Name: Mikromanipulacja chromosomami w spermatocytach owadów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Poznaj technikę mikromanipulacji chromosomów w żywych komórkach spermatocytów owadów przy użyciu mikromanipulatora piezoelektrycznego. Ta nieinwazyjna metoda pozwala badać rolę napięcia w punkcie kontrolnym wrzeciona podczas mejozy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jessice Hall za jej cenną dyskusję.

1. Przygotowanie pierwotnej hodowli komórek spermatocytów owadów do mikromanipulacji
<ol>
	<li>Przygotowanie preparatów
	<ol>
		<li>Zaopatrz się w szkiełko o wymiarach 75 mm x 25 mm z okrągłym otworem o średnicy 20 mm wyciętym w środku szkiełka. 
		UWAGA: Zostały one wycięte z pojedynczej tafli szkła okiennego tak, aby miały rozmiar szklanego szkiełka z otworem pośrodku.</li>
		<li>Przepuść szkiełko nakrywkowe 25 mm x 25 mm #1.5 przez płomień palnika Bunsena przez 2 sekundy.</li>
		<li>Nałóż smar próżniowy wokół krawędzi otworu w szkiełku</li>
		<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na otworze, jak w <silna klasa="xfig">Rysunek 1. Naciśnij go i upewnij się, że jest szczelnie zamknięty.</li>
		<li>Odwróć szklane szkiełko i dobrze napełnij sekcję olejem halowęglowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie hodowli spermatocytów do oglądania pod mikroskopem 
	UWAGA: Tutaj opisujemy metodę przygotowania kultury przy użyciu komórek konika polnego lub świerszcza. Zawartość jąder innych stawonogów można hodować przy użyciu podobnej metody.
	<ol>
		<li>Zdobądź niedorosłe samce świerszczy (lub koniki polne). Umieść żywego owada w lodówce na około 2 minuty, aby znieczulić go na zimno. Za pomocą nożyczek preparacyjnych szybko przetnij powierzchnię grzbietową równolegle do długiej osi brzucha bezpośrednio za pąkami skrzydeł. Ręcznie delikatnie ściśnij brzuch, aby przepchnąć jądra przez nacięcie w egzoszkielecie (<silna klasa="xfig">Ryc. 2).</li>
		<li>Za pomocą kleszczy umieść izolowane jądra w studzience preparacyjnej zawierającej olej halowęglowy.</li>
		<li>W razie potrzeby obejrzyj jądra pod mikroskopem preparacyjnym. Podziel je na mniejsze kawałki za pomocą drobno zakończonych kleszczy, usuwając tłuszcz pokrywający jądra, a następnie użyj drobno zakończonych kleszczy, aby rozbić jądra (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A i 3B). Rozprowadź zawartość jąder pod olejem, na powierzchni szkiełka nakrywkowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C).</li>
		<li>Rozłóż zawartość jąder tak, aby rozłożona część jądra była ledwo zauważalna dla oczu (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). W razie potrzeby użyj dodatkowych studni dysocjacyjnych wypełnionych ropą.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Mikromanipulacja
<ol>
	<li>Produkcja mikroigły
	<ol>
		<li>Umieść jeden koniec szklanej rurki (0.85 mm średnicy zewnętrznej, 0.65 mm średnicy wewnętrznej) w płomieniu palnika Bunsena. Pociągnij koniec szklanej rurki w taki sposób, aby powstał kąt 150° i powstał rozszerzony obszar wąskiej szklanej rurki. Przerwij rurkę w cienkim obszarze tak, aby cienki obszar wystający z kątownika miał około 10 mm długości (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A).</li>
		<li>Za pomocą mikrokuźni (wykonanej na zamówienie zgodnie z Powell27 lub dostępnej na rynku - patrz Tabela materiałów), przyłóż końcówkę szklanej igły do gorącego drutu platynowego, aby stopić szkło na końcówce. Uformuj kąt około 45° między igłą a platynowym drutem mikrokuźni (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B). Odciągnij szklankę od gorącego drutu, jednocześnie odcinając dopływ ciepła do drutu, tworząc cienką końcówkę ≤1.5 mm na końcu szklanej igły. 
		UWAGA: Średnica końcówki będzie trudna do zmierzenia, ale końcówka o tej długości prawdopodobnie wytworzy mocną, ale elastyczną igłę, która będzie odpowiednia do mikromanipulacji. Alternatywnie, ściągacz do mikropipet może być użyty do stworzenia szklanej rurki o odpowiedniej średnicy końcówki (eksperymentator będzie musiał przetestować różne receptury ciągnięcia, aby wytworzyć odpowiednio mocną, ale elastyczną mikroigłę do tego zadania). Igła może być umieszczona w uchwycie, który ma kształt podobny do igły manipulacyjnej utworzonej według metody opisanej powyżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umiejscowienie mikromanipulatora
	<ol>
		<li>Przygotowany szkiełko należy umieścić na stoliku odwróconego mikroskopu z kontrastem fazowym. Znajdź dzielące się komórki i wyśrodkuj je w polu widzenia. Ustaw ostrość na komórkach, używając najmniejszego możliwego powiększenia. 
		UWAGA: Użyliśmy obiektywu z kontrastem fazowym 16x.</li>
		<li>Umieść mikroigłę w uchwycie igły na mikromanipulatorze.</li>
		<li>Ręcznie ustaw mikroigłę na ścieżce światła mikroskopu tak, aby końcówka igły była oświetlona światłem (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5B).</li>
		<li>Ustaw ostrość mikroskopu kilka płaszczyzn ogniskowych powyżej płaszczyzny, w której leżą komórki.</li>
		<li>Kilkakrotnie zmień położenie mikroigły za pomocą joysticka sterującego na niską czułość, aby znaleźć cień igły w osiach X i Y. Kontynuuj regulację pozycji, aż położenie końcówki będzie widoczne. Wyreguluj położenie igły wzdłuż osi Z, aż końcówka igły znajdzie się w ostrości.</li>
		<li>Ponownie ustaw ostrość na komórkach, a następnie ustaw ostrość mikroskop nad płaszczyzną komórki, tak aby komórki były po prostu nieostre i niewidoczne. Ponownie wyreguluj położenie igły tak, aby jej końcówka była ostra w tej płaszczyźnie ogniskowej.</li>
		<li>Dostosuj powiększenie mikroskopu zgodnie z potrzebami. 
		UWAGA: Do mikromanipulacji użyliśmy obiektywu z kontrastem fazowym 100X 1,4 z aperturą numeryczną (NA).</li>
		<li>Po ustawieniu ostrości na komórkach za pomocą obiektywu o większym powiększeniu, ponownie ustaw ostrość mikroskop powyżej płaszczyzny komórki, tak aby komórki były po prostu nieostre i niewidoczne. Używając wyższego ustawienia czułości, dostosuj położenie igły tak, aby jej końcówka była ostra i wyśrodkowana w płaszczyźnie ogniskowej powyżej płaszczyzny, w której leżą komórki.</li>
		<li>Ponownie ustaw ostrość na komórkach, dostosowując ich położenie tak, aby pozostały w środku pola widzenia. Igła jest teraz gotowa do mikromanipulacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikromanipulacja chromosomami
	<ol>
		<li>Używając tego samego ustawienia czułości, co w przypadku precyzyjnego pozycjonowania przy dużym powiększeniu, użyj joysticka, aby sterować mikroigłą i popychać chromosomy do wnętrza komórki. Utrzymuj końcówkę igły powyżej płaszczyzny komórek.</li>
		<li>Aby pociągnąć lub przesunąć chromosom, skup się na chromosomie znajdującym się w górnej części komórki. 
		UWAGA: Te chromosomy są łatwiejsze do manipulowania - manipulowanie chromosomami w pobliżu szkiełka nakrywkowego zwiększa prawdopodobieństwo, że igła wbije się w szkiełko nakrywkowe, rozrywając komórkę i kończąc eksperyment.</li>
		<li>Wyreguluj oś Z na joysticku, aby ustawić ostrość końcówki igły, a następnie przesuń końcówkę igły za pomocą joysticka w X i Y. Umieść końcówkę igły bezpośrednio na chromosomie, który ma być manipulowany i popchnij ją w żądanym kierunku, aby umożliwić manipulatorowi zmianę położenia chromosomu.</li>
		<li>W zależności od tego, jak daleko chromosom jest wypchnięty, należy albo naprężyć chromosom, albo zastosować wystarczające napięcie, aby oderwać chromosom od wrzeciona. Po usunięciu chromosomu z wrzeciona umieść go w dowolnym miejscu komórki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Chambers, R. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/jez.1400230302">Microdissection studies II. The cell aster: a reversible gelation phenomenon.</a> Journal of Experimental Zoology. 23 (3), 483-505 (1917).</li>
<li>Carlson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+studies+of+the+dividing+neuroblast+of+the+grasshopper%2C+Chortophaga+viridifasciata%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Microdissection studies of the dividing neuroblast of the grasshopper, Chortophaga viridifasciata.</a> Chromosoma. 5 (3), 199-220 (1952).</li>
<li>Nicklas, R. B., Staehly, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+micromanipulation.+I.+The+mechanics+of+chromosome+attachment+to+the+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Chromosome micromanipulation. I. The mechanics of chromosome attachment to the spindle.</a> Chromosoma. 21 (1), 1-16 (1967).</li>
<li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+micromanipulation.+II.+Induced+reorientation+and+the+experimental+control+of+segregation+in+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Chromosome micromanipulation. II. Induced reorientation and the experimental control of segregation in meiosis.</a> Chromosoma. 21 (1), 17-50 (1967).</li>
<li>Nicklas, R. B., Koch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+micromanipulation.+3.+Spindle+fiber+tension+and+the+reorientation+of+mal-oriented+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosome micromanipulation. 3. Spindle fiber tension and the reorientation of mal-oriented chromosomes.</a> Journal of Cell Biology. 43 (1), 40-50 (1969).</li>
<li>Nicklas, R. B., Ward, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elements+of+error+correction+in+mitosis%3A+microtubule+capture%2C+release%2C+and+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Elements of error correction in mitosis: microtubule capture, release, and tension.</a> Journal of Cell Biology. 126 (5), 1241-1253 (1994).</li>
<li>Li, X., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+forces+control+a+cell-cycle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint.</a> Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).</li>
<li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+the+force+produced+by+the+mitotic+spindle+in+anaphase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase.</a> Journal of Cell Biology. 97 (2), 542-548 (1983).</li>
<li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forces+that+move+chromosomes+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The forces that move chromosomes in mitosis.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 431-449 (1988).</li>
<li>Nicklas, R. B., Koch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+micromanipulation.+IV.+Polarized+motions+within+the+spindle+and+models+for+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Chromosome micromanipulation. IV. Polarized motions within the spindle and models for mitosis.</a> Chromosoma. 39 (1), 1026(1972).</li>
<li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+chromosomes+and+centrosomes+on+spindle+assembly+as+observed+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The impact of chromosomes and centrosomes on spindle assembly as observed in living cells.</a> Journal of Cell Biology. 129 (5), 1287-1300 (1995).</li>
<li>Nicklas, R. B., Lee, G. M., Rieder, C. L., Rupp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+cut+mitotic+spindles%3A+clean+cuts+and+stable+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanically cut mitotic spindles: clean cuts and stable microtubules.</a> Journal of Cell Science. 94 (Pt 3), 415-423 (1989).</li>
<li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomes+initiate+spindle+assembly+upon+experimental+dissolution+of+the+nuclear+envelope+in+grasshopper+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosomes initiate spindle assembly upon experimental dissolution of the nuclear envelope in grasshopper spermatocytes.</a> Journal of Cell Biology. 131 (5), 1125-1131 (1995).</li>
<li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+distribution%3A+experiments+on+cell+hybrids+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London+B%22%5BJournal%5D)">Chromosome distribution: experiments on cell hybrids and in vitro.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. 227 (955), 267-276 (1977).</li>
<li>Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reduction+of+chromosome+number+in+meiosis+is+determined+by+properties+built+into+the+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The reduction of chromosome number in meiosis is determined by properties built into the chromosomes.</a> Journal of Cell Biology. 150 (6), 1223-1232 (2000).</li>
<li>Church, K., Nicklas, R. B., Lin, H. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2114567/">Micromanipulated bivalents can trigger mini-spindle formation in Drosophilamelanogaster spermatocyte cytoplasm.</a> Journal of Cell Biology. 103 (6), 2765-2773 (1986).</li>
<li>Forer, A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+autosome+movements+and+of+sex-chromosome+movements+on+sex-chromosome+segregation+in+crane+fly+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Influence of autosome movements and of sex-chromosome movements on sex-chromosome segregation in crane fly spermatocytes.</a> Chromosoma. 40 (4), 417-442 (1973).</li>
<li>Camenzind, R., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+non-random+chromosome+segregation+in+spermatocytes+of+Gryllotalpa+hexadactyla.+A+micromanipulation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">The non-random chromosome segregation in spermatocytes of Gryllotalpa hexadactyla. A micromanipulation analysis.</a> Chromosoma. 24 (3), 324-335 (1968).</li>
