Platforma mikroprzepływowa do obrazowania podłużnego u Caenorhabditis elegans

Ogólnym celem tej procedury jest podłużne zobrazowanie dynamicznych procesów u dorosłych nicieni w kontrolowanych warunkach środowiskowych w celu śledzenia reakcji behawioralnych robaków i kinetyki ekspresji genów robaków. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tego, jak zwierzęta przystosowują się do zmian w swoim środowisku, w tym różnic w podstawowych zachowaniach, ekspresji genów, pamięci i uczeniu się. Technika ta pozwala na multipleksową obserwację podłużną poszczególnych zwierząt w dynamicznie kontrolowanych środowiskach, a także na jednoczesne pobieranie próbek wielu aspektów adaptacji w wysokiej rozdzielczości.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku ilościowego zrozumienia adaptacji zwierząt, ponieważ pozyskiwanie precyzyjnych danych kinetycznych może ułatwić modelowanie matematyczne oraz formułowanie i testowanie złożonych hipotez. Aby skonfigurować urządzenie do zabiegu, najpierw podłącz końcówkę strzykawki wylotowej do 50-centymetrowego kawałka rurki strzykawki. Aby wykonać igłę adaptera, użyj szczypiec, aby wyciągnąć trzpień igły z piasty igły igły o wymiarach 20 na pół cala i użyj palnika Bunsena, aby usunąć pozostałe pozostałości plastiku.

Trzymając szczypce za oba końce igły, zegnij igłę adaptera zgodnie z geometrią zestawu doświadczalnego i podłącz igłę do połowy do drugiego końca rurki strzykawki wylotowej. Następnie podłącz jedną końcówkę strzykawki wlotowej buforu bezpośrednio do zaworu trójdrogowego i podłącz strzykawkę wlotową buforu do metrowego kawałka rurki strzykawki. Wkładając igłę adaptera do połowy do otwartego końca probówki, podłączyć strzykawkę do wymiany buforu do 50-centymetrowego kawałka rurki strzykawki za pomocą końcówki strzykawki.

Podłącz rurkę strzykawki do pozostałego portu zaworu trójdrogowego i zamknij zawór. Za pomocą igły adaptera podłącz strzykawkę z wlotem ślimakowym do metrowego kawałka rurki strzykawki, jak pokazano. Następnie spłucz wszystkie materiały dwukrotnie S-medium i napełnij wypłukane strzykawki i probówki świeżym S-medium, uważając, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.

Teraz podłącz rurkę strzykawki wylotowej do gniazdka urządzenia i podłącz igłę adaptera na końcu rurki strzykawkowej wylotowej do portu wylotowego. Wstrzyknąć niewielką objętość pożywki S przez wylot, aby napełnić urządzenie, aż pożywka S wydostanie się zarówno z wlotu bufora, jak i ślimaka. Podłącz rurkę strzykawki wlotowej bufora do portu wlotowego bufora urządzenia i zatkaj wlot ślimaka kołkiem ustalającym ze stali nierdzewnej o średnicy jednej trzydziestej sekundy cala.

Zamontuj urządzenie mikroprzepływowe na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym ze zmotoryzowanym stolikiem i przyklej pompę strzykawkową do wytrząsarki w pobliżu mikroskopu, aby pompa nie drgała podczas potrząsania. Następnie załadować strzykawkę wlotową buforu na pompę strzykawkową i ustawić pompę tak, aby dostarczała ciągły przepływ medium S do urządzenia z natężeniem przepływu trzech mikrolitrów na minutę. Aby załadować bakterie do urządzenia mikroprzepływowego, najpierw załaduj nową strzykawkę z zawiesiną E.coli OP50 o dużej gęstości.

Obrócić strzykawkę w pionie i kilkakrotnie postukać w cylinder, aby zebrać wszystkie pęcherzyki powietrza w górnej części strzykawki. Wyłączyć wytrząsarkę orbitalną i zamknąć zawór trójdrogowy strzykawek wlotowych buforu. Zastrzykać strzykawkę wlotową buforu strzykawką wypełnioną bakteriami i wypchnąć całe powietrze zebrane w górnej części strzykawki, aż niewielka ilość zawiesiny bakteryjnej dostanie się do systemu wymiany buforu i nie pozostaną żadne pęcherzyki w strzykawce załadowanej OP50 lub zaworze.

