Name: Generowanie dużej liczby progenitorów szpiku i prekursorów komórek dendrytycznych z mysiego szpiku kostnego przy użyciu nowej strategii sortowania komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Poznaj metodę izolacji dużych populacji komórek mieloidalnych z myszego szpiku kostnego przy użyciu sortowania komórek wysokiej prędkości. Technika opiera się na markerach Ly6C i CD115.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wdzięczni za pomoc techniczną od Alison Church Bird z Auburn University School of Veterinary Medicine Flow Cytometry Facility, za dofinansowanie z NIH do EHS R15 R15 AI107773 oraz dla Programu Biologii Komórkowej i Molekularnej na Uniwersytecie Auburn za letnie finansowanie badań dla PBR.

Wszystkie prace nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Auburn zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health.
1. Przygotowanie do pobrania szpiku kostnego
<ol>
	<li>Przygotuj 250 ml kompletnej pożywki, dodając roztwór pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, 2 mM glutaminą i 50 μM 2-merkaptoetanolem do górnej części próżniowej kolby filtracyjnej 0,22 μm i zastosuj próżnię. 
	UWAGA: Kompletne podłoże można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 miesięcy.</li>
	<li>Przygotować 70% roztwór etanolu, mieszając 350 ml 100% etanolu ze 150 ml sterylnegoH2Ow kolbie o pojemności 500 ml.</li>
	<li>Ustawić wirówkę na 4 °C.</li>
	<li>Sterylizuj kleszcze, skalpel i nożyczki w 70% etanolu.</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej dodać 5 ml kompletnej pożywki do trzech szalek Petriego o średnicy 60 mm.</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej dodać 30 ml kompletnej pożywki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
</ol>
2. Zbiór komórek szpiku kostnego myszy
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji mysz C57BL/6 za pomocą narkozy CO2 zgodnie z zasadami ustanowionymi w wytycznych Amerykańskiego Stowarzyszenia Lekarzy Weterynaryjnych (AVMA) z 2013 r. dotyczących eutanazji.</li>
	<li>Zdejmij i zdejmij tylne nogi.
	<ol>
		<li>Nasącz tylne nogi i tułów 75% etanolem i wykonaj płytkie nacięcia przez skórę wokół stawu biodrowego za pomocą zakrzywionych nożyczek tkankowych. Za pomocą kleszczy mocno pociągnij skórę od biodra w dół w kierunku kostki, odsłaniając mięsień. Użyj nożyczek, aby usunąć płatek skóry.</li>
		<li>Usuń całą tylną nogę, przecinając kość tuż nad stawem udowym/biodrowym. 
		UWAGA: Oprócz sterylizacji obszaru, etanol pomoże w zapewnieniu czystych cięć i zapobiegnie zanieczyszczeniu próbek przez włosy.</li>
		<li>Jeśli nogi zostaną przeniesione do nowego miejsca w celu pobrania szpiku kostnego, zanurz nogi w pełnym pożywce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pracując w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego, przenieś nogi na jedną z wcześniej przygotowanych szalek Petriego.</li>
	<li>Użyj nożyczek, aby przeciąć tuż pod kostką i ostrożnie usuń jak najwięcej mięśni i elastycznej tkanki łącznej. Przenieść oczyszczoną kość na drugą przygotowaną szalkę Petriego. 
	UWAGA: Chociaż nie jest konieczne usunięcie wszystkich mięśni, zbyt duża pozostała tkanka może utrudnić wypłukanie szpiku kostnego.</li>
	<li>Oddziel kość udową, kolano i piszczel.
	<ol>
		<li>Za pomocą kleszczy przytrzymaj nogę za kolano i zlokalizuj szpik. 
		UWAGA: Szpik kostny powinien być widoczny jako słaba czerwona linia wewnątrz jamy kostnej w górnej części kości udowej i w kierunku końca kości piszczelowej.
		<ol>
			<li>Za pomocą nożyczek wykonaj trzy cięcia w następujący sposób.
			<ol>
				<li>Przetnij kość piszczelową tuż nad miejscem, w którym wydaje się, że kończy się szpik.</li>
				<li>Wytnij tuż pod stawem kolanowym.</li>
				<li>Wycięcie tuż nad stawem kolanowym.</li>
				<li>Jeśli staw biodrowy jest nadal połączony z kością udową, przeciąć tuż poniżej stawu biodrowego.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Umieść trzy fragmenty z powrotem na szalce Petriego i powtórz ten proces na drugiej nodze.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Płukanie szpiku kostnego z kości udowej i piszczelowej.
	<ol>
		<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml kompletnym podłożem z probówki stożkowej o pojemności 50 ml i nakryj igłą 23 G.</li>
		<li>Trzymając kość kleszczami nad trzecią przygotowaną szalką Petriego, włóż igłę do kanału kostnego i przepchnij przez nią podłoże, wypłukując komórki (które mogą wyłonić się jako nienaruszony "czop" lub jako kilka skupisk). Powtarzaj, aż przez kość nie będzie już widać koloru. W razie potrzeby napełnić strzykawkę pożywką.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmiażdż nasady.
	<ol>
