Name: Platforma mikroprzepływowa do obrazowania podłużnego u Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Poznaj platformę mikroprzepływową do obrazowania podłużnego u Caenorhabditis elegans. Ta technika umożliwia śledzenie zachowań i ekspresji genów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez National Science Foundation poprzez granty PHY-1205494 i MCB-1413134 (EL) oraz przez National Research Foundation of Korea grant 2017R1D1A1B03035671 (KSL).

Poniższy protokół korzysta z WormSpa5, wcześniej opisanego urządzenia mikroprzepływowego do obrazowania podłużnego robaków. Produkcja WormSpa (zaczynając od plików CAD, które można uzyskać od autorów na żądanie) jest prosta, ale wymaga pewnej wiedzy specjalistycznej. W większości przypadków produkcja może być łatwo wykonana przez główny zakład lub przez firmę komercyjną, która świadczy takie usługi. Podczas produkcji urządzenia należy upewnić się, że wysokość elementów wynosi 50 μm.
1. Konfiguracja eksperymentalna
<ol>
	<li>Zamontuj urządzenie mikroprzepływowe na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym z zmotoryzowanym stolikiem.</li>
	<li>Umieść wytrząsarkę orbitalną blisko mikroskopu, ale upewnij się, że wibracje wytrząsarki nie wpływają bezpośrednio na mikroskop. Na przykład umieść shaker na półce przymocowanej do ściany, która nie styka się ze stołem optycznym.</li>
	<li>Umieść pompkę strzykawkową na wytrząsarce orbitalnej. Przyklej pompę do wytrząsarki, aby nie drgała podczas potrząsania.</li>
</ol>
2. Przygotowanie środowiska mikroprzepływowego
UWAGA: Podczas eksperymentu, cztery strzykawki są podłączone do urządzenia mikroprzepływowego za pomocą rurek strzykawkowych, jak opisano w Rysunek 1. Na tym etapie opisano sposób przygotowania tych strzykawek. O ile nie zaznaczono inaczej, rurki strzykawki powinny być jak najkrótsze, bez ich napinania.
<ol>
	<li>Przygotować strzykawkę wylotową i rurkę strzykawki. Ta strzykawka (S1 w <silnej klasie="xfig">Rysunek 1) zostanie później podłączona do wylotu urządzenia przez rurkę strzykawki i użyta do tymczasowego przechowywania płynu wychodzącego z urządzenia.
	<ol>
		<li>Wykonaj igłę adaptera, usuwając plastikowe części końcówki strzykawki o wymiarach 20 G x 1/2 cala, pozostawiając tylko igłę (metalową część). Zrób to, przytrzymując plastikowe i metalowe części szczypcami i rozsuwając je. Pozostałości plastiku na igle można spalić za pomocą palnika Bunsena.</li>
		<li>Zegnij igłę zgodnie z geometrią zestawu eksperymentalnego, przytrzymując jej dwa końce szczypcami. W opisanej tutaj konstrukcji najwygodniejsze jest zginanie igły w jej środku pod kątem ~110°.</li>
		<li>Włóż igłę adaptera do połowy do rurki. Druga połowa zostanie później podłączona do urządzenia. Rurka strzykawki powinna być kompatybilna z końcówką strzykawki 20 G bez wycieku (na przykład rurka o średnicy wewnętrznej 0,86 mm i średnicy zewnętrznej 1,32 mm). Zalecana długość rurki to ~50 cm.</li>
		<li>Podłączyć strzykawkę typu luer-lock o pojemności 10 ml do drugiego (otwartego) końca rurki strzykawki za pomocą końcówki strzykawki o wymiarach 20 G x 1/2 cala.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować strzykawki z wlotem buforu i probówki strzykawkowe. Jedna z tych strzykawek (S2 w <klasa silna = "xfig" >Rysunek 1) służy jako zbiornik na płyn, który trafia do urządzenia i do kontrolowania przepływu iniekcji. Druga strzykawka (S3 w <silna klasa="xfig">Rysunek 1) jest wymagana do wymiany bufora, jak wyjaśniono w kroku 3.2.
	<ol>
		<li>Podłącz strzykawkę typu luer-lock o pojemności 10 ml (S2) bezpośrednio do zaworu 3-drogowego i podłącz kolejną strzykawkę (S3) do tego samego zaworu za pomocą rurki strzykawkowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1): podłącz S3 do rurki za pomocą końcówki strzykawki i podłącz rurkę do zaworu za pomocą innej końcówki strzykawki. 
		UWAGA: Kolejność, w jakiej te materiały są połączone, nie ma znaczenia.</li>
		<li>Podłącz rurkę strzykawki do pozostałego portu zaworu 3-drogowego. Przygotować kolejną igłę adaptera, jak w kroku 2.1.2, i włożyć igłę do połowy do drugiego (otwartego) końca rurki strzykawki.</li>
		<li>Ustaw zawór w taki sposób, aby rurka strzykawki w kroku 2.2.2 i S2 była podłączona, podczas gdy S3 jest zamknięta (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować strzykawkę z wlotem ślimaka i rurkę strzykawki. Ta strzykawka (S4 w <silnej klasie="xfig">Rysunek 1) służy do ładowania robaków do urządzenia.
	<ol>
		<li>Podłączyć długą rurkę strzykawki do 10 ml strzykawki typu luer-lock (S4). Określ długość tej rurki na podstawie objętości płynu, który zostanie użyty do załadunku; na przykład 100 cm rurki podtrzymuje ponad 2 ml płynu (patrz również krok 4.2).</li>
		<li>Przygotować kolejną igłę adaptera, jak w kroku 2.1.2, i podłączyć jedną połowę igły do drugiego (otwartego) końca rurki strzykawki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przepłukać wszystkie strzykawki i rurki dwukrotnie za pomocą S-medium12. Napełnić strzykawki i probówki roztworem S-medium, uważając, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Podłączyć rurkę strzykawki wylotowej do wylotu urządzenia.
	<ol>
		<li>Podłączyć igłę adaptera na końcu rurki strzykawki do portu wylotowego.</li>
		<li>Wstrzyknij niewielką objętość pożywki S przez wylot, aby napełnić urządzenie, aż niewielka ilość pożywki S wydostanie się zarówno z wlotu bufora, jak i wlotu ślimaka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłącz rurkę strzykawki z wlotem bufora do portu wlotowego bufora urządzenia, jednocześnie zatykając wlot ślimakowy za pomocą kołka (kołek ustalający ze stali nierdzewnej o średnicy 1/32 cala).</li>
	<li>Wstrzyknąć stały przepływ buforu do urządzenia. Załadować strzykawkę S2 z wlotem buforu do pompy strzykawkowej13 i ustawić pompę tak, aby medium w S2 było w sposób ciągły wstrzykiwane do urządzenia z natężeniem przepływu 3 μl/min.</li>
</ol>
3. Ładowanie bakterii do urządzenia mikroprzepływowego
<ol>
	<li>Przygotuj Escherichia coli OP50 zawieszoną w S-medium12.
	<ol>
		<li>Postępując zgodnie ze standardowym protokołem, zaszczepić kolbę o pojemności 250 ml z 50 ml LB i pojedynczą kolonią, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Odwirować kulturę przez noc z prędkością 4000 obr./min przez 10 minut i ponownie zawiesić osad w 30 ml pożywki S.</li>
		<li>Przefiltrować zawiesinę przez filtr strzykawkowy 5 μm. Zmierz stężenie bakterii na podstawie jej gęstości optycznej przy 600 nm (OD600) i dostosuj stężenie do OD600 wynoszącego 3. Ta wysoka gęstość jest wymagana, aby robaki były dobrze odżywione.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymień bufor w urządzeniu na zawieszenie OP50.
	<ol>
		<li>Przygotować czystą strzykawkę (S5) wypełnioną zawiesiną OP50. Trzymać strzykawkę pionowo i postukać w nią kilka razy, aby zebrać wszystkie pęcherzyki powietrza u góry.</li>
		<li>Przekręć zawór 3-drogowy strzykawek z wlotem bufora, aby zamknąć połączenie z urządzeniem i podłącz dwie strzykawki, S2 i S3. Odłączyć S2 od pompy strzykawkowej.</li>
		<li>Odłączyć S2 od zaworu i podłączyć S5 do zaworu. Wypchnij całe powietrze zebrane w górnej części S5 do S3 przez zawór, aż trochę bufora OP50 trafi do S3. Należy przy tym upewnić się, że w S5 ani na zaworze nie pozostały żadne pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Przekręć zawór 3-drogowy z powrotem do pierwotnej pozycji, aby zamknąć połączenie między S3 i S5 i podłącz S5 do urządzenia. Załadować S5 do pompy strzykawkowej. Włącz wytrząsarkę orbitalną, która utrzymuje pompę. Ustaw prędkość wytrząsania na około 200 obr./min.</li>
		<li>Ustaw natężenie przepływu na 100 μl/min. Czas potrzebny na dotarcie nowego buforu do robaków w urządzeniu zależy od długości rurki strzykawki z wlotem buforu (około 5 minut z rurką opisaną powyżej). Wyższe natężenie przepływu można zastosować, jeśli wymagana jest szybsza wymiana bufora.</li>
		<li>Gdy bufor OP50 rozprzestrzeni się po całym urządzeniu, ustaw natężenie przepływu z powrotem na 3 μL/min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wczytywanie robaków do urządzenia mikroprzepływowego
<ol>
