Wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek

Ogólnym celem tej metodologii jest umożliwienie scharakteryzowania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną komórek adherentnych w sposób wysoce ilościowy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w rozwijającej się dziedzinie biomechaniki gospodarz-patogen, takie jak rola sił mechanicznych w modulowaniu podatności komórek gospodarza na infekcje bakteryjne. Technika ta pomaga tworzyć sekwencje filmów poklatkowych o wysokiej rozdzielczości, jednocześnie monitorując wiele warunków i automatyzując niektóre procedury.

Aby przeprowadzić aktywację szkła w 24-dołkowych szalkach, dodaj 500 mikrolitrów wodorotlenku sodu tumalo na studzienkę o średnicy 13 milimetrów i inkubuj płytki w temperaturze pokojowej przez godzinę. Wyrzuć wodorotlenek sodu i użyj ultraczystej wody do jednokrotnego przepłukania studzienek. Następnie dodaj 500 mikrolitrów dwuprocentowego trietoksysilanu w 95% etanolu do każdej studzienki i inkubuj je przez pięć minut.

Wodą przepłucz studzienki raz. Następnie dodaj 500 mikrolitrów 0,5% aldehydu glutarowego do każdej studzienki i inkubuj płytki przez 30 minut. Po jednokrotnym spłukaniu wodą osusz płytki w temperaturze 60 stopni Celsjusza bez pokrywki.

Aby wyprodukować hydrożele o sztywności przestrajanej, należy przygotować roztwory wodne, które zawierają od trzech do 10 procent 40% podstawowego roztworu akrylamidu i od 06 do 6 procent dwuprocentowego roztworu bis-akrylamidu, w zależności od pożądanej sztywności hydrożelu. Następnie dodaj wodę. Dla każdej sztywności roztwór pierwszy jest wolny od koralików, podczas gdy roztwór drugi zawiera 03%0,1 mikrometra fluorescencyjnego mikrogranulki.

Roztwory Deodgazowuje jeden i dwa próżnią przez 15 minut, aby wyeliminować tlen, który zahamuje polimeryzację. Następnie, działając szybko, dodaj 0,43% TEMED i 0,6% podstawowego roztworu APS o gramaturze 10 gramów na mililitr do roztworu pierwszego. Dodaj 3,6 mikrolitra roztworu do środka każdego dołka 24-dołkowego naczynia.

Natychmiast użyj 12-milimetrowych okrągłych szkiełek nakrywkowych, aby przykryć studzienki i pozostaw roztwór na 20 minut, aby w pełni się spolimeryzował. Delikatnie postukać igłą strzykawki w twardą powierzchnię, aby utworzyć mały haczyk na jej końcu, aby ułatwić usunięcie szkiełek nakrywkowych, a następnie użyć igły, aby podnieść szkiełka nakrywkowe. Następnie dodaj 0,43% TEMED i 0,6% podstawowego roztworu APS o gramaturze 10 gramów na mililitr do roztworu drugiego.

Następnie nałóż 2,4 mikrolitra mieszaniny na 12-milimetrowe okrągłe szkiełka nakrywkowe. Umieść okrągłe szkiełka nakrywkowe z kroplą roztworu drugiego na wierzchu pierwszej warstwy poliakrylamidu i delikatnie dociśnij kleszcze w dół, aby upewnić się, że grubość drugiej warstwy jest minimalna. Następnie pozwól roztworowi drugiemu polimeryzować przez 20 minut.

Dodaj 500 mikrolitrów 50 milimolowych HEPES o pH 7,5 do każdej z studzienek i użyj igły strzykawkowej i kleszczyków, aby usunąć szklane szkiełka nakrywkowe. Aby wysterylizować hydrożele, umieść je w kapturze do hodowli tkanek i wystaw na działanie promieniowania UV przez godzinę. Teraz przygotuj mieszaninę 0,5% wagowo na objętość sulfo-SANPAH i jednego procenta DMSO oraz 50 milimolowych HEPES o pH 7,5.

Dodaj 200 mikrolitrów roztworu do górnej powierzchni hydrożeli. Następnie, pracując szybko, naświetl je promieniami UV o długości 302 nanometrów przez 10 minut, aby je aktywować. Użyj jednego mililitra 50-milimolowego HEPES o pH 7,5, aby dwukrotnie umyć hydrożele, powtarzając w razie potrzeby w celu usunięcia nadmiaru środka sieciującego.

Hydrożele pokryj proteinami 200 mikrolitrów 0,25 miligrama na mililitr kolagenu z ogona szczura I i 50 milimolowymi HEPES. Inkubuj hydrożele z kolagenem w temperaturze pokojowej przez noc. Przed wysianiem interesujących komórek na hydrożelach dodaj jeden mililitr pożywki i równoważ je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Aby wysiać ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego, po wyhodowaniu i przygotowaniu zawiesiny komórkowej zgodnie z protokołem tekstowym, usuń pożywkę z hydrożeli, a następnie dodaj jeden mililitr zawiesiny komórkowej do każdej studzienki. Po przygotowaniu nocnej hodowli L.monocytogenes zgodnie z protokołem tekstowym, przenieść jeden mililitr kultury do probówki mikrowirówkowej i wirować ją z prędkością 2 000 g w temperaturze pokojowej przez cztery minuty. Po dwukrotnym umyciu osadu PBS klasy hodowli tkankowej, należy użyć jednego mililitra PBS do ponownego zawieszenia osadu.

