Prosty test oparty na cytometrii przepływowej do określenia zależnego od przeciwciał wzmocnienia wirusa dengi in vitro przy użyciu surowicy rekonwalescencyjnej wirusa Zika

Ogólnym celem tej procedury jest określenie zdolności surowic pobranych od makaków rezusów zakażonych wirusem Zika do pośredniczenia w zależnym od przeciwciał wzmocnieniu zakażenia wirusem dengi in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z zależnym od przeciwciał wzmocnieniem zakażenia dengą wywołanego przez przeciwciała krzyżowe indukowane wirusem Zika. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest wysoka, prosta i łatwa do wykonania.

Tę procedurę zademonstruje William Valiant, świeżo upieczony doktorant chorób zakaźnych, w moim laboratorium. Rozpocząć od rozmrożenia próbek surowicy w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu przenieś 100 mikrolitrów każdej próbki surowicy do sterylnej probówki, podgrzewaj i aktywuj przez 30 minut w temperaturze 56 stopni Celsjusza.

Następnie wykonaj 10-krotne seryjne rozcieńczenia próbki surowicy w zakresie od jeden do jednego do jednego w zimnym RPMI 10. Następnie przenieś 10 mikrolitrów każdej rozcieńczonej próbki surowicy do studzienek sterylnej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Następnie rozmrozić jedną, dwie, trzy i cztery cząsteczki wirusa dengi w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, zapewniając objętość około 170 mikrolitrów każdego RVP na próbkę surowicy.

Po rozmrożeniu natychmiast przenieś probówki RVP na lód. Następnie odpipetować 10 mikrolitrów RVP do studzienek zawierających rozcieńczenia próbki surowicy do studzienek kontrolnych bez surowicy. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół od pięciu do dziesięciu razy.

Przenieść 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V do inkubatora i inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, w obecności 5% dwutlenku węgla. Podczas inkubacji 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery V, oczyść powierzchnię szafy bezpieczeństwa biologicznego 70% etanolem i uruchom światło UV na 15 minut. Następnie wyjąć z inkubatora w pełni zlewającą się kolbę T-75 z komórkami K562.

Dobrze wymieszaj komórki za pomocą sterylnej pięciomilimetrowej pipety i przenieś pięć mililitrów do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Następnie wyjmij 10 mikrolitrów komórek z probówki, wymieszaj z 10 mikrolitrami błękitu trypanowego i załaduj do hemocytometru. Policz komórki i oblicz łączną liczbę komórek.

Po odwirowaniu komórek w temperaturze 12 sto razy G przez 10 minut, zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w ciepłym RPMI 10 w stężeniu 80 tysięcy komórek na 30 mikrolitrów pożywki. Po wyjęciu 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery V z inkubatora, przenieś 30 mikrolitrów komórek K562 na każdą ścianę 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery V. I dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół pięć do dziesięciu razy.

Następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze na godzinę. Po inkubacji odwirować płytkę z ciśnieniem 12 sto razy G przez pięć minut. Po odwirowaniu zdekantować pożywkę z dołków, obracając płytkę do góry nogami do pojemnika zawierającego 10% wybielacza.

Następnie umyj komórki w każdej ścianie, zawieszając je ponownie w 125 mikrolitrach ciepłego RPMI 10 i odwirowując jak poprzednio. Po dekantacji ostatniego prania dodaj 100 mikrolitrów ciepłego RPMI 10 do każdej studzienki. Mieszać w górę i w dół pipetą i inkubować płytkę przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w obecności 5% dwutlenku węgla.

Dwa dni później wyjmij płytkę z inkubatora i przenieś do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą pipety wielokanałowej wymieszaj zawartość każdej studzienki i przenieś na 96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery U. Przepłukać każdą studzienkę 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery V 100 mikrolitrami 1% paraformaldehydu i PBS i przenieść pozostałe komórki i PBS do odpowiednich dołków w 96-dołkowej płytce dolnej w kształcie litery U.

Dokładnie wymieszać za pomocą pipety wielokanałowej. Przykryj płytkę folią aluminiową i pozostaw ją w inkubatorze na 30 minut, aby utrwalić komórki. Przygotuj cytometr przepływowy, uruchamiając niebarwione komórki K562 w celu skalibrowania ustawień rozpraszania bocznego i przedniego przy użyciu kanału etylo-onowego do fluorescencji GFP.

Następnie pobierz od 30 tysięcy do 50 tysięcy komórek z każdej próbki. Korzystając z oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej, ustaw pierwszą bramkę na podstawie obszaru rozproszenia do przodu w funkcji wysokości rozproszenia do przodu, aby uwzględnić pojedyncze komórki i wykluczyć dublety autofluorescencyjne z analizy. Oblicz średni odsetek komórek GFP dodatnich dla każdego stanu, a następnie oblicz krotne zwiększenie infekcji dla każdego rozcieńczenia surowicy.

Poprawa zagięcia wykresu na osi y w porównaniu z rozcieńczeniem na osi x i przeprowadzenie analizy statystycznej przy użyciu ANOVA, a następnie testu post-hoc Tukeya w celu wielokrotnych porównań. Przedstawiono tutaj dane pochodzące od reprezentatywnego zwierzęcia wykorzystującego cząstki wirusa reporterowego one wirusa dengi. Odsetek komórek dodatnich GFP w próbce kontrolnej bez surowicy wynosił 0,253%Nierozcieńczona próbka surowicy była 2,58% dodatnia GFP.

Odsetek komórek GFP dodatnich osiągnął wysoki poziom 12,8% przy rozcieńczeniu surowicy od jednego do dziesięciu po 0,735% przy rozcieńczeniu od jednego do stu i 0,022% przy rozcieńczeniu od jednego do tysiąca. Zależne od przeciwciał wzmocnienie zakażenia dengą badano dla czterech typów surowic wirusa dengi. Dane pokazują, że surowica pobrana 16 tygodni po zakażeniu znacznie zwiększyła zakażenie komórek K562 przez wszystkie typy surowic wirusa dengi w rozcieńczeniu od jednego do dziesięciu.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 48 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby uzyskać dane w ciągu jednej do dwóch godzin po zakończeniu ostatniego etapu fiksacji trwającego 30 minut. Nie zapominaj, że praca z zakażoną surowicą może być bardzo niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak środki ochrony osobistej i praktyki na poziomie BSL2, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania tej procedury.