<li>Ault, J. G., Felt, K. D., Doan, R. N., Nedo, A. O., Ellison, C. A., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-segregation+of+sex+chromosomes+in+the+male+black+widow+spider+Latrodectus+mactans+%28Araneae%2C+Theridiidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Co-segregation of sex chromosomes in the male black widow spider Latrodectus mactans (Araneae, Theridiidae).</a> Chromosoma. 126 (5), 645-654 (2017).</li>
<li>Felt, K. D., Lagerman, M. B., Ravida, N. A., Qian, L., Powers, S. R., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+the+amphitelically+attached+univalent+X+chromosome+in+the+spittlebug+Philaenus+spumarius%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Segregation of the amphitelically attached univalent X chromosome in the spittlebug Philaenus spumarius.</a> Protoplasma. 254 (6), 2263-2271 (2017).</li>
<li>Golding, A. E., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyotype%2C+sex+determination%2C+and+meiotic+chromosome+behavior+in+two+pholcid+%28Araneomorphae%2C+Pholcidae%29+spiders%3A+implications+for+karyotype+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Karyotype, sex determination, and meiotic chromosome behavior in two pholcid (Araneomorphae, Pholcidae) spiders: implications for karyotype evolution.</a> PLoS One. 6, e24748(2011).</li>
<li>Doan, R. N., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromanipulation+reveals+an+XO-XX+sex+determining+system+in+the+orb-weaving+spider+Neoscona+arabesca+%28Walckenaer%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hereditas%22%5BJournal%5D)">Micromanipulation reveals an XO-XX sex determining system in the orb-weaving spider Neoscona arabesca (Walckenaer).</a> Hereditas. 146 (4), 180-182 (2009).</li>
<li>Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromanipulation+of+chromosomes+reveals+that+cohesion+release+during+cell+division+is+gradual+and+does+not+require+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Micromanipulation of chromosomes reveals that cohesion release during cell division is gradual and does not require tension.</a> Current Biology. 14 (23), 2124-2129 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biology+Micromanipulator.+DIY+High+Precision+Micromanipulator%22">Biology Micromanipulator. DIY High Precision Micromanipulator</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://micromanipulator.scholar.bucknell.edu">http://micromanipulator.scholar.bucknell.edu</a> (2018).</li>
<li>Ellis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezoelectric+micromanipulators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Piezoelectric micromanipulators.</a> Science. 138 (3537), 84-91 (1962).</li>
<li>Ellis, G. W., Begg, D. A. Chromosome micromanipulation studies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEllis%2C+GW+%22Mitosis%2FCytokinesis%22">Mitosis/Cytokinesis</a>. Zimmerman , A. M., Forer, A. , Academic Press. 155-179 (1981).</li>
<li>Powell, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microforge+attachment+for+the+biological+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal.+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">A microforge attachment for the biological microscope.</a> Journal. Royal Microscopical Society. 72 (4), 214-217 (1953).</li>
<li>Alsop, G. B., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+continuously+dictate+distribution+of+actin+filaments+and+positioning+of+cell+cleavage+in+grasshopper+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Microtubules continuously dictate distribution of actin filaments and positioning of cell cleavage in grasshopper spermatocytes.</a> Journal of Cell Science. 117 (Pt 8), 1591-1602 (2004).</li>
<li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase%27+and+cytokinesis+in+the+absence+of+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Anaphase' and cytokinesis in the absence of chromosomes.</a> Nature. 382, 466-468 (1996).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wraz z praktyką przesuwanie chromosomów w komórce może stać się drugą naturą. Igły, które są zarówno wystarczająco sztywne, jak i wystarczająco cienkie, są trudne do "opanowania" w wytwarzaniu, ale ta umiejętność przychodzi również z praktyką. Igły, które są tak cienkie, że odkształcają się podczas ruchu w oleju halowęglowym, nie będą przydatne do wpychania chromosomów w komórce. Igły, które są tak, że ich końcówki są widoczne i tak duże, jak 1/3 szerokości chromosomu (lub większej), z dużym prawdopodobieństwem zabiją ko...

Mikromanipulacja ujawniła część mechanizmu kongresacji chromosomów, punkt kontrolny wrzeciona i ruchy chromosomów anafazy. Najwcześniejsza publikacja opisująca wyniki eksperymentów mikromanipulacyjnych została napisana przez Roberta Chambersa1. Chambers używał mechanicznego mikromanipulatora z dołączoną szklaną igłą do badania cytoplazmy wielu różnych typów komórek. Niestety, metody kontrastowe, które pozwalały na wizualizację chromosomów i wielu innych składników komórkowych w żywych komórkach, nie były wówczas dostępne, więc eksperymenty Chambersa nie mogły pokazać efektów repozycjonowania takich składników komórkowych. Wczesne mikromanipulacje, które zmieniały pozycję chromosomów, wykorzystywały aparat Chambersa do zamiatania strefy środkowej wrzeciona w komórkach anafazowych, pokazując, że takie manipulacje mogą zmienić pozycję ramion chromosomów w neuroblastach anafazowych koników polnych2. Nicklas i jego współpracownicy byli pierwszymi, którzy przeprowadzili precyzyjne mikromanipulacje chromosomami, rozciągając chromosomy3, odłączając je od wrzeciona i wywołując reorientację3,4, stabilizując nieprawidłową orientację poprzez przyłożenie napięcia do chromosomów5,6,7, oraz mierząc siły wytwarzane przez wrzeciona w anaphase8,9. Inne prace przeprowadzone przez laboratorium Nicklas wykazały, że ziarnistościami cytoplazmatycznymi można również manipulować10 i że centrosomy mogą być repozycjonowane za pomocą mikromanipulacji11. Mikromanipulacja jest przydatna nie tylko do przenoszenia chromosomów i innych składników komórkowych. Igła do mikromanipulacji może czysto przeciąć wrzeciono mitotyczne w zdemembranowanych komórkach12 lub może być użyta do rozpuszczenia otoczki jądrowej13. Ponadto sąsiednie komórki mogą być łączone za pomocą mikromanipulacji14,15.
Przy tak szerokiej gamie interesujących eksperymentów, które można przeprowadzić za pomocą mikromanipulacji, na pierwszy rzut oka zaskakujące jest, że eksperymenty mikromanipulacji zostały przeprowadzone przez bardzo niewielu biologów chromosomowych. Jednym z powodów tego niedoboru jest to, że mitotycznie dzielące się hodowane komórki, które pochodzą z tkanek kręgowców i są powszechnie używane do badania ruchów chromosomów, są niezwykle trudne do mikromanipulacji. Te komórki hodowli tkankowej na ogół mają cytoszkielet korowy, który "przeszkadza" igle do mikromanipulacji, a chromosomy albo nie mogą być osiągnięte przez igłę, albo igła przebija się przez komórkę, prowadząc do pęknięcia i śmierci komórki. My i inni eksperymentatorzy, którzy stosują mikromanipulację, odkryliśmy, że komórki stawonogów są podatne na mikromanipulację. Spermatocyty stawonogów łatwo rozprzestrzeniają się pod warstwą oleju halowęglowego i wydają się mieć znacznie mniej wytrzymały cytoszkielet korowy pod błoną komórkową podczas podziału komórki. W ten sposób jądra stawonogów stanowią dobre źródło komórek dzielących się meiotycznie (spermatocyty) i komórek dzielących się mitotycznie (spermatogonia) z łatwo dostępnymi chromosomami do mikromanipulacji. Seryjne cięcie spermatocytu konika polnego utrwalonego podczas manipulacji ujawniło, że igła nigdy nie penetruje błony komórkowej; błona komórkowa deformuje się wokół igły (Nicklas R.B., komunikacja osobista). Spermatocyty wielu taksonów owadów i pająków zostały z powodzeniem poddane mikromanipulacji, w tym konikom polnym, modliszkom, muszkom owocowym, muchom żurawiowym, świerszczom, plucikom,, pająkom czarnej wdowy, pająkom piwnicznym i pająkom tkającym kule3,7,17,18,19,20,21,22. Hodowane, mitotycznie dzielące się komórki owadów mogą być mikromanipulowane. Na przykład chromosomy w neuroblastach koników polnych w kulturze pierwotnej mają chromosomy, którymi można łatwo manipulować za pomocą mikromanipulacji2,23. Podejrzewamy, że dostępne linie hodowlane pochodzące od Drosophila i innych owadów będą również mikromanipulowalne, chociaż nie testowaliśmy tej techniki na tych komórkach. Pokażemy, jak można przygotować dzielące się komórki koników polnych i świerszczy do mikromanipulacji. Świerszcze można łatwo dostać w większości sklepów zoologicznych o każdej porze roku. Koniki polne są łatwo dostępne tylko latem, chyba że badacz ma dostęp do kolonii laboratoryjnej, ale używany gatunek (Melanoplus sanguinipes) ma łatwo spłaszczone komórki i długie, łatwe do manipulowania chromosomy.
Innym powodem, dla którego eksperymenty z mikromanipulacją zostały przeprowadzone przez niewielką garstkę biologów, jest to, że mikromanipulatory, które dobrze poruszają chromosomami, są rzadko dostępne na rynku. Odkryliśmy, że mikromanipulator piezoelektryczny sterowany joystickiem kontroluje ruch igły bez wibracji, dryfu lub opóźnienia między ruchem joysticka a ruchem igły, ale inne typy manipulatorów mogą również z powodzeniem przesuwać chromosomy w komórce. Mikromanipulatory zaprojektowane przez Ellisa i Begga25,26 są idealne do mikromanipulacji chromosomami, chociaż wykorzystują starszą technologię. Mikromanipulatory piezoelektryczne są obecnie dostępne i powszechnie stosowane w elektrofizjologii; Jednak te mikromanipulatory nie są zazwyczaj sterowane joystickiem. Sterowanie joystickiem jest kluczem do płynnych ruchów wymaganych do udanej mikromanipulacji, dlatego należy skonstruować niestandardowy joystick, aby obecnie dostępne mikromanipulatory piezoelektryczne działały w mikromanipulacji chromosomowej. Mikromanipulatory piezoelektryczne sterowane joystickiem, które działają najlepiej, mają bezpośrednią kontrolę położenia, w której ruch joysticka przekłada się bezpośrednio na ruch igły.
Nowo zaprojektowany mikromanipulator piezoelektryczny może być zbudowany z dostępnych na rynku części, które można łatwo wymienić, oraz z małych elementów drukowanych w 3D, i dobrze sprawdza się w mikromanipulacji chromosomami24. Mikromanipulator ma regulowaną czułość, ręczne pozycjonowanie zgrubne i brak wibracji, dryfu lub opóźnień w ruchu igły oraz bezpośrednią kontrolę położenia igły. Naukowcy mogą skonstruować mikromanipulator, korzystając z instrukcji dostępnych online24. Poniżej przedstawiono metody przygotowania pierwotnej hodowli komórek spermatocytów i mikromanipulowania chromosomami w komórkach w tej hodowli.

<table><tbody><tr><td>Mikro szkło osłonowe VWR</td><td>VWR</td><td>48366 249</td><td>25 mm x 25 mm, nie 1,5</td></tr><tr><td>Dow Corning Smar wysokopróżniowy</td><td>VWR</td><td>AA44224-KT</td><td></td></tr><tr><td>KEL-F Oil #10</td><td>Ohio Valley Specialty Chemical</td><td>10189</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikropreparacji, stal nierdzewna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3271-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 fine foreceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Średnica zewnętrzna 0,85 mm, średnica wewnętrzna 0,65 mm rurka ze szkła Pyrex&nbsp;</td><td>Drummond Scientific</td><td>Zamówienie niestandardowe - zadzwoń w celu złożenia wniosku</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony, fazowy mikroskop kontrastowy z 10-krotnym lub 16-krotnym obiektywem o małym powiększeniu i 60-krotnym lub 100-krotnym obiektywem o dużym powiększeniu</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikrokuźnia</td><td>zbudowana na zamówienie lub mikromanipulator Narashige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td></td><td>zbudowany na zamówienie lub Burleigh PCS-6000 z niestandardowym joystickiem sterującym piezo-pieczo</td><td>PCS-6300</td><td></td></tr></tbody></table>

mikromanipulacja chromosomami w spermatocytach owadów

Micromanipulation of Chromosomes in Insect Spermatocytes

Mikromanipulacja chromosomami była podstawową metodą wyjaśnienia mechanizmu kongresacji chromosomów, punktu kontrolnego wrzeciona i ruchów chromosomów anafazowych, a także była kluczem do zrozumienia, co kontroluje ruchy chromosomów podczas podziału komórki. Wykwalifikowany biolog może użyć mikromanipulatora do odłączenia chromosomów od wrzeciona, do przemieszczenia chromosomów w komórce i do przyłożenia sił do chromosomów za pomocą małej szklanej igły z bardzo cienką końcówką. Podczas gdy perturbacje chromosomów można wywołać przy użyciu innych metod, takich jak pułapkowanie optyczne i inne zastosowania lasera, do tej pory żadna inna metoda nie pozwala na repozycjonowanie składników komórkowych w skali od dziesiątek do setek mikronów przy niewielkim lub zerowym uszkodzeniu komórki.
Wybór i przygotowanie odpowiednich komórek do mikromanipulacji chromosomami, szczegółowo opisując przygotowanie pierwotnych kultur spermatocytów konika polnego i świerszcza do użycia w obrazowaniu żywych komórek i mikromanipulacji, są opisane tutaj. Ponadto pokazujemy konstrukcję igły, która ma być używana do przesuwania chromosomów w komórce, oraz zastosowanie sterowanego joystickiem mikromanipulatora piezoelektrycznego z przymocowaną do niego szklaną igłą do repozycji chromosomów w dzielących się komórkach. Przykładowy wynik pokazuje użycie mikromanipulatora do odłączenia chromosomu od wrzeciona w pierwotnym spermatocycie i przemieszczenia tego chromosomu w komórce.

Rysunek 6 przedstawia przykładową mikromanipulację dwiema sąsiadującymi pierwotnymi spermatocytami pasikonika w kilku przykładach możliwych zastosowań mikromanipulacji. Eksperyment ten został przeprowadzony przy użyciu odwróconego mikroskopu fazowo-kontrastowego. Obraz z 0:00 (czasy podano w min:s) pokazuje obie komórki przed manipulacją. Jeden chromosom w dolnej komórce jest pokazany pod wpływem naprężenia wywołanego przez igłę do mikromanipulacji (0:05; cza...

W tym protokole opisujemy wybór i przygotowanie odpowiednich komórek do mikromanipulacji oraz użycie mikromanipulatora piezoelektrycznego do repozycji chromosomów w tych komórkach.

Mikromanipulacja chromosomami w spermatocytach owadów

The micromanipulation of chromosomes has been an essential method for illuminating the mechanism for chromosome congression, the spindle checkpoint, and ...

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii komórki, takie jak, jak ważne jest napięcie w zaspokojeniu punktu kontrolnego wrzeciona i jaka jest rola przyczepu wrzeciona w zachowaniu chromosomów w zwężeniu źrenicy? Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to technika nieletalna, która pozwala eksperymentatorowi na naprężenie lub zmianę położenia chromosomów w żywej komórce. Na początek przygotuj szkiełko o wymiarach 75 na 25 milimetrów z okrągłym otworem o średnicy 20 milimetrów wyciętym pośrodku.Następnie przeprowadź szczelinę pokrywy o wymiarach 25 na 25 milimetrów i średnicy 1,5 przez płomień palnika Bunsena przez dwie sekundy. Nałóż smar próżniowy wokół krawędzi otworu w szkiełku podstawowym. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na otworze i dociśnij go, aby uzyskać szczelne uszczelnienie.Odwróć suwak i napełnij nowo utworzoną studnię rozwarstwiającą olejem halowęglowym. Po uzyskaniu kilku dorosłych samców świerszczy użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć powierzchnię grzbietową równolegle do długiej osi brzucha, bezpośrednio za pąkami skrzydeł. Następnie delikatnie ściśnij brzuch, aby przepchnąć jądra przez nacięcie w egzoszkielecie.Za pomocą kleszcz

micromanipulation-of-chromosomes-in-insect-spermatocytes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie mikroiniekcji i obrazowania o wysokiej rozdzielczości w zarodku syncytialnym Drosophila melanogaster w celu badania mitozy.

Techniki mikroiniekcji do badania mitozy w embrionie syncytialnym Drosophila melanogaster

Oocyty są podatne na aneuploidię z powodu błędów w segregacji chromosomów podczas dojrzewania meiotycznego. Aneuploidne komórki jajowe mogą prowadzić do niepłodności, poronień lub zaburzeń rozwojowych, takich jak zespół Downa. W niniejszej pracy opisujemy metody wprowadzania wybranych materiałów do oocytów oraz metody badania dojrzewania meiotycznego i oceny ploidii.

Mikroiniekcja, dojrzewanie i ocena ploidii oocytów mysich

Metody izolowania i przygotowywania próbek jąder Drosophila (żywych i stałych) do obrazowania za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego i fluorescencji są opisane tutaj.

Cytologiczna analiza spermatogenezy: żywe i utrwalone preparaty jąder Drosophila

Malowanie chromosomów jest użyteczną metodą do badania organizacji jądra komórkowego i ewolucji kariotypu. W tym miejscu demonstrujemy podejście do izolowania i amplifikacji określonych regionów zainteresowania z pojedynczych chromosomów politenowych, które są następnie wykorzystywane do dwu- i trójwymiarowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Malowanie chromosomów 2D i 3D u komarów malarii

Mejoza to proces rozwojowy, w którym gamety są formowane przez pojedynczą rundę replikacji DNA i dwie kolejne rundy segregacji chromosomów. Mejozę ssaków można zbadać, wykorzystując technikę przygotowania mejotycznych rozsiewów chromosomów. W tym miejscu przedstawiono metodę przygotowania jąder rozsianych powierzchniowo ze spermatocytów myszy.

Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów myszy

Celem tej techniki zgniatania kanalików jest szybka ocena cech cytologicznych rozwijających się mysich spermatocytów przy jednoczesnym zachowaniu integralności komórkowej. Metoda ta pozwala na badanie wszystkich etapów spermatogenezy i może być łatwo stosowana wraz z innymi biochemicznymi i molekularnymi podejściami biologicznymi do badania mejozy myszy.

Technika squasha kanalików nasiennych do cytologicznej analizy spermatogenezy z wykorzystaniem modelu mysiego

Rozprzestrzenianie się powierzchni jądrowej jest niezbędnym narzędziem do badania zdarzeń chromosomowych podczas mejozy. Tutaj demonstrujemy metodę przygotowania i wizualizacji chromosomów mejotycznych podczas profazy I ze spermatocytów danio pręgowanego.

Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy prostą i skuteczną metodę izolowania żywych mejotycznych i postmejotycznych komórek rozrodczych od jąder dorosłych myszy. Korzystając z barwnika wiążącego DNA o niskiej cytotoksyczności, wzbudzonego fioletem i sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, można wyizolować wysoce wzbogacone populacje komórek spermatogennych do wielu dalszych zastosowań.

Izolacja mysich komórek spermatogennych za pomocą fioletowo-wzbudzonego, przepuszczalnego dla komórek barwnika wiążącego DNA

Ten artykuł opisuje in-vivo hamowanie CENP-E poprzez operację jamy brzusznej i wstrzyknięcie do jąder GSK923295, cenny model męskiego podziału mejotycznego. Korzystając z testów immunofluorescencji, cytometrii przepływowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej, pokazujemy, że hamowanie CENP-E powoduje niewspółosiowość chromosomów i niestabilność genomu w spermatocytach myszy.

Ocena funkcjonalna kinezyny-7 CENP-E w spermatocytach za pomocą inhibicji in vivo, immunofluorescencji i cytometrii przepływowej

Biorąc pod uwagę ich prostą anatomię, jądra Anopheles oferują dobry model cytologiczny do badania spermatogenezy. Protokół ten opisuje hybrydyzację in situ z fluorescencją na całej górze, technikę stosowaną do badania tego procesu biologicznego, a także fenotyp szczepów transgenicznych zawierających mutacje w genach zaangażowanych w produkcję plemników.

Hybrydyzacja fluorescencji in situ w całości w celu zbadania spermatogenezy u komara Anopheles

Tutaj wprowadzamy metodę wykonywania okrągłych wstrzyknięć spermatyd (ROSI) u myszy, technikę o obiecujących zastosowaniach klinicznych i użyteczność do badania mechanizmów leżących u podstaw rozwoju embrionalnego.

Wstrzyknięcie okrągłego plemnika myszy

Poznaj technikę mikromanipulacji chromosomów w żywych komórkach spermatocytów owadów przy użyciu mikromanipulatora piezoelektrycznego. Ta nieinwazyjna metoda pozwala badać rolę napięcia w punkcie kontrolnym wrzeciona podczas mejozy.

Mikromanipulacja chromosomami w spermatocytach owadów

Przeglądaj więcej filmów