Optogenetyczne porywanie oscylacji theta hipokampa u zachowujących się myszy

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurofizjologii, takie jak przyczynowa rola oscylacji theta w specjalnej nawigacji i związanych z nią zachowaniach. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia kontrolę w czasie rzeczywistym nad częstotliwością i regularnością oscylacji theta hipokampa u zachowujących się myszy. Procedurę zademonstruje dr Franziska Bender, była studentka w moim laboratorium.

Zacznij od w pełni znieczulonej myszy zabezpieczonej w ramce stereotaktycznej. Wywierć otwór nad przegrodą przyśrodkową. Zanurz końcówkę igły iniekcyjnej w kropli wirusa na kawałku folii parafinowej i ostrożnie wciągnij wirusa w ilości około 500 nanolitrów na minutę, obserwując poziom płynu.

Aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do igły iniekcyjnej, należy przerwać pobieranie pokarmu, zanim wirus zostanie całkowicie wchłonięty. Oczyść igłę chusteczką papierową. Sprawdź, czy wirus i olej są oddzielone pęcherzykiem powietrza i zaznacz poziom wirusa na probówce.

Umieść igłę nad kraniotomią i powoli wprowadź ją do mózgu w pierwszym miejscu wstrzyknięcia. Wstrzyknij 450 nanolitrów wirusa z szybkością od 100 do 150 nanolitrów na minutę. Po wstrzyknięciu należy odczekać 10 minut.

Po 10 minutach ostrożnie przesuń igłę w górę o 0,1 milimetra i odczekaj kolejne pięć minut. Użyj mikro ściągacza izolacji, aby usunąć 125 mikrometrów okładziny ze światłowodu wielomodowego, podczas gdy włókno jest nadal przymocowane do szpuli światłowodu. Następnie za pomocą noża diamentowego przyciąć włókno na długość około dwóch do trzech centymetrów.

Włóż światłowód do ceramicznej skuwki w sztyfcie z tlenku cyrkonu o średnicy wewnętrznej 126 mikronów. Około 0,5 do jednego milimetra włókna powinno wystawać z wypukłej strony skuwki. Za pomocą igły nałóż jedną kroplę kleju epoksydowego na oba końce skuwki, ale nie na boki skuwki.

Po wyschnięciu użyj diamentowej folii polerskiej z włókna docierającego o ziarnistości trzech mikronów, aby wypolerować wypukłą stronę skuwki. Aby przygotować układ drutu wolframowego, najpierw przyklej kilka prowadnic rurki krzemionkowej o grubości 100 mikronów do lepkiej strony kawałka taśmy. Następnie za pomocą kleszczy przewlecz przez rurki prowadzące druty wolframowe o grubości 45 mikronów w izolacji.

Następnie za pomocą skalpela zdejmij izolację z obu końców sześciu izolowanych emalią cienkich miedzianych drutów wiążących o długości około pięciu milimetrów. Następnie zdejmij izolację z obu końców przewodu uziemiającego o długości około dwóch do trzech centymetrów. każdy odizolowany przewód do pinów nanozłącza.

Podłącz każdy drut łączący do jednego drutu wolframowego za pomocą jednej kropli srebrnej farby przewodzącej. Po wyschnięciu nałóż niewielką ilość cementu, aby przykryć druty miedziane. Unikaj nakładania cementu na górną część nanołącznika.

Po pozostawieniu cementu do wyschnięcia przez co najmniej 30 minut, użyj nożyczek ze stali nierdzewnej, aby przeciąć druty wolframowe pod kątem od pięciu do 20 stopni. Zacznij od wywiercenia czterech otworów o średnicy 0,8 mm w czystej czaszce znieczulonego zwierzęcia. Wywierć dwa otwory rostralne do szwu koronalnego i dwa nad móżdżkiem.

Następnie należy umieścić kostne ze stali nierdzewnej do uziemienia i stabilizacji implantu. Umieść uziemiającą podłączoną do drutu miedzianego nad móżdżkiem. Całkowicie przykryj uziemiającą cementem, aby zapobiec artefaktom mięśniowym podczas zapisów elektrofizjologicznych.

Zbuduj pierścień mebliżacyjny łączący wszystkie. Wykonaj kraniotomię powyżej miejsca implantacji, a następnie nałóż około jednego mikrolitra sterylnej soli fizjologicznej na powierzchnię tkanki mózgowej. Użyj stereotax, aby powoli opuścić układ drutów do kraniotomii.

Następnie nałóż około pięciu mikrolitrów ciepłego płynnego wosku nad miejscem implantacji, aby chronić tkankę mózgową. Nałóż cement wokół siatki drucianej i przykryj czaszkę cementem. Nałóż jedną kroplę topnika na wstępnie przylutowany przewód uziemiający lub wstępnie przylutowany przewód podłączony do uziemiającej i połącz przewody za pomocą lutownicy.

Na koniec przykryj cały drut uziemiający cementem. Sprawdź moc światła z krosowego. Jeśli szybkość transmisji wszczepionego włókna wynosiła 50%, upewnij się, że strumień świetlny na końcówce krosowego wynosi 20 miliwatów.

Podłącz przedwzmacniacz stopnia głównego do wszczepionego złącza i podłącz patchcord światłowodowy do wszczepionego włókna hipokampa w celu stymulacji optogenetycznej. Rejestruj zachowanie linii bazowej przez czas odpowiedni dla mierzonych parametrów. Otwórz oprogramowanie, aby sterować generatorem bodźców.

Kliknij plik, otwórz i wybierz plik protokołu. Kliknij pobierz i rozpocznij, aby zainicjować stymulację świetlną. Obserwuj kontrolę rytmu theta za pomocą impulsów świetlnych.

Widoczny jest tutaj potencjał pola lokalnego hipokampa podczas spontanicznych oscylacji theta. Zwróć uwagę na obwiedni gamma, wskaźnik fizjologicznego rytmu theta. Widoczny jest tutaj potencjał pola lokalnego hipokampa na poziomie siedmiu Hz podczas porywania optogenetycznego.

Niebieskie paski wskazują okna czasowe aplikacji światła. Zwróć uwagę na resetowanie fazy przez impuls świetlny wskazywany tutaj strzałką. Potencjał lokalnego pola hipokampa przy 10 hercach odzwierciedla porywanie optogenetyczne.

Należy zauważyć, że obwiedni gamma z synchronizacją fazową i odwrócenie fazy między stratham orian a stratum radiatum jest również utrzymywane podczas porywania. Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu czterech godzin eksperymentu plus sześć tygodni w przypadku ekspresji wirusa. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o zapewnieniu skutecznej transdukcji wirusa.

Prawidłowo podłącz implant światłowodowy do patchcordu i uzyskaj dobrą jakość spontanicznych oscylacji theta potencjału pola lokalnego.