Przygotuj mieszaninę infekcji, łącząc 10 lub 50 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej z jednym mililitrem pełnego podłoża MCDB 131 dla wielokrotności infekcji lub MOI około 50 bakterii na komórkę gospodarza lub 10 bakterii na komórkę gospodarza. Usunąć pożywkę z dołków 24-dołkowych płytek, uważając, aby nie uszkodzić hydrożeli ani komórek. Użyj jednego mililitra pełnego podłoża MCDB 131, aby raz umyć komórki, a następnie dodaj jeden mililitr bakterii do każdej studzienki.

Umieść pokrywkę na talerzach i owiń je folią spożywczą z polietylenu, aby uniknąć wycieku. Odwirować płytki w temperaturze 2 000 g przez 10 minut, aby zsynchronizować inwazję, a następnie inkubować kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Za pomocą pełnej pożywki MCDB 131 umyć próbki cztery razy i umieścić je z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych.

Po dodatkowych 30 minutach zastąpić pożywkę pełną pożywką MCDB 131 uzupełnioną o 20 mikrogramów na mililitr gentamycyny. Aby przeprowadzić cytometrię przepływową, osiem godzin po zakażeniu usuń pożywkę z dołków 24-dołkowej płytki i użyj PBS z hodowli tkankowej, aby raz umyć studzienki. Po usunięciu PBS dodaj 200 mikrolitrów mieszanki kolagenazy trypsyny EDTA do każdej studzienki.

Umieść naczynie w inkubatorze do hodowli tkankowych na 10 minut, aby umożliwić całkowite oderwanie komórek. Po delikatnym odpipetowaniu każdej studzienki osiem razy, dodaj 200 mikrolitrów pełnej pożywki, aby zneutralizować trypsynę. Przenieś 400 mikrolitrów roztworu komórkowego z każdej studzienki do pięciomililitrowej rurki polistyrenowej z 35-mikrometrową nasadką sitkową

Analizować próbki metodą cytometrii przepływowej. Po wysianiu komórek HMEC-1 na hydrożelach Pa i potraktowaniu gentamycyną zgodnie z protokołem tekstowym, inkubuj płytkę przez pięć godzin, aby umożliwić promotorowi ActA włączenie i sterowanie ekspresją otwartej ramki odczytu mTagRFP. Cztery godziny po zakażeniu wymieszaj jeden mikrolitr jednego miligrama na mililitr barwnika Hoechst z jednym mililitrem pełnej pożywki L-15 i dodaj go do każdej studzienki, aby zabarwić jądra.

Po inkubacji komórek przez 10 minut, zastąp pożywkę jednym mililitrem pełnej pożywki L-15 uzupełnionej 20 mikrogramami na mililitr gentamycyny. Obrazuj wiele pozycji co pięć minut za pomocą funkcji automatycznego ustawiania ostrości, aby monitorować, w jaki sposób bakterie LM rozprzestrzeniają się przez monowarstwy HMEC-1 osadzone na hydrożelach o różnej sztywności. Jak podano na tym wykresie, pomiary AFM zostały przeprowadzone w celu potwierdzenia dokładnej sztywności hydrożeli Pa przygotowanych przy użyciu protokołu przedstawionego w tym filmie.

W tym przypadku komórki HMEC-1 na matrycach o różnej sztywności zostały zakażone szczepem LM, który po internalizacji wyraża marker fluorescencyjny, który pozwala tylko na wykrycie bakterii wewnątrzkomórkowych. Komórki bramkowano przy użyciu wykresu punktowego przód kontra bok, a drugi etap bramkowania wykluczał komórki, które wykazywały autofluorescencję. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że zakażenie LM było około dwukrotnie większe w przypadku sztywnych hydrożeli o mocy 70 kilopaskala w porównaniu z hydrożelami o masie 0,6 kilopaskala.

Aby sprawdzić, czy zwiększona adhezja LM do HMEC-1 zwiększa inwazję LM do HMEC-1, czy też oba te czynniki są odpowiedzialne za zwiększoną podatność na infekcję wkrótce po zakażeniu LM konstytutywnie eksprymującym GFP, komórki HMEC-1 utrwalono, a przylegające bakterie wybarwiono przeciwciałami. Jak pokazano tutaj, było znacznie więcej bakterii przylegających do HMEC-1, gdy komórki gospodarza znajdują się na sztywno w porównaniu z miękkimi żelami. Zgodnie z danymi cytometrii przepływowej, istnieje znacznie więcej bakterii internalizowanych przez HMEC-1, gdy komórki gospodarza znajdują się na sztywno w porównaniu z miękkimi żelami.

Po opanowaniu test ten można wykonać w ciągu około trzech dni, ponieważ pomiędzy nimi wymagane są długie etapy inkubacji. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby być tak sterylnym, jak to tylko możliwe, aby upewnić się, że hydrożele i komórki gospodarza są wolne od zanieczyszczeń. Zgodnie z tą procedurą można również zastosować inne metody, takie jak mikroskopia sił atomowych, aby odpowiedzieć na pytania, takie jak to, jak zmienia się sztywność komórek gospodarza po infekcji i czy efekt ten zależy od sztywności matrycy.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się mechanobiologią do zbadania roli interakcji biomechanicznych patogenów komórek gospodarza przy użyciu różnych komórek gospodarza, takich jak komórki nabłonkowe, i różnych patogenów bakteryjnych, takich jak Rickettsia parkeri. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać hydrożele o regulowanej sztywności na płytkach wielodołkowych i jak przeprowadzić test infekcji. Nie zapominaj, że praca z bakteriami chorobotwórczymi może być niebezpieczna.

Dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak umieszczanie barier między miejscem wejścia a patogenem, a także zapobieganie wytwarzaniu się aerozoli.