Name: Konstruowanie peptydów helisowych na uwięzi tioeteru/siarczku winylu za pomocą fotoindukowanej hydrotiolacji tiolu-enu / yny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Poznaj metodę syntezy cyklicznych peptydów z uwięzią tioeterową przy użyciu fotoindukowanej hydrotiolacji tiolu-enu/yny. Technika ta oferuje wysoką wydajność i rozszerza przestrzeń chemiczną stabilnych peptydów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe ze strony Grantów Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 21372023, 21778009 i 81701818); Ministerstwa Nauki i Technologii Chińskiej Republiki Ludowej (nr 2015DFA31590); Komitetu ds. Innowacji Naukowych i Technologicznych w Shenzhen (nr 2015 DFA31590); JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 i GJHS20170310093122365); oraz Chińska Fundacja Nauk Podoktoranckich (nr 2017M610704).

1. Przygotowanie sprzętu
<ol>
	<li>W przypadku ręcznego aparatu do syntezy peptydów należy umieścić kolektor próżniowy (tabela materiałów) w wydajnym dygestorium. Następnie umieść trójdrogowe kurki na kolektorze próżniowym i podłącz je do przewodu gazowego azotu lub argonu. Zakryj wszystkie niewykorzystane wloty gumowymi przegrodami.</li>
	<li>Podłącz kolumny wypełnione żywicą (zbiornik 0,8 x 4 cm, 10 ml, patrz tabela materiałów) do kolektora za pomocą trójdrogowych kurków (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Użyj pompy podłączonej do systemu próżniowego jako filtracji próżniowej lub gumowej gruszki do pipet przez wytłaczanie w celu usunięcia rozpuszczalnika z kolumn.</li>
	<li>Użyj fotoreaktora (<silna klasa="xfig">Rysunek 2), wyposażonego w dziesięć lamp 350 nm (Tabela materiałów) do naświetlania promieniowaniem UV. Podłącz je do zbiornika argonu przez wlot powietrza do fotoreaktora, aby upewnić się, że fotoreaktor jest napełniony argonem przed i podczas fotoreakcji.</li>
	<li>Przed włączeniem lampy UV fotoreaktora należy upewnić się, że drzwiczki fotoreaktora są zamknięte na wypadek napromieniowania światłem UV.</li>
</ol>
2. Przygotowanie żywicy
UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, budowa substratów peptydowych odbywa się przy użyciu protokołów syntezy peptydów w fazie stałej opartych na Fmoc. Przeprowadza się je przy użyciu żywicy amidowej lodowiska, która pozostawia C-końcowy amid pozostały po rozszczepieniu peptydu. Protokół ten jest używany w całym artykule.
UWAGA: N,N-dimetyloformamid (DMF), dichlorometan (DCM), 4-metylomorfolina (NMM) i N,N-diizoproiloetyloamina (DIPEA) są toksyczne i szkodliwe przez wdychanie, spożycie lub kontakt ze skórą. Eter dietylowy jest wysoce łatwopalny. Kwas trifluorooctowy (TFA) jest. 1,2-etanedhiol (EDT) jest silnie cuchnący. Dlatego ze wszystkimi rozpuszczalnikami organicznymi i chemikaliami należy obchodzić się przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (rękawice nitrylowe, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne) oraz w osłonie przeciwchemicznej.
<ol>
	<li>Oblicz wymaganą ilość żywicy, korzystając z następującego wzoru: 
	Skala (mmol) / (Pojemność żywicy (mmol/g) 1,000 (mg/g)) = Masa żywicy (mg) 
	Np. ilość żywicy MBHA amidowej na lodowisku (0,5 mmol/g) na 25 μmol = 0,025 mmol / (0,5 mmol/g 1,000 mg/g) = 50 mg. Następnie zważ 50 mg żywicy w kolumnie i umieść ją na kolektorze próżniowym za pomocą trójdrogowych kurków.</li>
	<li>Dodaj 1 - 2 ml DCM do żywicy w kolumnie (0,8 x 4 cm, zbiornik 10 ml). Aby spęcznić żywicę, delikatnie mieszaj ją strumieniem azotu lub argonu przez 10 minut. Następnie usuń rozpuszczalnik za pomocą filtracji próżniowej.</li>
</ol>
3. N-terminal Fmoc Deprotection and Washing
<ol>
	<li>Przygotować N-końcowy roztwór odprobierający Fmoc: przygotować odpowiednią objętość (200 ml) 50% (v/v) morfoliny w DMF w szklanej butelce.</li>
	<li>Do żywicy dodać 1 - 2 ml roztworu odbezpieczającego, delikatnie mieszać przez 10 minut, a następnie odcedzić roztwór za pomocą próżni. Używając DMF (1 - 2 ml) i DCM (1 - 2 ml) w tej kolejności, dokładnie umyj żywicę i naczynie reakcyjne, w sumie 3 razy. Następnie powtórz procedury deprotekcji i prania 1x.</li>
</ol>
4. Sprzęgło aminokwasów chronione przez Fmoc
<ol>
	<li>Na przykładzie sprzężenia reszty alaniny, w przypadku ręcznej syntezy w skali 25 μmol, zważyć Fmoc-Ala-OH (5 odpowiednik, 41,4 mg), 2-(6-chloro-1H-benzotriazolo-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametyloaminofosforan heksafluorofosforanu (HCTU; odpowiednik 4,9, 50,5 mg) w pojemniku polipropylenowym i rozpuścić go w DMF (0,5 ml).</li>
	<li>Dodać DIPEA (odpowiednik 10, 43,5 μl) w celu wytworzenia 0,25-M aktywowanego roztworu aminokwasów (Tabela 1). Po około 1 minutowej wstępnej aktywacji dodaj roztwór do żywicy, a następnie bąbelkuj go zN2 przez około 1 - 2 godziny.</li>
	<li>Począwszy od tego kroku, włącz każdy aminokwas w łańcuchu peptydowym jako sekwencję kroków: najpierw deprotekcja N-końcowej grupy Fmoc, a następnie mycie, a następnie sprzężenie aminokwasu poprzez aktywację za pomocą HCTU. 
	UWAGA: Dłuższy czas sprzęgania (np. 2 h) jest zalecany, jeśli sprzężenie następuje po sterycznie utrudnionej resztie aminokwasowej [np. Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH]. Alkeny/alkony zawierające nienaturalne aminokwasy są używane w 3 odpowiednikach zamiast 5 i pozostawia się je do reakcji na 3 godziny.</li>
	<li>Monitoruj postęp syntezy peptydów za pomocą testów Kaisera lub chloranilu, jak opisano przez Arora i wsp.36 Te testy dostarczają jakościowych ocen obecności lub braku wolnych amin pierwszorzędowych i drugorzędowych. Alternatywnie, około 2 - 3 mg peptydu można odłupać od żywicy i przeanalizować za pomocą LC-MS.</li>
</ol>
5. Hydrotiolacja tiolu i cyklizacja tiol-yny
<ol>
	<li>Zbuduj łącznik tioeterowy poprzez cyklizację na żywicy (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).
	<ol>
		<li>Przygotować około 50 ml roztworu odbezpieczającego Trt (TFA/TIS/DCM 0,03/0,06/1,0). Potraktuj żywicę 5-łożyskową Cys i mS [żywica NH2-R-mS 5-A-A-A-Cys(Trt)-R'-, 50 mg] 1 - 2 ml roztworu odbezpieczającego Trt w kolumnie o pojemności 10 ml. Delikatnie mieszać roztwór przez 10 minut za pomocą N2. Na koniec umyj go DCM (1 -2 ml), aby uzyskać łącznie 3x, 
		UWAGA: MS5 reprezentuje blok budulcowy zawierający alkilen (patrz struktura przedstawiona na <silna klasa="xfig">Rysunek 6) używany do sprzęgania peptydów i cyklizacji tioenów<klasa sup="xref">38.</li>
		<li>Powtórz procedurę opisaną powyżej, w sumie około 6 razy w celu usunięcia trytylowej grupy ochronnej cysteiny, aż kolor roztworu przestanie być żółty.</li>
		<li>Bąbelkowaną N2 przemyć żywicę R-mS 5-A-A-A-Cys(-SH)-R'-[cysteina z wolnym tio(-SH)] DMF (1 - 2 ml) i DCM (1 - 2 ml) w tej kolejności. Żywicę należy obkurczać za pomocą metanolu (1 - 2 ml) przez 2 minuty, a następnie usunąć rozpuszczalnik za pomocą filtracji. Następnie kolejno suszyć żywicę pod parą gazu N2 przez około 5 minut w kolumnie.</li>
		<li>Przygotować wcześniej odgazowany DMF w kolbie ustnej, bulgocząc azot przez około 1 godzinę przez długą igłę, która została rozciągnięta w rozpuszczalniku.</li>
		<li>Przenieść żywicę do kolby okrągłodennej o pojemności 10 ml przez papier do ważenia. Zawiesić żywicę w 2 ml odgazowanego DMF, a następnie dodać fotoinicjator 2-hydroksy-1-[4-(2-hydroksyetoksy)-fenylo]-2-metylo-1-propanon (MMP; 1 odpowiednik, 5,6 mg), 4-metoksyacetofenon (MAP; 1 odpowiednik, 3,8 mg).</li>
		<li>Dodać mieszadło (0,3 cm) do kolby i przykryć kolbę odpowiednią gumową zatyczką, a następnie wyprzeć powietrze z kolby z azotem gazowym za pomocą pompy olejowej. 
		UWAGA: Atmosfera obojętna nie jest ściśle wymagana do efektywnej fotoreakcji tioenu w fazie stałej. Jest to jednak bardzo potrzebne do fotoreakcji tio-yny w fazie roztworu w <silna klasa="xfig">Rysunek 5. W przeciwnym razie siarka utleni się podczas naświetlania promieniami UV.</li>
		<li>Umieścić kolbę reakcyjną w fotoreaktorze i mieszać żywicę przez 1 godzinę pod wpływem promieniowania UV w temperaturze pokojowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2). 
		UWAGA: Przed włączeniem fotoreaktora UV lamp upewnij się, że drzwi fotoreaktora są zamknięte na wypadek szkodliwego napromieniowania światłem UV. 
		UWAGA: W przypadku nowych sekwencji zaleca się częste pobieranie próbek mieszaniny reakcyjnej podczas fotoreakcji, ponieważ liniowy prekursor peptydowy ma identyczną masę cząsteczkową produktu. Ogólnie rzecz biorąc, peptydy liniowe i cykliczne wykazują znacznie różną hydrofilowość. Można to łatwo odróżnić za pomocą HPLC. Alternatywnie, odczynnik 5,5'-ditiobis-(kwas 2-nitrobenzoesowy) (DTNB) może być również użyty do badania obecności wolnego tiolu37.</li>
		<li>Przenieść żywicę z kolby do kolumny i usunąć rozpuszczalnik za pomocą filtracji próżniowej. Umyj i wysusz żywicę zgodnie z opisem w kroku 5.1.3.</li>
		<li>Przygotuj około 10 ml koktajlu rozszczepienia (TFA/TIPS/EDT/H2O 94/1/2,5/2,5) w dygestorium.</li>
		<li>Przenieś żywicę do 2-mililitrowego pojemnika polipropylenowego, dodaj 1 ml koktajlu rozszczepiającego (TFA/TIPS/EDT/H2O 94/1/2,5/2,5) do pojemnika i szczelnie zamknij pojemnik za pomocą zakrętki. Następnie delikatnie wymieszać pojemnik na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 60 obr./min w dygestoriach przez 1,5 - 2 godz. 
		UWAGA: TFA jest silnie. Nosić odzież ochronną i pracować w wydajnym dygestorium. EDT jest substancją o silnym cuchre, która musi być obsługiwana w wydajnym dygestorium.</li>
		<li>Usunąć koktajl TFA przez odparowanie pod strumieniem gazuN2 w dygestorium. Następnie wytrącić pozostałość za pomocą zimnego eteru dietylowego (1 ml) przez 30 s i wyizolować ją przez odwirowanie przy 12 000 x g przez 2 minuty. Po odwirowaniu delikatnie wylej składnik eterowy. Powtórz etapy wytrącania i wirowania 2x. Odparować pozostałość do sucha.</li>
		<li>Na koniec rozpuścić pozostałość w 1 ml H2O/acetonitrylu (2:1) i oczyścić za pomocą HPLC przy użyciu kolumny analitycznej C18 (4,6 x 250 mm, natężenie przepływu 1,0 ml/min). StosowaćH2O(zawierający 0,1% TFA) i czysty acetonitryl jako rozpuszczalniki w gradieniu liniowym 2%/min od 20% do 70% acetonitrylu przez 25 min. Monitoruj widma HPLC przy użyciu długości fal UV 280 nm i 220 nm (tabela 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonstruuj łącznik tioeterowy poprzez międzycząsteczkową reakcję tioenową, a następnie cyklizuj peptyd przez makrolaktamizację (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4).
	<ol>
		<li>Zsyntetyzować resztę alkilenu zawierającą liniowy peptydH2N-A-A-A-mS5(2-R'')-R'--żywicę (50 mg) przy użyciu standardowej syntezy peptydów w fazie stałej (SPPS) na bazie Fmoc, jak opisano w krokach 2 - 4. Następnie umyj i wysusz żywicę zgodnie z opisem w kroku 5.1.3.</li>
		<li>Zawiesić żywicę w 10-mililitrowej kolbie okrągłodennej zawierającej 2 ml odgazowanego DMF, jak opisano w kroku 5.1.4.</li>
		<li>Dodać fotoinicjator MMP i MAP (MMP: 1 odpowiednik, 5,6 mg; MAP: 1 ekwiwalent, 3,8 mg), Fmoc-Cys-OH (3 odpowiedniki, 25,7 mg) i mieszadło (0,3 cm) do kolby. Zakryj kolbę odpowiednią gumową zatyczką, a następnie użyj pompy olejowej, aby zastąpić powietrze w kolbie azotem.</li>
		<li>Umieścić kolbę reakcyjną w fotoreaktorze. Mieszaj przez 1 - 2 godziny pod wpływem promieniowania UV w temperaturze pokojowej (<klasa silna="xfig">Rysunek 2).</li>
		<li>Monitoruj reakcję pod analizą LC-MS: rozszczepić 2 - 3 mg żywicy za pomocą koktajlu łupliwego. Następnie wytrącić pozostałość zimnym eterem dietylowym (300 μl), wyizolować pozostałość przez odwirowanie i odparować pozostałość do sucha, jak opisano w kroku 5.1.11. Następnie rozpuścić pozostałość w 100 μlH2O/acetonitrylu (2:1). Przefiltrować roztwór peptydu za pomocą mikroporowatej warstwy 0,22 μm i przeanalizować go za pomocą LC-MS ze związkiem zjonizowanym w jonizacji elektrorozpylającej (ESI) i działającym w trybie dodatnim.</li>
		<li>W razie potrzeby powtórzyć kroki 5.2.2 - 5.2.4, aby upewnić się, że reakcja została przeprowadzona do końca.</li>
		<li>Po zakończeniu reakcji fotoaktywnej przenieść żywicę z kolby do kolumny i usunąć rozpuszczalnik za pomocą filtracji próżniowej. Umyj i wysusz żywicę zgodnie z opisem w kroku 5.1.3.</li>
		<li>Dodać roztwór DMF heksafluorofosforanu benzotriazole-1-y-ylo-oksytrolidinofosfonium (PyBob; odpowiednik 2,4, 31,2 mg), 1-hydroksybenzotriazolu (HoBt; odpowiednik 2,4, 8,1 mg) i NMM (4 równoważnik, 11 μl) do żywicy w kolumnie do makrolaktamizacji. Bąbelkować ten roztwór z N2 przez 2 godziny.
		<ol>
			<li>Ponadto należy monitorować tę reakcję sprzęgania za pomocą LC-MS, jak opisano w kroku 5.2.3. W razie potrzeby powtórz ten krok, aby upewnić się, że reakcja została przeprowadzona do końca.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wydłuż peptyd za pomocą standardowego SPPS na bazie Fmoc, jak opisano w krokach 3 i 4.</li>
		<li>Po zebraniu wszystkich reszt aminokwasowych należy odciąć peptyd od żywicy zgodnie z opisem w krokach 5.1.10 i 5.1.11 i oczyścić go zgodnie z opisem w kroku 5.1.12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonstruuj łącznik siarczku winylu w fazie roztworu (<silna klasa="xfig">Rysunek 5).
	<ol>
		<li>Zsyntetyzuj liniowy peptyd zawierający resztę alkinów przy użyciu standardowego SPPS na bazie Fmoc, jak opisano w krokach 2 - 4. Zsyntetyzuj aminokwas zawierający alkin zgodnie z dobrze ustalonym protokołem, jak opisano w poprzednim badaniu20.</li>
		<li>Rozszczepić peptyd z żywicy i wytrącić go za pomocą zimnego eteru dietylowego, jak opisano w krokach 5.1.9 - 5.1.11. Po rozszczepieniu i wytrąceniu żywicy, zebrać peptyd za pomocą wirowania przy 12 000 x g przez 2 minuty.</li>
		<li>Wysuszyć powstałą pozostałość w próżni. Rozpuścić pozostałość w odgazowanym DMF (50 ml) w kolbie okrągłodennej o pojemności 100 ml w celu osiągnięcia końcowego stężenia 0,5 mM (w oparciu o obciążenie żywicy, 0,025 mmol (1000 mL/L / 0,5 mmol/L) = 50 ml).
		<ol>
			<li>Dodać fotoinicjator DMPA (odpowiednik 0,5, 3,2 mg), a następnie odgazowywać roztwór reakcyjny przez 10 minut za pomocą N2 przez długą igłę rozciągniętą w roztworze. Następnie naświetlać próbkę światłem UV w temperaturze pokojowej przez 0,5 - 1 godzinę bez mieszania.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Usunąć DMF w wysokiej próżni i wytrącić surową pozostałość, dodając eter dietylowy w celu rozpuszczenia jego organicznych produktów ubocznych. Następnie wyizolować pozostałość za pomocą wirowania przy 12 000 x g przez 2 minuty. Po odwirowaniu delikatnie wylej składnik eterowy. Odparować pozostałość do sucha. Na koniec rozpuścić pozostałość w 1 mlH2O/acetonitrylu (2:1) i oczyścić ją za pomocą HPLC, jak opisano w kroku 5.1.7.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Pelay-Gimeno, M., Glas, A., Koch, O., Grossmann, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+design+of+inhibitors+of+protein-protein+interactions%3A+mimicking+peptide+binding+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Structure-based design of inhibitors of protein-protein interactions: mimicking peptide binding epitopes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (31), 8896-8927 (2015).</li>
<li>Passioura, T., Katoh, T., Goto, Y., Suga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection-based+discovery+of+druglike+macrocyclic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Selection-based discovery of druglike macrocyclic peptides.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 727-752 (2014).</li>
<li>Gonzalez, M. W., Kann, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+interactions+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein interactions and disease.</a> PLoS Computational Biology. 8 (12), 1-11 (2012).</li>
<li>Wilson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein-protein+interactions+using+designed+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein-protein interactions using designed molecules.</a> Chemical Society Reviews. 38 (12), 3289-3300 (2009).</li>
<li>Teresa, A. F. C., Alessio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+and+macrocyclic+peptides+as+chemical+tools+to+recognise+protein+surfaces+and+probe+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Cyclic and macrocyclic peptides as chemical tools to recognise protein surfaces and probe protein-protein interactions.</a> ChemMedChem. 11 (8), 787-794 (2016).</li>
<li>Craik, D. J., Fairlie, D. P., Liras, S., Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+peptide-based+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Biology+%26+Drug+Design%22%5BJournal%5D)">The future of peptide-based drugs.</a> Chemical Biology & Drug Design. 81 (1), 136-147 (2013).</li>
<li>Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrocarbon+stapled+peptides+as+modulators+of+biological+function%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function.</a> ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).</li>
<li>Zhang, Q. Z., Tian, Y., Lao, Y. Z., Li, Z. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptides-staple+method+development+and+its+application+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptides-staple method development and its application in cancer therapy.</a> Current Medicinal Chemistry. 21 (21), 2438-2452 (2014).</li>
<li>Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrocarbon+stapled+peptides+as+modulators+of+biological+function%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function.</a> ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).</li>
<li>Wang, D., Liao, W., Arora, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+metabolic+stability+and+protein-binding+properties+of+artificial+alpha+helices+derived+from+a+hydrogen-bond+surrogate%3A+application+to+Bcl-xL%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Enhanced metabolic stability and protein-binding properties of artificial alpha helices derived from a hydrogen-bond surrogate: application to Bcl-xL.</a> Angewandte Chemie International Edition. 44 (40), 6525-6529 (2005).</li>
<li>Bullock, B. N., Jochim, A. L., Arora, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+helical+protein+interfaces+for+inhibitor+design%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Assessing helical protein interfaces for inhibitor design.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 14220-14223 (2011).</li>
<li>Jackson, D. Y., King, D. S., Chmielewski, J., Singh, S., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja00024a067">General approach to the synthesis of short α-helical peptides.</a> Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9391-9392 (1991).</li>
<li>Timmerman, P., Beld, J., Puijk, W. C., Meloen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+quantitative+cyclization+of+multiple+peptide+loops+onto+synthetic+scaffolds+for+structural+mimicry+of+protein+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Rapid and quantitative cyclization of multiple peptide loops onto synthetic scaffolds for structural mimicry of protein surfaces.</a> ChemBioChem. 6 (5), 821-824 (2005).</li>
<li>Muppidi, A., Wang, Z., Li, X., Chen, J., Lin, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+cell+penetration+with+distance-matching+cysteine+cross-linkers%3A+a+facile+route+to+cell-permeable+peptide+dual+inhibitors+of+Mdm2%2FMdmx%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Achieving cell penetration with distance-matching cysteine cross-linkers: a facile route to cell-permeable peptide dual inhibitors of Mdm2/Mdmx.</a> Chemical Communications. 47 (33), 9396-9398 (2011).</li>
<li>Schafmeister, C. E., Po, J., Verdine, G. L. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja000563a">An all-hydrocarbon cross-linking system for enhancing the helicity and metabolic stability of peptides.</a> Journal of the American Chemical Society. 122 (24), 5891-5892 (2000).</li>
<li>Osapay, G., Taylor, J. W. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja00172a021">Multicyclic polypeptide model compounds. 1. synthesis of a tricyclic amphiphilic alpha-helical peptide using an oxime resin, segment-condensation approach.</a> Journal of the American Chemical Society. 112 (16), 6046-6051 (1990).</li>
<li>Lau, Y. H., Andrade, dP., Wu, Y., Spring, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+stapling+techniques+based+on+different+macrocyclisation+chemistries%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Peptide stapling techniques based on different macrocyclisation chemistries.</a> Chemical Society Reviews. 44 (1), 91-102 (2015).</li>
<li>Spokoyny, A. M., Zou, Y., Ling, J. J., Yu, H., Lin, Y. S., Pentelute, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perfluoroaryl-cysteine+S%28N%29Ar+chemistry+approach+to+unprotected+peptide+stapling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A perfluoroaryl-cysteine S(N)Ar chemistry approach to unprotected peptide stapling.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 5946-5949 (2013).</li>
<li>Lautrette, G., Touti, F., Lee, H. G., Dai, P., Pentelute, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+arylation+for+macrocyclization+of+unprotected+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Nitrogen arylation for macrocyclization of unprotected peptides.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (27), 8340-8343 (2016).</li>
<li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2016/sc/c6sc00106h">Stapling of unprotected helical peptides via photoinduced intramolecular thiol-yne hydrothiolation.</a> Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).</li>
<li>Chang, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stapled+%CE%B1-helical+peptide+drug+development%3A+a+potent+dual+inhibitor+of+MDM2+and+MDMX+for+p53-dependent+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stapled α-helical peptide drug development: a potent dual inhibitor of MDM2 and MDMX for p53-dependent cancer therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (36), 3445-3454 (2013).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinked+aspartic+acids+as+helix-nucleating+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).</li>
<li>Leshchiner, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+inhibition+of+oncogenic+KRAS+by+hydrocarbon-stapled+SOS1+helices%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct inhibition of oncogenic KRAS by hydrocarbon-stapled SOS1 helices.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1761-1766 (2015).</li>
<li>Wang, D., Qin, X., Zhao, H., Li, Z. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11426-016-9033-y">N-cap helix nucleation: methods and their applications.</a> Science China Chemistry. 60 (6), 689-700 (2017).</li>
<li>Zorzi, A., Deyle, K., Heinis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+peptide+therapeutics%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Cyclic peptide therapeutics: past, present and future.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 38, 24-29 (2017).</li>
<li>Hu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in-tether+chiral+center+modulates+the+helicity%2C+cell+permeability%2C+and+target+binding+affinity+of+a+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).</li>
<li>Lin, H., Jiang, Y., Zhang, Q., Hu, K., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in-tether+sulfilimine+chiral+center+induces+helicity+in+short+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">An in-tether sulfilimine chiral center induces helicity in short peptides.</a> Chemical Communications. 52 (68), 10389-10391 (2016).</li>
<li>Zhao, B., Zhang, Q., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+thioether-tethered+cyclic+peptides+via+on-resin+intra-molecular+thiol-ene+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">Constructing thioether-tethered cyclic peptides via on-resin intra-molecular thiol-ene reaction.</a> Journal of Peptide Science. 22 (8), 540-544 (2016).</li>
<li>Dondoni, A., Massi, A., Nanni, P., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+ligation+strategy+for+peptide+and+protein+glycosylation%3A+photoinduced+thiol-ene+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new ligation strategy for peptide and protein glycosylation: photoinduced thiol-ene coupling.</a> Chemistry. 15 (43), 11444-11449 (2009).</li>
<li>Hu, K., Sun, C., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+and+versatile+on-tether+modification+of+chiral-center-induced+helical+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides.</a> Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).</li>
<li>Shi, X., Jiang, Y., Yang, D., Zhao, H., Tian, Y., Li, Z. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1001841717302395">Reversibly switching the conformation of short peptide through in-tether chiral sulfonium auxiliary.</a> Chinese Chemical Letters. , In Press (2017).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+substitution+groups+on+the+in-tether+chiral+centre+influences+backbone+peptides%27+permeability+and+target+binding+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+%26+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Switching substitution groups on the in-tether chiral centre influences backbone peptides' permeability and target binding affinity.</a> Organic & Biomolecular Chemistry. 15 (3), 541-544 (2017).</li>
<li>Aimetti, A. A., Shoemaker, R. K., Lin, C. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-resin+peptide+macrocyclization+using+thiol-ene+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">On-resin peptide macrocyclization using thiol-ene click chemistry.</a> Chemical Communications. 46 (23), 4061-4063 (2010).</li>
<li>Wang, Y. X., Chou, D. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thiol-ene+coupling+approach+to+native+peptide+stapling+and+macrocyclization%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">A thiol-ene coupling approach to native peptide stapling and macrocyclization.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (37), 10931-10934 (2015).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+thiol-yne%2Fthiol-ene+reactions+for+peptide+and+protein+macrocyclizations%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Application of thiol-yne/thiol-ene reactions for peptide and protein macrocyclizations.</a> Chemistry. 23 (29), 7087-7092 (2017).</li>
<li>Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+synthesis+of+short+%CE%B1-helices+stabilized+by+the+hydrogen+bond+surrogate+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach.</a> Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).</li>
<li>Ozyurek, M., Baki, S., Gungor, N., Celik, S. E., Guclu, K., Apak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+biothiols+by+a+novel+on-line+HPLC-DTNB+assay+with+post-column+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Determination of biothiols by a novel on-line HPLC-DTNB assay with post-column detection.</a> Analytica Chimica Acta. 750, 173-181 (2012).</li>
<li>Zhang, Q. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+sulfoxide-induced+single+turn+peptide+%CE%B1-helicity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Chiral sulfoxide-induced single turn peptide α-helicity.</a> Scientific Reports. 6, 38573(2016).</li>
<li>Lin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in-tether+sulfilimine+chiral+center+induces+beta-turn+conformation+in+short+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+%26+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An in-tether sulfilimine chiral center induces beta-turn conformation in short peptides.</a> Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (42), 9993-9999 (2016).</li>
<li>Hu, K., Li, W., Yu, M., Sun, C., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+cellular+uptakes+of+the+in-tether+chiral-center-induced+helical+pentapeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Investigation of cellular uptakes of the in-tether chiral-center-induced helical pentapeptides.</a> Bioconjugate Chemistry. 27 (12), 2824-2827 (2016).</li>
<li>Hu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+precisely+positioned+chiral+center+in+an+i%2C+i+%2B+7+tether+modulates+the+helicity+of+the+backbone+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">A precisely positioned chiral center in an i, i + 7 tether modulates the helicity of the backbone peptide.</a> Chemical Communications. 53 (50), 6728-6731 (2017).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in-tether+chiral+center+modulates+the+proapoptotic+activity+of+the+KLA+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">An in-tether chiral center modulates the proapoptotic activity of the KLA peptide.</a> Chemical Communications. 53 (75), 10452-10455 (2017).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thioether-stabilized-D-proline-L-proline-induced+%CE%B2-hairpin+peptide+of+defensin+segment+increases+its+anti-Candida+albicans+ability%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">A thioether-stabilized-D-proline-L-proline-induced β-hairpin peptide of defensin segment increases its anti-Candida albicans ability.</a> ChemBioChem. 17 (15), 1416-1420 (2016).</li>
<li>Tian, Y., Yang, D., Ye, X., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioether-derived+macrocycle+for+peptide+secondary+structure+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Chemical+Record%22%5BJournal%5D)">Thioether-derived macrocycle for peptide secondary structure fixation.</a> The Chemical Record. 17 (9), 874-885 (2017).</li>
<li>Hu, K., Yin, F., Yu, M., Sun, C., Li, J., Liang, Y., Li, W., Xie, M., Lao, Y., Liang, W., Li, Z. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-tether+chiral+center+induced+helical+peptide+modulators+target+p53-MDM2%2FMDMX+and+inhibit+tumor+growth+in+stem-like+cancer+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">In-tether chiral center induced helical peptide modulators target p53-MDM2/MDMX and inhibit tumor growth in stem-like cancer cell.</a> Theranostics. 7 (18), 4566-4576 (2017).</li>
<li>Tian, Y., Jiang, Y., Li, J., Wang, D., Zhao, H., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+stapling+architecture+on+physiochemical+properties+and+cell+permeability+of+stapled+%CE%B1-helical+peptides%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: a comparative study.</a> ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W wewnątrzcząsteczkowej cyklizacji tioenu na żywicy opisanej na rysunku 3 stwierdzono, że usunięcie grupy trytylowej reszty cysteiny jest krytycznym krokiem dla późniejszej fotoreakcji. Ponadto stwierdzono, że masa cząsteczkowa peptydu przed i po reakcji jest identyczna, jak pokazano na rysunku 6B. W związku z tym w celu monitorowania reakcji wymagane jest zastosowanie identyfikacji metodą HPLC lub testu DTNB. W przypadku międzycząsteczkowej reakcji tioenowej op...

Rozwój ligandów do modulowania interakcji białko-białko (PPI) stanowi atrakcyjne podejście do odkrywania nowoczesnych leków. W związku z tym włożono wiele wysiłku w badanie nowych modalności chemicznych, które mogłyby skutecznie modulować PPIs1,2,3. IPP zazwyczaj składają się z płytkich, dużych i/lub przerwanych powierzchni oddziałujących, a małe cząsteczki są zwykle uważane za nieodpowiednie ligandy do modulacji IPP4,5. Przy odpowiedniej odsłoniętej powierzchni oddziałującej, krótkie peptydy, które naśladują cechy strukturalne interfejsów białkowych, są idealnymi kandydatami do rozwiązania tego problemu6,7. Jednak krótkie peptydy są zwykle nieustrukturyzowane w roztworze wodnym. Wynika to z faktu, że cząsteczki wody, które konkurują z wewnątrzcząsteczkową siecią wiązań wodorowych szkieletu peptydowego i dobrze zdefiniowanymi konformacjami, są entropicznie niekorzystne w water8. Ponadto z natury niska stabilność peptydów i przepuszczalność komórek znacznie ograniczają ich zastosowanie w zastosowaniach biologicznych9,10. Zgodnie z analizą Banku Danych o Białkach (PDB), >50% IPP obejmuje krótkie interakcje α-helisa11. W związku z tym opracowano różne metody chemiczne w odniesieniu do stabilizacji spirali. Należą do nich: tworzenie wiązań dwusiarczkowych/tioeterowych12,13,14, metateza zamykania pierścienia15, tworzenie pierścienia laktamowego16, "click" chemistry17, dodawanie perfluoroarenów18,19, oraz tworzenie siarczku winylu20.
Stabilizowane peptydy spiralne są szeroko stosowane dla różnych celów wewnątrzkomórkowych, w tym p53, receptorów estrogenowych, Ras, białek rodziny BCL-2 i innych21,22,23,24. ALRN-6924, całkowicie węglowodorowy zszywany peptyd podwójny inhibitor MDM2 i MDMX, jest obecnie używany do badań klinicznych25. W ciągu ostatnich kilku lat nasza grupa skupiła się na rozwoju nowatorskich metod stabilizacji peptydów z wykorzystaniem reakcji tiol-en i tiol-yne26,27,28. Ogólnie rzecz biorąc, wykazaliśmy, że te reakcje inicjowane światłem są skuteczne w łagodnych warunkach, gdy stosuje się naturalnie obfitą cysteinę. Ponadto wykazaliśmy, że reakcje te mają doskonałą tolerancję grup funkcyjnych, są bioortogonalne i udowodniono, że mają zastosowanie do modyfikacji peptydów i białek29. Powstałe w ten sposób peptydy na uwięzi tioeterowo-siarczkowe winylu znacznie poprawiają przestrzeń chemiczną peptydów ograniczających, zapewniają labilne centrum modyfikacji na uwięzi i udowodniono, że mają zastosowanie w wielu zastosowaniach biologicznych30,31,32. Do tej pory opisano tylko ograniczone doniesienia dotyczące cyklizacji peptydów tiol-en/tiol-yne. W badaniu opublikowanym przez Anseth i wsp. w 2009 r. wykazano wewnątrzcząsteczkową reakcję tiolowo-enową na żywicy w celu cyklizacji peptydów między aktywowanymi alkenami z cysteiną33. W 2015 roku Chou i wsp. Opisał dwuskładnikową reakcję tiol-en, inicjowaną przez rodnik dla zszywania peptydów34 i następną, sekwencyjną reakcję sprzężenia tiol-yne/en35. Niedawno opisaliśmy serię prac opartych na peptydach na uwięzi tioeteru/siarczku winylu20,26,27. Protokół ten opisuje szczegółową syntezę wyżej wymienionych peptydów na uwięzi tioeteru/siarczku winylu w nadziei, że będzie ona pomocna dla szerszej społeczności naukowej.