	<li>Przygotować małą probówkę do mikrowirówki o niskim poziomie wiązania (650 μl) i napełnić ją 100 μl zawiesiny OP50. Przenieś około 20 - 30 zsynchronizowanych z wiekiem młodych dorosłych robaków (46 godzin po zatrzymaniu larw L1 w temperaturze 25 °C) z płytki agarowej NGM (pożywka do wzrostu nicieni) do probówki, zbierając je jeden po drugim za pomocą wytrychacza robaków. Synchronizacja wieku może być wykonana zgodnie ze standardowym protokołem12.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę ślimakową i rurkę strzykawki (S4 w <klasa silna = "xfig" >Rysunek 1) zawiesiną OP50. Wstrzyknąć ~500 μL płynu do probówki mikrowirówki z robakami. Nabrać zawiesinę z robakami do rurki strzykawki z wlotem ślimaka. Upewnij się, że rurka strzykawki jest wystarczająco długa (>1 m) i że wciągnięte robaki pozostają w rurce strzykawki i nie docierają do strzykawki S4.</li>
	<li>Podłącz S4 do wlotu ślimaka. Wstrzyknąć wszystkie robaki z rurki strzykawki ślimakowej do urządzenia mikroprzepływowego. Odłączyć S4 i rurkę strzykawki. Zatkać wlot ślimakowy za pomocą szpilki.</li>
	<li>Odłącz strzykawkę S2 z wlotem bufora od pompy mechanicznej ( <silna klasa = "xfig" > Rysunek 1) i ręcznie steruj S1 i S2, aby wepchnąć wszystkie robaki do oddzielnych kanałów. Naciśnięcie S2 przeniesie robaki do kanałów, natomiast naciśnięcie S1 przesunie je w odwrotnym kierunku. Po załadowaniu kanału, robak w każdym kanale zablokuje dostęp innym robakom.</li>
	<li>Pozwól robakom dostosować się do nowego środowiska przez 2-3 godziny.</li>
</ol>
5. Konfiguracja protokołu obrazowania
<ol>
	<li>Znajdź wszystkie robaki, które są bezpiecznie zlokalizowane w urządzeniu, i ustaw pozycję obrazowania dla każdego z nich w oprogramowaniu do akwizycji obrazu, które steruje mikroskopem. Należy pamiętać, że w niektórych przypadkach (np. gdy wymagane jest większe powiększenie lub gdy używane są kamery z mniejszą matrycą CCD) dla każdego kanału wymagane jest wiele pozycji obrazowania. 
	UWAGA: Chociaż można to zrobić ręcznie, niektóre pakiety oprogramowania do akwizycji mogą załadować plik tekstowy z listą pozycji, w których należy zrobić obrazy. Ponieważ te pozycje są regularnie porządkowane w WormSpa, użytkownik może napisać mały skrypt (np. w Pythonie lub komercyjnym oprogramowaniu), który automatycznie tworzy taką listę. Dokładny format tego skryptu zależy od formatu pliku oczekiwanego przez oprogramowanie do akwizycji (patrz przykład w Materiałach uzupełniających 1).</li>
	<li>Ustaw wymaganą częstotliwość obrazowania poklatkowego. Na przykład obrazowanie odpowiedzi genów immunologicznych na infekcję odbywa się z częstotliwością 10 minut na klatkę. Upewnij się, że wszystkie niezbędne kanały (np. jasne pole i fluorescencja GFP) są rejestrowane w każdym punkcie czasowym.</li>
</ol>
6. Odpowiedź gospodarza na infekcję Pseudomonas
Uwaga: Ten krok jest specyficzny dla badania interakcji gospodarz-patogen. Alternatywnie można przygotować bufor, który zawiera inne interesujące sygnały środowiskowe (stresory biotyczne i abiotyczne, leki, cząsteczki sygnałowe itp.).
<ol>
	<li>Przygotuj Pseudomonas aeruginosa PA14 zawieszony w SK-medium14.
	<ol>
		<li>Zaszczepić kolbę o pojemności 250 ml 50 ml LB i pojedynczą kolonią, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zaszczepić kolejną kolbę o pojemności 250 ml z 50 ml LB i podwielokrotnością kultury, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Odwirować nocną hodowlę z prędkością 4000 obr./min przez 10 minut i ponownie zawiesić osad w 10 ml pożywki SK. Zmierz stężenie bakterii i dostosuj stężenie do OD600 = 4.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę do czystej kolby i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny i w temperaturze 25 °C przez kolejne 24 godziny, wytrząsając. Ten krok naśladuje etap inkubacji płytki w standardowym teście zabijania14.</li>
		<li>Przefiltrować zawiesinę przez filtr strzykawkowy 5 μm. Ma to na celu zapobieżenie zatykaniu się urządzenia przez agregaty bakteryjne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymień zawieszenie OP50 w urządzeniu na zawieszenie PA14, postępując zgodnie z tą samą procedurą, co w kroku 3.2. Kontynuuj obrazowanie przez 10 godzin.</li>
</ol>

