Name: Rusztowanie przewodzące prąd elektryczny do modulacji i dostarczania komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Poznaj metodę stymulacji elektrycznej komórek macierzystych na przewodzącym rusztowaniu polimerowym z minimalnie inwazyjnym wszczepieniem in vivo. Technika ta wspiera badania nad udarem i terapią komórkową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Kati Andreasson (Wydział Neurologii i Nauk Neurologicznych, Uniwersytet Stanforda) za korzystanie z urządzenia qRT-PCR. Prace były wspierane przez National Institutes of Health Grants K08NS098876 (dla P.M.G.) oraz Stanford School of Medicine's Postdoctoral Fellowship (dla B.O.).

Wszystkie procedury dotyczące komórek macierzystych i zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet Nadzoru nad Komórkami Macierzystymi Uniwersytetu Stanforda oraz przez Panel Administracyjny ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi Uniwersytetu Stanforda (SCRO-616 i APLAC-31909).
1. Wytrawianie szkła ITO
<ol>
	<li>Przygotować szkiełko pokryte tlenkiem indu i cyny (ITO), umieszczając środek maskujący po przewodzącej stronie szkła. 
	UWAGA: Większość dostępnych na rynku taśm przezroczystych może być stosowana jako środek maskujący.
	<ol>
		<li>Usuń nadmiar maski za pomocą ostrza, pozostawiając na szkle tylko pożądany kształt końcowego wzoru ITO.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Połączyć 5% (v/v) kwasu azotowego i 45% (v/v) HCl w szklanej zlewce wewnątrz dygestoriów, aby przygotować roztwór do trawienia.
	<ol>
		<li>Użyj płyty grzejnej i termometru, aby upewnić się, że temperatura roztworu do trawienia jest utrzymywana na poziomie 70 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy roztwór trawiący osiągnie temperaturę 70 °C, umieść szkiełko z maskowanym ITO w roztworze na 2 minuty, aby usunąć nadmiar warstwy ITO. 
	UWAGA: Taśma maskująca chroni warstwę ITO przed działaniem roztworu kwasu.</li>
	<li>Wyjąć szkiełko z roztworu i przepłukać je dejonizowanym (DI)H2O.</li>
	<li>Ostrożnie zdejmij maskę i zmierz rezystancję za pomocą multimetru, aby upewnić się, że pozostały ITO jest nienaruszony. Odczyty żądanego wytrawionego obszaru powinny wynosić około 0 Ω.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu pirolu
<ol>
	<li>W szklanej butelce o pojemności 1000 ml rozpuścić 70 g dodecylobenzenosulfonianu sodu (NaDBS) w 600 ml DI H2O.</li>
	<li>Po rozpuszczeniu NaDBS dodać do roztworu 14 ml 0,2 M pirolu i 386 ml DIH 2O.</li>
	<li>Przykryj roztwór folią aluminiową i przechowuj w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Galwanizacja polipirolu na szkle ITO
<ol>
	<li>Podgrzać roztwór pirolu do temperatury pokojowej, aż NaDBS całkowicie się rozpuści. 
	UWAGA: Zajmuje to około 15 do 20 minut.</li>
	<li>Wlać 25 ml roztworu pirolu do zlewki.</li>
	<li>Podłącz wytrawione szkło ITO do multimetru i zanurz szkiełko w roztworze pirolu.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że strona o rezystancji 0 Ω jest skierowana w stronę elektrody referencyjnej z siatki platynowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastosuj prąd elektryczny, aby zainicjować galwanizację PPy na powierzchni ITO za pomocą multimetru (prąd kontrolowany na poziomie 3 mA/cm2 przez 4 godziny).</li>
	<li>Wyjmij szkło ITO z multimetru i umyj galwaniczny PPy w DI H2O, aby usunąć resztki środka powierzchniowo czynnego.</li>
	<li>Delikatnie odłącz galwaniczną płytkę PPy od szkła ITO za pomocą żyletki.
	<ol>
		<li>Przechowuj płytkę PPy w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie polidimetylosiloksanu (PDMS)
<ol>
	<li>Za pomocą szpatułki i naczynia wagowego wymieszaj 18 g środka bazowego z 2 g utwardzacza i wlej mieszaninę do dwóch szklanych foremek o wymiarach 10 cm x 8 cm.</li>
	<li>Usuń bąbelki z foremek za pomocą komory próżniowej przez 15 - 20 minut.</li>
	<li>Wstaw foremki do piekarnika o temperaturze 70 °C na 3 godziny.</li>
	<li>Po schłodzeniu użyj płaskiej szpatułki, aby usunąć PDMS z foremek.</li>
</ol>
5. Produkcja komory do stymulacji elektrycznej in vitro
<ol>
	<li>Autoklawować metalowe płytki (szer. x dł., 2,5 cm x 12,5 cm) i zawory przepływowe w temperaturze 120 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Używając szkiełka komorowego jako szablonu, wytnij dwa kawałki PDMS. 
	UWAGA: Jeden kawałek PDMS służy jako obwód komory celi z wycięciami dwóch przylegających kwadratów z wnętrza komory celi. Drugi element PDMS to zarys obwodu komory.
	<ol>
		<li>Wytnij wewnętrzną komorę komórkową tak, aby miała kształt kwadratu i pasowała do kształtu komory komórki. Upewnij się, że ogólny kształt obu części PDMS jest prostokątny i odpowiada kształtowi szkiełka komory.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ułóż materiały w następujący sposób od dołu do góry: (1) metalowa płytka, (2) PDMS (bez wycięć), (3) płytka PPy (prostopadła do PDMS), (4) PDMS (z wycięciami) i (5) komora komórkowa.</li>
	<li>CLAMP URZĄDZENIE RAZEM, GDY JEST W PEŁNI WYRÓWNANE.</li>
	<li>Wytnij dwa 60 cm kawałki metalowego drutu i za pomocą pasty srebrnej przymocuj po jednym drucie do każdego końca płytki PPy, która wystaje z zewnątrz komory. Upewnij się, że przewody są wystarczająco długie, aby wystawały z aparatu na zewnątrz inkubatora.</li>
	<li>Po utwardzeniu pasty srebrnej wzmocnij i uszczelnij połączenie przewodów żywicą epoksydową.
	<ol>
		<li>Zapisz rezystancję za pomocą multimetru, aby upewnić się, że zastosowane pole jest takie samo w każdej komorze.</li>
		<li>W celu implantacji należy usunąć przewody, odpiąć komory komórkowe i PDMS, a następnie oddzielić je od rusztowania przewodzącego. Wymiar wszczepionych rusztowań wynosi około 1 mm x 3 mm x 0,25 mm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Posiewanie ludzkich neuronalnych komórek progenitorowych (hNPC) na PPy
<ol>
	<li>Zmontowane komory sterylizować w świetle UV przez 2 godziny.
	<ol>
		<li>Po 1 godzinie obrócić zmontowane komory o 90°.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po sterylizacji powierzchnię PPy na dnie komory pokryć 800 μl podłoża powlekającego i pozostawić substrat do zestalenia się na płytce PPy w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 1 godzinę.</li>
	<li>Po 1 godzinie wyjąć supernatant z komór i delikatnie spłukać 1 ml DPBS +Ca +Mg na studzienkę. 
	UWAGA: Unikaj mocnego mycia powierzchni PPy, ponieważ spowoduje to oderwanie podłoża powłokowego.</li>
	<li>Używając świeżych pożywek komórkowych, mechanicznie zdysocjuj hodowane komórki do użycia z komorami z płytki do hodowli tkankowej z delikatnym pipetowaniem. 
	UWAGA: Komórki powinny zlewać się w 90 - 100% po dysocjacji.</li>
	<li>Zbieraj granulki hNPC, odwirowując przy 8000 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Za pomocą hemocytometru policz i ponownie zawieś komórki w objętości 100 000 komórek/cm2.</li>
	<li>Umieść 100 000 komórek w każdej studzience komory (100 000 komórek/cm2 w 1 ml pożywki).</li>
	<li>Komory powrotne do inkubatora w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .</li>
</ol>
7. Stymulacja elektryczna hNPC
<ol>
	<li>Jednego dnia po wysianiu komórek w komorach użyj generatora fal, aby zastosować stymulację elektryczną do komórek.</li>
	<li>Przed stymulacją należy dobrze usunąć stare pożywki z każdej komory i uzupełnić 800 μl świeżej pożywki.</li>
	<li>Po wymianie pożywki umieść komory z powrotem w inkubatorze, wyprowadź przewody z inkubatora i podłącz je do generatora przebiegów</li>
	<li>Zastosuj stymulację do komórek sygnałem fali prostokątnej o napięciu ±400 mV i częstotliwości 100 Hz przez 1 godzinę.</li>
	<li>Po stymulacji usunąć druty i inkubować komory przez kolejny dzień w inkubatorze nastawionym na 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Wykonaj późniejszą analizę biologiczną, w tym żywotność komórek i ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
8. Implantacja in vivo PPy
<ol>
	<li>Wykonaj modele udaru okluzji dystalnej tętnicy środkowej mózgu (dMCA) na dorosłych nagich szczurach płci męskiej z niedoborem limfocytów T (NIH-RNU 230 ± 30 g), jak opisano wcześniej2. Wykonaj implantację tydzień po okluzji dMCA.</li>
	<li>Na dzień przed zabiegiem należy podać szczurom ampicylinę (1 mg/ml) w wodzie w klatce.</li>
	<li>Znieczulić szczura w komorze indukcyjnej za pomocą 0,5 - 3% mg/kg izofluranu podawanego wziewnie.</li>
	<li>Potwierdź znieczulenie szczura przez brak reakcji odruchu szczypania palca u nogi.
	<ol>
		<li>Gdy zwierzę jest pod narkozą, kontynuuj monitorowanie koloru błony, wzorca oddychania i temperatury w odbycie co 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po potwierdzeniu znieczulenia nałóż sztuczne łzy na oczy szczura, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
	<li>Upewnij się, że podczas tej procedury zachowana jest technika aseptyczna, używając sterylnych rękawiczek i sterylnego serwety chirurgicznego13. Sterylne narzędzia chirurgiczne należy przechowywać w sterylnym polu.</li>
	<li>Gdy szczur jest pod narkozą, wywierć kraniektomię powyżej lewej kory. Otwórz oponę twardą.
	<ol>
		<li>Usuń oponę twardą z mózgu za pomocą mikrocienkiej igły chirurgicznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wszczepić rusztowania przewodzące z systemu in vitro do kory szczura. 
	UWAGA: W naszych eksperymentach wszczepiliśmy rusztowania od 3 dnia in vitro po posiewie hNPC.
	<ol>
		<li>Implant należy umieścić przede wszystkim na korze półcienia przyśrodkowej do zmiany udaru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po umieszczeniu rusztowania umieść Surgicel na implancie, aby zapobiec ruchom przy zamykaniu skóry.</li>
	<li>Zszyć ranę i wstrzyknąć podskórnie szczurom buprenorfinę SR w dawce 1 mg/kg w celu opanowania bólu związanego z chirurgią stereotaktyczną i okluzją dMCA.</li>
	<li>Umieść szczura w klatce regeneracyjnej, gdy odzyska przytomność.
	<ol>
		<li>Nigdy nie zostawiaj zwierzęcia bez opieki, gdy jest nieprzytomne.</li>
		<li>Nie umieszczaj zwierzęcia z innymi, dopóki nie odzyska pełnej świadomości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Codziennie monitoruj zwierzęta pod kątem oznak bólu, w tym utraty masy ciała, zmniejszonego spożycia pokarmu/wody, zmniejszonej pielęgnacji/zaniedbanej sierści, zmniejszonej/zwiększonej spontanicznej aktywności, nieprawidłowej postawy, odwodnienia/zwiewania skóry, zapadniętych oczu, ukrywania się, samookaleczania, szybkiego oddechu, oddychania z otwartymi ustami, drgawek, drżenia, drżenia, drżenia i wokalizacji.
	<ol>
		<li>Monitoruj zwierzęta codziennie, dopóki nie okaże się, że jedzą, piją, pielęgnują się i przybierają na wadze, a następnie co tydzień po przybraniu na wadze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wczesna eutanazja poprzez wdychanie CO2 i wtórne potwierdzenie eutanazji (w celu zapewnienia, że zwierzę nie ożyje z powodu normalnego dostarczania tlenu po wdychaniu CO2 ) nastąpi u każdego zwierzęcia, które wydaje się nie jeść, nie pić i przybierać na wadze po początkowym zabiegu chirurgicznym; pojawia się w bólu; lub wydaje się niezdolne do ukończenia testów behawioralnych z powodu większego niż oczekiwano deficytu kory ruchowej. </li>
</ol>

<ol><li>Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Science+of+Stroke%3A+Mechanisms+in+Search+of+Treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Science of Stroke: Mechanisms in Search of Treatments.</a> Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).</li>
<li>George, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Preconditioning+of+Stem+Cells+with+a+Conductive+Polymer+Scaffold+Enhances+Stroke+Recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrical Preconditioning of Stem Cells with a Conductive Polymer Scaffold Enhances Stroke Recovery.</a> Biomaterials. 142, 31-40 (2017).</li>
<li>Steinberg, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Outcomes+of+Transplanted+Modified+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Stroke%3A+A+Phase+1%2F2a+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Clinical Outcomes of Transplanted Modified Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in Stroke: A Phase 1/2a Study.</a> Stroke. 47 (7), 1817-1824 (2016).</li>
<li>George, P. M., Steinberg, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Stroke+Therapeutics%3A+Unraveling+Stroke+Pathophysiology+and+Its+Impact+on+Clinical+Treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Novel Stroke Therapeutics: Unraveling Stroke Pathophysiology and Its Impact on Clinical Treatments.</a> Neuron. 87 (2), 297-309 (2015).</li>
<li>Schabitz, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Enhances+Poststroke+Sensorimotor+Recovery+and+Stimulates+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Intravenous Brain-Derived Neurotrophic Factor Enhances Poststroke Sensorimotor Recovery and Stimulates Neurogenesis.</a> Stroke. 38 (7), 2165-2172 (2007).</li>
<li>Liauw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondins+1+and+2+Are+Necessary+For+Synaptic+Plasticity+and+Functional+Recovery+After+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Thrombospondins 1 and 2 Are Necessary For Synaptic Plasticity and Functional Recovery After Stroke.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28 (10), 1722-1732 (2008).</li>
<li>Cantu, D. A., Hematti, P., Kao, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Encapsulating+Biomaterial+Regulates+Mesenchymal+Stromal%2FStem+Cell+Differentiation+and+Macrophage+Immunophenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell Encapsulating Biomaterial Regulates Mesenchymal Stromal/Stem Cell Differentiation and Macrophage Immunophenotype.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1 (10), 740-749 (2012).</li>
<li>Chaudhuri, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+with+Tunable+Stress+Relaxation+Regulate+Stem+Cell+Fate+and+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydrogels with Tunable Stress Relaxation Regulate Stem Cell Fate and Activity.</a> Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).</li>
<li>Ballios, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Hyaluronan-Based+Injectable+Hydrogel+Improves+the+Survival+and+Integration+of+Stem+Cell+Progeny+following+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Hyaluronan-Based Injectable Hydrogel Improves the Survival and Integration of Stem Cell Progeny following Transplantation.</a> Stem Cell Reports. 4 (6), 1031-1045 (2015).</li>
<li>Mothe, A. J., Tam, R. Y., Zahir, T., Tator, C. H., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+Injured+Spinal+Cord+by+Transplantation+of+Neural+Stem+Cells+in+a+hyaluronan-based+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Repair of the Injured Spinal Cord by Transplantation of Neural Stem Cells in a hyaluronan-based hydrogel.</a> Biomaterials. 34 (15), 3775-3783 (2013).</li>
<li>Saini, M., Singh, Y., Arora, P., Arora, V., Jain, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implant+Biomaterials%3A+A+Comprehensive+Review%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Clin+Cases%22%5BJournal%5D)">Implant Biomaterials: A Comprehensive Review.</a> World J Clin Cases. 3 (1), 52-57 (2015).</li>
<li>Huang, Y., Li, Y., Chen, J., Zhou, H., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Stimulation+Elicits+Neural+Stem+Cells+Activation%3A+New+Perspectives+in+CNS+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Hum+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electrical Stimulation Elicits Neural Stem Cells Activation: New Perspectives in CNS Repair.</a> Front Hum Neurosci. 9, (2015).</li>
<li>Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+Rodent+Surgery+for+the+New+Surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li>
<li>Abdelwahid, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Death+and+Survival+in+Heart+Regeneration+and+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Death and Survival in Heart Regeneration and Repair.</a> Apoptosis. 21 (3), 252-268 (2016).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Clinical+Status+of+Stem+Cell+Therapy+for+Ischemic+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy.</a> Stem Cells Int. 2015, (2015).</li>
<li>George, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+Biocompatibility+of+Polypyrrole+Implants+Suitable+for+Neural+Prosthetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Fabrication and Biocompatibility of Polypyrrole Implants Suitable for Neural Prosthetics.</a> Biomaterials. 26 (17), 3511-3519 (2005).</li>
<li>Aravamudan, B., Thompson, M., Pabelick, C., Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Induces+Proliferation+of+Human+Airway+Smooth+Muscle+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Brain-Derived Neurotrophic Factor Induces Proliferation of Human Airway Smooth Muscle Cells.</a> J Cell Mol Med. 16 (4), 812-823 (2012).</li>
<li>Lopes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin+2+Regulates+Cell+Proliferation+Induced+by+Rac1+Redox-Dependent+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin 2 Regulates Cell Proliferation Induced by Rac1 Redox-Dependent Signaling.</a> Mol Cell Biol. 23 (15), 5401-5408 (2003).</li>
<li>Ploughman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Contributes+to+Recovery+of+Skilled+Reaching+After+Focal+Ischemia+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Brain-Derived Neurotrophic Factor Contributes to Recovery of Skilled Reaching After Focal Ischemia in Rats.</a> Stroke. 40 (4), 1490-1495 (2009).</li>
<li>Baker, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Neural+Stem+Cell+Therapy+Enhances+Recovery+in+an+Ischemic+Stroke+Pig+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Stem Cell Therapy Enhances Recovery in an Ischemic Stroke Pig Model.</a> Sci Rep. 7 (1), 10075(2017).</li>
<li>Bacigaluppi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Stem+Cell+Transplantation+Induces+Stroke+Recovery+by+Upregulating+Glutamate+Transporter+GLT-1+in+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural Stem Cell Transplantation Induces Stroke Recovery by Upregulating Glutamate Transporter GLT-1 in Astrocytes.</a> J Neurosci. 36 (41), 10529-10544 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby zadeklarować w związku z tą pracą.

Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że komórki macierzyste są obiecujące jako nowatorska terapia udaru mózgu. Obietnica ta zaowocowała znaczącym wysiłkiem na rzecz udoskonalenia terapii komórkami macierzystymi w leczeniu pacjentów pacjentów, w ramach co najmniej 40 trwających lub zakończonych badań klinicznych. Patologia udaru mózgu jest wyjątkowym zaburzeniem neurologicznym, które nadaje się do terapii komórkami macierzystymi, ponieważ po ostrym uszkodzeniu nie zachodzi proces neurodegeneracyjny uniemożliwiający powrót...

Udar mózgu jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów na świecie i piątą najczęstszą przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych. Pomimo tak wysokiej śmiertelności, leczenie w celu powrotu do zdrowia po udarze pozostaje obecnie wyzwaniem, ponieważ obecnie nie są dostępne żadne realne opcje medyczne1. Obecnie prowadzonych jest około 300 badań klinicznych dotyczących udarów niedokrwiennych, z których tylko 40 wykorzystuje komórki macierzyste. Wcześniejsze badania wykazały, że terapie komórkami macierzystymi mają korzystny wpływ na naprawę udaru2,3. Czynniki parakrynne, takie jak neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF) i trombospondyna-1 (THBS-1) uwalniane z przeszczepionych ludzkich nerwowych komórek progenitorowych (hNPC), wykazały poprawę regeneracji funkcjonalnej dzięki mechanizmom związanym ze wzrostem tworzenia synaps, angiogenezą, rozgałęzieniami dendrytycznymi i nowymi projekcjami aksonalnymi, a także modulowaniem układu odpornościowego4,5,6. Jednak optymalne metody dostarczania komórek macierzystych pozostają nieuchwytne.
Skuteczne dostarczenie komórek macierzystych do mózgu pozostaje wyzwaniem. Obecnie wprowadzono iniekcyjne systemy hydrożelowe i polimerowe rusztowania do dostarczania komórek macierzystych. Te metody dostarczania chronią komórki macierzyste podczas przeszczepu, a także zapewniają ochronę przed trudnym środowiskiem po udarze, w tym reakcją zapalną gospodarza i stanami niedotlenienia7,8,9,10. Jednak najczęściej stosowane materiały są obojętne, co ogranicza stosowanie ciągłej modulacji (tj. stymulacji elektrycznej) komórek11. Stymulacja elektryczna jest wskazówką, która wpływa na różnicowanie, gęstość kanałów jonowych i wzrost neurytów komórek macierzystych12. W porównaniu z polimerami obojętnymi, polimery przewodzące mogą przewodzić prąd pozwalający na elektryczną stymulację i manipulację komórkami macierzystymi2. Jednak dokładny mechanizm, za pomocą którego stymulacja elektryczna moduluje uwalnianie czynników neurotroficznych (tj. BDNF i THBS-1) nadal nie jest w pełni zbadany.
W tym protokole opisujemy kroki do skonstruowania systemu hodowli komórkowej składającego się z przewodzącego rusztowania polimerowego, polipirolu (PPy), który pozwala na stymulację elektryczną in vitro. Ze względu na sposób, w jaki system hodowli komórkowej jest wytwarzany, możliwe jest późniejsze zagnieżdżenie rusztowania wysiewanego przez komórki macierzyste do kory okołozawałowej. W przypadku tego systemu wstępnie kondycjonujemy elektrycznie komórki macierzyste na rusztowaniu przez krótki okres czasu przed implantacją. Po stymulacji elektrycznej przewodzące rusztowanie polimerowe przenoszące komórki jest z powodzeniem wszczepiane wewnątrzczaszkowo przy użyciu minimalnie inwazyjnej metody.

<table><tbody><tr><td>FGF-Basic</td><td>Invitrogen</td><td>CTP0261</td><td>20 ng/ml do pożywek roboczych</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td></td><td>Corning cb40234a</td> 1<td>:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>LIF Białko, Recom. Hum. (10 &mikro; g/mL)</td><td>EMD Milipore</td><td>LIF1010</td><td>10 ng/ml do mediów roboczych</td></tr><tr><td>Sylgard 184 silikon 3,9 kg</td><td>Fisherbrand</td><td>NC0162601</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisherbrand</td><td>SA56-4</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrat kwasu azotowego (certyfikowany) ACS, Fisher Chemical</td><td>Fisherbrand</td><td>SA95</td><td></td></tr><tr><td>ITO Szkło</td><td>Delta Technologies</td><td>CG-40IN-0115</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylobenzenosulfonian sodu</td><td>Sigma</td><td>289957-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Pyrrole</td><td>Sigma</td><td>131709-500ML</td><td>Chronić roztwór pirolu przed światłem i temperaturą pokojową</td></tr><tr><td>8-dołkowe szklane komory szkiełkowe</td><td>Thermo Sci Nuc&nbsp;</td><td>125658</td><td>Odłącz komorę celi i przechowuj ją w wysterylizowanych warunkach</td></tr><tr><td>Wspornik o płaskiej powierzchni, 3"x1"</td><td>McMaster-Carr&nbsp;</td><td>1030A4</td><td></td></tr><tr><td>DWUCZĘŚCIOWA SREBRNA FARBA 14G</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki&nbsp;</td><td>1264214</td><td>Wymieszaj dwie części (1:1) w plastikowej płytce</td></tr><tr><td>DPBS, 1x, z Ca i Mg, bez czerwieni fenolowej</td><td>Genesse&nbsp;</td><td>25-508C</td><td></td></tr><tr><td>AB2 ArunA Zestaw do hodowli komórek nerwowych</td><td>Aruna Biomedical&nbsp;</td><td>ABNS7013.2</td><td></td></tr><tr><td>hNP1 Zestaw do ekspansji ludzkiego neuronalnego progenitora</td><td>Aruna Biomedical&nbsp;</td><td>&nbsp; hNP7013.1</td><td></td></tr><tr><td>Bezkontaktowy zawór regulacji przepływu, mosiądz niklowany, do rury 3/32" do 5/8" OD</td><td>McMaster-Carr&nbsp;</td><td>Multimetr 5330K22</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Keysight&nbsp;</td><td>E3641A</td><td></td></tr><tr><td>Generator piany falowej</td><td>Keysight</td><td>33210A-10MHz</td><td></td></tr><tr><td>Siatki Pt</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>298107-425MG</td><td>Elektroda referencyjna o wymiarach, 1x1 cm</td></tr><tr><td>ŻYWY/MARTWY Zestaw do żywotności/cytotoksyczności, do komórek ssaków</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td></td><td></td>Hs02718934_s1</tr><tr><td>THBS1</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>Hs00962908_m1</tr><tr><td>GAPDH</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td></td><td></td>Hs02758991_g1</tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder (250)</td><td>Qiagen</td><td>79656</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DNaz bez RNaz (50)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>iScript Zestaw do syntezy cDNA, 100 x 20 i mikro; L rxns</td><td>BIORAD</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>4369510</tr><tr><td>7-8 tygodniowe, samiec, szczury RNU</td><td>NCI-Frederick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 Nic-0 Nici jedwabne Ethicon</td><td>eSutures.com</td><td>683G</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Henry Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>V-1 Stołowy laboratoryjny system znieczulenia zwierząt</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Surgicel Oryginalny wchłanialny hemostat</td><td>Ethicon</td><td>1952</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoryjny standardowy instrument stereotaktyczny, Rat</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td></td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional&nbsp; Sterylne rękawiczki nitrylowe Safeskin Purple</td><td>Fisherbrand</td><td>19-063-130</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna serweta</td><td>Medline</td><td>DYNJSD1092</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; Rękojeść ostrza skalpela ze stali nierdzewnej Shandon, mieści ostrza nr 20-25</td><td>Fisherbrand</td><td>53-34</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela Walter Stern seria 300</td><td>Fisherbrand</td><td>17-654-456</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex System PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484642</td><td></td></tr><tr><td>Mikro hak preparacyjny Frazier</td><td>Aparat Harvard</td><td>52-2706</td><td></td></tr></tbody></table>

rusztowanie przewodzące prąd elektryczny do modulacji i dostarczania komórek macierzystych

Electrically Conductive Scaffold to Modulate and Deliver Stem Cells

Terapia komórkami macierzystymi okazała się ekscytującym sposobem leczenia udaru mózgu, ale optymalna metoda dostarczania pozostaje niejasna. Chociaż technika mikroiniekcji jest stosowana od dziesięcioleci do dostarczania komórek macierzystych w modelach udaru, technika ta jest ograniczona przez brak możliwości manipulowania komórkami macierzystymi przed wstrzyknięciem. W artykule szczegółowo opisano metodę wykorzystania elektroforetycznego rusztowania polimerowego do dostarczania komórek macierzystych. Elektryczna stymulacja komórek macierzystych za pomocą przewodzącego rusztowania polimerowego zmienia geny komórek macierzystych zaangażowane w przeżycie komórki, odpowiedź zapalną i przebudowę synaptyczną. Po wstępnym kondycjonowaniu elektrycznym komórki macierzyste na rusztowaniu są przeszczepiane śródczaszkowo do modelu szczura z dystalną niedrożnością tętnicy środkowej mózgu. Protokół ten opisuje potężną technikę manipulowania komórkami macierzystymi za pomocą przewodzącego rusztowania polimerowego i tworzy nowe narzędzie do dalszego rozwoju terapii opartej na komórkach macierzystych.

Schemat przedstawiony na Rysunku 1 obrazuje ogólny przebieg procesu stymulacji elektrycznej hNPC oraz potencjalne zastosowania w dalszych etapach. Obecnym ograniczeniem w terapii komórkami macierzystymi jest fakt, że komórki te są narażone na trudne warunki po transplantacji, w tym na stan zapalny i warunki niedokrwienne. Trudne warunki te prawdopodobnie ograniczają ich skuteczność terapeutyczną14,15....

Ten protokół opisuje wytwarzanie systemu hodowli komórek, który umożliwia wysiewanie komórek macierzystych na przewodzącym rusztowaniu polimerowym do stymulacji elektrycznej in vitro, a następnie implantację in vivo rusztowania z komórek macierzystych przy użyciu techniki minimalnie inwazyjnej.

Rusztowanie przewodzące prąd elektryczny do modulacji i dostarczania komórek macierzystych

Stem cell therapy has emerged as an exciting stroke therapeutic, but the optimal delivery method remains unclear. While the technique of microinjection ...

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie platformy do elektrycznej stymulacji komórek macierzystych in vitro na przewodzącym rusztowaniu polimerowym, a następnie implantacji in vivo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach nad udarem mózgu i biologią komórek macierzystych, zapewniając środki do modulacji komórek macierzystych. Główną zaletą jest to, że komórki macierzyste mogą być optymalizowane in vitro, a następnie wszczepiane.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w powrót do zdrowia po udarze, może być również stosowana w innych systemach jako nowa metoda dostarczania komórek. Ogólnie rzecz biorąc, użytkownicy, którzy nie znają tej techniki, będą mieli trudności ze względu na precyzję wymaganą do montażu komory komórkowej oraz technikę związaną z kraniektomią. W przygotowaniu przeprowadź w autoklawie metalowe płytki o wymiarach 2,5 na 12,5 centymetra i zawory przepływowe.Następnie, używając szkiełka komorowego jako szablonu, wytnij dwa kawałki PDMS. Jeden z elementów służy do obrysowania obwodu komory. Na drugim kawałku wytnij dwa sąsiednie kawałki od wewnętrznej strony zjeżdżalni komory.Obie części powinny być prostokątne i pasować do szkiełka komory. Teraz ułóż materiały warstwami. Zacznij od metalowej płytki, następnie nieoszlifowanego PDMS, następnie płytki polipirolowej, zorientowanej prostopadle, następnie PDMS z wycięciami, a na końcu komory komórkowej.Ostrożnie wyrównaj warstwy i zaciśnij urządzenie razem. Następnie przetnij dwa odcinki metalowego drutu, aby wystawał od aparatu na zewnątrz inkubatora, w którym będzie się znajdował. Długości 60 centymetrów są zwykle wystarczająco długie.Następnie za pomocą pasty srebrnej przymocuj drut do każdego końca płytki polipyrolowej wystającej z zewnątrz komory. Po utwardzeniu pasty srebrnej wzmocnij i uszczelnij połączenia za pomocą żywicy epoksydowej. Teraz zarejestruj rezystancję w całym zespole za pomocą multimetru.Zastosowane pole musi być takie samo w każdej komorze. Następnie umieść komórki na zespole i stymuluj je elektrycznie zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przed wszczepieniem ogniw należy usunąć przewody z zespołu.Następnie odblokuj komory komórek i oddziel PDMS od rusztowania przewodzącego. Rusztowanie jest teraz gotowe do wszczepienia. Na dzień przed zabiegiem należy podać badanemu zwierzęciu ampicylinę w wodzie pitnej.W dniu zabiegu znieczulij szczura izofluranem i potwierdź znieczulenie szczyptaniem palca u nogi. Teraz nałóż sztuczne łzy na oczy szczura, aby były wilgotne. Po ogoleniu czaszki ułóż zwierzę i przygotuj się do sterylnej operacji.Noś odzież ochronną, rozpakuj wysterylizowane narzędzia i wysterylizuj skórę głowy. W przypadku kraniektomii wywierć otwór powyżej lewej kory mózgowej w dół do opony twardej. Spraw, aby otwór był nieco większy niż 1 na 3 milimetry, rozmiar implantu.Następnie otwórz oponę twardą i usuń oponę twardą z mózgu za pomocą mikrocienkiej igły chirurgicznej. Wyjmij zestaw z inkubatora hodowli TC i wyłącz zestawy. Następnie ostrożnie wszczep rusztowanie przewodzące z systemu in vitro do kory szczura.Następnie przykryj implant Surgicel, aby go zabezpieczyć, w przeciwnym razie może się przesunąć podczas zamykania skóry. Teraz zszyj ranę za pomocą jedwabnego szwu 4-0. Po wykonaniu szwów należy wstrzyknąć szczurom podskórnie buprenorfinę SR. Następnie umieść szczura w klatce regeneracyjnej, aż odzyska przytomność.Procedura pooperacyjna jest szczegółowo opisana w protokole tekstowym. Ludzkie neuronalne komórki progenitorowe poddano stymulacji elektrycznej, a następnie wybarwiono testami żywotności komórek. Zielony kolor wskazuje na żywą komórkę.Komórki były wyraźnie w stanie przetrwać stymulację elektryczną. Czynniki uwolnione z komórek neuroprogenitorowych, które są ważne w powrocie do zdrowia po udarze, oceniono na podstawie jednego mikrograma całkowitego RNA przy użyciu ilościowego RTPCR. Po znormalizowaniu wyników za pomocą metody progu cyklu delta delta, ujawniają one następnie ekspozycję na stymulację elektryczną w górę regulowaną ekspresję BDNF i THBS1.Po obejrzeniu tej procedury powinieneś dobrze zrozumieć, jak stworzyć system hodowli komórek dla przewodzących elektrycznie komórek macierzystych, a następnie implantację tych komórek macierzystych do modelu szczurzego. Po opanowaniu zabieg można wykonać w 45 minut, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać, aby zawsze monitorować zwierzęta pod kątem prawidłowego wzorca oddychania i koloru błony, aby zapewnić prawidłowe znieczulenie.Nie zapominaj, że praca ze szczurami i komórkami macierzystymi może być niebezpieczna i zawsze należy podjąć środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej.

electrically-conductive-scaffold-to-modulate-and-deliver-stem-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ludzkie okołonaczyniowe komórki macierzyste (PSCs) stanowią nową klasę komórek macierzystych do regeneracji tkanek szkieletowych, podobnie jak mezenchymalne komórki macierzyste (MSCs). PSCs można wyizolować za pomocą FACS (sortowania komórek aktywowanego fluorescencją) z tkanki tłuszczowej pobranej podczas standardowych procedur liposukcji, a następnie połączyć z rusztowaniem osteoindukcyjnym w celu uzyskania formowania kości in vivo.

Zastosowanie ludzkich peryvaskularnych komórek macierzystych w regeneracji kości

Ten film demonstruje procedurę wytwarzania mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej za pomocą elektrorozpylania. Te mikronośniki symulują natywne mikrośrodowisko specyficzne dla tkanek i są stabilne w długoterminowych modelach hodowli komórkowych 3D in vitro.

Wytwarzanie rusztowań biologicznych przez elektronatryskiwanie: technika generowania rusztowań mikronośnikowych pochodzących z zewnątrzkomórkowej macierzy tkanki pozbawionej komórek

Aby stworzyć wysoce zorganizowane struktury złożonej tkanki, należy złożyć wiele typów materiałów i komórek w zintegrowany kompozyt.  Ten kombinatoryczny projekt obejmuje warstwowe arkusze komórek specyficzne dla narządów z dwoma odrębnymi materiałami pochodzenia biologicznego, zawierającymi silną włóknistą podstawę macierzy oraz komórki śródbłonka w celu usprawnienia tworzenia nowych naczyń.

Inżynieria tkankowa: budowa wielokomórkowego rusztowania 3D do dostarczania warstwowych arkuszy komórkowych

Ten artykuł opisuje szereg ustawień do wysiewu ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych na materiały, w tym przypadku przędze elektroprzędzone, które nie pokrywają podstawy standardowych płytek dołków hodowlanych, aby zmaksymalizować i określić ilościowo liczbę komórek, które początkowo się przyczepiają, w porównaniu do znanej gęstości wysiewu.

Optymalizacja mocowania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do przędz elektroprzędzonych z poli(ε-kaprolaktonu)

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania elektroprzędzonych rusztowań z nanowłókien o stopniowanej organizacji włókien i badamy ich zastosowania w regulacji morfologii/orientacji komórek. Gradienty w odniesieniu do właściwości fizycznych i chemicznych rusztowań z nanowłókien oferują szeroką gamę zastosowań w dziedzinie biomedycyny.

Rusztowania z nanowłókien elektroprzędzonych z gradacją w organizacji włókien

Chondrogeneza z komórek macierzystych wymaga precyzyjnego dostrojenia warunków hodowli. W tym miejscu przedstawiamy magnetyczne podejście do kondensacji komórek, które jest niezbędnym krokiem do zainicjowania chondrogenezy. Ponadto wykazaliśmy, że dynamiczne dojrzewanie w bioreaktorze stosuje mechaniczną stymulację konstruktów komórkowych i zwiększa produkcję chrzęstnej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Agregacja magnetycznych komórek macierzystych 3D i dojrzewanie bioreaktora w celu regeneracji chrząstki

Ten artykuł dostarcza efektywnej i wykonalnej metody tworzenia wielowarstwowych arkuszy komórek macierzystych o korzystnych właściwościach komórek macierzystych.

Budowa wielowarstwowego arkusza mezenchymalnych komórek macierzystych z systemem dynamicznej hodowli 3D

Tutaj prezentujemy protokół treningu populacji komórek za pomocą bodźców elektrycznych i mechanicznych naśladujących fizjologię serca. Ta elektromechaniczna stymulacja zwiększa potencjał kardiomiogenny leczonych komórek i jest obiecującą strategią dla dalszej terapii komórkowej, modelowania choroby i badań przesiewowych leków.

Jednoczesna stymulacja elektryczna i mechaniczna w celu zwiększenia potencjału kardiomiogennego komórek

Tutaj prezentujemy protokół budowy komory do hodowli komórek, przeznaczonej do wystawiania komórek na różne rodzaje stymulacji elektrycznej, oraz jej zastosowanie w leczeniu mezenchymalnych komórek macierzystych w celu zwiększenia różnicowania osteogennego.

Budowa i zastosowanie komory do stymulacji elektrycznej w celu zwiększenia różnicowania osteogennego w mezenchymalnych komórkach macierzystych/zrębowych in vitro

Ta metodologia ma na celu zilustrowanie mechanizmów, za pomocą których sygnały macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak sztywność substratu, skład białka i morfologia komórki, regulują fenotyp komórek Schwanna (SC).

Przygotowanie przestrajalnych mikrośrodowisk macierzy zewnątrzkomórkowej w celu oceny specyfikacji fenotypu komórek Schwanna

Ten artykuł przedstawia strategię budowania modeli elementów skończonych z włóknistych materiałów przewodzących wystawionych na działanie pola elektrycznego (EF). Modele te można wykorzystać do oszacowania wkładu elektrycznego, jaki otrzymują komórki zasiane w takich materiałach, oraz do oceny wpływu zmiany właściwości, struktury lub orientacji materiału składowego rusztowania.

Modelowanie metodą elementów skończonych w komórkowym mikrośrodowisku elektrycznym

Poznaj metodę stymulacji elektrycznej komórek macierzystych na przewodzącym rusztowaniu polimerowym z minimalnie inwazyjnym wszczepieniem in vivo. Technika ta wspiera badania nad udarem i terapią komórkową.

Rusztowanie przewodzące prąd elektryczny do modulacji i dostarczania komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów