Generowanie dużej liczby progenitorów szpiku i prekursorów komórek dendrytycznych z mysiego szpiku kostnego przy użyciu nowej strategii sortowania komórek

Metoda ta może umożliwić naukowcom uzyskanie wystarczającej liczby typów komórek, aby odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii rozwojowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że opiera się ona na kilku wybranych markerach w celu wyizolowania dużej liczby komórek, które tradycyjnie znajdują się w niewielkiej liczbie ex vivo. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapeutycznego przeszczepu szpiku kostnego, ponieważ pozwala na izolację dużej liczby komórek progenitorowych.

Aby rozpocząć protokół, nasycić tylne nogi i tułów wcześniej przygotowanej myszy 75% etanolem i wykonać płytkie nacięcia przez skórę wokół stawu biodrowego za pomocą zakrzywionych nożyczek do tkanek. Następnie zdejmij i zdejmij tylne nogi. Za pomocą kleszczy mocno pociągnij skórę od biodra w dół w kierunku kostki, odsłaniając mięsień, a następnie użyj nożyczek, aby usunąć płat skóry.

Przeciąć tuż nad kością udową i stawem biodrowym i usunąć całą tylną nogę, przecinając kość. Pracując w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego, przenieś nogi na jedną z wcześniej przygotowanych szalek Petriego. Użyj nożyczek, aby przeciąć tuż pod kostką i ostrożnie usuń jak najwięcej mięśni i elastycznej tkanki łącznej.

Przenieś oczyszczoną kość na drugą przygotowaną szalkę Petriego. Następnie oddziel kość udową, kolano i piszczel. Za pomocą kleszczy przytrzymaj nogę za kolano i zlokalizuj szpik, słabą czerwoną linię wewnątrz jamy kostnej w górnej części kości udowej i w kierunku końca kości piszczelowej.

Nożyczkami przetnij kość piszczelową tuż nad miejscem, w którym wydaje się, że kończy się szpik. Wytnij tuż pod stawem kolanowym, wytnij tuż nad stawem kolanowym. Następnie przepłucz szpik kostny z kości udowej i piszczelowej.

Napełnij 10-mililitrową strzykawkę kompletnym podłożem z 50-mililitrowej stożkowej rurki i zakryj strzykawkę igłą o rozmiarze 23. Trzymając kość kleszczami nad trzecią przygotowaną szalką Petriego, włóż igłę do kanału kostnego i przepchnij przez nią podłoże, wypłukując komórki. Powtarzaj ten krok, aż przez kość nie będzie już widać koloru.

Kontynuuj procedurę, miażdżąc nasadę. Będąc jeszcze na drugiej szalce Petriego, mocno chwyć rzepkę kleszczami i zmiażdż kolana końcówką strzykawki. Kontynuuj, aż nasada przestanie być czerwona.

Za pomocą strzykawki przenieś komórki z drugiej i trzeciej szalki Petriego do 50-mililitrowej probówki. Rozdrabniaj grudki, delikatnie pipetując w górę i w dół, starając się unikać tworzenia pęcherzyków. Odwirować komórki.

Następnie usunąć supernatant za pomocą pipety serologicznej, usunąć osad przez strzepywanie i poddać lizie czerwone krwinki, inkubując je w jednym mililitrze roztworu potasu chlorku amonu lub buforu do lizy ACK, przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Za pomocą pipety serologicznej dodać 40 mililitrów buforu HBSS. Za pomocą pipety serologicznej przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i odwiruj komórki.

Za pomocą pipety serologicznej usunąć supernatant i wyhodować komórki szpiku kostnego w kompletnym pożywce z 10 nanogramami na mililitr rekombinowanej myszy GM-CSF o gęstości od 10 do 6 komórek na mililitr. Za pomocą pipety serologicznej przenieś komórki na płytki do hodowli tkankowych i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla, aż będą gotowe do przystąpienia do barwienia. Delikatnie, ale dokładnie, pipetuj komórki w górę i w dół, aby usunąć luźno przylegające komórki.

Za pomocą pipety serologicznej przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i odwiruj komórki. Delikatnie wylać supernatant i przemyć granulowane komórki, dodając 30 mililitrów buforu płuczącego FACS lub SFWB za pomocą pipety serologicznej. Następnie odwiruj komórki i powtórz mycie.

Następnie zawiesić i wybarwić komórki zgodnie z instrukcjami producenta przeciwciała. Ponownie zawiesić pięć razy 10 do 7 komórek w jednym mililitrze FWB i dodać po dwa mikrogramy anty Ly-6C i anty CD115, znakowane fluoroforami. Aby jeszcze bardziej odróżnić CMP od MODC, dodaj dwa mikrogramy przeciwciał anty CD11C.

Próbki należy inkubować przez 30 minut na lodzie. Po inkubacji za pomocą pipety serologicznej dodać 10 mililitrów FWB i odwirować komórki. Delikatnie odlej sklarowany sklarant i umyj granulowane komórki, dodając 30 mililitrów FWB za pomocą pipety serologicznej.

Odwiruj komórki i powtórz mycie. Przed podwieszeniem ogniw należy dokładnie przesunąć rurkę, aby usunąć osad. Użyj pipety serologicznej, aby ponownie zawiesić komórki w ilości od 10 do 7 komórek na mililitr FWB i przefiltruj je przez filtr komórkowy o średnicy 35 mikrometrów.

Za pomocą pipety serologicznej przenieś przefiltrowane komórki do probówki polipropylinowej i umieść probówkę na lodzie, aż będą gotowe do sortowania. Przepuść niezabarwioną kontrolę przez sortownik komórek i zastosuj bramkę, aby wykluczyć drobne zanieczyszczenia i bardzo ziarniste cząstki. Przepuść pojedyncze fluorescencyjne próbki kontrolne przez sortownik komórek i dostosuj kompensację w razie potrzeby.

Uruchom próbkę próbki z wieloma znakami i obserwuj cztery odrębne populacje. Zastosuj bramę, aby odizolować każdą z czterech głównych populacji. Przygotuj probówki do pobrania, dodając wystarczającą ilość płodowej surowicy cielęcej lub FCS, aby osiągnąć co najmniej 20% końcowe stężenie po wypełnieniu.

Na przykład, jeśli używasz pięciomililitrowych probówek, dodaj jeden mililitr FCS przed sortowaniem i wyjmij probówkę, gdy osiągnie całkowitą objętość pięciu mililitrów. Aby zapobiec wymianie błony i wychwytowi przeciwciał, wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cały czas sortowania. Po zebraniu żądanej liczby komórek za pomocą pipety serologicznej przenieść komórki do nowej stożkowej probówki i odwirować komórki.

Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach FWB, a następnie ponownie odwirować komórki. Powtórz zawiesinę FWB, w sumie przez dwa prania. Na koniec usuń supernatant po drugim przemyciu i kontynuuj zgodnie z projektem eksperymentu.

Aby zachować jak najwięcej kanałów dostępnych do analizy, rutynowo wybierano żywotne komórki, oparte na rozproszeniu do przodu i na boki, z wyłączeniem bardzo małych i bardzo szczegółowych zdarzeń. Aby ustalić, czy ta strategia bramkowania niezawodnie wyklucza martwe komórki, próbki barwiono 7-aminoaktynomycyną D. Komórki analizowane bezpośrednio po zbiorach zawierały około 10% komórek 7-AAD dodatnich, gdy typowa bramka FSC, SSC została zastosowana do świeżo wyizolowanych komórek ze szpiku kostnego. Podobny odsetek martwych komórek był również obecny w 1. i 3. miejscu hodowli.

Do piątego dnia liczba martwych komórek w bramce została zmniejszona do 5%, dlatego użycie takiej bramki żywotności jest ogólnie odpowiednie do sortowania w piątym dniu i później. Cytometria przepływowa wykazała, że w populacji Ly6C ujemnej, CD115, komórki CD3, CD45R dodatnie utrzymywały się silnie od dnia zerowego do trzeciego. W czwartym dniu pozostało tylko kilka komórek CD3, CD45R dodatnich, a w piątym i szóstym dniu nie było komórek eksprymujących CD3, CD45R; w ten sposób, w ciągu czterech dni hodowli w GM-CSF, komórki dodatnie linii były zasadniczo nieobecne i nie były w ogóle wykrywane w piątym i szóstym dniu hodowli.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że skład komórkowy zależy od długości hodowli. Sortowanie trzy dni po zbiorach daje dużą liczbę wczesnych stadiów i niewiele późnych etapów i odwrotnie w przypadku kultur posortowanych po pięciu dniach.