<ol><li>Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+gene+expression+to+changing+environments%3A+from+rapid+responses+to+evolutionary+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation.</a> Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).</li>
<li>de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+gene+expression+in+response+to+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Controlling gene expression in response to stress.</a> Nat Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).</li>
<li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Samuel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics%3A+Streamlining+discovery+in+worm+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics: Streamlining discovery in worm biology.</a> Nat Methods. 5 (7), 589-590 (2008).</li>
<li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. , (2013).</li>
<li>Kopito, R. B., Levine, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+spatiotemporal+surveillance+of+Caenorhabditis+elegans+response+to+environmental+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues.</a> Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).</li>
<li>Mishra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+Responses+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury Responses in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (84), e50998(2014).</li>
<li>Grisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+spectroscopy+of+single+sub-nL+ova+with+inductive+ultra-compact+single-chip+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">NMR spectroscopy of single sub-nL ova with inductive ultra-compact single-chip probes.</a> Sci Rep. 7, 44670(2017).</li>
<li>Crane, M. M., Chung, K., Stirman, J., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-enabled+phenotyping%2C+imaging%2C+and+screening+of+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-enabled phenotyping, imaging, and screening of multicellular organisms.</a> Lab Chip. 10 (12), 1509-1517 (2010).</li>
<li>Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+manipulation+of+neural+activity+in+freely+moving+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans.</a> Nat Meth. 8 (2), 147-152 (2011).</li>
<li>Lee, K. S., Lee, L. E., Levine, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HandKAchip+-+Hands-free+killing+assay+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">HandKAchip - Hands-free killing assay on a chip.</a> Sci Rep. 6, 35862(2016).</li>
<li>Lee, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin-dependent+kinetics+of+feeding+bursts+underlie+a+graded+response+to+food+availability+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans.</a> Nat Commun. 8, 14221(2017).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.sisweb.com/lc/new-era-ne1000.htm">NE-1000 Series of Programmable Syringe Pumps</a>. , New Era Pump Systems Inc. (2017).</li>
<li>Tan, M. W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+of+Caenorhabditis+elegans+by+Pseudomonas+aeruginosa+used+to+model+mammalian+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 715-720 (1999).</li>
<li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+p38+MAP+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> Science. 297 (5581), 623-626 (2002).</li>
<li>Troemel, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p38+MAPK+regulates+expression+of+immune+response+genes+and+contributes+to+longevity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans.</a> PLoS Genet. 2 (11), 183(2006).</li>
<li>Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bZIP+transcription+factor+zip-2+mediates+an+early+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 2153-2158 (2010).</li>
<li>Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+I.+Wild-type+growth+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction.</a> Dev Biol. 51 (1), 23-33 (1976).</li>
<li>Chalancon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+gene+expression+noise+and+regulatory+network+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture.</a> Trends Genet. 28 (5), 221-232 (2012).</li>
<li>Sanchez, A., Choubey, S., Kondev, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+noise+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Regulation of noise in gene expression.</a> Annu Rev Biophys. 42, 469-491 (2013).</li>
<li>Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+Switching+of+Cell+Fate+in+Microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stochastic Switching of Cell Fate in Microbes.</a> Annu Rev Microbiol. 69, 381-403 (2015).</li>
<li>Gardner, T. S., di Bernardo, D., Lorenz, D., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+genetic+networks+and+identifying+compound+mode+of+action+via+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inferring genetic networks and identifying compound mode of action via expression profiling.</a> Science. 301 (5629), 102-105 (2003).</li>
<li>Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+activities+that+mediate+increased+life+span+of+C.+elegans+insulin-like+signaling+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants.</a> Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).</li>
<li>Edwards, C. B., Copes, N., Brito, A. G., Canfield, J., Bradshaw, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malate+and+Fumarate+Extend+Lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Malate and Fumarate Extend Lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 8 (3), 58345(2013).</li>
<li>Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19997/">C. elegans II</a>. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. , (1997).</li>
<li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652(2017).</li>
<li>Scholz, M., Lynch, D. J., Lee, K. S., Levine, E., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+method+for+automatically+measuring+pharyngeal+pumping+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A scalable method for automatically measuring pharyngeal pumping in C. elegans.</a> J Neurosci Methods. 274, 172-178 (2016).</li>
<li>Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+feeding+dynamics+arise+from+the+need+for+information+and+energy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (35), 9261-9266 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Narzędzia mikroprzepływowe zapewniają wiele korzyści w badaniu robaków. Obrazowanie w urządzeniu PDMS zapewnia wyższą jakość obrazowania w porównaniu ze standardową płytką agarową NGM. Z jednego robaka można wykonać wiele obrazów, w przeciwieństwie do tradycyjnych metod, w których zwierzęta są wybierane z płytki i umieszczane na szkiełku mikroskopowym w celu obrazowania. Ponadto mikrośrodowisko, w którym przebywają robaki, może być utrzymywane na stałym poziomie lub modulowane w zależności od potrzeb, co pozwala na precy...

Zmiany warunków środowiskowych mogą prowadzić do aktywacji programów genetycznych, której towarzyszy indukcja i tłumienie ekspresji określonych genów1,2. Te zmiany kinetyczne mogą być zmienne w tkankach tych samych zwierząt i między różnymi zwierzętami. Badania nad takimi programami genetycznymi wymagają zatem metod, które umożliwiają obrazowanie podłużne poszczególnych zwierząt i zapewniają precyzyjną dynamiczną kontrolę warunków środowiskowych.
W ostatnich latach mikrofabrykowane urządzenia fluidyczne były wykorzystywane do badania wielu aspektów reakcji i zachowania u małych zwierząt, w tym robaków, much, niedźwiedzi wodnych i innych3,4,5,6,7. Zastosowania obejmują na przykład głębokie fenotypowanie, optogenetyczne rejestrowanie aktywności neuronów w odpowiedzi na bodźce chemiczne oraz śledzenie zachowań motorycznych, takich jak lokomocja i pompowanie8,9,10,11.
Podejścia oparte na mikroprzepływach posiadają wiele właściwości, które mogłyby przynieść korzyści długoterminowemu obrazowaniu podłużnemu reakcji na sygnały środowiskowe, w tym precyzyjną dynamiczną kontrolę lokalnego mikrośrodowiska, elastyczny projekt, który pozwala na utrzymanie poszczególnych zwierząt w oddzielnych pomieszczeniach, oraz korzystne atrybuty do obrazowania. Jednak utrzymanie zwierząt w komorze mikroprzepływowej przez długi czas przy minimalnym negatywnym wpływie na ich dobrostan jest wyzwaniem, które wymaga szczególnej staranności przy projektowaniu urządzenia mikroprzepływowego, a także przy wykonywaniu eksperymentu.
Tutaj demonstrujemy użycie WormSpa, urządzenia mikroprzepływowego do obrazowania podłużnego Caenorhabditis elegans. 5 Pojedyncze robaki są zamknięte w komorach. Stały, niski przepływ zawiesiny płynów i bakterii gwarantuje, że robaki są dobrze odżywione i wystarczająco aktywne, aby utrzymać dobry stan zdrowia i złagodzić stres, a budowa komór umożliwia robakom składanie jaj. Prostota konstrukcji i obsługi WormSpa powinna pozwolić naukowcom bez wcześniejszego doświadczenia w dziedzinie mikrofluidyki na włączenie tego urządzenia do własnych planów badawczych.

<table><tbody><tr><td>WormSpa</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Plik CAD dla WormSpa jest dostępny w laboratorium Levine.</td></tr><tr><td>Mikroskop złożony</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver Z1</td><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny z zmotoryzowanym stolikiem</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-501</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Rurki SCI Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/5</td><td>0,034" (0,86 mm) średnica wewnętrzna x 0,052" (1,32 mm) Końcówka</td></tr><tr><td>strzykawki</td> OD <td>CMLsupply</td><td>901-20-050</td><td>20 Gauge x 1/2 "końcówka canula canula</td></tr> filtr <tr><td>strzykawkowy</td><td>PALL</td><td>4650</td><td>Acrodisc 32 mm Filtr strzykawkowy z membraną 5 um Supor</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Qosina</td><td>C3307</td><td>10 ml męska strzykawka Luer Lock</td></tr><tr><td>3-drogowy</td><td>zawór ColeParmer</td><td>FF-30600-23</td><td>3-drogowy o dużym otworze, męski zamek, kurki, 10 sztuk w opakowaniu, Niesterylny</td></tr><tr><td>kołek ustalający</td><td>McMaster-Carr</td><td>90145A317</td><td>18-8 Kołki ustalające ze stali nierdzewnej (średnica 1/32" x średnica 1/2" dł.)</td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek o niskim poziomie wiązania</td><td>Corning</td><td>CL S3206</td><td>0,65 ml probówka do mikrowirówek z zatrzaskiem o niskim wiązaniu</td></tr></tbody></table>

platforma mikroprzepływowa do obrazowania podłużnego u caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

W ostatniej dekadzie, techniki mikroprzepływowe zostały zastosowane do badania małych zwierząt, w tym nicienia Caenorhabditis elegans, i okazały się użyteczne jako wygodna platforma obrazowania na żywo, zapewniająca możliwość precyzyjnej kontroli warunków eksperymentalnych w czasie rzeczywistym. W tym artykule demonstrujemy obrazowanie na żywo poszczególnych robaków za pomocą WormSpa, wcześniej opublikowanego niestandardowego urządzenia mikroprzepływowego. W urządzeniu wiele robaków jest indywidualnie zamkniętych w oddzielnych komorach, co pozwala na wielokrotny nadzór podłużny nad różnymi procesami biologicznymi. Aby zilustrować tę zdolność, przeprowadziliśmy eksperymenty typu proof-of-principle, w których robaki zostały zakażone w urządzeniu bakteriami chorobotwórczymi, a dynamika ekspresji genów odpowiedzi immunologicznej i składania jaj była stale monitorowana u poszczególnych zwierząt. Prosta konstrukcja i obsługa tego urządzenia sprawiają, że jest ono odpowiednie dla użytkowników, którzy nie mają wcześniejszego doświadczenia z eksperymentami opartymi na mikroprzepływach. Proponujemy, że takie podejście będzie przydatne dla wielu badaczy zainteresowanych obserwacjami podłużnymi procesów biologicznych w dobrze zdefiniowanych warunkach.

Zsynchronizowane wiekowo młode dorosłe nicienie (46 godzin po zatrzymaniu larwalnym w stadium L1 w temperaturze 25 °C)12 zostały umieszczone w urządzeniu zgodnie z opisem w protokole. Nicienie rozmieszczono pojedynczo w osobnych kanałach, co umożliwiło podłużny pomiar reakcji zwierząt na patogen. W przypadku pomyślnego przebiegu eksperymentu większość nicieni pozostaje w swoich kanałach przez cały czas trwania badania. W takiej sytuacji obrazy poszczególnych osobni...

W tym artykule demonstrujemy obrazowanie na żywo poszczególnych robaków za pomocą niestandardowego urządzenia mikroprzepływowego. W urządzeniu wiele robaków jest indywidualnie zamkniętych w oddzielnych komorach, co pozwala na wielokrotny nadzór podłużny nad różnymi procesami biologicznymi.

Platforma mikroprzepływowa do obrazowania podłużnego u Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Ogólnym celem tej procedury jest podłużne zobrazowanie dynamicznych procesów u dorosłych nicieni w kontrolowanych warunkach środowiskowych w celu śledzenia reakcji behawioralnych robaków i kinetyki ekspresji genów robaków. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tego, jak zwierzęta przystosowują się do zmian w swoim środowisku, w tym różnic w podstawowych zachowaniach, ekspresji genów, pamięci i uczeniu się. Technika ta pozwala na multipleksową obserwację podłużną poszczególnych zwierząt w dynamicznie kontrolowanych środowiskach, a także na jednoczesne pobieranie próbek wielu aspektów adaptacji w wysokiej rozdzielczości.Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku ilościowego zrozumienia adaptacji zwierząt, ponieważ pozyskiwanie precyzyjnych danych kinetycznych może ułatwić modelowanie matematyczne oraz formułowanie i testowanie złożonych hipotez. Aby skonfigurować urządzenie do zabiegu, najpierw podłącz końcówkę strzykawki wylotowej do 50-centymetrowego kawałka rurki strzykawki. Aby wykonać igłę adaptera, użyj szczypiec, aby wyciągnąć trzpień igły z piasty igły igły o wymiarach 20 na pół cala i użyj palnika Bunsena, aby usunąć pozostałe pozostałości pl

a-microfluidic-platform-for-longitudinal-imaging-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Niniejszy artykuł opisuje technikę wizualizacji wczesnych etapów embriogenezy u nicienia Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia poklatkowa wczesnego embrionogenezy u Caenorhabditis elegans

Opracowano proste urządzenie mikrofluidyczne do obrazowania in vivo bez użycia środków znieczulających dla C. elegans, nienaruszonych larw Drosophila oraz larw rybek danio. Urządzenie wykorzystuje odkształcalną membranę z PDMS do unieruchomienia tych organizmów modelowych w celu wykonania obrazowania poklatkowego licznych procesów, takich jak bicie serca, podział komórkowy i podkomórkowy transport neuronalny. Prezentujemy zastosowanie tego urządzenia i pokazujemy przykłady różnych typów danych...

Proste urządzenia mikrofluidyczne do in vivo Obrazowanie C. elegans, Muszka owocówka oraz danio pręgowany

Opisano półautomatyczną metodę mikro-elektro-fluidyczną do wywoływania lokomocji na żądanie u Caenorhabditis elegans. Metoda ta opiera się na neurofizjologicznym zjawisku robaków reagujących na łagodne pola elektryczne ("elektrotaksję") wewnątrz kanałów mikroprzepływowych. Elektrotaksja mikroprzepływowa służy jako szybka, czuła, tania i skalowalna technika badań przesiewowych pod kątem czynników wpływających na zdrowie neuronów.

Elektrotaksja oparta na mikroprzepływach do analizy ilościowej na żądanie lokomocji Caenorhabditis elegans

Obrazowanie zachowania i aktywności neuronalnej w długich skalach czasowych bez unieruchomienia zwierzęcia jest warunkiem wstępnym do zrozumienia zachowania. Obrazowanie komór mikroprzepływowych z agarozą (AMI) może być wykorzystywane do obrazowania aktywności i zachowania neuronów na wszystkich etapach życia Caenorhabditis elegans.

Mikrokomory agarozowe do długoterminowego obrazowania wapnia Caenorhabditis elegans

Użycie dostosowanego "chipa węchowego" do efektywnego obrazowania wapnia u samców C. elegans jest opisane tutaj. Pokazano również badania dotyczące narażenia mężczyzn na glicerol i feromon.

Wykorzystanie dostosowanego mikroprzepływowego chipa węchowego do obrazowania aktywności neuronalnej w odpowiedzi na feromony w męskich neuronach głowy C. elegans

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Protokół opisuje prosty mikroprzepływowy układ scalony i metodologię mikroprodukcji używaną do hodowli C. elegans w obecności ciągłego dostarczania pożywienia przez okres do 36 godzin. Urządzenie do wzrostu i obrazowania umożliwia również przerywane, długotrwałe obrazowanie procesów komórkowych i subkomórkowych w wysokiej rozdzielczości podczas rozwoju przez kilka dni.

Prosty chip mikroprzepływowy do długoterminowego wzrostu i obrazowania Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w celu śledzenia parametrów fizjologicznych przez całe życie i kwantyfikacji fluorescencji. Ten system hodowli obejmuje barierę kwasu palmitynowego wokół studni z pojedynczymi robakami, aby zapobiec ucieczce zwierząt, umożliwiając stosowanie interwencji awersyjnych, w tym bakterii chorobotwórczych i chemicznych czynników stresogennych.

Długotrwała hodowla poszczególnych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych do długotrwałego monitorowania fluorescencji i interwencji awersyjnych

Ten protokół opisuje obrazowanie poklatkowe C. elegans oparte na mikroprzepływach w całym rozwoju postembrionalnym.

Obrazowanie C. elegans w wysokiej rozdzielczości we wszystkich stadiach larwalnych

Poznaj platformę mikroprzepływową do obrazowania podłużnego u Caenorhabditis elegans. Ta technika umożliwia śledzenie zachowań i ekspresji genów w czasie rzeczywistym.

Platforma mikroprzepływowa do obrazowania podłużnego u Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów