Name: Prosty test oparty na cytometrii przepływowej do określenia zależnego od przeciwciał wzmocnienia wirusa dengi in vitro przy użyciu surowicy rekonwalescencyjnej wirusa Zika (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Poznaj metodę cytometrii przepływowej do oceny wzmocnienia zależnego od przeciwciać infekcji wirusem dengi przy użyciu surowicy rekonwalescencyjnej wirusa Zika. Protokół umożliwia szybkie badania ADE in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opisany projekt był wspierany przez fundusze z Uniwersytetu Służb Mundurowych Nauk o Zdrowiu dla JJM. Opinie lub twierdzenia zawarte w niniejszym dokumencie są prywatnymi opiniami autorów i nie mogą być interpretowane jako oficjalne lub odzwierciedlające poglądy Departamentu Obrony, Uniwersytetu Nauk o Zdrowiu Służb Mundurowych ani żadnej innej agencji rządu Stanów Zjednoczonych.
WGV przeprowadziło wszystkie eksperymenty i przeanalizowało dane; JJM zaprojektował i nadzorował badanie; Autorami artykułu są WGW i JJM.

Próbki surowicy użyte do zademonstrowania opisanego tutaj protokołu zostały pobrane od makaków rezusów, które były trzymane i pielęgnowane zgodnie z lokalnymi, stanowymi i federalnymi politykami w akredytowanym przez Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania, a próbki zostały pobrane za pomocą protokołu udostępniania tkanek.
1. Dzień 1
UWAGA: Wykonaj wszystkie opisane poniżej kroki w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym, używanej do hodowli tkanek w laboratorium BSL-2.
<ol>
	<li>Rozmrozić próbki surowicy w temperaturze pokojowej i przenieść 100 μl każdej próbki surowicy do sterylnej probówki. Podgrzewać przez 30 minut w temperaturze 56°C w łaźni wodnej lub termomikserze o regulowanej temperaturze. Wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia próbki surowicy w zakresie od 1:1 do 1:1,000 przy użyciu zimnego RPMI-10 (RPMI z 10% płodową surowicą bydlęcą).</li>
	<li>Przenieść 10 μl seryjnie rozcieńczonej próbki surowicy do każdego dołka sterylnej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Uwzględnij dwa zestawy studzienek kontrolnych, RPMI-10 tylko z RVP i bez próbki surowicy oraz RPMI-10 tylko bez RVP i bez próbki surowicy. Ustawić każdą próbkę surowicy i kontrolki RPMI-10 w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Wyjąć RVP Dengue-1, 2, 3 i 4 z zamrażarki w temperaturze -80 °C i rozmrozić je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Natychmiast przenieś rozmrożone RVP na lód. Uzyskać około 170 μl RVP dla każdej próbki surowicy (10 μl RVP x 3 dołki na każde rozcieńczenie surowicy (1:1, 1:10, 1:100, 1:1,000) i 10 μl RVP x 3 dołki dla każdego z RPMI-10 z dołkami kontrolnymi tylko RVP).</li>
	<li>Odpipetować 10 μl RVP do każdego dołka 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V zawierającej próbkę surowicy i do RPMI-10 z dołkami kontrolnymi RVP (bez surowicy). Nie dodawaj RVP tylko do dołków RPMI-10 (bez próbki surowicy i bez RVP). Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół 5–10 razy. Dodaj 10 μl zimnego RPMI-10 zamiast RVP do każdej zimnej studzienki kontrolnej RPMI-10 (bez próbki surowicy i bez RVP).</li>
	<li>Przenieść 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V do inkubatora i inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 . Podczas inkubacji 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V, oczyść powierzchnię komory bezpieczeństwa biologicznego 70% etanolem i włącz światło UV na 15 minut.</li>
	<li>Wyjąć z inkubatora w pełni zlewającą się kolbę T75 z komórkami K562, dobrze wymieszać komórki za pomocą sterylnej pipety o pojemności 5 ml i przenieść 5 ml komórek do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml. 
