Śledzenie zachowań larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację neuronów węchowych
21 marca 2018
Ten protokół analizuje zachowanie nawigacyjne larwy Drosophila w odpowiedzi na jednoczesną optogenetyczną stymulację jej neuronów węchowych. Światło o długości fali 630 nm służy do aktywacji pojedynczych neuronów węchowych wyrażających rodopsynę z przesuniętym ku czerwieni kanałem. Ruch larw jest jednocześnie śledzony, rejestrowany cyfrowo i analizowany za pomocą specjalnie napisanego oprogramowania.
Ogólnym celem tej metodologii jest analiza zachowań nawigacyjnych larw drosophila w odpowiedzi na jednoczesną stymulację optogenetyczną jej neuronów węchowych. Metoda ta umożliwia kompleksową analizę funkcji obwodów węchowych i uzupełnia badania nad tym, jak funkcja obwodu węchowego przekłada się na reakcję behawioralną. Główną zaletą tej techniki jest jej specyfika i kontrola czasowa poprzez wykorzystanie światła zamiast tradycyjnych gradientów zapachowych do aktywacji poszczególnych neuronów węchowych.
Aby rozpocząć eksperyment, zbuduj arenę zachowań pozbawionych światła. Zbuduj pudełko o wymiarach 89 na 61 na 66 centymetrów, wykonane z czarnych arkuszy akrylowych z pleksi o grubości trzech milimetrów. Umieść pudełko na blacie w pokoju zachowań.
Następnie zamontuj monochromatyczną kamerę CCD USB 3.0 wyposażoną w filtr IR Longpass 830 nanometrów i ośmiomilimetrowy obiektyw z mocowaniem F1.4 C na środku sufitu czarnej skrzynki. Umieść dwa paski LED na podczerwień na blacie, aby oświetlić larwy na ciemnej arenie. Następnie zdobądź kwadratową płytę aluminiową o wymiarach 22 cm na 22 centymetry, aby zbudować platformę LED.
Na środku płyty użyj metalowego noża, aby wyciąć otwór, który jest wystarczająco duży, aby zmieścił się wokół kamery CCD. Przykryj metalową płytkę czerwonymi taśmami LED. przewody taśmy świetlnej LED szeregowo i wprowadź przewody taśmy do przekaźnika transoptora sterowanego mikroprocesorem Raspberry Pi 2B.
Następnie zamontuj platformę LED wokół kamery CCD. Następnie zainstaluj i skonfiguruj system operacyjny Ubuntu MATE oparty na Raspbian Jessie Linux na procesorze Raspberry Pi przed podłączeniem przekaźnika transoptora do taśm LED. Podłącz zasilacz do zasilania taśm LED i transoptora.
Upewnij się, że w różnych punktach wokół kamery CCD na arenie zachowania występuje jednorodne natężenie promieniowania. Za pomocą spektrometru należy ustalić bezwzględne natężenie promieniowania na powierzchni areny i określić je na około 1,3 wata na metr kwadratowy na całej powierzchni areny. Utrzymuj muchy na standardowym pokarmie dla much w temperaturze 25 stopni Celsjusza, wilgotności względnej od 50 do 60% w 12-godzinnym, 12-godzinnym cyklu światła/ciemności.
Aby uzyskać ekspresję CsChrimson w jednej parze ORN, skrzyżuj dziewicze samice z linii UAS-IVS-CsChrimson z samcami z linii ORX-GAL4. Po tym, jak samce i samice much w krzyżówce zostaną dopuszczone do łączenia się w pary i składania jaj przez 48 godzin, przenieś dorosłe osobniki do świeżej fiolki. Na powierzchnię fiolki z żywnością zawierającą jaja dodać 400 mikrolitrów mieszaniny zawierającej 400 mikromolowych all-trans-retinalu lub ATR, rozpuszczonych w dimetylosulfotlenku lub DMSO w 89-milimolowej sacharozie rozpuszczonej w wodzie destylowanej.
Po dodaniu ATR do fiolek z pokarmem zawierających jaja, należy inkubować fiolki w ciemności przez dodatkowe 72 godziny. Po inkubacji wyekstrahuj larwy trzeciego stadium rozwojowego z powierzchni pokarmu much, unosząc je na wodzie za pomocą 15% roztworu sacharozy o dużej gęstości. Za pomocą mikropipety P1000 oddziel larwy unoszące się na powierzchni roztworu sacharozy do szklanej zlewki o pojemności 1 000 mililitrów.
Umyj larwy cztery razy, za każdym razem wymieniając 800 mililitrów świeżej wody destylowanej w szklanej zlewce. Po ostatnim umyciu pozwól larwom odpocząć przez 10 minut przed poddaniem ich testowi zachowania. W przypadku testu zachowania utrzymuj stałą temperaturę i wilgotność w pomieszczeniu behawioralnym.
Przygotuj pożywkę dla larw, wlewając 150 mililitrów stopionej 1,5% agarozy na kwadratową szalkę Petriego o wymiarach 22 cm na 22 centymetry. Pozwól agarozie zestalić się i ostygnąć przez jedną do dwóch godzin na szalkach Petriego przed użyciem ich w teście zachowania. Po zestaleniu się agarozy przenieś nie więcej niż 20 przygotowanych larw trzeciego stadium rozwojowego na środek szalki Petriego i przykryj szalkę Petriego pokrywką.
Umieść szalkę Petriego na arenie zachowania pod kamerą CCD. Włącz źródło światła podczerwonego LED o długości fali podczerwonej 850 nanometrów, aby wyświetlić larwy na filmie. Uruchom kamerę CCD, aby zarejestrować ruch larw.
Na koniec przejdź do przetwarzania i analizy danych. Gdy ORN 7a wykazujący ekspresję CsChrimson był stymulowany przez światło, nastąpił znaczny spadek długości serii w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. I odwrotnie, gdy ORN 42a wykazujący ekspresję CsChrimson był stymulowany przez światło, nastąpił znaczny wzrost długości serii w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi.
Odkryliśmy, że w przypadku ORN 42a różne czasowe wzorce stymulacji świetlnej wywoływały różne reakcje behawioralne. Chociaż zademonstrowaliśmy tę metodę dla neuronów receptorów węchowych pierwszego rzędu, nasza metoda pozwala również na wiele przyszłych zastosowań, takich jak pomiar wpływu neuronów znajdujących się w dole, takich jak neurony projekcyjne i neurony lokalne, na zachowanie larw. Spodziewamy się, że ta technika utoruje drogę do kompleksowej analizy funkcji obwodu węchowego larw.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół analizuje zachowanie nawigacyjne larwy Drosophila w odpowiedzi na jednoczesną stymulację optogenetyczną jej neuronów węchowych. Wykorzystuje on światło o długości fali 630 nm do aktywacji specyficznych neuronów węchowych wykazujących ekspresję przesuniętego w czerwień kanału rhodopsyny, co umożliwia szczegółowe badania funkcji obwodów węchowych oraz reakcji behawioralnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka behawioralna
- Optogenetyka
- Genetyka Drosophila
Wstęp
- Ta metodologia pozwala na badanie korelacji między funkcjonowaniem obwodów węchowych a odpowiedziami behawioralnymi.
- Umożliwia ona kontrolę czasową aktywacji z wykorzystaniem światła zamiast tradycyjnych gradientów zapachowych.
- Podejście to ułatwia analizę specyficznych neuronów w systemie węchowym Drosophila.
Cel badania
- Aby precyzyjnie przeanalizować funkcję obwodów węchowych.
- Aby zaobserwować reakcje behawioralne larw na celowaną stymulację neuronalną.
- Aby dostarczyć informacji na temat tego, jak poszczególne neurony węchowe wpływają na wybory nawigacyjne.
Zastosowane metody
- W badaniu wykorzystano specjalnie zaprojektowaną arenę behawioralną do analizy ruchu larw.
- Larwy Drosophila wykazujące ekspresję CsChrimson w neuronach receptorowych węchu (ORNs) były stymulowane światłem.
- Test behawioralny obejmuje przygotowanie agarowego podłoża do pełzania oraz rejestrację wideo ruchów larw.
- Kluczowe etapy obejmują konstrukcję areny, montaż sprzętu oraz przygotowanie larw w określonych warunkach.
Główne wyniki
- Stymulacja świetlna specyficznych neuronów receptorowych węchu prowadziła do istotnych różnic w długości przebiegu larw, co wskazuje na odmienne reakcje behawioralne.
- Różne wzorce czasowe stymulacji wywoływały zróżnicowany wpływ na zachowanie nawigacyjne.
- Metoda ta może ułatwić przyszłą eksplorację oddziaływań neuronów w dalszych etapach szlaku na zachowanie larw.
Wnioski
- Badanie to obrazuje nowatorskie podejście do analizy obwodów węchowych i ich implikacji behawioralnych.
- Pozwala ono badaczom na badanie specyficznych ról wybranych neuronów w kontekście żywego organizmu.
- Odkrycia te pogłębiają naszą wiedzę na temat mechanizmów neuronalnych w przetwarzaniu sensorycznym i zachowaniu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Metoda ta umożliwia precyzyjną analizę funkcji obwodów węchowych poprzez zastąpienie bodźców zapachowych kontrolą optogenetyczną, rozwiązując kluczowy problem walidacji celu, w którym odczyty behawioralne muszą być powiązane z konkretną aktywnością neuronalną. Wspiera ona ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania poprzez izolację wkładu poszczególnych neuronów receptorowych węchu w zachowanie nawigacyjne, co zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celu. Podejście to poprawia ciągłość translacyjną od celu molekularnego do fenotypu na poziomie obwodu, co jest istotne dla ograniczania ryzyka w programach odkrywania koncentrujących się na neuronauce.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez powiązanie aktywacji konkretnych neuronów węchowych z określonymi reakcjami behawioralnymi.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny system funkcjonalnej walidacji celów neuronalnych z wykorzystaniem stymulacji światłem.
- Wartość naukowa: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez izolowaną manipulację poszczególnymi ORN w celu wyjaśnienia ich roli w zachowaniu nawigacyjnym larw.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe odczyty behawioralne (np. zmiany długości przebiegu), które umożliwiają standaryzowaną ocenę efektów modulacji neuronalnej.
- Wartość operacyjna: Tworzy skalowalną platformę analityczną do przesiewania genetycznych lub farmakologicznych modulatorów funkcji obwodów węchowych.
- Wartość naukowa: Ułatwia standaryzację analizy poprzez eliminację lotności odorantów i zmienności ich dostarczania dzięki stymulacji optogenetycznej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie systemów istotnych dla chorób, umożliwiając analizę przekładania bodźców sensorycznych na zachowanie u organizmu podatnego na modyfikacje genetyczne.
- Wartość operacyjna: Zapewnia kompatybilny z badaniami przedklinicznymi schemat pracy do oceny wpływu celów neuronalnych na zachowanie przed walidacją na ssakach.
- Wartość naukowa: Umożliwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie, w jaki sposób aktywność neuronalna w górę strumienia przekłada się na fenotypy behawioralne w dół strumienia.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, wspierając walidację celu poprzez fenotypowanie behawioralne oraz dostarczając informacji pomocnych w identyfikacji związku wiodącego poprzez precyzyjne określenie celów neuronalnych odpowiedzialnych za mierzalne wyniki.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących funkcji pojedynczych neuronów węchowych w sterowaniu zachowaniem nawigacyjnym larw.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych mierników behawioralnych (długość biegu), odpowiednich do oceny związków chemicznych lub modulatorów genetycznych.
- Analityka: Zapewnia możliwe do śledzenia wyniki behawioralne oraz porównania statystyczne między warunkami stymulowanymi a kontrolnymi.
- Badania translacyjne: Łączy aktywność obwodów neuronalnych z odpowiedziami behawioralnymi, wspierając ekstrapolację do modeli wyższego rzędu.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do systematycznego badania celów neuronalnych w obwodach węchowych i innych obwodach sensorycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez zmniejszenie niejednoznaczności w wiązaniu aktywacji neuronalnej z efektami behawioralnymi.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację dzięki zastosowaniu kontroli optogenetycznej zamiast zmiennych bodźców zapachowych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje typu go/no-go, zapewniając wyraźniejsze powiązania mechanistyczne między celami a fenotypami behawioralnymi.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie zwalidowanego wpływu behawioralnego w systemie istotnym dla procesu odkrywania leków.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga doświadczenia w zakresie genetyki Drosophila, optogenetyki oraz projektowania testów behawioralnych.
- Zależność od specjalistycznej aparatury, w tym areny behawioralnej, oświetlenia IR, kamery CCD oraz sterownika stymulacji opartego na Raspberry Pi.
- Konieczność standaryzacji międzyzespołowej w zakresie przygotowania larw, sporządzania podłoża agarowego oraz protokołów śledzenia wideo.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji przy rozszerzeniu metody na inne typy neuronów (np. neurony projekcyjne, neurony lokalne) lub inne stadia rozwojowe.
- Ograniczone przez konieczność zapewnienia dostępności genetycznej i karmienia retinalnego w systemie modelowym, co może ograniczać skalowalność do systemów innych niż Drosophila.