<table><tbody><tr><td>Żywica MBHA Amide (0,53 mmol/g)</td> <td>HECHENG</td><td>GRM50407</td><td></td></tr><tr><td>Standard Aminokwasy chronione Fmoc</td><td>GL Biochem (Shanghai) Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-metylo-2-pirolidynon</td><td>Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd.</td><td>3230</td><td>szkodliwy</td></tr><tr><td>dla skóry N,N-dimetyloformamid</td><td>Energia</td><td>B020051</td><td>szkodliwa dla skóry</td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Energy</td><td>W330229</td><td>szkodliwa dla skóry</td></tr><tr><td>N,N-Diizoproyloetyloamina</td><td>Aldrich</td><td>9578</td><td>drażniący</td></tr><tr><td>kwas trifluorooctowy</td><td>J& K</td><td>101398</td><td></td></tr><tr><td>triizopropylosilan</td><td>J& K</td><td>973821</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>J& K</td><td>248897</td><td>Smród</td></tr><tr><td>2-(6-chloro-1H-benzotriazolo-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametyloaminowo-heksafluorofosforan&nbsp;</td><td>GL Biochem (Szanghaj) Sp. z o.o.</td><td></td><td></td>851012</tr><tr><td>Morpholine</td><td>Aldrich</td><td>M109062</td><td>drażniący</td></tr><tr><td>eter dietylowy</td><td>Aldrich</td><td>673811</td><td>łatwopalny</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td>toksyczność</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td>toksyczność</td></tr><tr><td>2-hydroksy-1-[4-(2-hydroksyetoksy)-fenylo]-2-metylo-1-propanon</td><td>Energia</td><td>A050035</td><td></td></tr><tr><td>4-metoksyacetofenon</td><td>Energia</td><td>A050098</td><td></td></tr><tr><td>2,2-dimetoksy-2-fenyloacetofenonu</td><td>Energia</td><td>D070132</td><td></td></tr><tr><td>5,5'-Ditiobis-(kwas 2-nitrobenzoesowy)</td><td>J& K</td><td>281281</td><td></td></tr><tr><td>Benzotriazol-1-yl-oksytrirolidinofosfonium Energia heksafluorofosforanu</td><td></td><td>E020172</td><td></td></tr><tr><td>1-hydroksybenzotriazol</td><td>Energia</td><td>D050256</td><td></td></tr><tr><td>4-metylomorfolina</td><td>Energia</td><td>W320038</td><td></td></tr><tr><td>Wysokosprawna chromatografia cieczowa</td><td>SHIMADZU</td><td>LC-30AD</td><td></td></tr><tr><td>Masa jonizacyjna elektrorozpylania</td><td>SHIMADZU</td><td>LCMS-8030</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator</td> System zatężania <td>Labconco</td><td>FreeZone</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Kolektor</td> próżniowy Thermo <td>Savant</td><td></td></tr><tr><td></td><td>promega</td><td>A7231</td><td></td></tr><tr><td>zawory trójdrogowe</td><td>Kolumny chromatograficzne Bio-Rad</td><td>7328107</td><td></td></tr><tr><td>poly-prep&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td><td></td></tr></tbody></table>

konstruowanie peptydów helisowych na uwięzi tioeteru/siarczku winylu za pomocą fotoindukowanej hydrotiolacji tiolu-enu / yny

Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół przygotowania peptydów na uwięzi tioeterowej za pomocą wewnątrzcząsteczkowej/międzycząsteczkowej hydrotiolacji tiolowej na żywicy. Ponadto protokół ten opisuje przygotowanie peptydów na uwięzi siarczku winylu przy użyciu wewnątrzcząsteczkowej hydrotiolizacji tiol-yny w roztworze między aminokwasami, które posiadają łańcuchy boczne alkenu / alkinu i reszty cysteiny w pozycjach i, i + 4. Peptydy liniowe zsyntetyzowano przy użyciu standardowej syntezy peptydów w fazie stałej (SPPS) opartej na Fmoc. Hydrotiolowanie tiolu przeprowadza się za pomocą wewnątrzcząsteczkowej reakcji tioenu lub międzycząsteczkowej reakcji tioenowej, w zależności od długości peptydu. W niniejszej pracy przeprowadza się wewnątrzcząsteczkową reakcję tioenową w przypadku krótszych peptydów przy użyciu deprotekcji grup trytylowych reszt cysteinowych na żywicy po pełnej syntezie peptydu liniowego. Żywica jest następnie naświetlana promieniowaniem UV za pomocą fotoinicjatora 4-metoksyacetofenonu (MAP) i 2-hydroksy-1-[4-(2-hydroksyetoksy)-fenylo]-2-metylo-1-propanonu (MMP). Międzycząsteczkową reakcję tiolowo-europejską przeprowadza się przez rozpuszczenie Fmoc-Cys-OH w rozpuszczalniku N,N-dimetyloformamidu (DMF). Jest on następnie reagowany z peptydem przy użyciu pozostałości zawierającej alkeny na żywicy. Następnie makrolaktamizację przeprowadza się przy użyciu heksafluorofosforanu benzotriazole-1-yl-oksytrolidinofosfonium (PyBop), 1-hydroksybenzotriazolu (HoBt) i 4-metylomorfoliny (NMM) jako odczynników aktywujących żywicę. Po makrolaktamizacji synteza peptydu jest kontynuowana przy użyciu standardowego SPPS. W przypadku hydrotiolacji tio-ynu peptyd liniowy jest oddzielany od żywicy, suszony, a następnie rozpuszczany w odgazowanym DMF. Jest on następnie naświetlany światłem UV za pomocą fotoinicjatora 2,2-dimetoksy-2-fenyloacetofenonu (DMPA). Po reakcji DMF jest odparowywany, a surowa pozostałość jest wytrącana i oczyszczana za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Metody te mogą działać w celu uproszczenia wytwarzania cyklicznych peptydów na uwięzi tioeterowej dzięki zastosowaniu chemii tio-enu / ynu, która ma lepszą tolerancję grup funkcyjnych i dobrą wydajność. Wprowadzenie wiązań tioeterowych do peptydów wykorzystuje nukleofilowy charakter reszt cysteiny i jest obojętne na redoks w stosunku do wiązań dwusiarczkowych.

Widma HPLC i MS peptydu Ac-YmS5AAAC-NH2 oraz jego cyklicznego produktu Ac-Y-(cyclo-1,5)-[mS5AAAC]-NH2, otrzymanego w drodze wewnątrzcząsteczkowej fotoreakcji tiol-en na żywicy, przedstawiono na Rysunku 6B. Stwierdzono, że peptyd cykliczny posiada identyczną masę cząsteczkową w porównaniu do swojego liniowego prekursora. Zaobserwowano jednak, że w tych samych warunkach rozdziału jego czas retencji w HPLC był o około ...

Przedstawiamy protokół budowy spiralnych peptydów tioeterowych/siarczków winylu za pomocą fotoindukowanej hydrotiolacji tiol-en/tiol-yne.

Konstruowanie peptydów helisowych na uwięzi tioeteru/siarczku winylu za pomocą fotoindukowanej hydrotiolacji tiolu-enu / yny

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene ...

Metody te upraszczają wytwarzanie cyklicznych peptydów na uwięzi tioeterowej dzięki zastosowaniu chemii tio-enu lub tio-yny, która ma lepszą tolerancję grup funkcyjnych i dobrą wydajność. Główną zaletą tej techniki jest to, że uwięź tioeterowa zapewnia bezśladowe miejsce modyfikacji, które znacznie rozszerza przestrzeń chemiczną stabilnych peptydów po modyfikacji syntezy peptydów. Aby rozpocząć procedurę, należy przymocować kolumnę wypełnioną 50 miligramami żywicy Rink Amide MBHA zarówno do stołowego kolektora próżniowego, jak i do przewodu gazowego azotu lub argonu za pomocą trójdrogowego kurka.Dodaj jeden do dwóch mililitrów dichlorometanu do złoża żywicy i spęczniaj żywicę, delikatnie mieszając mieszaninę strumieniem pęcherzyków gazu obojętnego przez 10 minut. Po zakończeniu odcedź żywicę za pomocą gumowej gruszki pipety. Następnie dodaj od jednego do dwóch mililitrów N-końcowego roztworu deprotektoracyjnego Fmoc do żywicy.Delikatnie mieszaj mieszaninę, bulgocząc gazem obojętnym przez 10 minut, a następnie spuść żywicę za pomocą gumowej gruszki do pipet. W ten sam sposób umyj kolumnę jednym do dwóch mililitrów DMF, a następnie jednym do dwóch mililitrów DCM. Powtórz sekwencję deprotekcji jeden raz.Następnie połącz 0,125 milimola aminokwasu chronionego Fmoc i 50,5 miligrama HCTU z 0,5 mililitra DMF w pojemniku polipropylenowym. Potrząsaj mieszaniną przez minutę, aby rozpuścić ciała stałe. Następnie dodaj 43,5 mikrolitra DIPEA i potrząsaj pojemnikiem przez kolejną minutę, aby uzyskać 0,25-molowy aktywowany roztwór aminokwasu.Dodaj ten roztwór do przemytej żywicy i bąbelkuj gaz obojętny przez mieszaninę przez jedną do dwóch godzin. Następnie zdeprotect i umyj związaną resztę aminokwasów. Kontynuuj sprzęganie aminokwasów z łańcuchem peptydowym w ten sposób, aby utworzyć peptyd liniowy.Użyj syntezy peptydów w fazie stałej, aby przygotować żywicę podtrzymującą peptyd liniowy, który zawiera chronioną trytylem resztę cysteiny oddzieloną trzema jednostkami od reszty mono-S-pięć. Dodaj jeden do dwóch mililitrów trytylowego roztworu deprotektoracyjnego do 50 miligramów żywicy zawierającej peptydy. Przez mieszaninę przepuszczać gazowy azot przez 10 minut.Odcedź roztwór odbezpieczający i umyj żywicę trzykrotnie jedno- lub dwumililitrowymi porcjami DCM. Powtórz procedurę deprotekcji sześć razy lub do momentu, gdy roztwór przestanie być żółty, aby całkowicie zdeprotect cysteinę. Pełna deprotekcja grupy Trt cysteiny jest bardzo ważna dla następnego etapu fotoreakcji.Umyj żywicę kolejno jedno- lub dwumililitrowymi porcjami DMF i DCM. Następnie namocz żywicę w jednym do dwóch mililitrów metanolu na dwie minuty, aby skurczyć żywicę. Odcedź metanol i susz żywicę azotem przez pięć minut.Przenieść suchą żywicę do 10-mililitrowej kolby okrągłodennej za pomocą papieru wagowego. Zawieś żywicę w dwóch mililitrach DMF spryskiwanego azotem. Następnie dodaj 5,6 miligrama MMP i 38 miligramów MAP jako fotoinicjatory.Umieścić mieszadło w kolbie i przykryć kolbę gumową przegrodą. Przedmuchnąć atmosferę kolby trzykrotnie azotem gazowym, aby całkowity czas przedmuchiwania wynosił około pięciu minut. Umieścić kolbę reakcyjną w fotoreaktorze wyposażonym w lampy UVA, wlot obojętnego azotu i płytkę mieszającą.Zacznij mieszać mieszaninę i zamknij fotoreaktor. Oczyść fotoreaktor argonem przez 10 minut. Następnie ustaw natężenie przepływu argonu na jeden litr na minutę i naświetlaj mieszaninę światłem UVA przez godzinę w temperaturze pokojowej.Monitorować reakcję za pomocą HPLC. Po zakończeniu umyj, rozszczep i oczyść cykliczny peptyd. Przygotuj 50 miligramów żywicy zawierającej liniowy peptyd, który zawiera podstawioną promieniami gamma resztę mono-S-5.Umyj żywicę kolejno DMF i DCM. Żywicę obkurczyć metanolem i wysuszyć gazowym azotem. Następnie w 10-mililitrowej kolbie okrągłodennej zawiesić żywicę w dwóch mililitrach DMF spryskiwanego azotem.Dodaj do mieszaniny 5,6 miligrama MMP, 3,8 miligrama MAP i 25,7 miligrama cysteiny chronionej przed Fmoc. Dodać mieszadło do kolby, uszczelnić ją gumową przegrodą i przepłukać atmosferę kolby azotem gazowym. Następnie naświetlić mieszaninę światłem UVA w fotoreaktorze wypełnionym obojętnym gazem azotowym, mieszając w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch godzin.Monitorować reakcję za pomocą LC-MS. Po zakończeniu fotoreakcji przemyć związany peptyd i przeprowadzić reakcję makrolaktamizacji. Następnie wznów sprzęganie aminokwasów z cyklicznym peptydem, aby utworzyć pożądaną strukturę.Rozszczep i oczyść peptyd po zakończeniu. Przygotować 50 miligramów żywicy zawierającej peptyd liniowy, który zawiera pozostałość z końcowym alkinem oddzielonym trzema jednostkami od reszty z końcowym tiolem. Rozetnij peptyd z żywicy i wytrącić go jednym mililitrem zimnego eteru dietylowego.Odwirować mieszaninę peptydów z prędkością 12 000 g przez dwie minuty. Delikatnie zdekantować supernatant i dodać kolejny mililitr zimnego eteru dietylowego. Powtórz pranie jeszcze dwa razy, a następnie wysusz pozostałość peptydów w próżni.Rozpuścić pozostałość w 50 mililitrach rozpylonego azotem DMF w kolbie okrągłodennej. Dodaj 3,2 miligrama DMPA do roztworu peptydów i przepuszczaj azot przez mieszaninę reakcyjną przez 10 minut. Atmosfera obojętna jest ściśle wymagana do efektywnej fotoreakcji tio-yny w fazie roztworu.Poza tym zaobserwowaliśmy utlenianie siarki podczas naświetlania promieniami UV. Następnie naświetlić mieszaninę światłem UVA bez mieszania w fotoreaktorze wypełnionym obojętnym gazem azotowym w temperaturze pokojowej przez 30 minut do jednej godziny. Po zakończeniu wyizoluj i oczyść cykliczny peptyd.Cyklizacja tego peptydu na żywicy wytworzyła jeden z pięciu cyklicznych peptydów na uwięzi tioeterowych o identycznej masie cząsteczkowej jak peptyd liniowy. Czas retencji produktu cyklicznego w HPLC był o dwie minuty krótszy niż w przypadku peptydu liniowego. Dobrą konwersję zaobserwowano również w przypadku cyklizacji na żywicy kilku innych krótkich peptydów.Peptydy liniowe poddano badaniom przesiewowym pod kątem zdolności do zszywania peptydów poprzez indukowaną fotoindukowaną hydrotiolację tiolowo-ynową. Niska wydajność dwóch c została przypisana konformacyjnej preferencji do uwięzienia rodnika tiylowego na N-końcu podczas skurczu do 20-członowego makrocyklu. Peptydy jeden a i jeden b wygenerowały po dwa izomery z ośmioczłonowym wiązaniem krzyżowym siarczku winylu.Peptydy produktu dwa a-A i dwa a-B miały różne czasy retencji i były wytwarzane w różnych proporcjach w różnych czasach napromieniania. Spektroskopia protonowego NMR wykazała, że dwa a-A to izomer E siarczku winylu, a dwa a-B to izomer Z. Izomer Z był głównym produktem podczas tworzenia peptydów dwóch d, dwóch e i dwóch f, co przypisano preferencji konformacyjnej podczas tworzenia siedmioczłonowego wiązania siarczku winylu.Spektroskopia dichroizmu kołowego wykazała losową cewkę dla wszystkich form peptydów dwa a i dwa b oraz konformację spiralną dla peptydu dwa d. Opracowaliśmy szereg protokołów chemicznych do budowy peptydów na uwięzi tioeterowej i siarczku winylu przy użyciu fotoindukowanej chemii tioenu i tio-ynu. Wierzymy, że będzie to pomocne dla społeczności naukowej.

constructing-thioethervinyl-sulfide-tethered-helical-peptides-via

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Synteza asymetrycznych gatunków ferrocenu jest wyzwaniem przy użyciu technik rozwiązań.  Niniejszy raport koncentruje się na metodach przeprowadzonych w celu wytworzenia biokoniugatu ferrocen-biotyna przy użyciu łatwych i czystych reakcji przeprowadzanych w drodze syntezy w fazie stałej.  Wykazano, że włączenie ugrupowania tiolanowego nadaje zdolność do unieruchamiania na powierzchniach złota.

Metodologia syntezy asymetrycznych układów biosprzężonych pochodzących z ferrocenu za pomocą metodologii opartej na żywicy w fazie stałej

Przedstawiono nowatorską metodologię syntezy i programowania elastomerów ciekłokrystalicznych w łańcuchu głównym przy użyciu dostępnych na rynku monomerów wyjściowych. Szeroki zakres właściwości termomechanicznych został dostosowany poprzez dostosowanie ilości środka sieciującego, podczas gdy wydajność uruchamiania zależała od wielkości zastosowanego naprężenia podczas programowania.

Synteza programowalnych elastomerów ciekłokrystalicznych w łańcuchu głównym z wykorzystaniem dwuetapowej reakcji tiolowo-akrylowej

Adhezyjna komórka jest kluczem do wielu podejść w badaniach nad biomateriałami i inżynierii tkankowej. Przedstawiono technikę krok po kroku wykorzystującą chemię mokrą do modyfikacji powierzchni ważnego polimeru PTFE za pomocą peptydów.

Chemia mokra i immobilizacja peptydów na politetrafluoroetylenie w celu poprawy adhezji komórek

Aby dostarczyć leki przeciwnowotworowe do miejsc nowotworowych o wysokiej swoistości i zmniejszonych skutkach ubocznych, potrzebne są nowe metody oparte na nanocząsteczkach. Tutaj opisujemy usieciowane micele dwusiarczkowe, które można łatwo przygotować przez utlenianie za pośrednictwem nadtlenku wodoru i są w stanie skutecznie dysocjować w środowisku redukującym guza, aby uwolnić ładunki.

Łatwe i wydajne podejście do produkcji odwracalnych miceli usieciowanych dwusiarczkowym

Szczegółowo przedstawiono reprezentatywne procedury eksperymentalne dotyczące syntezy N-(2-alkoksywinylo)sulfonamidów i późniejszej konwersji do pochodnych ftalanu i fenyloetyloaminy.

Otrzymywanie N-(2-alkoksywinylo)sulfonamidów z N-tozylo-1,2,3-triazoli, a następnie konwersja do podstawionych ftalanów i fenyloetyloamin

Tutaj prezentujemy jednogarnkową, wolną od metali przejściowych syntezę tioli i tioestrów z halogenków aromatycznych i tiometlenku sodu, a następnie przygotowanie monokryształów sieci metal-ditiolen przy użyciu form tiolu generowanych in situ z bardziej stabilnego i podatnego na działanie tioestru.

Synteza tiolowego bloku budulcowego do krystalizacji półprzewodnikowego żyroidalnego szkieletu metal-siarka

Protokół syntezy peptydu modyfikowanego 1,2-ditiolanem i charakterystyka struktur supramolekularnych wynikających z samoorganizacji peptydu.

Synteza i charakterystyka samoorganizujących się peptydów modyfikowanych 1,2-ditiolanem

W tym protokole opiszemy syntezę PODS, odczynnika na bazie fenyoksadiazolylu metylosulfonu do selektywnego przyłączania ładunków do tioli biomolekuł, szczególnie przeciwciał. Ponadto opiszemy syntezę i charakterystykę dwufunkcyjnego chelatora nośnego POD oraz jego koniugację z modelowym przeciwciałem.

Synteza i biokoniugacja odczynników tiolowo-reaktywnych do tworzenia immunokoniugatów modyfikowanych selektywnie

Przedstawione tutaj są protokoły tworzenia małych jednopłytkowych pęcherzyków opartych na peptydach, zdolnych do wzrostu. Aby ułatwić produkcję pęcherzyków peptydu błonowego, pęcherzyki te są wyposażone w system transkrypcyjno-translacyjny i plazmid kodujący peptydy.

In Vesiculo Synteza prekursorów błony peptydowej do autonomicznego wzrostu pęcherzyków

Przedstawiono protokół do syntezy kodowanych informacyjnie oligomerów peptoidowych oraz do sekwencyjnego samoorganizowania tych peptoidów w drabinki molekularne przy użyciu amin i aldehydów jako dynamicznych par kowalencyjnych reagentów oraz kwaśnych triflatów metali ziem rzadkich Lewisa jako odczynników wielozadaniowych.

Synteza peptydów niosących informacje i ich sekwencyjna dynamiczna samoorganizacja kowalencyjna

Ten protokół przedstawia syntezę cyklicznych peptydów poprzez bissalkilację między cysteiną a metioniną oraz łatwą reakcję tiol-yne wywołaną przez centrum propargylu sulfonium.

Konstruowanie cyklicznych peptydów przy użyciu centrum sulfonowego na uwięzi

Poznaj metodę syntezy cyklicznych peptydów z uwięzią tioeterową przy użyciu fotoindukowanej hydrotiolacji tiolu-enu/yny. Technika ta oferuje wysoką wydajność i rozszerza przestrzeń chemiczną stabilnych peptydów.

Konstruowanie peptydów helisowych na uwięzi tioeteru/siarczku winylu za pomocą fotoindukowanej hydrotiolacji tiolu-enu / yny

Przeglądaj więcej filmów