	UWAGA: Komórki K562 są utrzymywane w RPMI-10 i subhodowane w temperaturze 1 x 106/ml.</li>
	<li>Policz liczbę komórek, usuwając 10 μl komórek ze sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wymieszaj z 10 μl błękitu tryphanowego. Policz komórki za pomocą hemocytometru, aby określić całkowitą liczbę komórek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować 15 ml stożkowy z komórkami przy ~1,200 x g przez 10 minut, zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w ciepłym RPMI-10 o stężeniu 80 000 komórek/30 μL pożywki (2,66 x 106 komórek / ml).</li>
	<li>Wyjąć 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V z inkubatora (krok 1.6), przenieść 30 μl komórek K562 do każdego dołka 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół 5–10 razy. Przenieść 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V do inkubatora i inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 .</li>
	<li>Po inkubacji przez 1 godzinę wyjąć z inkubatora 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V i odwirować przy ~1,200 x g przez 5 minut. Po odwirowaniu zdekantować pożywkę z dołków, obracając płytkę do góry nogami do pojemnika zawierającego 10% wybielacza.</li>
	<li>Umyj komórki w każdym dołku, umieszczając je ponownie w 125 μl ciepłego RPMI-10, dokładnie wymieszaj pipetą i odwiruj płytkę przy ~1,200 x g przez 5 minut. Zdekantuj pożywkę, obracając płytkę do góry nogami do pojemnika zawierającego 10% wybielacza. Powtórz ten krok prania dwa razy.</li>
	<li>Po umyciu dodać 100 μl ciepłego RPMI-10 do każdej studzienki, wymieszać w górę i w dół pipetą i inkubować płytkę przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w obecności 5%CO2.</li>
</ol>
2. Dzień 3
<ol>
	<li>Wyjąć z inkubatora 96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery V zawierającą 100 μl komórek i pożywki/basenika i przenieść ją do komory bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą pipety wielokanałowej wymieszaj zawartość każdej studzienki i przenieś komórki i pożywkę na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery U lub do wstępnie oznakowanych probówek polipropylenowych o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Przepłukać każdą studzienkę w 96-dołkowej płytce dolnej w kształcie litery V 100 μl 1% paraformaldehydu (PFA) w 1x roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i przenieść do odpowiednich studzienek na 96-dołkowej płytce dolnej w kształcie litery U lub oznakowanych probówkach polipropylenowych o pojemności 5 ml z kroku 2.1, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5% PFA / studzienkę lub probówkę. Dokładnie wymieszaj za pomocą pipety wielokanałowej, przykryj płytkę folią aluminiową i pozostaw w inkubatorze na 30 minut, aby utrwalić komórki.</li>
	<li>Przygotuj cytometr przepływowy (patrz na przykład tabela materiałów), uruchamiając niebarwione komórki K562, aby skalibrować rozproszenie boczne i przednie wraz z ustawieniami fluorescencji. Jedynym wymaganym kanałem fluorescencji jest FL1, ponieważ GFP jest jedyną fluorescencją emitowaną przez komórki. Zdobądź ~30 000–50 000 komórek z każdej próbki. 
