Name: Wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Poznaj metodę wielodołkowego testu na poliakrylamidzie do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję komórek śródbłonka przez Listeria monocytogenes. Protokół umożliwia ilościową analizę mechanobiologii infekcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nasze podziękowania dla M. Footera, R. Lamasona, M. Rengaranjana i członków Theriot Lab za ich dyskusje i eksperymentalne wsparcie. Praca ta była wspierana przez NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), HHMI Gilliam Fellowship for Advanced Study (F.E.O.), Stanford Graduate Fellowship (F.E.O.), American Heart Association (E.E.B.), NIH 1R01HL128630 (RS) i NIH 1R01HL130840 (RS). Cytometrię przepływową wykonano w Stanford Shared FACS Facility.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Komórki mogą wyczuwać różne fizyczne sygnały środowiskowe, które mogą wpływać nie tylko na morfologię komórek, ale także na ich ekspresję genów i aktywność białek, wpływając w ten sposób na krytyczne funkcje i zachowania komórek45,46. Sztywność ECM komórek jest coraz bardziej doceniana jako ważny modulator ruchliwości komórek, różnicowania, proliferacji i ostatecznie losu komórki 47,48,49. Chociaż w ostatnim czasie poczyniono wiele postępów w zrozumieniu złożonej interakcji biomechanicznej między komórkami a ich ECM, niewiele wiadomo na temat tego, jak sztywność środowiska wpływa na podatność komórek na infekcje bakteryjne. Aby ułatwić takie badania, opracowaliśmy ten nowatorski test wielodołkowy oparty na dobrze znanym wytwarzaniu hydrożeli poliakrylamidowych o regulowanej sztywności, która jest zgodna z testami infekcji50. Tradycyjnie, infekcja bakteryjna komórek w hodowli tkankowej była badana na powierzchniach szklanych lub polistyrenowych, które są o około 1 - 3 rzędy wielkości sztywniejsze niż naturalny ECM większości przylegających komórek 8,51. Opisany tutaj test otwiera nowe autostrady, umożliwiając badanie interakcji bakteria-gospodarz w fizjologicznie istotnym reżimie sztywności środowiskowej.
W celu potwierdzenia słuszności koncepcji przedstawionego testu, wybrano komórki HMEC-1 jako modelowe przylegające komórki gospodarza oraz Lm jako modelowy patogen bakteryjny. Test może jednak zostać rozszerzony o dalsze badania, jeśli zostanie odpowiednio zmodyfikowany. Takie badania mogą obejmować zakażenie różnych typów przylegających komórek gospodarza ssaków przez dodatkowe patogeny, w tym bakterie i wirusy. W tym konkretnym teście żele były pokryte białkiem kolagenu I, ale w zależności od typu komórki gospodarza możliwe jest zastosowanie innej powłoki białkowej ECM, takiej jak laminina lub fibronektyna, aby ułatwić przyczepienie komórek gospodarza będących przedmiotem zainteresowania do hydrożelu52. Dodatkową kwestią, która zależy od typu komórki gospodarza, jest badany zakres sztywności hydrożelu. Zakres sztywności powinien zależeć od tego, co jest fizjologicznie istotne dla konkretnego typu komórki gospodarza i jak dobrze ten gospodarz przyczepia się, tworząc monowarstwę przy danej sztywności hydrożelu. Podobnie, w zależności od modelowego patogenu, który ma być badany, może być konieczne wprowadzenie niewielkich modyfikacji w opisanym w niniejszym dokumencie teście infekcji.
Innowacyjność testu w porównaniu z poprzednimi metodami wytwarzania hydrożeli poliakrylamidowych 24,50,53 polega na pewnych unikalnych cechach zintegrowanych z proponowanym testem infekcji. Po pierwsze, hydrożele są budowane na wielodołkowych szklanych płytkach dennych, co umożliwia jednoczesne badanie przesiewowe wielu warunków, a także automatyzację niektórych procedur. Monitorowanie wielu warunków w tym samym czasie lub badanie wielu kontrprób ma kluczowe znaczenie, ponieważ na wynik takiego podejścia mogą mieć wpływ takie czynniki, jak pasaż komórek gospodarza i dokładna liczba bakterii dodanych w celu zakażenia gospodarzy, które często zmieniają się między niezależnymi eksperymentami. Dodatkową unikalną cechą tego testu jest to, że hydrożele mają wysokość około 40 μm, która jest wystarczająco cienka, aby można było ją obrazować za pomocą konwencjonalnej mikroskopii. Wykazaliśmy, że możemy z powodzeniem przeprowadzić zarówno mikroskopię żywych komórek i ich utrwalanie, jak i barwienie immunologiczne, a następnie obrazowanie, bez wprowadzania wysokiej fluorescencji tła. Wreszcie, hydrożele są wykonane z dwóch warstw, z których górna ma osadzone mikrokulki fluorescencyjne, zamknięte w jednej płaszczyźnie ogniskowej. Ten atrybut gwarantuje, że podczas obrazowania nie będzie zakłócania ostrego światła. Obecność kulek umożliwia zarówno badanie topografii powierzchni żeli w celu upewnienia się, że są one jednolite, jak i poprawia wydajność TFM i MSM 24,32,41. Za pomocą TFM i MSM możliwe jest obliczenie odpowiednio sił komórka-ECM i komórka-komórka komórek znajdujących się na matrycach o różnej sztywności. Korzystając z tego nowatorskiego testu, możliwe jest wykonanie takich pomiarów sił fizycznych, porównując jednocześnie zarówno wpływ sztywności środowiskowej, jak i infekcji. Stosując takie podejście, można określić wpływ infekcji na mechanikę komórek gospodarza w całym jej przebiegu. Ponadto ewolucję naprężeń wewnątrzkomórkowych komórek można obliczyć za pomocą MSM i można ją wykorzystać jako miarę integralności bariery monowarstwy. Wreszcie, biorąc pod uwagę wielodołkowy charakter testu, możliwe jest jednoczesne wprowadzenie zaburzeń farmakologicznych i genetycznych związanych z infekcją bakteryjną, aby bardziej dogłębnie zbadać złożone zależności między mechaniką komórek gospodarza a infekcją.
Jednym z nieodłącznych ograniczeń tej techniki jest wpływ, jaki sztywność substratu może mieć na szybkość proliferacji komórek. Zazwyczaj w testach infekcji musimy upewnić się, że gęstość komórek gospodarza w różnych warunkach jest taka sama. Dzieje się tak, ponieważ gęstość komórek sama w sobie może mieć wpływ na podatność gospodarzy na infekcje. Komórki HMEC-1, które zostały użyte jako komórki gospodarza, nie wykazują znaczącej różnicy w swojej liczbie po wysiewie przez 24 godziny na hydrożelach. Jednak różne typy komórek mogą wykazywać zróżnicowaną proliferację, w zależności od sztywności hydrożelu, co może zniekształcać badania nad infekcjami. Podobnie, błąd infekcji może powstać, gdy komórki nie tworzą monowarstw lub nie przyczepiają się dobrze do hydrożeli, jak ma to miejsce, gdy niektóre typy komórek są wysiewane na bardzo miękkich matrycach (np. Ludzkie komórki śródbłonka pępowiny lub komórki nabłonka nerki psów Madin-Darby wysiane na hydrożelach 0,6-kPa54,55). Jeśli chodzi o patogeny, niektóre bakterie (np. Borrelia burdgorferi) mogą przyczepiać się do komórek gospodarza i atakować je, ale mogą również migrowaćprzez nie. Nie sprawdziliśmy jeszcze, czy ten test zadziała w badaniach nad transmigracją patogenów, ale wydaje się to możliwe, ponieważ poprzednie badania na neutrofilach transmigrujących komórkach śródbłonka wysianych na hydrożelach PA zostały udokumentowane, że działają z powodzeniem57. Przeprowadzono wiele badań pokazujących, jak wytwarzać hydrożele poliakrylamidowe o danym module Younga poprzez mieszanie odpowiednich stężeń akrylamidu i bis-akrylamidu 24,25,26,27. Jednakże, zwłaszcza gdy chce się przeprowadzić eksperymenty TFM na komórkach znajdujących się na hydrożelach o różnej sztywności, ważne jest, aby potwierdzić oczekiwaną sztywność hydrożeli za pomocą AFM lub innych technik wgłębiania58. Niewielkie odchylenia od wartości oczekiwanej mogą wynikać z użycia innego rozpuszczalnika lub starzonego roztworu podstawowego akryloamidu lub ze sposobu, w jaki wykonywane są pomiary AFM (np. kształt końcówki AFM). Wreszcie, przedstawione tutaj podejście opiera się na wysiewaniu komórek gospodarza na matrycach 2D, które mogą różnić się od bardziej realistycznego i fizjologicznie istotnego scenariusza 3D. Jednak wytwarzanie żeli 3D o regulowanej sztywności, zasiewanie ich komórkami gospodarza, a następnie infekowanie ich patogenami, nadal wiąże się z pewnymi trudnościami technicznymi. Niemniej jednak przewidujemy, że w niedalekiej przyszłości będziemy w stanie rozszerzyć obecny test do badania infekcji w warunkach 3D.
Podsumowując, opisany protokół wraz ze wstępnymi wynikami dostarczają dowodów na to, że ten nowatorski test może stać się niezwykle użytecznym narzędziem do badania infekcji przylegających komórek gospodarza bakteriami chorobotwórczymi w sposób ilościowy i w znacznie bardziej fizjologicznie istotnym środowisku niż dotychczas badane. Moc wytwarzania hydrożeli poliakrylamidowych w proponowanej konfiguracji polega na tym, że test jest kompatybilny z wydajnością wielu technik, takich jak cytometria przepływowa, barwienie immunologiczne, a następnie mikroskopia świetlna i mikroskopia sił trakcyjnych. Test może być wykorzystany do badań obejmujących zakażenie różnymi przylegającymi typami komórek gospodarza przez patogeny, co, jak przewidujemy, będzie miało znaczący wpływ zarówno na rozwikłanie strategii, za pomocą których patogeny infekują gospodarzy, jak i na ułatwienie opracowania interwencji terapeutycznych przeciwko infekcjom.

Komórki w większości tkanek zwierzęcych są zazwyczaj przylegające, przyczepiając się zarówno do sąsiednich komórek, jak i do ich macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Zakotwiczenie komórek w ich ECM ma kluczowe znaczenie dla wielu procesów komórkowych, począwszy od ruchliwości komórek, a skończywszy na proliferacji i przetrwaniu komórek1,2. Zakotwiczenie komórkowe do ECM zależy zarówno od składu ECM, jak i sztywności. Komórki reagują na zmiany w tym ostatnim poprzez dynamiczne przegrupowywanie swojego cytoszkieletu, adhezji komórka-ECM i komórka-komórka, co z kolei krytycznie zmienia biomechanikę i funkcje komórki3,4,5,6. Sztywność ECM może się różnić w zależności od przestrzeni (tj. lokalizacji anatomicznej), czasu (tj. starzenia się) oraz procesów patofizjologicznych (np. miażdżyca, rak, infekcje itp.). Na przykład powszechnie przyjmuje się, że komórki śródbłonka znajdujące się na sztywniejszych w porównaniu z bardziej miękkimi matrycami wywierają zwiększone siły na swoje ECM i na siebie nawzajem oraz wykazują zwiększoną ruchliwość i proliferację7,8. Podobnie, fibroblasty znajdujące się na sztywniejszych matrycach nadają swoim ECM duże siły skurczu i wykazują zwiększoną proliferację, ruchliwość i produkcję ECM9,10,11. Chociaż mechanika komórek i odpowiedź na sztywność ECM były szeroko badane dla różnych typów komórek, związek między przylegającymi komórkami gospodarza, sztywność ich ECM i infekcje bakteryjne są nadal w dużej mierze nieznane.
Aby zbadać rolę sztywności ECM w interakcjach bakteria-komórka gospodarza, L. monocytogenes (Lm) został wybrany jako modelowy patogen. Lm jest wszechobecną bakterią przenoszoną przez żywność, która może powodować infekcje ogólnoustrojowe u wielu różnych gospodarzy ssaków. Ten fakultatywny patogen wewnątrzkomórkowy może przemieszczać się z nabłonka jelitowego do odległych narządów, przechodząc przez różne typy śródbłonka naczyniowego. Jeśli naruszy barierę krew-mózg, Lm może spowodować zapalenie opon mózgowych, a gdy przekroczy łożysko, może spowodować samoistne poronienie12,13. Lm może infekować różne typy komórek gospodarza i może to robić przy użyciu różnych strategii patogennych. Zakażenie Lm było badane głównie w kontekście komórek nabłonkowych, podczas gdy znacznie mniej wiadomo o tym, jak Lm może infekować i omijać komórki śródbłonka wyściełające światło naczyń krwionośnych14,15,16. Co więcej, nadal w dużej mierze nie wiadomo, w jaki sposób sztywność ECM, w którym znajdują się komórki śródbłonka, moduluje zdolność Lm do inwazji na te komórki gospodarza, a następnie do rozprzestrzeniania się. Lm i kilka innych gatunków bakterii (np. Rickettsia parkeri) wykorzystują cytoszkielet aktynowy komórek gospodarza, które infekują, aby zarówno zaatakować ich cytoplazmę, jak i ułatwić rozprzestrzenianie się między komórkami17,18,19. Osiągają to poprzez ekspresję białek, które umożliwiają im zakłócanie szlaków polimeryzacji aktyny gospodarza i wytwarzanie ogonów komet aktynowych, które ułatwiają ich napęd do przodu16,20. W wyniku infekcji cytoszkielet aktynowy komórki gospodarza musi dynamicznie przegrupować się w sposób, który wciąż nie jest w pełni scharakteryzowany, potencjalnie wpływając na biomechanikę komórek gospodarza, w tym siły fizyczne, które wywierają na ich ECM i na siebie nawzajem. Aby zbadać te procesy, ludzkie komórki śródbłonka mikrokrążenia (HMEC-1) zostały wybrane jako modelowe komórki gospodarza z trzech powodów: 1. komórki śródbłonka są znane z tego, że są wysoce wrażliwe mechanicznie, ponieważ są stale narażone na różne sygnały fizyczne21; 2. Strategie stosowane przez Lm do infekowania komórek śródbłonka są nadal w dużej mierze nieznane22; oraz 3. HMEC-1 są unieśmiertelnioną linią komórkową i dlatego mogą być łatwo hodowane i poddawane manipulacjom genetycznym.
Infekcja bakteryjna komórek gospodarza była głównie badana in vitro poprzez umieszczanie komórek na podłożach szklanych lub polistyrenowych, które są znacznie sztywniejsze niż fizjologiczny ECM większości komórek12,14,23. Aby zbadać infekcję komórek wysianych na matrycy, której sztywność jest fizjologicznie istotna i wyjaśnić rolę sztywności ECM w zakażeniu komórek patogenami bakteryjnymi, zastosowaliśmy innowacyjne podejście oparte na wytwarzaniu cienkich hydrożeli poliakrylamidowych zatopionych w mikrokulkach o regulowanej sztywności na płytkach wielodołkowych. Nowatorstwo proponowanego podejścia polega na tym, że umożliwia ono monitorowanie wielu warunków jednocześnie ze względu na format wielodołkowy oraz na tym, że jest kompatybilne z wieloma technikami ze względu na szczególny sposób budowy substratów. Komórki HMEC-1 wysiano na tych pokrytych białkiem hydrożelach, a następnie zainfekowano różnymi szczepami Lm, które albo stają się fluorescencyjne po internalizacji, albo są konstytutywnie fluorescencyjne. Rolę sztywności ECM w podatności komórek HMEC-1 gospodarza na infekcje oceniano za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto wykorzystano barwienie immunologiczne i mikroskopię fluorescencyjną w celu rozróżnienia bakterii przylegających od zinternalizowanych. Wreszcie, z powodzeniem przeprowadzono mikroskopię sił trakcyjnych (TFM) w celu scharakteryzowania wpływu infekcji Lm na stresy trakcyjne, które komórki śródbłonka gospodarza wywierają na swoje matryce podczas infekcji. Prezentowany test może być łatwo modyfikowany, aby umożliwić dalsze badania nad wpływem sztywności ECM na podatność na infekcje komórek adherentnych wykorzystujących różne linie komórkowe lub patogeny.

<table><tbody><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Granulki wodorotlenku sodu</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>(3-aminopropylo)trietoksysilan</td><td>Sigma</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>25% aldehyd gluterowy</td><td>Sigma</td><td>G6257-100ML</td><td></td></tr><tr><td>40% akryloamid</td><td>Sigma</td><td>A4058-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór bis-akrylamidu (2% w/v)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP1404-250</td><td></td></tr><tr><td>Fluorosfery mikrosfery modyfikowane karboksylanem, 0,1 &mu; m, żółto-zielony fluorescencyjny (505/515)</td><td>Invitrogen</td><td>F8803</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Fisher</td><td>BP17925</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Proteochem</td><td>c1111-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen, Typ I Roztwór ze szczura</td><td>Sigma</td><td>C3867-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>J.T. Baker</td><td>9224-01</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Wolny kwas</td><td>J.T. Baker</td><td>4018-04</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka L-15 Leibovitza, bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermofischer</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 Podłoże, bez glutaminy</td><td>Technologie życia</td><td>10372019</td><td></td></tr><tr><td>Fundacja Płodowa surowica bydlęca, Partia: A37C48A</td><td>Gemini Bio-Prod</td><td>900108 500ml</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu, EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200mM</td><td>Fisher</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Fisher</td><td>SH30028FS</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>MP biomedicals</td><td>194530</td><td></td></tr><tr><td>Cloramphenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378-5G</td><td></td></tr><tr><td>DifcoTM Agar, granulowany</td><td>BD</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>BBL TM Napar mózgowo-sercowy</td><td>BD</td><td>211059</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, trichlorowodorek, trójwodzian - 10 mg/ul roztwór w wodzie</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd 16% klasy EM</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>15710-S Przeciwciało</td><td></td></tr><tr><td>anty-Listeria monocytogenes</td><td>Abcam</td><td>ab35132</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) drugorzędowe, Alexa Fluor&reg; 546 koniugat</td><td>Thermofischer</td><td>A-11035</td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA, czerwień fenolowa</td><td>Thermofischer</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>KOLAGENAZA Z CLOSTRIDIUM HISTOLITIC</td><td>Sigma</td><td>C8051</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan streptomycyny</td><td>Fisher Scientific</td><td>3810-74-0</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Calbiochem</td><td>8510</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan</td> <td>soduThermofischer</td><td>28364</td><td></td></tr><tr><td>MES proszek</td><td>Sigma</td><td>M3885</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3040-05</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>J.T. Baker</td><td>2444-1</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros</td><td>40991</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Jednorazowy sprzęt laboratoryjny</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 mm szkło okrągłe Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-81</td><td>Nr 1.5 Szkiełko nakrywkowe | Średnica szkła 10 mm | Niepowlekane</td></tr><tr><td>szklane płytki 24-dołkowe</td><td>Mattek</td><td>P24G-1.5-13-F</td><td></td></tr><tr><td>5 ml probówki polistyrenowe z 35 &mu; Nasadka z filtrem siatkowym M&nbsp;</td><td>Kolby Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>T-25</td><td>Falcon</td><td>353118</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki stożkowe</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>Jednorazowe</td><td></td> pipety serologiczne Falcon 352196 <td></td></tr><tr><td>(1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)</td><td>Pipety</td> szklane Falcon <td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (1-200 &mu; l, 101-1000 &mu; l)</td> <td>Denville</td><td>P1122, P1126</td><td></td></tr><tr><td>Bezpudrowe rękawice diagnostyczne</td><td>Microflex</td><td>XC-310</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety bakterie</td><td>Sarstedt</td><td>67.746</td><td></td></tr><tr><td>Maszynki do golenia</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Igła strzykawkowa</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>Butelki sterylizujące 0,2um</td><td>Thermo Scientific</td><td>566-0020</td><td></td></tr><tr><td>20 ml strzykawki</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>Filtry 0,2um</td><td>Thermo Scientific</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>drewniane patyczki</td><td>Grainger</td><td>42181501</td><td></td></tr><tr><td>Saran wrap</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-3687</td><td></td></tr><tr><td>Płytki bakterie</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Duży/jednorazowy sprzęt laboratoryjny</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaptur do hodowli tkankowych</td><td>Baker</td><td>SG504</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator bakterii</td><td>Thermo Scientific</td><td>IGS180</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do kultur tkankowych</td><td>NuAire</td><td>NU-8700</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop epifluorescencyjny Nikon Diaphot 200</td><td>Nikon</td><td>NIKON-DIAPHOT-200</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator klatkowy</td><td>Haison</td><td>Niestandardowy</td><td></td></tr><tr><td>analizator Scanford FACScan&nbsp;</td><td>Stanford i Cytek zmodernizowali niestandardowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>przyrząd do pipet</td> FACScan <td>Pipetory Drummond</td><td>4-000-110</td><td></td></tr><tr><td>(10 &mu; l, 200 &mu; l, 1000ul)</td><td>pH-metr Gilson</td><td>F144802, F123601, F123602</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>do 30019028</td><td></td><td>Mettler Toledo</td></tr><tr><td></td><td>FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Kolba 1 L</td><td>Fisherbrand</td><td>FB5011000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>Amsco</td><td>3021</td><td></td></tr><tr><td>Płyta magnetyczna z mieszadłem</td><td>Bellco</td><td>7760-06000</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadła magnetyczne</td><td>Bellco</td><td>1975-00100</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Beckman</td><td>DU 640</td><td></td></tr><tr><td>Analizator Scanford FACScan</td><td>Cytek Biosciences</td><td>Custom Stanford i Cytek zmodernizowany FACScan</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Software (&mu; Menedżer)</td><td>Open Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Matlab Matlab Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowjo</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do automatycznej analizy obrazu, CellC</td><td>https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td><td></td> <td>Oprogramowanie jest dostępne bezpłatnie. Pliki wykonywalne i kody źródłowe MATLAB można uzyskać pod adresem https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td></tr></tbody></table>

wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

Sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej składa się z wielu mechanicznych bodźców środowiskowych, które są dobrze znane z tego, że wpływają na zachowanie, funkcję i los komórki w ogóle. Chociaż scharakteryzowano reakcje coraz bardziej przylegających typów komórek na sztywność macierzy, w dużej mierze nieznane jest to, w jaki sposób podatność komórek przylegających na infekcje bakteryjne zależy od sztywności macierzy, podobnie jak wpływ infekcji bakteryjnej na biomechanikę komórek gospodarza. Stawiamy hipotezę, że podatność komórek śródbłonka gospodarza na infekcję bakteryjną zależy od sztywności macierzy, na której znajdują się te komórki, oraz że zakażenie komórek gospodarza bakteriami zmieni ich biomechanikę. Aby przetestować te dwie hipotezy, wykorzystano komórki śródbłonka jako modelowych gospodarzy i Listeria monocytogenes jako modelowego patogenu. Opracowując nowatorski test w formacie wielodołkowym, pokazujemy, że wpływ sztywności matrycy na zakażenie komórek śródbłonka przez L. monocytogenes można ocenić ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej i barwienia immunologicznego, a następnie mikroskopii. Ponadto, za pomocą mikroskopii sił trakcyjnych, można badać wpływ zakażenia L. monocytogenes na biomechanikę komórek śródbłonka gospodarza. Proponowana metoda pozwala na analizę wpływu mechaniki tkankowej na infekcję bakteryjną komórek przylegających, co jest kluczowym krokiem w kierunku zrozumienia interakcji biomechanicznych między komórkami, ich macierzą zewnątrzkomórkową i bakteriami chorobotwórczymi. Metoda ta ma również zastosowanie w wielu innych typach badań nad biomechaniką komórki i reakcją na sztywność substratu, gdzie ważna jest możliwość przeprowadzenia wielu powtórzeń równolegle w każdym eksperymencie.

Zależność podatności komórek HMEC-1 na zakażenie Lm od sztywności ECM: 
Hydrożele PA o różnej sztywności, wszystkie pokryte powierzchniowo kolagenem I, przygotowano na szklanych płytkach wielodołkowych zgodnie z opisem w kroku 1 protokołu (patrz Rysunek 1). W celu potwierdzenia dokładnej sztywności hydrożeli przeprowadzono pomiary AFM, zgodnie z wcześniejszym opisem26,27 (patrz Rysunek 2). Poprzednie badania wykazały, że lokalna podatność błony podstawnej komórek śródbłonka może wynosić od 1 kPa (np. tkanka mózgu) do 70 kPa (np. aorta)36,37,38,39,40. W związku z tym zdecydowano się zbadać zakażenie komórek HMEC-1 bytujących na macierzach o następującej sztywności: 0,6 kPa, 3 kPa, 20 kPa i 70 kPa. Dla każdej sztywności hydrożelu wykonano sześć hydrożeli, aby ocenić powtarzalność wyników.
Cytometrię przepływową wykorzystano do oceny podatności komórek HMEC-1 na zakażenie Lm w zależności od sztywności ECM (patrz Rycina 3). Komórki HMEC-1 zainfekowano szczepem Lm (JAT985), który po internalizacji wykazuje ekspresję markera fluorescencyjnego (actAp::mTagRFP), co umożliwia detekcję wyłącznie bakterii wewnątrzkomórkowych (patrz Ryciny 1L - 1N). JAT985 nie posiada również białka ActA, co uniemożliwia bakteriom rozprzestrzenianie się z komórki do komórki, ponieważ ActA jest niezbędne do tworzenia aktynowych „ogonów komet” i późniejszej dysseminacji bakterii. W 7–8 h po zakażeniu oceniono stopień infekcji komórek HMEC-1 za pomocą cytometrii przepływowej. Aby zapewnić analizę pojedynczych komórek, główną część rozkładu liczby komórek wyodrębniono za pomocą bramkowania na wykresie rozproszenia w przód (forward scatter) względem rozproszenia bocznego (side scatter), a następnie wykonano drugi etap bramkowania w celu wykluczenia komórek wykazujących autofluorescencję (patrz Ryciny 3A - 3C). Wstępne wyniki przedstawione na Rycini 3 wskazują, że zakażenie komórek HMEC-1 przez Lm jest około dwukrotnie większe w przypadku komórek HMEC-1 znajdujących się na sztywnych hydrożelach 70 kPa w porównaniu do komórek znajdujących się na miękkich hydrożelach 0.6 kPa (patrz Ryciny 3B - 3D). Zwiększona podatność komórek HMEC-1 na zakażenie Lm na macierzach sztywnych w porównaniu do miękkich mogłaby wynikać z: 1. zwiększonej adhezji Lm do HMEC-1; 2. zwiększonej inwazji Lm do wnętrza HMEC-1; lub 3. współwystępowania obu powyższych czynników. Aby sprawdzić, która hipoteza jest słuszna, komórki HMEC-1 wysiano na miękkie (3 kPa) i sztywne (70 kPa) hydrożele i zainfekowano Lm konstytutywnie ekspresującym GFP (patrz Ryciny 4A - 4C). Próbki utrwalono krótko po zakażeniu, a bakterie zewnętrzne (przylegające) zabarwiono przeciwciałami. Przy użyciu mikroskopii ilościowej stwierdzono, że znacznie więcej bakterii przylega do HMEC-1, gdy komórki gospodarza znajdują się na żelach sztywnych w porównaniu do miękkich (patrz Rycina 4D). Zgodnie z danymi z cytometrii przepływowej, znacznie więcej bakterii zostaje zinternalizowanych przez HMEC-1, gdy komórki gospodarza znajdują się na żelach sztywnych w porównaniu do miękkich (patrz Rycina 4E). Jednakże wydajność inwazji (liczba zinternalizowanych bakterii/całkowita liczba bakterii) Lm do komórek HMEC-1 jest podobna, niezależnie od sztywności podłoża (patrz Rycina 4F).
Mikroskopia sił trakcyjnych komórek HMEC-1 zainfekowanych Lm: 
Infekcja komórek HMEC-1 przez Lm może zmieniać biomechanikę zainfekowanych komórek gospodarza, w tym siłę przylegania do ich ECM lub do siebie nawzajem, co wpływa na integralność bariery. Postanowiliśmy ocenić, czy tak jest w rzeczywistości, wykorzystując mikroskopię sił trakcyjnych (Traction Force Microscopy)32 do obliczenia sił trakcyjnych komórka-ECM oraz mikroskopię naprężeń monowarstwy (Monolayer Stress Microscopy)41 do obliczenia wewnątrzkomórkowych sił napięciowych. Rysunek 5 przedstawia mapy pola deformacji, pola naprężeń trakcyjnych oraz pola napięcia wewnątrzkomórkowego komórek HMEC-1 znajdujących się na hydrożelach o sztywności 20 kPa w różnych punktach czasowych po infekcji. Rysunki 5A - 5D odnoszą się do niezainfekowanych kontrolnych komórek HMEC-1, natomiast Rysunki 5E - 5H odnoszą się do komórek HMEC-1 zainfekowanych Lm przy wielokrotności infekcji równej 300 bakterii/komórkę. Te wstępne prace sugerują, że zainfekowane komórki HMEC-1 zmniejszają wielkość naprężeń komórka-ECM oraz naprężeń wewnątrzkomórkowych w przebiegu infekcji Lm, podczas gdy nie obserwuje się tego w przypadku niezainfekowanych komórek kontrolnych.
Rozprzestrzenianie się Lm przez monowarstwy HMEC-1 zależnie od sztywności ECM: 
W celu zbadania wpływu sztywności macierzy na rozprzestrzenianie się Lm przez monowarstwy HMEC-1 wykorzystano mikroskopię poklatkową. W miarę jak Lm rozprzestrzenia się przez monowarstwę, bakterie tworzą ognisko infekcji, które powiększa się w czasie (patrz Rysunek 6A oraz Filmy 1 i 2). Powierzchnię ogniska infekcji mierzono poprzez wyznaczenie otoczki wypukłej, czyli najmniejszego wypukłego wielokąta obejmującego zbiór punktów, wokół bakterii42. W tej dziedzinie nie istnieje standardowa metoda pomiaru wydajności rozprzestrzeniania się komórek L. monocytogenes z komórki na komórkę przez monowarstwę komórek gospodarza. Aby ocenić wydajność rozprzestrzeniania, niektórzy badacze liczyli liczbę komórek gospodarza w ognisku infekcji41, a inni ręcznie wyznaczały granice wokół grupy zainfekowanych komórek gospodarza43. Zdecydowaliśmy się na wyznaczenie wielokąta wypukłego wokół bakterii, ponieważ jest to zautomatyzowany, spójny i niewymagający dużych zasobów obliczeniowych proces pomiaru wydajności rozprzestrzeniania się L. monocytogenes. W ten sposób stwierdzono niewielki spadek powierzchni ogniska infekcji w komórkach HMEC-1 wysianych na hydrożele o sztywności 70 kPa w porównaniu do tych wysianych na macierzach 3 kPa (patrz Rysunek 6B oraz Filmy 1 i 2). Aby określić szybkość wzrostu ogniska infekcji, odległość promieniową przedstawiono jako funkcję czasu, wyciągając pierwiastek kwadratowy z powierzchni ogniska infekcji i dzieląc wynik przez pi. Ta transformacja matematyczna zakłada, że kształt ogniska infekcji jest w przybliżeniu okrągły44. Aby zmierzyć prędkość wzrostu ogniska, zmierzono tempo zmian (t.j. nachylenie) odległości promieniowej dla macierzy 3 i 70 kPa. Podejście to wykazało, że ognisko infekcji rosło szybciej i monotonicznie w komórkach HMEC-1 wysianych na macierzach 3 kPa. Natomiast w komórkach wysianych na macierzach 70 kPa ognisko rosło znacznie wolniej (pierwsze 200 min) i nieco wolniej (od 200 do 600 min) (patrz Rysunek 6C). Rzeczywiście, analiza dalszych danych potwierdziła, że ognisko infekcji rosło średnio dwukrotnie wolniej w macierzach 70 kPa, szczególnie w ciągu pierwszych 200 min (patrz Rysunek 6D).
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej, analiza rozkładu komórek; wykresy kropkowe pokazują fluorescencję, wpływ modułu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57361/57361fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Zależna od sztywności ECM podatność komórek HMEC-1 na inwazję Lm zmierzona za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki HMEC-1 zainfekowano Lm (JAT985), a infekcję przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej. A. Ten panel przedstawia wykres rozproszenia bocznego względem przedniego dla reprezentatywnych komórek HMEC-1 pochodzących z jednej studzienki. Główny rozkład komórek został wybrany za pomocą bramkowania w celu wykluczenia zanieczyszczeń (lewo) oraz dubletów lub tripletów komórek (prawo). B. Wykres ten przedstawia histogram logarytmu intensywności fluorescencji Lm na komórkę dla komórek HMEC-1 posianych na miękkim podłożu 0.6 kPa. C. Wykres ten przedstawia histogram logarytmu intensywności fluorescencji Lm na komórkę dla komórek HMEC-1 posianych na sztywnych hydrożelach 70 kPa. Histogramy dla N = 4 - 6 powtórzeń są przedstawione w różnych kolorach. Histogram dla niezinfekowanych komórek kontrolnych jest koloru fioletowego. Bramka służąca do zdefiniowania komórek zainfekowanych jest zaznaczona na czerwono. MOI wynosi 100, a infekcję oceniono 8 h po zainfekowaniu. D. Dane przedstawiają procent zainfekowanych komórek HMEC-1 w zależności od sztywności hydrożelu (N = 5). Poziome paski obrazują średnią z danych. Wartość P została obliczona za pomocą nieparametrycznego testu suma rang Wilcoxona. <a href="/files/ftp_upload/57361/57361fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy hodowli komórkowej z wyróżnionymi strukturami komórkowymi; badania nad dynamiką wzrostu komórek." src="/files/ftp_upload/57361/57361mov1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina wideo 1"> 
Wideo Rycina 1: Rozprzestrzenianie się wewnątrzkomórkowych Lm (kanał czerwony) przez monowarstwę komórek HMEC-1 (fazowy) wysianych na podłożu o sztywności 3-kPa. Komórki obrazowano w pożywce Leibovitz's L-15 (10% FBS, 20 µg/mL gentamycyny) w komorze inkubacyjnej ustalonej na 37 ˚C. Obrazy gromadzono co 5 min. Prędkość filmu wynosi 15 klatek/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_1.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)</a>
<img alt="Obraz z mikroskopu hodowli komórkowych; mikroskopia fluorescencyjna uwydatnia struktury komórkowe w kolorze różowym." src="/files/ftp_upload/57361/57361mov2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Wideo Rycina 2"> 
Wideo Rycina 2: Rozprzestrzenianie się wewnątrzkomórkowych Lm (kanał czerwony) poprzez monowarstwę komórek HMEC-1 (fazowy) wysianych na podłożu o sztywności 70 kPa. Obrazowanie komórek przeprowadzono w pożywce Leibovitza L-15 (10% FBS, 20 µg/mL gentamycyny) w komorze środowiskowej ustabilizowanej w temperaturze 37 °C. Obrazy gromadzono co 5 min. Prędkość filmu wynosi 15 klatek/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_2.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Moduł Younga (E, kPa)</td>
			<td>% akryloamidu (z roztworu zapasowego 40%)</td>
			<td>% bisakryloamidu (z roztworu stokowego 2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6</td>
			<td>3</td>
			<td>0.045</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>0.075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>0.075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>8</td>
			<td>0.195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70</td>
			<td>10</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Skład hydrożeli poliakrylamidowych (PA) o różnej sztywności. W tabeli tej, w oddzielnych kolumnach, wskazano procentową zawartość roztworu akrylamidu stężenia 40% oraz roztworu bis-akrylamidu stężenia 2% niezbędnych do uzyskania określonej sztywności (modułu Younga, E).
<img alt="Równania równowagi statycznej w biomechanice; tensor naprężeń i bilans sił; schemat badawczy." src="/files/ftp_upload/57361/57361supfig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Materiały uzupełniające"> 
Materiały uzupełniające 1. Obliczanie napięcia wewnątrzkomórkowego na podstawie obliczonych naprężeń trakcyjnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Supplemental_Material_1.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Opracowaliśmy wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek. Test ten jest kompatybilny z cytometrią przepływową, barwieniem immunologicznym i mikroskopią sił trakcyjnych, umożliwiając ilościowe pomiary interakcji biomechanicznych między komórkami, ich macierzą zewnątrzkomórkową i bakteriami chorobotwórczymi.

Wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

Ogólnym celem tej metodologii jest umożliwienie scharakteryzowania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną komórek adherentnych w sposób wysoce ilościowy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w rozwijającej się dziedzinie biomechaniki gospodarz-patogen, takie jak rola sił mechanicznych w modulowaniu podatności komórek gospodarza na infekcje bakteryjne. Technika ta pomaga tworzyć sekwencje filmów poklatkowych o wysokiej rozdzielczości, jednocześnie monitorując wiele warunków i automatyzując niektóre procedury.Aby przeprowadzić aktywację szkła w 24-dołkowych szalkach, dodaj 500 mikrolitrów wodorotlenku sodu tumalo na studzienkę o średnicy 13 milimetrów i inkubuj płytki w temperaturze pokojowej przez godzinę. Wyrzuć wodorotlenek sodu i użyj ultraczystej wody do jednokrotnego przepłukania studzienek. Następnie dodaj 500 mikrolitrów dwuprocentowego trietoksysilanu w 95% etanolu do każdej studzienki i inkubuj je przez pięć minut.Wodą przepłucz studzienki raz. Następnie dodaj 500 mikrolitrów 0,5% aldehydu glutarowego do każdej studzienki i inkubuj płytki przez 30 minut. Po jednokrotnym spłukaniu wodą osusz płytki w temperaturze 60 stopni Celsjusza bez pokrywki.Aby wyprodukować hydrożele o sztywności przestrajanej, należy przygotować roztwory wodne, które zawierają od trzech do 10 procent 40% podstawowego roztworu akrylamidu i od 06 do 6 procent dwuprocentowego roztworu bis-akrylamidu, w zależności od pożądanej sztywności hydrożelu. Następnie dodaj wodę. Dla każdej sztywności roztwór pierwszy jest wolny od koralików, podczas gdy roztwór drugi zawiera 03%0,1 mikrometra fluorescencyjnego mikrogranulki.Roztwory Deodgazowuje jeden i dwa próżnią przez 15 minut, aby wyeliminować tlen, który zahamuje polimeryzację. Następnie, działając szybko, dodaj 0,43% TEMED i 0,6% podstawowego roztworu APS o gramaturze 10 gramów na mililitr do roztworu pierwszego. Dodaj 3,6 mikrolitra roztworu do środka każdego dołka 24-dołkowego naczynia.Natychmiast użyj 12-milimetrowych okrągłych szkiełek nakrywkowych, aby przykryć studzienki i pozostaw roztwór na 20 minut, aby w pełni się spolimeryzował. Delikatnie postukać igłą strzykawki w twardą powierzchnię, aby utworzyć mały haczyk na jej końcu, aby ułatwić usunięcie szkiełek nakrywkowych, a następnie użyć igły, aby podnieść szkiełka nakrywkowe. Następnie dodaj 0,43% TEMED i 0,6% podstawowego roztworu APS o gramaturze 10 gramów na mililitr do roztworu drugiego.Następnie nałóż 2,4 mikrolitra mieszaniny na 12-milimetrowe okrągłe szkiełka nakrywkowe. Umieść okrągłe szkiełka nakrywkowe z kroplą roztworu drugiego na wierzchu pierwszej warstwy poliakrylamidu i delikatnie dociśnij kleszcze w dół, aby upewnić się, że grubość drugiej warstwy jest minimalna. Następnie pozwól roztworowi drugiemu polimeryzować przez 20 minut.Dodaj 500 mikrolitrów 50 milimolowych HEPES o pH 7,5 do każdej z studzienek i użyj igły strzykawkowej i kleszczyków, aby usunąć szklane szkiełka nakrywkowe. Aby wysterylizować hydrożele, umieść je w kapturze do hodowli tkanek i wystaw na działanie promieniowania UV przez godzinę. Teraz przygotuj mieszaninę 0,5% wagowo na objętość sulfo-SANPAH i jednego procenta DMSO oraz 50 milimolowych HEPES o pH 7,5.Dodaj 200 mikrolitrów roztworu do górnej powierzchni hydrożeli. Następnie, pracując szybko, naświetl je promieniami UV o długości 302 nanometrów przez 10 minut, aby je aktywować. Użyj jednego mililitra 50-milimolowego HEPES o pH 7,5, aby dwukrotnie umyć hydrożele, powtarzając w razie potrzeby w celu usunięcia nadmiaru środka sieciującego.Hydrożele pokryj proteinami 200 mikrolitrów 0,25 miligrama na mililitr kolagenu z ogona szczura I i 50 milimolowymi HEPES. Inkubuj hydrożele z kolagenem w temperaturze pokojowej przez noc. Przed wysianiem interesujących komórek na hydrożelach dodaj jeden mililitr pożywki i równoważ je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.Aby wysiać ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego, po wyhodowaniu i przygotowaniu zawiesiny komórkowej zgodnie z protokołem tekstowym, usuń pożywkę z hydrożeli, a następnie dodaj jeden mililitr zawiesiny komórkowej do każdej studzienki. Po przygotowaniu nocnej hodowli L.monocytogenes zgodnie z protokołem tekstowym, przenieść jeden mililitr kultury do probówki mikrowirówkowej i wirować ją z prędkością 2 000 g w temperaturze pokojowej przez cztery minuty. Po dwukrotnym umyciu osadu PBS klasy hodowli tkankowej, należy użyć jednego mililitra PBS do ponownego zawieszenia osadu.Przygotuj mieszaninę infekcji, łącząc 10 lub 50 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej z jednym mililitrem pełnego podłoża MCDB 131 dla wielokrotności infekcji lub MOI około 50 bakterii na komórkę gospodarza lub 10 bakterii na komórkę gospodarza. Usunąć pożywkę z dołków 24-dołkowych płytek, uważając, aby nie uszkodzić hydrożeli ani komórek. Użyj jednego mililitra pełnego podłoża MCDB 131, aby raz umyć komórki, a następnie dodaj jeden mililitr bakterii do każdej studzienki.Umieść pokrywkę na talerzach i owiń je folią spożywczą z polietylenu, aby uniknąć wycieku. Odwirować płytki w temperaturze 2 000 g przez 10 minut, aby zsynchronizować inwazję, a następnie inkubować kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Za pomocą pełnej pożywki MCDB 131 umyć próbki cztery razy i umieścić je z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych.Po dodatkowych 30 minutach zastąpić pożywkę pełną pożywką MCDB 131 uzupełnioną o 20 mikrogramów na mililitr gentamycyny. Aby przeprowadzić cytometrię przepływową, osiem godzin po zakażeniu usuń pożywkę z dołków 24-dołkowej płytki i użyj PBS z hodowli tkankowej, aby raz umyć studzienki. Po usunięciu PBS dodaj 200 mikrolitrów mieszanki kolagenazy trypsyny EDTA do każdej studzienki.Umieść naczynie w inkubatorze do hodowli tkankowych na 10 minut, aby umożliwić całkowite oderwanie komórek. Po delikatnym odpipetowaniu każdej studzienki osiem razy, dodaj 200 mikrolitrów pełnej pożywki, aby zneutralizować trypsynę. Przenieś 400 mikrolitrów roztworu komórkowego z każdej studzienki do pięciomililitrowej rurki polistyrenowej z 35-mikrometrową nasadką sitkową.Analizować próbki metodą cytometrii przepływowej. Po wysianiu komórek HMEC-1 na hydrożelach Pa i potraktowaniu gentamycyną zgodnie z protokołem tekstowym, inkubuj płytkę przez pięć godzin, aby umożliwić promotorowi ActA włączenie i sterowanie ekspresją otwartej ramki odczytu mTagRFP. Cztery godziny po zakażeniu wymieszaj jeden mikrolitr jednego miligrama na mililitr barwnika Hoechst z jednym mililitrem pełnej pożywki L-15 i dodaj go do każdej studzienki, aby zabarwić jądra.Po inkubacji komórek przez 10 minut, zastąp pożywkę jednym mililitrem pełnej pożywki L-15 uzupełnionej 20 mikrogramami na mililitr gentamycyny. Obrazuj wiele pozycji co pięć minut za pomocą funkcji automatycznego ustawiania ostrości, aby monitorować, w jaki sposób bakterie LM rozprzestrzeniają się przez monowarstwy HMEC-1 osadzone na hydrożelach o różnej sztywności. Jak podano na tym wykresie, pomiary AFM zostały przeprowadzone w celu potwierdzenia dokładnej sztywności hydrożeli Pa przygotowanych przy użyciu protokołu przedstawionego w tym filmie.W tym przypadku komórki HMEC-1 na matrycach o różnej sztywności zostały zakażone szczepem LM, który po internalizacji wyraża marker fluorescencyjny, który pozwala tylko na wykrycie bakterii wewnątrzkomórkowych. Komórki bramkowano przy użyciu wykresu punktowego przód kontra bok, a drugi etap bramkowania wykluczał komórki, które wykazywały autofluorescencję. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że zakażenie LM było około dwukrotnie większe w przypadku sztywnych hydrożeli o mocy 70 kilopaskala w porównaniu z hydrożelami o masie 0,6 kilopaskala.Aby sprawdzić, czy zwiększona adhezja LM do HMEC-1 zwiększa inwazję LM do HMEC-1, czy też oba te czynniki są odpowiedzialne za zwiększoną podatność na infekcję wkrótce po zakażeniu LM konstytutywnie eksprymującym GFP, komórki HMEC-1 utrwalono, a przylegające bakterie wybarwiono przeciwciałami. Jak pokazano tutaj, było znacznie więcej bakterii przylegających do HMEC-1, gdy komórki gospodarza znajdują się na sztywno w porównaniu z miękkimi żelami. Zgodnie z danymi cytometrii przepływowej, istnieje znacznie więcej bakterii internalizowanych przez HMEC-1, gdy komórki gospodarza znajdują się na sztywno w porównaniu z miękkimi żelami.Po opanowaniu test ten można wykonać w ciągu około trzech dni, ponieważ pomiędzy nimi wymagane są długie etapy inkubacji. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby być tak sterylnym, jak to tylko możliwe, aby upewnić się, że hydrożele i komórki gospodarza są wolne od zanieczyszczeń. Zgodnie z tą procedurą można również zastosować inne metody, takie jak mikroskopia sił atomowych, aby odpowiedzieć na pytania, takie jak to, jak zmienia się sztywność komórek gospodarza po infekcji i czy efekt ten zależy od sztywności matrycy.Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się mechanobiologią do zbadania roli interakcji biomechanicznych patogenów komórek gospodarza przy użyciu różnych komórek gospodarza, takich jak komórki nabłonkowe, i różnych patogenów bakteryjnych, takich jak Rickettsia parkeri. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać hydrożele o regulowanej sztywności na płytkach wielodołkowych i jak przeprowadzić test infekcji. Nie zapominaj, że praca z bakteriami chorobotwórczymi może być niebezpieczna.Dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak umieszczanie barier między miejscem wejścia a patogenem, a także zapobieganie wytwarzaniu się aerozoli.

a-multi-well-format-polyacrylamide-based-assay-for-studying-effect

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wpływ sztywności podłoża na funkcje komórkowe można modelować in vitro, wykorzystując hydrożele poliakryloamidowe o różnym stopniu podatności.

Badanie wpływu sztywności macierzy na funkcje komórkowe z wykorzystaniem hydrożeli na bazie akrylamidu

Ten film demonstruje test do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) na infekcję bakteryjną przylegających komórek. Hydrożele poliakrylamidowe o różnej sztywności, pokryte kolagenem, są ułożone warstwami w płytce wielodołkowej, aby naśladować sztywność fizjologicznego ECM. Po nałożeniu ludzkich komórek śródbłonka na hydrożele i zakażeniu komórek bakteriami Listeria monocytogenes zmodyfikowanymi do ekspresji białka fluorescencyjnego po wejściu do komórki, cytometria...

Test do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną

Ten film prezentuje ilościową mikroskopię poklatkową do oceny zależnej od sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej rozprzestrzeniania się Listeria monocytogenes przez komórki śródbłonka. Bardziej miękki hydrożel ułatwia szybsze rozprzestrzenianie się bakterii przez komórki śródbłonka w porównaniu ze sztywniejszymi odpowiednikami, co podkreśla wpływ sztywności matrycy na rozprzestrzenianie się bakterii.

Ilościowa mikroskopia poklatkowa do oceny rozsiewu bakterii zależnego od sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej

Mechaniczna sztywność w mikrośrodowisku guza odgrywa kluczową rolę w napędzaniu złośliwych zachowań poprzez zwiększanie aktywności inwadopodii i kurczliwości aktomiozyny. Za pomocą żeli poliakrylamidowych (PAA), testy inwadopodiów i siły trakcyjnej można wykorzystać do badania właściwości inwazyjnych i kurczliwych komórek rakowych w odpowiedzi na sztywność matrycy.

Żele poliakryloamidowe do oznaczania inwadopodiów i siły trakcyjnej na komórkach nowotworowych

Tutaj opisana jest metoda, która umożliwia szybkie, efektywne i niedrogie przygotowanie żeli poliakrylamidowych w formacie wielodołkowej płytki. Metoda nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być z łatwością zaadoptowana przez każde laboratorium badawcze. Byłoby to szczególnie przydatne w badaniach skoncentrowanych na zrozumieniu odpowiedzi komórek zależnych od sztywności.

Prosty test sztywności wielodołkowej na bazie poliakrylamidu do badania odpowiedzi komórek zależnych od sztywności

Podczas procesu infekcji kluczowym etapem jest adhezja patogenów do komórek gospodarza. W większości przypadków etap adhezji ten zachodzi w obecności stresu mechanicznego generowanego przez przepływającą ciecz. Opisujemy technikę, która wprowadza naprężenie ścinające jako istotny parametr w badaniu adhezji bakteryjnej.

Wprowadzenie naprężenia ścinającego w badaniach nad adhezją bakteryjną

Opisujemy jakościowy test do monitorowania konkurencji bakteryjnej, w której pośredniczy system sekrecji Pseudomonas aeruginosa typu VI (T6SS). Test opiera się na przeżyciu/zabiciu komórek docelowych Escherichia coli zawierających lacZ-reporter. Technika ta jest regulowana w celu oceny aktywności bakteriobójczej/bakteriostazy mikroorganizmów biegłych w T6SS.

Test wizualny do monitorowania konkurencji bakteryjnej za pośrednictwem T6SS

Ta metoda opisuje użycie chemii kliknięć do pomiaru zmian w transkrypcji komórek gospodarza po zakażeniu wirusem gorączki doliny Rift (RVFV) szczepem MP-12. Wyniki można wizualizować jakościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub uzyskiwać ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej. Ta metoda można dostosować do użytku z innymi wirusami.

Wykorzystanie chemii kliknięć do pomiaru wpływu infekcji wirusowej na syntezę RNA komórki gospodarza

Testy przestrzegania zaleceń in vitro mogą być wykorzystane do badania przyczepiania się Streptococcus pneumoniae do monowarstw komórek nabłonka i do zbadania potencjalnych interwencji, takich jak użycie probiotyków do hamowania kolonizacji pneumokoków.

Badanie wpływu probiotyków na kolonizację pneumokoków za pomocą testu przylegania in vitro

Zdolność śródbłonka w stanie zapalnym do rekrutacji leukocytów z przepływu jest regulowana przez mezenchymalne komórki zrębu. Opisujemy dwa modele in vitro obejmujące pierwotne komórki ludzkie, które można wykorzystać do oceny rekrutacji neutrofili na podstawie przepływu i zbadania roli, jaką mezenchymalne komórki zrębu odgrywają w regulacji tego procesu.

Analiza wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów z przepływu

Poznaj metodę wielodołkowego testu na poliakrylamidzie do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję komórek śródbłonka przez Listeria monocytogenes. Protokół umożliwia ilościową analizę mechanobiologii infekcji.

Wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek (Wideo) | JoVE Journal

Wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek

Przeglądaj więcej filmów