Przy zamkniętym zaworze podłącz strzykawkę wypełnioną bakteriami do pompy strzykawkowej i włącz wytrząsarkę orbitalną. Ustaw prędkość wytrząsania na około 200 obr./min, a natężenie przepływu na 100 mikrolitrów na minutę. Gdy bufor OP50 rozprzestrzeni się po całym urządzeniu, ustaw natężenie przepływu z powrotem na trzy mikrolitry na minutę.

Aby załadować urządzenie nicieniami, najpierw napełnij 650-mikrolitrową probówkę wirówkową o niskim poziomie wiązania 100 mikrolitrami świeżej zawiesiny OP50 i użyj kilofa, aby indywidualnie przenieść od 20 do 30 zsynchronizowanych z wiekiem młodych dorosłych robaków z płytki agarowej pożywki do wzrostu nicieni do probówki. Napełnić strzykawkę wlotową ślimaka i probówkę strzykawki świeżą zawiesiną OP50 i wstrzyknąć około 500 mikrolitrów zawiesiny do probówki do mikrowirówki. Następnie wciągnąć zawiesinę ślimaka do rurki strzykawki z wlotem ślimaka i podłączyć strzykawkę z wlotem ślimaka do wlotu ślimaka.

Wstrzyknąć wszystkie robaki przez rurkę strzykawki z wlotem ślimaka do urządzenia mikroprzepływowego i odłączyć strzykawkę wlotową ślimaka i rurkę strzykawki. Zatkać wlot ślimakowy szpilką i odłączyć strzykawkę wlotową bufora od pompy mechanicznej. Użyj strzykawki wlotowej bufora, aby ręcznie przesunąć robaki do kanałów, a strzykawki wylotowej, aby w razie potrzeby odwrócić ruch ślimaka.

Załadunek zwierząt wymaga pewnej koordynacji. Użyj delikatnych nacisków na tłoki strzykawki, aby wyrównać się z kanałem i nieco mocniejszego nacisku, aby wbić robaka do końca. Następnie pozwól robakom dostosować się do nowego środowiska przez dwie do trzech godzin przed rozpoczęciem eksperymentu.

Robaki są ograniczone do swoich kanałów, ale nie są unieruchomione. Większość robaków pozostanie w swoich kanałach przez cały czas trwania eksperymentu, ale niektóre mogą uciec lub zaplątać się w mikroszczeliny. Tutaj można zaobserwować obrazy jasnego pola pojedynczego, reprezentatywnego robaka w ciągu dziesięciu godzin w urządzeniu.

Używając transgenicznych robaków, które wyrażają GFP pod promotorem genu odpowiedzi immunologicznej, po zakażeniu P.Aeruginosa, PA14, ekspresję GFP obserwuje się w środkowej i ogonowej części ciała robaka w ciągu pierwszych pięciu godzin ekspozycji na patogen, zwiększając się do silnej, pełnej ekspresji ciała w ciągu następnych pięciu godzin. Wykreślenie całkowitej fluorescencji każdego robaka w funkcji czasu po zakażeniu ilustruje dynamikę indukcji pierwszego genu odpowiedzi immunologicznej, a także zmienność między robakami w czasie i zakresie indukcji. Obrazowanie poklatkowe jaj złożonych przez robaki w każdym kanale pozwala na wykreślenie łącznej liczby jaj złożonych przez każdego robaka w funkcji czasu po zakażeniu i uchwycenie zmienności między zwierzętami a zwierzętami, a także wywołanego przez patogen spadku składania jaj w miarę postępu infekcji.

Po opanowaniu urządzenie mikroprzepływowe można przygotować i załadować w ciągu jednej godziny. Po załadowaniu urządzenia i zaaklimatyzowaniu się robaków, inne odczynniki, takie jak określone leki lub interesujące sygnały chemiczne, mogą zostać dostarczone robakom, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące kontroli systemów neuronalnych i genetycznych nicieni. Po jej opracowaniu my i nasi współpracownicy wykorzystaliśmy tę technikę do analizy zachowań żywieniowych nicieni, a także reakcji genetycznych robaków na infekcję szokiem cieplnym i głód w różnych środowiskach.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać urządzenia mikroprzepływowego do wykonywania esejów podłużnych.