		<li>Będąc jeszcze na drugiej szalce Petriego, mocno chwyć rzepkę kolanową kleszczami i zmiażdż kolana końcówką strzykawki. Kontynuuj, aż nasady przestaną być czerwone.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą strzykawki przenieść komórki z drugiej i trzeciej płytki Petriego do probówki o pojemności 50 ml. Rozbij grudki, delikatnie pipetując w górę i w dół. Staraj się nie generować bąbelków. Wirować przy 250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min.</li>
	<li>Liza czerwonych krwinek
	<ol>
		<li>Usunąć supernatant za pomocą pipety serologicznej, usunąć osad przez strzepywanie i poddać lizie czerwone krwinki, inkubując w 1 ml buforu do lizy ACK (chlorek amonu-potasu) przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Za pomocą pipety serologicznej dodać 40 ml buforu HBSS (Hanks Balanced Salt Solution).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej przefiltruj komórki przez sitko o pojemności 70 μm do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy 250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min.</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej usunąć supernatant i przemyć komórki 40 ml kompletnego podłoża. Wirować przy 250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min. 
	UWAGA: Na tym etapie limfocyty dodatnie można usunąć za pomocą FACS lub oczyszczania kolumny magnetycznej. Jednak limfocyty nie są utrzymywane przez długi czas w hodowli. Chociaż duża liczba komórek dodatnich w linii jest obecna w populacji Ly6C-CD115- w szpiku kostnym ex vivo, prawie wszystkie są nieobecne do 5 dnia (<silna klasa = "xfig">Figura 2).</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej usunąć supernatant i wyhodować komórki szpiku kostnego w kompletnym pożywce z 10 ng/ml rekombinowanego mysiego GM-CSF o gęstości 1 x 106 komórek/ml. 
	UWAGA: Zazwyczaj po lizie czerwonych krwinek można pobrać 4 x 107 całkowitych komórek. Spodziewaj się jednak zaledwie 2 x 107 dla początkujących i do 5 x 107 ogniw dla doświadczonych kombajnów.</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej przenieść komórki na płytki do hodowli tkankowych i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . Jeśli używasz płytki 24-dołkowej, zasiej każdą studzienkę 2 ml zawiesiny komórek.</li>
	<li>Co 48 godzin za pomocą pipety serologicznej usunąć połowę pożywki i zastąpić ją świeżą kompletną pożywką i GM-CSF. 
	UWAGA: Kultury można przechowywać do 9 dni. Jednak kompozycja zmienia się z czasem. Więcej informacji na ten temat znajduje się w sekcji 3.</li>
</ol>
3. Wybór dnia sortowania
<ol>
	<li>Ponieważ skład populacji komórek zmienia się w czasie, wybierz dzień, w którym uzyskasz największą liczbę pożądanych komórek.</li>
	<li>Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z oczekiwaną wydajnością komórek po sortowaniu dla każdej z populacji po 3, 5 i 7 dniach hodowli w GM-CSF na 1 x 107 komórek.</li>
</ol>
4. Strategia barwienia
<ol>
	<li>Do przygotowania próbek kontrolnych należy użyć małych porcji komórek. Obejmują niebarwioną kontrolę, kompensacyjne próbki kontrolne barwione tylko jednym przeciwciałem fluorescencyjnym każda oraz kontrole fluorescencji minus jeden, w których dodaje się wszystkie przeciwciała z wyjątkiem jednego, w celu kontroli niespecyficznej fluorescencji w tym kanale. W przypadku korzystania z etykietowania pośredniego uwzględnij tylko podstawowy, sam drugorzędny oraz zarówno podstawowy, jak i pomocniczy. 
	UWAGA: Przeciwciała znakowane fikoerytryną (PE) i allofikocyjaniną (APC) zapewniają wyraźną separację z minimalnym krwawieniem, gdy są stosowane razem. Jeśli jednak opcje fluorochromu są ograniczone, CD115 ulega ekspresji na stosunkowo niskim poziomie, podczas gdy Ly6C ulega ekspresji na bardzo wysokich poziomach. Dlatego jaśniejsze fluorochromy są pożądane dla anty-CD115, a fluorochromy anty-Ly6C są wybierane, aby zapobiec krwawieniu.</li>
	<li>Przygotuj 100 ml buforu do płukania FACS (FWB), mieszając 97 ml schłodzonego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco (DPBS) z 3 ml surowicy cielęcej płodu w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i umieść w łaźni lodowej.</li>
	<li>Użyj pipety, aby delikatnie, ale dokładnie pipetować komórki w górę i w dół, aby usunąć luźno przylegające komórki.</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy 250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min.
	<ol>
		<li>Jeśli objętość komórek przekracza 50 ml, przenieś komórki do niezbędnej liczby probówek i połącz na etapie barwienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie odlać supernatant i przemyć granulowane komórki, dodając 30 ml FWB za pomocą pipety serologicznej. Odwirować w temperaturze 250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i powtórzyć mycie. 
	UWAGA: Jeśli spodziewana jest wysoka śmierć komórek, komórki można przemyć FWB zaledwie 0,5% płodowej surowicy cielęcej (FCS). Zapobiegnie to zlepianiu się komórek.</li>
	<li>Zawiesić i wybarwić komórki zgodnie z instrukcjami producenta przeciwciała.
	<ol>
		<li>Zawieś 5 x 107 komórek w 1 ml FWB i dodaj po 2 μg anty-Ly6C i anty-CD115 znakowanych fluoroforami (według wyboru badacza). Aby jeszcze bardziej odróżnić CMP od moDC (oba są Ly6C- i CD115-), dodaj 2 μg przeciwciał anty-CD11c (CMP to CD11c-; moDC to CD11c+). Inkubować przez 30 minut na lodzie. 
		UWAGA: Rysunek 3 został wygenerowany przy użyciu Ly6C-PE i CD115-APC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej dodać 10 ml FWB i odwirować przy 250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Delikatnie odlać supernatant i przemyć granulowane komórki, dodając 30 ml FWB za pomocą pipety serologicznej. Wirować przy 250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i powtórzyć mycie.</li>
	<li>Przed podwieszeniem komórek dokładnie przesuń rurkę, aby usunąć osad. Użyj pipety serologicznej, aby zawiesić komórki na poziomie 1 x 107 komórek/ml FWB i przefiltrować przez filtr komórkowy 35 μm. Za pomocą pipety serologicznej przenieś przefiltrowane komórki do probówki polipropylenowej i umieść na lodzie, aż będą gotowe do sortowania. 
	UWAGA: Jeśli polipropylen jest niedostępny, można użyć tubek polistyrenowych powlekanych białkiem (beztłuszczowe mleko w proszku lub FCS) w celu zmniejszenia wiązania.</li>
</ol>
5. Ustaw bramki na podstawie próbek kontrolnych
UWAGA: Aby zapobiec zakłóceniu komórek przez ciśnienie strumienia o dużej prędkości, użyj dyszy 100-130 μm do sortowania komórek.
<ol>
	<li>Przeprowadź niezabarwioną kontrolę (patrz krok 4.1) przez sortownik komórek i zastosuj bramkę, aby wykluczyć małe zanieczyszczenia (niski rozrzut do przodu; FSC) i wysoce ziarniste (wysoki rozrzut boczny; SSC).
	<ol>
		<li>Aby przeanalizować tylko późniejsze etapy (monocyty, moMac/MoDP i MoDC), zastosuj bramkowanie, aby uwzględnić tylko większe komórki (wysoki FSC).</li>
		<li>Jeśli używane są barwniki żywotności, użyj ich, aby wykluczyć poplamione, nieżywotne zdarzenia (przykład jest zilustrowany w <silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przepuść pojedyncze fluorescencyjne próbki kontrolne przez sorter komórek i dostosuj kompensację w razie potrzeby.</li>
	<li>Uruchom próbkę przykładu z wieloma etykietami. Obserwuj cztery odrębne populacje: Ly6C+CD115- (GMPs), Ly6C+CD115+ (monocyty), Ly6C-CD115+ (moMac/moDP) i Ly6C-CD115- (CMPs/moDCs). Zastosuj bramkę, aby wyizolować każdą z czterech głównych populacji. 
	UWAGA: CMP i moDC mają wspólny fenotyp Ly6C-CD115-. Można je jednak rozróżnić na podstawie ekspresji CD11c: CMP nie mają CD11c, podczas gdy MoDC wyrażają CD11c.</li>
</ol>
6. Zbiór izolowanych populacji
<ol>
	<li>Przygotować probówki zbiorcze, dodając tyle FCS, aby osiągnąć co najmniej 20% stężenia końcowego po napełnieniu. Na przykład, jeśli używasz probówek o pojemności 5 ml, dodaj 1 ml FCS przed sortowaniem i wyjmij probówkę, gdy osiągnie całkowitą objętość 5 ml.</li>
	<li>Aby zapobiec wymianie błony i wychwytowi przeciwciał, wszystkie próbki (zmieszane i posortowane) należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez cały czas sortowania.
	<ol>
		<li>Jeżeli nie jest to możliwe, należy w jak największym stopniu przechowywać probówkę zawierającą komórki, które mają być sortowane, na lodzie i w razie potrzeby przenieść porcje do sortownika.</li>
		<li>Dodatkowo posortowane próbki należy przenosić na lód co 20–30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po pobraniu żądanej liczby komórek za pomocą pipety serologicznej przenieść komórki do nowej stożkowej probówki. Wirować przy 250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min.
	<ol>
		<li>Potwierdź czystość za pomocą analizy po sortowaniu na małych porcjach z każdej zebranej populacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć supernatant, zawiesić w 10 ml FWB i odwirować w temperaturze 250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Powtórzyć w sumie przez dwa przemycia. 
	UWAGA: Usunięcie całego supernatantu bez usunięcia osadu może być trudne. Podłączenie końcówki pipety do przewodu podciśnieniowego może pomóc w usuwaniu. Jeśli nie jest to możliwe, sugeruje się, aby supernatant został zebrany w świeżej probówce w przypadku dysocjacji osadu.</li>
	<li>Usunąć supernatant po drugim praniu.</li>
	<li>Jeśli projekt eksperymentalny użytkownika nakazuje ponowne hodowanie komórek, wykonaj kroki 2.12–2.14. W przeciwnym razie, jeśli komórki będą używane do natychmiastowej analizy, przygotuj komórki zgodnie z żądanym protokołem. 
	UWAGA: Przykład typowej analizy funkcjonalnej znajduje się w Rysunek 4.</li>
</ol>

<ol><li>Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+the+development+and+function+of+dendritic+cell+subsets+by+GM-CSF%3A+more+than+a+hematopoietic+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor.</a> Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).</li>
<li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+cytokine%2C+GM-CSF%2C+alters+the+developmental+outcome+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells.</a> Eur J Immunol. , (2012).</li>
<li>van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendritic+cell+development+by+GM-CSF%3A+molecular+control+and+implications+for+immune+homeostasis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy.</a> Blood. 119, 3383-3393 (2012).</li>
<li>Steinman, R. M., Inaba, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10449155">Myeloid dendritic cells.</a> J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).</li>
<li>Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+development+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell development and maturation.</a> Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).</li>
<li>Pierre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+MHC+class+II+transport+in+mouse+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells.</a> Nature. 388, 787-792 (1997).</li>
<li>Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells%3A+antigen+presentation%2C+accessory+function+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance.</a> Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).</li>
<li>Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+Grown+Bone+Marrow+Derived+Cells+Are+Composed+of+Phenotypically+Different+Dendritic+Cells+and+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cells%22%5BJournal%5D)">GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages.</a> Mol Cells. 39, 734-741 (2016).</li>
<li>Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+developmental+stages%2C+kinetics%2C+and+phenotypes+exhibited+by+myeloid+cells+driven+by+GM-CSF+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro.</a> PLoS One. 12, e0181985(2017).</li>
<li>Helft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+Mouse+Bone+Marrow+Cultures+Comprise+a+Heterogeneous+Population+of+CD11c%28%2B%29MHCII%28%2B%29+Macrophages+and+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells.</a> Immunity. 42, 1197-1211 (2015).</li>
<li>Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+maturation+and+cross-presentation%3A+timing+matters%21%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters!</a> Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).</li>
<li>Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+differentiation+and+antigen-presenting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte differentiation and antigen-presenting functions.</a> Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).</li>
<li>Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Dendritic+Cell+Maturation+in+the+Induction+of+Insulin-Dependent+Diabetes+Mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus.</a> Frontiers in immunology. 8, 327(2017).</li>
<li>Shortman, K., Naik, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+and+inflammatory+dendritic-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Steady-state and inflammatory dendritic-cell development.</a> Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).</li>
<li>Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+development+of+murine+dendritic+cells+by+GM-CSF+versus+Flt3+ligand+has+implications+for+inflammation+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking.</a> J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).</li>
<li>Naik, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+pro-DCs+and+pre-DCs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro.</a> Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).</li>
<li>Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stages+of+myeloid+dendritic+cells+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow.</a> Int Immunol. 15, 515-524 (2003).</li>
<li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).</li>
<li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311, 83-87 (2006).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+CD8%7Balpha%7D-Positive+Dendritic+Cells+from+a+Common+Myeloid+Progenitor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor.</a> Science. 290, 2152-2154 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Protokół ten ułatwia izolację typów komórek progenitorowych i prekursorowych sterowanych przez GM-CSF w liczbie wystarczającej do przeprowadzenia kilku rodzajów analiz, w tym testów biochemicznych, testów funkcji komórkowych in vitro lub wkraplania in vivo. Metoda ta stanowi znaczący postęp w dziedzinie rozwoju komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów, umożliwiając niezawodną izolację i identyfikację komórek na wczesnym etapie tego szlaku rozwoju, a także tych zróżnicowanych typów komórek, które ...

Hodowla komórek szpiku kostnego myszy za pomocą cytokiny Czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) jest szeroko stosowana jako metoda generowania komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (moDC; znanych również jako zapalne DC) w dużych ilościach 1,2,3,4,5. Komórki te okazały się niezwykle przydatne w różnych badaniach funkcji komórek dendrytycznych (DC) 6,7,8. Zazwyczaj te mysie komórki szpiku kostnego są hodowane przez 6-8 dni, a następnie są wykorzystywane do badania funkcji komórek dendrytycznych 5. Kultury te przez długi czas były uważane za w większości jednorodne, składające się w większości ze zróżnicowanych moDC. Niedawno stało się jasne, że pod koniec tego 6-8-dniowego okresu hodowli rzeczywiście istnieje wiele moDC, a także duży podzbiór zróżnicowanych makrofagów pochodzących z monocytów (moMac) 9,10,11. Nasze własne badania jeszcze bardziej rozszerzyły te wyniki, pokazując, że inne podzbiory mniej rozwiniętych komórek, takie jak prekursory moDC (moDP) i monocyty, pozostają w kulturach z niską częstotliwością nawet po 7 dniach 10. W związku z tym badania funkcji komórek dendrytycznych (DC) przy użyciu komórek generowanych przez ten system mogą odzwierciedlać odpowiedzi szerszej kohorty typów komórek, niż wcześniej sądzono.
Nauczyliśmy się bardzo dużo z badań nad generowanym przez GM-CSF moDC dotyczącym funkcji tych komórek w końcowych stadiach różnicowania 12,13,14. Jednak wiemy znacznie mniej o ścieżce rozwojowej tych komórek 2,15,16 oraz o tym, jak i kiedy wykazują określone funkcje, takie jak: reagowanie na wzorce molekularne związane z patogenami (PAMPs), fagocytoza, przetwarzanie i prezentacja antygenu 13i działanie przeciwbakteryjne. Protokół izolacji dużej liczby konwencjonalnych progenitorów i prekursorów prądu stałego sterowanych przez Flt3L został zgłoszony 17. Izolację tych odrębnych populacji osiągnięto przy użyciu komórek szpiku kostnego barwionych estrem sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE) (w celu śledzenia dzielących się komórek) i hodowli we Flt3L przez 3 dni. Komórki zostały następnie pozbawione komórek line-dodatnich i posortowane na populacje progenitorowe i prekursorowe na podstawie ekspresji CD11c 17. Innym podejściem grupy Leenena do identyfikacji wczesnych prekursorów DC w hodowli sterowanej przez GM-CSF było sortowanie komórek na podstawie CD31 i Ly6C 18. Początkowym celem było stworzenie podobnej metody otrzymywania prekursorów i prekursorów moDC sterowanego GM-CSF. Ze względu na specyficzne typy komórek generowanych przez GM-CSF, dostosowaliśmy podejście i strategię sortowania w oparciu o ekspresję cząsteczek, które uległy ekspresji we wczesnych i późniejszych etapach rozwoju. Ostatecznie ustaliliśmy, że Ly6C, CD115 (receptor CSF-1) i CD11c były najlepszymi markerami do rozróżniania tych typów komórek 10.
Tutaj prezentujemy metodę izolacji komórek na kilku różnych etapach rozwoju wzdłuż szlaku różnicowania napędzanego przez GM-CSF: Common Myeloid Progenitor (CMP), Granulocyte-Macrophage Progenitor (GMP), monocyte, Macrophage pochodzące z monocytów (MoMac) i DC pochodzące z monocytów (MoDC). Populacja moMac może być dalej segregowana na podstawie poziomu wyrażenia MHC klasy II, ujawniając populację prekursorów moDC (moDP) 10. Wykorzystujemy strategię szybkiego sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), aby wyizolować te 5 populacji na podstawie ekspresji Ly6C, CD115 i CD11c. Następnie demonstrujemy badanie tych komórek w testach funkcjonalnych, ujawniając ich reakcje na stymulację PAMP.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla cieląt płodowych (FCS)</td><td>HyClone</td><td>SV30014.04</td><td>do uzupełnienia kompletnej pożywki i FWB</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td>do uzupełnienia kompletnej pożywki</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanolu (2-ME)</td><td>MP 190242 biomedycznej</td><td></td><td>do uzupełnienia kompletnej pożywki</td></tr><tr><td>Filtr próżniowy 75 mM</td><td>Thermo Scientific</td><td>156-4045</td><td>do sterylizacji kompletnych pożywek</td></tr><tr><td>ACK Lysis Buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>do lizy czerwonych krwinek</td></tr><tr><td>Bufor HBSS</td><td>Corning</td><td>21-020-CM</td><td>do ratowania leukocytów po lizie czerwonych krwinek</td></tr> Sól fizjologiczna <tr><td>buforowana fosforanami (PBS), Dulbecco's</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td>musi być wolna od endotoksyn; schłodzony w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>35 &mikro; m Filtr komórkowy</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>do rozbijania grudek przed przepuszczeniem przez cytometr.</td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Biosource</td><td>PMC2011</td><td>stężeniu użytkowym 10 ng/ml</td></tr><tr><td>Płytka poddana hodowli tkankowej</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td>do komórek szpiku kostnego po pobraniu</td></tr><tr><td>Anty-Ly6C, klon HK1.4</td><td>Biolegend</td><td>128018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD115, klon AFS98</td><td>Tonbo Bioscience</td><td>20-1152-U100</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD11c, klon HL3</td><td>BD Biosciences</td><td>557400</td><td>do odróżnienia CMP i MoDCs</td></tr><tr><td>MoFlo XPD Cytometr przepływowy Beckman</td><td>Coulter</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>BD Accuri C6</td><td>BD Biosciences</td><td>660517</td><td></td></tr><tr><td>100% etanolu</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200CSPP</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Szalka Petriego</td><td>Corning, Inc</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Rurka stożkowa</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 Myszy</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>000664</td><td>Kobieta; 10-20 tygodni</td></tr><tr><td>Kaptur bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Thermo Scientific</td><td>8354-30-0011</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>301604</td><td></td></tr><tr>Wirówka <td>do 305145</td><td></td><td>igłowa</td><td>BD Biosciences</td></tr><tr><td>5810&nbsp; R</td><td>eppendorf</td><td>22625501</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software v10</td><td>BD Biosciences</td><td>Wersja 10</td><td>flowjo.com</td></tr></tbody></table>

generowanie dużej liczby progenitorów szpiku i prekursorów komórek dendrytycznych z mysiego szpiku kostnego przy użyciu nowej strategii sortowania komórek

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Kultury komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (moDC) generowanych ze szpiku kostnego myszy przy użyciu czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) zostały ostatnio uznane za bardziej heterogeniczne niż wcześniej sądzono. Kultury te rutynowo zawierają moDC, a także makrofagi pochodzące z monocytów (moMac), a nawet niektóre mniej rozwinięte komórki, takie jak monocyty. Celem tego protokołu jest zapewnienie spójnej metody identyfikacji i separacji wielu typów komórek obecnych w tych kulturach w miarę ich rozwoju, tak aby można było dalej badać ich specyficzne funkcje. Przedstawiona tutaj strategia sortowania rozdziela komórki najpierw na cztery populacje w oparciu o ekspresję Ly6C i CD115, z których obie są przejściowo wyrażane przez komórki w miarę rozwoju w hodowli napędzanej przez GM-CSF. Te cztery populacje obejmują pospolite komórki progenitorowe szpiku lub CMP (Ly6C-, CD115-), progenitorów granulocytów/makrofagów lub GMP (Ly6C+, CD115-), monocyty (Ly6C+, CD115+) oraz makrofagi pochodzące z monocytów lub moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c jest również dodawany do strategii sortowania w celu rozróżnienia dwóch populacji w populacji Ly6C-, CD115-: CMP (CD11c-) i moDC (CD11c+). Wreszcie, dwie populacje mogą być dalej rozróżniane w populacji Ly6C-, CD115+ w oparciu o poziom ekspresji MHC klasy II. MoMac wyrażają niższe poziomy MHC klasy II, podczas gdy prekursor DC pochodzący z monocytów (moDP) wyraża wyższy MHC klasy II. Metoda ta pozwala na wiarygodną izolację kilku odrębnych rozwojowo populacji w liczbie wystarczającej do przeprowadzenia różnorodnych analiz funkcjonalnych i rozwojowych. Zwracamy uwagę na jeden z takich odczytów funkcjonalnych, zróżnicowane odpowiedzi tych typów komórek na stymulację za pomocą wzorców molekularnych związanych z patogenami (PAMP).

W celu zachowania jak największej liczby kanałów dostępnych do analizy, żywe komórki rutynowo wyznaczano na podstawie rozproszonego światła przedniego i bocznego, wykluczając zdarzenia bardzo małe i bardzo ziarniste (typową bramkę zastosowano do wszystkich wykresów kropkowych na Rysunku 1A). Aby sprawdzić, czy ta strategia bramkowania skutecznie wyklucza martwe komórki, przeprowadzono barwienie 7-aminoaktynominą D (7-AAD) (Rysunek 1B</str...

Tutaj udostępniamy metodę identyfikacji i izolowania dużej liczby komórek szpikowych sterowanych przez GM-CSF za pomocą szybkiego sortowania komórek. Na podstawie ekspresji Ly6C i CD115 można zidentyfikować pięć odrębnych populacji (pospolite przodki szpiku, progenitorzy granulocytów/makrofagów, monocyty, makrofagi pochodzące z monocytów i DC pochodzące z monocytów).

Generowanie dużej liczby progenitorów szpiku i prekursorów komórek dendrytycznych z mysiego szpiku kostnego przy użyciu nowej strategii sortowania komórek

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

Metoda ta może umożliwić naukowcom uzyskanie wystarczającej liczby typów komórek, aby odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii rozwojowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że opiera się ona na kilku wybranych markerach w celu wyizolowania dużej liczby komórek, które tradycyjnie znajdują się w niewielkiej liczbie ex vivo. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapeutycznego przeszczepu szpiku kostnego, ponieważ pozwala na izolację dużej liczby komórek progenitorowych.Aby rozpocząć protokół, nasycić tylne nogi i tułów wcześniej przygotowanej myszy 75% etanolem i wykonać płytkie nacięcia przez skórę wokół stawu biodrowego za pomocą zakrzywionych nożyczek do tkanek. Następnie zdejmij i zdejmij tylne nogi. Za pomocą kleszczy mocno pociągnij skórę od biodra w dół w kierunku kostki, odsłaniając mięsień, a następnie użyj nożyczek, aby usunąć płat skóry.Przeciąć tuż nad kością udową i stawem biodrowym i usunąć całą tylną nogę, przecinając kość. Pracując w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego, przenieś nogi na jedną z wcześniej przygotowanych szalek Petriego. Użyj nożyczek, aby przeciąć tuż pod kostką i ostrożnie usuń jak najwięcej mięśni i elastycz

generation-large-numbers-myeloid-progenitors-dendritic-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę różnicowania myeloidnych komórek dendrytycznych z szpiku kostnego myszy. Zaprezentowano izolację kości piszczelowej i udowej myszy oraz przetwarzanie szpiku kostnego. Pokazano zdjęcia obrazujące morfologię komórek przed i po różnicowaniu, a także schematy przedstawiające fenotyp komórek oraz produkcję IL-12 po dojrzewaniu z użyciem CpG.

Hodowla mieloidalnych komórek dendrytycznych z prekursorów szpiku kostnego

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Ten film opisuje protokół generowania komórek dendrytycznych - kluczowych komórek prezentujących antygen, które aktywują limfocyty T - ze szpiku kostnego dorosłej myszy.

Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego: metoda generowania komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

Tutaj prezentujemy protokół, który generuje duże ilości mysich monocytów z heterogenicznego szpiku kostnego do zastosowań translacyjnych. W porównaniu z innymi, ta nowa metoda pomaga zmniejszyć liczbę uśmierconych zwierząt i obniżyć koszty, unikając kosztownych metod, takich jak magnetyczna separacja komórek o wysokim gradimencie (MACS).

Izolacja i wstrzyknięcie dożylne monocytów pochodzących ze szpiku kostnego myszy

W tym badaniu prezentujemy system hodowli in vitro, który może efektywnie generować pDC poprzez kokulturę pospolitych komórek progenitorowych limfoidalnych z komórkami zasilającymi AC-6 w obecności ligandu Flt3.

In vitro Generowanie mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze wspólnych progenitorów limfoidalnych przy użyciu systemu AC-6 Feeder

Zgłaszamy protokół wykorzystujący sortowanie komórek aktywowane fluorescencją do izolowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) o wysokiej czystości ze szpiku kostnego myszy podatnych na toczeń do badań funkcjonalnych pDC.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu oczyszczenia plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

Tutaj przedstawiono szczegółowe protokoły hodowli mysiego prekursora mieloidu linii komórkowej 32D/G-CSF-R, przeprowadzania infekcji wirusowych oraz przeprowadzania testów proliferacji i różnicowania. Ta linia komórkowa nadaje się do badania rozwoju komórek szpikowych oraz roli genów będących przedmiotem zainteresowania we wzroście komórek szpikowych i różnicowaniu neutrofilów.

Proliferacja i różnicowanie mysich komórek prekursorowych mieloidu 32D/G-CSF-R

Pokazujemy, jak zidentyfikować i wyizolować 6 podzbiorów komórek progenitorowych szpiku myszy za pomocą kombinacji sortowania magnetycznego i fluorescencyjnego (MACS i FACS). Protokół ten może być stosowany do testów hodowli in vitro (hodowle metylocelulozy lub płynów), eksperymentów z transferem adoptywnym in vivo oraz analiz RNA/białka.

Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

Ta metoda opisuje oczyszczanie za pomocą cytometrii przepływowej MEP i MKp z kości udowych, piszczelowych i miednicy myszy.

Izolacja progenitorów megakariocytów myszy

Tutaj prezentujemy ekonomiczną i efektywną metodę izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego o wysokiej czystości od myszy po 7 dniach hodowli z 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Tutaj opisujemy nowatorską metodę cytometrii przepływowej do prospektywnej izolacji wczesnych prekursorów erytroidalnych (BFU-e) i erytroidalnych tworzących kolonie (CFU-e) bezpośrednio ze świeżego szpiku kostnego i śledziony myszy. Protokół ten, opracowany na podstawie danych transkryptomicznych pojedynczych komórek, jest pierwszym, który izoluje wszystkie erytroidalne komórki progenitorowe tkanki o wysokiej czystości.

Identyfikacja i izolacja progenitorów erytroidalnych jednostek tworzących pęknięcia i kolonii z tkanki myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Poznaj metodę izolacji dużych populacji komórek mieloidalnych z myszego szpiku kostnego przy użyciu sortowania komórek wysokiej prędkości. Technika opiera się na markerach Ly6C i CD115.

Generowanie dużej liczby progenitorów szpiku i prekursorów komórek dendrytycznych z mysiego szpiku kostnego przy użyciu nowej strategii sortowania komórek (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie dużej liczby progenitorów szpiku i prekursorów komórek dendrytycznych z mysiego szpiku kostnego przy użyciu nowej strategii sortowania komórek

Przeglądaj więcej filmów