Rusztowanie przewodzące prąd elektryczny do modulacji i dostarczania komórek macierzystych
13 kwietnia 2018
Ten protokół opisuje wytwarzanie systemu hodowli komórek, który umożliwia wysiewanie komórek macierzystych na przewodzącym rusztowaniu polimerowym do stymulacji elektrycznej in vitro, a następnie implantację in vivo rusztowania z komórek macierzystych przy użyciu techniki minimalnie inwazyjnej.
Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie platformy do elektrycznej stymulacji komórek macierzystych in vitro na przewodzącym rusztowaniu polimerowym, a następnie implantacji in vivo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach nad udarem mózgu i biologią komórek macierzystych, zapewniając środki do modulacji komórek macierzystych. Główną zaletą jest to, że komórki macierzyste mogą być optymalizowane in vitro, a następnie wszczepiane.
Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w powrót do zdrowia po udarze, może być również stosowana w innych systemach jako nowa metoda dostarczania komórek. Ogólnie rzecz biorąc, użytkownicy, którzy nie znają tej techniki, będą mieli trudności ze względu na precyzję wymaganą do montażu komory komórkowej oraz technikę związaną z kraniektomią. W przygotowaniu przeprowadź w autoklawie metalowe płytki o wymiarach 2,5 na 12,5 centymetra i zawory przepływowe.
Następnie, używając szkiełka komorowego jako szablonu, wytnij dwa kawałki PDMS. Jeden z elementów służy do obrysowania obwodu komory. Na drugim kawałku wytnij dwa sąsiednie kawałki od wewnętrznej strony zjeżdżalni komory.
Obie części powinny być prostokątne i pasować do szkiełka komory. Teraz ułóż materiały warstwami. Zacznij od metalowej płytki, następnie nieoszlifowanego PDMS, następnie płytki polipirolowej, zorientowanej prostopadle, następnie PDMS z wycięciami, a na końcu komory komórkowej.
Ostrożnie wyrównaj warstwy i zaciśnij urządzenie razem. Następnie przetnij dwa odcinki metalowego drutu, aby wystawał od aparatu na zewnątrz inkubatora, w którym będzie się znajdował. Długości 60 centymetrów są zwykle wystarczająco długie.
Następnie za pomocą pasty srebrnej przymocuj drut do każdego końca płytki polipyrolowej wystającej z zewnątrz komory. Po utwardzeniu pasty srebrnej wzmocnij i uszczelnij połączenia za pomocą żywicy epoksydowej. Teraz zarejestruj rezystancję w całym zespole za pomocą multimetru.
Zastosowane pole musi być takie samo w każdej komorze. Następnie umieść komórki na zespole i stymuluj je elektrycznie zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przed wszczepieniem ogniw należy usunąć przewody z zespołu.
Następnie odblokuj komory komórek i oddziel PDMS od rusztowania przewodzącego. Rusztowanie jest teraz gotowe do wszczepienia. Na dzień przed zabiegiem należy podać badanemu zwierzęciu ampicylinę w wodzie pitnej.
W dniu zabiegu znieczulij szczura izofluranem i potwierdź znieczulenie szczyptaniem palca u nogi. Teraz nałóż sztuczne łzy na oczy szczura, aby były wilgotne. Po ogoleniu czaszki ułóż zwierzę i przygotuj się do sterylnej operacji.
Noś odzież ochronną, rozpakuj wysterylizowane narzędzia i wysterylizuj skórę głowy. W przypadku kraniektomii wywierć otwór powyżej lewej kory mózgowej w dół do opony twardej. Spraw, aby otwór był nieco większy niż 1 na 3 milimetry, rozmiar implantu.
Następnie otwórz oponę twardą i usuń oponę twardą z mózgu za pomocą mikrocienkiej igły chirurgicznej. Wyjmij zestaw z inkubatora hodowli TC i wyłącz zestawy. Następnie ostrożnie wszczep rusztowanie przewodzące z systemu in vitro do kory szczura.
Następnie przykryj implant Surgicel, aby go zabezpieczyć, w przeciwnym razie może się przesunąć podczas zamykania skóry. Teraz zszyj ranę za pomocą jedwabnego szwu 4-0. Po wykonaniu szwów należy wstrzyknąć szczurom podskórnie buprenorfinę SR. Następnie umieść szczura w klatce regeneracyjnej, aż odzyska przytomność.
Procedura pooperacyjna jest szczegółowo opisana w protokole tekstowym. Ludzkie neuronalne komórki progenitorowe poddano stymulacji elektrycznej, a następnie wybarwiono testami żywotności komórek. Zielony kolor wskazuje na żywą komórkę.
Komórki były wyraźnie w stanie przetrwać stymulację elektryczną. Czynniki uwolnione z komórek neuroprogenitorowych, które są ważne w powrocie do zdrowia po udarze, oceniono na podstawie jednego mikrograma całkowitego RNA przy użyciu ilościowego RTPCR. Po znormalizowaniu wyników za pomocą metody progu cyklu delta delta, ujawniają one następnie ekspozycję na stymulację elektryczną w górę regulowaną ekspresję BDNF i THBS1.
Po obejrzeniu tej procedury powinieneś dobrze zrozumieć, jak stworzyć system hodowli komórek dla przewodzących elektrycznie komórek macierzystych, a następnie implantację tych komórek macierzystych do modelu szczurzego. Po opanowaniu zabieg można wykonać w 45 minut, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać, aby zawsze monitorować zwierzęta pod kątem prawidłowego wzorca oddychania i koloru błony, aby zapewnić prawidłowe znieczulenie.
Nie zapominaj, że praca ze szczurami i komórkami macierzystymi może być niebezpieczna i zawsze należy podjąć środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje sposób wykonania systemu hodowli komórkowej do wysiewania komórek macierzystych na rusztowaniu z polimeru przewodzącego. Umożliwia on stymulację elektryczną in vitro oraz późniejszą implantację in vivo z zastosowaniem techniki małoinwazyjnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórek macierzystych
- Techniki stymulacji elektrycznej
Wstęp
- Metoda ma na celu optymalizację komórek macierzystych do badań nad regeneracją po udarze mózgu.
- Przedstawia ona nowatorskie podejście do modulowania zachowania komórek macierzystych.
- Precyzja jest kluczowa dla prawidłowego montażu komory komórkowej.
- Obejmuje małoinwazyjną technikę kraniektomii w celu implantacji.
Cel badania
- Stworzenie platformy do elektrycznej stymulacji komórek macierzystych in vitro.
- Ułatwienie implantacji zoptymalizowanych komórek macierzystych in vivo.
- Zbadanie zastosowań w badaniach nad udarem mózgu oraz w innych układach.
Zastosowane metody
- Wytwarzanie przewodzącego rusztowania polimerowego.
- Zasiewanie komórek macierzystych na rusztowaniu.
- Stymulacja elektryczna komórek macierzystych in vitro.
- Minimalnie inwazyjna technika implantacji.
Główne wyniki
- Skuteczna optymalizacja komórek macierzystych do implantacji.
- Wnioski dotyczące modulacji zachowania komórek macierzystych.
- Potencjalne zastosowania w rekonwalescencji po udarze oraz metody dostarczania komórek.
- Wskazanie wyzwań dla nowych użytkowników w zakresie precyzji i techniki.
Wnioski
- Metoda ta stanowi wartościowe narzędzie w badaniach nad komórkami macierzystymi.
- Umożliwia ona lepsze zrozumienie mechanizmów regeneracji po udarze.
- Dalsze badania mogą doprowadzić do postępów w terapii komórkowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Przewodzące elektrycznie rusztowania do dostarczania komórek macierzystych stanowią nowoczesną platformę do modulowania fenotypu komórek przed transplantacją, rozwiązując kluczowy problem w medycynie regeneracyjnej i modelowaniu chorób neurologicznych. Podejście to umożliwia optymalizację właściwości komórek macierzystych in vitro, co zwiększa wiarygodność przewidywań w późniejszych badaniach in vivo oraz ułatwia dostosowanie ryzyka w procesach przedklinicznych. Modułowość tej metody sprawia, że może ona być wykorzystywana wielokrotnie w różnorodnych zastosowaniach w terapii komórkowej i inżynierii tkankowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie odpowiedzi komórek macierzystych na sygnały elektryczne, wyjaśniając szlaki mechanistyczne istotne dla przeżywalności komórek i neuroregeneracji.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez umożliwienie modulacji i oceny ekspresji genów powiązanych z efektami terapeutycznymi przed implantacją.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celu poprzez korelację wstępnego przygotowania in vitro z wydajnością in vivo w modelach chorób.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Przygotowuje ustandaryzowane, elektrycznie prekondycjonowane populacje komórek macierzystych do powtarzalnych analiz następczych.
- Umożliwia ilościową ocenę ekspresji genów i żywotności komórek po stymulacji, wspierając opracowywanie testów.
- Zapewnia platformę do skalowalnej oceny parametrów rusztowania i stymulacji w różnych typach komórek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia zestawienie modulacji komórek in vitro z istotnymi dla choroby modelami in vivo, wspierając odkrywanie biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość przejścia od optymalizacji komórek na etapie odkryć do walidacji przedklinicznej w modelach urazów neurologicznych.
- Wspiera podejmowanie decyzji z uwzględnieniem ryzyka poprzez powiązanie efektów prekondycjonowania z wynikami funkcjonalnymi po implantacji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając modulację komórek macierzystych in vitro, a następnie testowanie in vivo w modelach chorób, takich jak udar. Wspiera ona iteracyjną optymalizację oraz analitykę porównawczą w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia platformę do weryfikacji hipotez dotyczących wpływu stymulacji elektrycznej na fenotyp komórek macierzystych i ekspresję genów.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, prekondycjonowane populacje komórek do dalszych analiz funkcjonalnych.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar ekspresji genów i żywotności, wspierając podejmowanie decyzji w oparciu o dane.
- Badania translacyjne: Łączy optymalizację in vitro z badaniami skuteczności in vivo na odpowiednich modelach zwierzęcych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje modułowy przepływ pracy, który można dostosować do różnych typów komórek i kontekstów terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną wyników terapii komórkowych poprzez umożliwienie modulacji i oceny przed implantacją.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły przygotowania i stymulacji komórek, poprawiając powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji typu go/no-go poprzez powiązanie optymalizacji in vitro z wydajnością in vivo.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów do terapii komórkowej i metod dostarczania z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie hodowli komórkowych, stymulacji elektrycznej oraz chirurgii małych zwierząt.
- Wymagany jest precyzyjny montaż wielowarstwowych komór komórkowych i rusztowań przewodzących.
- Niezbędna jest zwalidowana aparatura do stymulacji elektrycznej oraz ilościowej analizy ekspresji genów.
- Kluczowa dla powtarzalności eksperymentów i wyników w różnych ośrodkach jest standaryzacja międzyzespołowa.
- Adaptacja do innych typów komórek lub modeli chorób może wymagać optymalizacji i walidacji protokołu.
