Konstruowanie peptydów helisowych na uwięzi tioeteru/siarczku winylu za pomocą fotoindukowanej hydrotiolacji tiolu-enu / yny

Metody te upraszczają wytwarzanie cyklicznych peptydów na uwięzi tioeterowej dzięki zastosowaniu chemii tio-enu lub tio-yny, która ma lepszą tolerancję grup funkcyjnych i dobrą wydajność. Główną zaletą tej techniki jest to, że uwięź tioeterowa zapewnia bezśladowe miejsce modyfikacji, które znacznie rozszerza przestrzeń chemiczną stabilnych peptydów po modyfikacji syntezy peptydów. Aby rozpocząć procedurę, należy przymocować kolumnę wypełnioną 50 miligramami żywicy Rink Amide MBHA zarówno do stołowego kolektora próżniowego, jak i do przewodu gazowego azotu lub argonu za pomocą trójdrogowego kurka.

Dodaj jeden do dwóch mililitrów dichlorometanu do złoża żywicy i spęczniaj żywicę, delikatnie mieszając mieszaninę strumieniem pęcherzyków gazu obojętnego przez 10 minut. Po zakończeniu odcedź żywicę za pomocą gumowej gruszki pipety. Następnie dodaj od jednego do dwóch mililitrów N-końcowego roztworu deprotektoracyjnego Fmoc do żywicy.

Delikatnie mieszaj mieszaninę, bulgocząc gazem obojętnym przez 10 minut, a następnie spuść żywicę za pomocą gumowej gruszki do pipet. W ten sam sposób umyj kolumnę jednym do dwóch mililitrów DMF, a następnie jednym do dwóch mililitrów DCM. Powtórz sekwencję deprotekcji jeden raz.

Następnie połącz 0,125 milimola aminokwasu chronionego Fmoc i 50,5 miligrama HCTU z 0,5 mililitra DMF w pojemniku polipropylenowym. Potrząsaj mieszaniną przez minutę, aby rozpuścić ciała stałe. Następnie dodaj 43,5 mikrolitra DIPEA i potrząsaj pojemnikiem przez kolejną minutę, aby uzyskać 0,25-molowy aktywowany roztwór aminokwasu.

Dodaj ten roztwór do przemytej żywicy i bąbelkuj gaz obojętny przez mieszaninę przez jedną do dwóch godzin. Następnie zdeprotect i umyj związaną resztę aminokwasów. Kontynuuj sprzęganie aminokwasów z łańcuchem peptydowym w ten sposób, aby utworzyć peptyd liniowy.

Użyj syntezy peptydów w fazie stałej, aby przygotować żywicę podtrzymującą peptyd liniowy, który zawiera chronioną trytylem resztę cysteiny oddzieloną trzema jednostkami od reszty mono-S-pięć. Dodaj jeden do dwóch mililitrów trytylowego roztworu deprotektoracyjnego do 50 miligramów żywicy zawierającej peptydy. Przez mieszaninę przepuszczać gazowy azot przez 10 minut.

Odcedź roztwór odbezpieczający i umyj żywicę trzykrotnie jedno- lub dwumililitrowymi porcjami DCM. Powtórz procedurę deprotekcji sześć razy lub do momentu, gdy roztwór przestanie być żółty, aby całkowicie zdeprotect cysteinę. Pełna deprotekcja grupy Trt cysteiny jest bardzo ważna dla następnego etapu fotoreakcji.

Umyj żywicę kolejno jedno- lub dwumililitrowymi porcjami DMF i DCM. Następnie namocz żywicę w jednym do dwóch mililitrów metanolu na dwie minuty, aby skurczyć żywicę. Odcedź metanol i susz żywicę azotem przez pięć minut.

Przenieść suchą żywicę do 10-mililitrowej kolby okrągłodennej za pomocą papieru wagowego. Zawieś żywicę w dwóch mililitrach DMF spryskiwanego azotem. Następnie dodaj 5,6 miligrama MMP i 38 miligramów MAP jako fotoinicjatory.

Umieścić mieszadło w kolbie i przykryć kolbę gumową przegrodą. Przedmuchnąć atmosferę kolby trzykrotnie azotem gazowym, aby całkowity czas przedmuchiwania wynosił około pięciu minut. Umieścić kolbę reakcyjną w fotoreaktorze wyposażonym w lampy UVA, wlot obojętnego azotu i płytkę mieszającą.

Zacznij mieszać mieszaninę i zamknij fotoreaktor. Oczyść fotoreaktor argonem przez 10 minut. Następnie ustaw natężenie przepływu argonu na jeden litr na minutę i naświetlaj mieszaninę światłem UVA przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Monitorować reakcję za pomocą HPLC. Po zakończeniu umyj, rozszczep i oczyść cykliczny peptyd. Przygotuj 50 miligramów żywicy zawierającej liniowy peptyd, który zawiera podstawioną promieniami gamma resztę mono-S-5.

Umyj żywicę kolejno DMF i DCM. Żywicę obkurczyć metanolem i wysuszyć gazowym azotem. Następnie w 10-mililitrowej kolbie okrągłodennej zawiesić żywicę w dwóch mililitrach DMF spryskiwanego azotem.

Dodaj do mieszaniny 5,6 miligrama MMP, 3,8 miligrama MAP i 25,7 miligrama cysteiny chronionej przed Fmoc. Dodać mieszadło do kolby, uszczelnić ją gumową przegrodą i przepłukać atmosferę kolby azotem gazowym. Następnie naświetlić mieszaninę światłem UVA w fotoreaktorze wypełnionym obojętnym gazem azotowym, mieszając w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch godzin.

Monitorować reakcję za pomocą LC-MS. Po zakończeniu fotoreakcji przemyć związany peptyd i przeprowadzić reakcję makrolaktamizacji. Następnie wznów sprzęganie aminokwasów z cyklicznym peptydem, aby utworzyć pożądaną strukturę.

Rozszczep i oczyść peptyd po zakończeniu. Przygotować 50 miligramów żywicy zawierającej peptyd liniowy, który zawiera pozostałość z końcowym alkinem oddzielonym trzema jednostkami od reszty z końcowym tiolem. Rozetnij peptyd z żywicy i wytrącić go jednym mililitrem zimnego eteru dietylowego.

Odwirować mieszaninę peptydów z prędkością 12 000 g przez dwie minuty. Delikatnie zdekantować supernatant i dodać kolejny mililitr zimnego eteru dietylowego. Powtórz pranie jeszcze dwa razy, a następnie wysusz pozostałość peptydów w próżni.

Rozpuścić pozostałość w 50 mililitrach rozpylonego azotem DMF w kolbie okrągłodennej. Dodaj 3,2 miligrama DMPA do roztworu peptydów i przepuszczaj azot przez mieszaninę reakcyjną przez 10 minut. Atmosfera obojętna jest ściśle wymagana do efektywnej fotoreakcji tio-yny w fazie roztworu.

Poza tym zaobserwowaliśmy utlenianie siarki podczas naświetlania promieniami UV. Następnie naświetlić mieszaninę światłem UVA bez mieszania w fotoreaktorze wypełnionym obojętnym gazem azotowym w temperaturze pokojowej przez 30 minut do jednej godziny. Po zakończeniu wyizoluj i oczyść cykliczny peptyd

Cyklizacja tego peptydu na żywicy wytworzyła jeden z pięciu cyklicznych peptydów na uwięzi tioeterowych o identycznej masie cząsteczkowej jak peptyd liniowy. Czas retencji produktu cyklicznego w HPLC był o dwie minuty krótszy niż w przypadku peptydu liniowego. Dobrą konwersję zaobserwowano również w przypadku cyklizacji na żywicy kilku innych krótkich peptydów.

Peptydy liniowe poddano badaniom przesiewowym pod kątem zdolności do zszywania peptydów poprzez indukowaną fotoindukowaną hydrotiolację tiolowo-ynową. Niska wydajność dwóch c została przypisana konformacyjnej preferencji do uwięzienia rodnika tiylowego na N-końcu podczas skurczu do 20-członowego makrocyklu. Peptydy jeden a i jeden b wygenerowały po dwa izomery z ośmioczłonowym wiązaniem krzyżowym siarczku winylu.

Peptydy produktu dwa a-A i dwa a-B miały różne czasy retencji i były wytwarzane w różnych proporcjach w różnych czasach napromieniania. Spektroskopia protonowego NMR wykazała, że dwa a-A to izomer E siarczku winylu, a dwa a-B to izomer Z. Izomer Z był głównym produktem podczas tworzenia peptydów dwóch d, dwóch e i dwóch f, co przypisano preferencji konformacyjnej podczas tworzenia siedmioczłonowego wiązania siarczku winylu.

Spektroskopia dichroizmu kołowego wykazała losową cewkę dla wszystkich form peptydów dwa a i dwa b oraz konformację spiralną dla peptydu dwa d. Opracowaliśmy szereg protokołów chemicznych do budowy peptydów na uwięzi tioeterowej i siarczku winylu przy użyciu fotoindukowanej chemii tioenu i tio-ynu. Wierzymy, że będzie to pomocne dla społeczności naukowej.