollu. Zbyt mała lub zbyt duża ilość Ficollu spowoduje nieprawidłową gęstość oddzielenia naczyń włosowatych od resztek komórkowych, a tym samym zmniejszy paletę naczyń włosowatych i ograniczy wydajność.Użyj 10 mililitrów buforu izolacyjnego, aby przepłukać tłuczek i homogenizator i rozprowadzić je w czterech probówkach wirówkowych. Następnie rozprowadź 50 mililitrów buforu gradientu gęstości do probówek wirujących. Szczelnie zamknij probówki wirówkowe nakrętkami.Następnie wymieszać homogenat, pożywkę o gradiencie gęstości i bufor, energicznie potrząsając probówkami. Wirować przy 5 800 razy grawitacji przez 15 minut w czterech stopniach Celsjusza. Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś każdą osadkę w dwóch mililitrach 1% BSA.Po ponownym wymieszaniu granulatu przefiltruj zawiesinę przez siatkę o grubości 300 mikrometrów. Kapilary są filtrowane przez siatkę, podczas gdy większe naczynia i większe szczątki mózgu pozostają na siatce. Ostrożnie umyj siatkę do 50 mililitrów 1%BSA.Następnie wyrzuć siatkę. Aby oddzielić naczynia włosowate od czerwonych krwinek i innych resztek mózgu, rozprowadź filtrat kapilarny na pięciu 30-mikrometrowych filtrach szczepu komórek. Naczynia włosowate są zatrzymywane przez ten filtr, podczas gdy czerwone krwinki, inne pojedyncze komórki i małe szczątki mózgu przechodzą przez filtr i są gromadzone w filtracie.Następnie umyj każdy filtr 25 mililitrami 1%BSA. Wlej wszystkie filtraty na szósty filtr, aby zwiększyć wydajność. Umyj każdy filtr 50 mililitrami 1% BSA.Zachowaj filtry odkształceń komórkowych zawierające naczynia włosowate i wyrzuć filtrat. Następnie odwróć filtry do góry nogami i umyj naczynia włosowate 50 mililitrami 1% BSA do 50-mililitrowych probówek. Delikatnie dociśnij końcówką pipety i przesuwaj ją po filtrze, aby zmyć naczynia włosowate mózgu.Upewnij się, że zmyłeś wszystkie naczynia włosowate mózgu, zwłaszcza z krawędzi filtra. Unikaj pęcherzyków, ponieważ utrudnia to proces filtracji i zwiększa ryzyko utraty naczyń włosowatych. Po zebraniu naczyń włosowatych odwirować wszystkie próbki pod ciśnieniem 1500 razy większym niż grawitacja przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w około trzech mililitrach buforu izolacyjnego. Następnie połącz wszystkie zawieszone granulki z jednej próbki w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i napełnij ją buforem izolacyjnym. Odwirować ponownie przy 1500-krotności grawitacji przez trzy minuty w czterech stopniach Celsjusza i umyć jeszcze dwa razy.Udokumentuj czystość naczyń włosowatych za pomocą mikroskopu przy 100-krotnym powiększeniu i kamery. Izolowane naczynia włosowate mózgu mogą być teraz wykorzystywane do eksperymentów, przetwarzane lub zamrażane błyskawicznie i przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w krioprobówkach przez co najmniej sześć do 12 miesięcy. Rysunek ten przedstawia reprezentatywny obraz w świetle przechodzącym naczynia włosowatego ludzkiego mózgu z dołączonym perycytem i czerwoną krwinką w świetle.Izolowana kapilara ludzkiego mózgu została wybarwiona immunologicznie pod kątem PGP przy użyciu C219 jako pierwszorzędowego przeciwciała, a jądra zostały podbarwione przeciwwagowo DAPI. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby uniknąć utraty naczyń włosowatych podczas etapów pipetowania i filtracji, aby zapewnić dobrą wydajność kapilarną. Po tej procedurze izolowane naczynia włosowate ludzkiego mózgu mogą być wykorzystywane do szerokiego zakresu badań, takich jak badania farmakologiczne i fizjologiczne, a także badania genomiczne, proteomiczne i celomiczne.Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się barierą krew-mózg do zbadania funkcji bariery w naczyniach włosowatych ludzkiego mózgu jak najbardziej zbliżonych do sytuacji in vivo u człowieka. Nie zapominaj, że praca z ludzką tkanką mózgową stwarza ryzyko infekcji patogenami przenoszonymi przez krew. Należy podjąć środki ostrożności, takie jak noszenie fartucha laboratoryjnego, osłony twarzy i rękawiczek, a także obchodzenie się z próbkami tkanek w warunkach BSL-2 podczas wykonywania tej procedury.

isolation-of-cerebral-capillaries-from-fresh-human-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film przedstawia izolację mikronaczyń z mózgu szczura za pomocą kombinacji wirowania gradientu gęstości i enzymatycznego trawienia. Wyizolowane mikronaczynia można hodować w kolbie hodowlanej wstępnie pokrytej matrycą kolagenu i fibronektyny w celu uzyskania kolonii komórek śródbłonka.

Hodowla komórek śródbłonka z mikronaczyń mózgu szczura: procedura izolacji i hodowli komórek śródbłonka z mikronaczyń mózgu szczura

W tym filmie pokazujemy procedurę izolacji i hodowli perycytów z naczyń włosowatych mózgu bydlęcego bez zanieczyszczenia komórkami śródbłonka.

Izolacja i hodowla pierwotnych perycytów mózgu: procedura izolacji i hodowli perycytów z naczyń włosowatych mózgu bydła bez zanieczyszczenia komórek śródbłonka

Ten film przedstawia izolację naczyń włosowatych mózgu z świeżej tkanki mózgowej człowieka. Wyizolowane naczynia włosowate można następnie wykorzystać do wygenerowania modelu bariery krew-mózg ex vivo.

Izolacja naczyń włosowatych mózgu od ludzkiego mózgu: zoptymalizowana metoda ekstrakcji naczyń włosowatych mózgu z ludzkiej tkanki mózgowej

Ten film pokazuje izolację nienaruszonych naczyń z mózgu myszy, które tworzą barierę krew-mózg (BBB) wraz z neuronami i komórkami glejowymi. Wyizolowane naczynia mogą być wykorzystane jako model in vitro do zbadania ich roli w utrzymaniu homeostazy mózgu.

Izolowanie naczyń mózgowych myszy: protokół izolowania nienaruszonych naczyń z próbki mózgu myszy

Ten film pokazuje izolację naczyń włosowatych od świeżych mózgów świń. Proces ten polega na usunięciu opon mózgowych, wyizolowaniu istoty szarej z tkanki mózgowej, homogenizacji i filtrowaniu istoty szarej w celu wyizolowania naczyń włosowatych, a na koniec zastosowaniu trawienia enzymatycznego w celu dalszego oczyszczenia naczyń włosowatych.

Oczyszczanie naczyń włosowatych z mózgu świni

Ten film pokazuje proces izolowania mikronaczyń mózgowych od szczurów poddanych eutanazji. Obejmuje preparację mózgu, oczyszczanie tkanki i trawienie mechaniczne, a następnie wielokrotne wirowanie w celu wyizolowania czystej frakcji mikronaczyń.

Metoda izolacji jednostek nerwowo-naczyniowych z mózgu szczura

Opisujemy protokół pozwalający na oczyszczenie przedziału naczyniowego mózgu myszy. Izolowane naczynia mózgowe obejmują komórki śródbłonka połączone ścisłymi połączeniami i otoczone ciągłą blaszką podstawną, perycyty, komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych, a także okołonaczyniowe błony astroglejowe.

Oczyszczanie naczyń mózgowych myszy

Ten manuskrypt opisuje prosty i powtarzalny protokół izolacji tętniczek śródmózgowych (grupa naczyń krwionośnych obejmujących tętniczki miąższowe, tętniczki penetrujące i tętniczki przedkapilarne) od myszy, do wykorzystania w miografii ciśnieniowej, immunofluorescencji, biochemii i badaniach molekularnych.

Izolacja i kaniulacja tętniczek miąższowych mózgu

Przedstawiamy protokół ekstrakcji mysich perycytów mózgowych. Protokół ten, oparty na ekstrakcji perycytów zorientowanej na wzbogacanie bez antybiotyków, jest cennym narzędziem do badań in vitro, zapewniając wysoką czystość i wysoką wydajność, zmniejszając w ten sposób liczbę wykorzystywanych zwierząt doświadczalnych.

Wysokowydajna metoda izolowania perycytów mózgowych od myszy

Niniejszy manuskrypt szczegółowo opisuje, jak izolować tętniczki i naczynia włosowate hipokampa od mózgu myszy oraz jak zwiększać w nich ciśnienie do miografii ciśnieniowej, immunofluorescencji, biochemii i badań molekularnych.

Przygotowanie tętniczki kapilarno-miąższowej hipokampa pod ciśnieniem do badania funkcjonalnego

Perycyty kapilarne mózgu odgrywają kluczową rolę w regulacji właściwości bariery krew-mózg i przepływu krwi. Protokół ten opisuje, w jaki sposób perycyty naczyń włosowatych mózgu mogą być izolowane, hodowane, charakteryzowane w odniesieniu do typu komórki i stosowane do badań wewnątrzkomórkowej sygnalizacji wapniowej za pomocą sond fluorescencyjnych.

Posiew perycytów naczyń włosowatych mózgu do cytozolowych pomiarów wapnia i badań obrazowych wapnia

Poznaj metodę izolacji naczyń włosowatych mózgu ze świeżej ludzkiej tkanki mózgowej do badań bariery krew-mózg. Technika umożliwia analizę fizjologicznie aktywnych naczyń i ścieżek sygnałowych.

Izolacja naczyń włosowatych mózgu ze świeżej ludzkiej tkanki mózgowej

Przeglądaj więcej filmów