	UWAGA: Do pozyskiwania danych można użyć dowolnego cytometru przepływowego zdolnego do odczytu pojedynczej fluorescencji, ponieważ komórki zakażone RVP będą emitować tylko zieloną fluorescencję ze względu na obecność GFP i nie jest potrzebny żaden inny kanał fluorescencyjny.</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Analizuj dane uzyskane na cytometrze przepływowym za pomocą dowolnego oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Ustaw pierwszą bramkę na podstawie FSC-A (forward scatter – obszar) vs FSC-H (forward scatter – height), aby uwzględnić pojedyncze komórki i wykluczyć autofluorescencyjne dublety z analizy12. Następnie bramkowane komórki bramkowane singletowo oparte na SSC-A (rozproszenie boczne – obszar) vs FSC-A, aby wykluczyć wszelkie zanieczyszczenia autofluorescencyjne.</li>
		<li>Analizuj komórki bramkowane SSC-A i FSC-A pod kątem ekspresji GFP na podstawie SSC-A vs GFP-A. Określ procentową zawartość komórek GFP+ dla każdego rozcieńczenia surowicy i próbek kontrolnych, ustawiając bramkę wokół komórek GFP+.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określić średni procent komórek GFP+ dla każdej studzienki rozcieńczenia i kontrolnej próbki surowicy, dzieląc całkowity procent komórek GFP+ w studzienkach potrójnych przez 3.</li>
	<li>Oblicz zwiększenie krotności infekcji, dzieląc średni odsetek komórek GFP+ w próbkach surowicy dla każdego rozcieńczenia podzielony przez średni odsetek komórek GFP+ w dołku kontrolnym RPMI-10 z RVPs (bez próbki surowicy).</li>
	<li>Zwiększ zwiększenie fałdu na wykresie (oś y) w porównaniu z rozcieńczeniem (oś x) i wykonaj analizę statystyczną przy użyciu ANOVA, a następnie testu post-hoc Tukeya w celu wielokrotnych porównań.</li>
</ol>

<ol><li>George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prior+exposure+to+zika+virus+significantly+enhances+peak+dengue-2+viremia+in+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques.</a> Sci Rep. 7 (1), 10498(2017).</li>
<li>Stettler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity%2C+cross-reactivity%2C+and+function+of+antibodies+elicited+by+Zika+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection.</a> Science. 353 (6301), 823-826 (2016).</li>
<li>Mattia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+reporter+virus+particles+for+measuring+neutralizing+antibodies+against+each+of+the+four+dengue+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes.</a> PLoS One. 6 (11), e27252(2011).</li>
<li>Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via,, F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subclass+specificity+of+the+Fc+receptor+for+human+IgG+on+K562%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562.</a> Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).</li>
<li>Klein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+K562+cell+line%2C+derived+from+a+patient+with+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia.</a> Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).</li>
<li>Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+growth+in+human+monocytes+as+a+risk+factor+for+dengue+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever.</a> Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).</li>
<li>Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgG+Fc+receptor+II+mediates+antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection.</a> J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).</li>
<li>Wang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+antibodies+to+dengue+enhanced+for+FcgammaRIIIA+binding+determine+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity.</a> Science. 355 (6323), 395-398 (2017).</li>
<li>Dejnirattisai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reacting+antibodies+enhance+dengue+virus+infection+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans.</a> Science. 328 (5979), 745-748 (2010).</li>
<li>Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus-induced+antibody+response+enhances+dengue+virus+serotype+2+replication+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro.</a> J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).</li>
<li>Morens, D. M., Halstead, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antibody-dependent+infection+enhancement+of+four+dengue+virus+serotypes+by+monoclonal+and+polyclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies.</a> J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).</li>
<li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+reactive+dyes%3A+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+Cell+responses+during+secondary+dengue+virus+infection+are+dominated+by+highly+cross-reactive%2C+memory-derived+plasmablasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts.</a> J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody+responses+after+dengue+virus+infection+are+highly+cross-reactive+to+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Flawiwirusy, takie jak DENV i ZIKV, mają znaczące dowody na homologię zarówno w swoich strukturalnych, jak i niestrukturalnych białkach, które wytwarzają przeciwciała, które reagują krzyżowo ze sobą13,14. Wykazano, że te krzyżowe odpowiedzi przeciwciał nasilają infekcję zarówno in vivo, jak i in vitro heterologicznym serotypem lub innymi pokrewnymi flawiwirusami 1,2. Możliwość nasilenia ...

Poprawa zakażenia zależna od przeciwciał (ADE) to proces, w którym częściowo krzyżowo reagujące odpowiedzi przeciwciał wywołane przez serotyp wirusa zwiększa wychwyt innego serotypu wirusa, prowadząc do zwiększonej replikacji wirusa i wiremii. ADE zostało obszernie udokumentowane w zakażeniach wirusem dengi (DENV), w których dominują cztery główne serotypy. W podgrupie pacjentów ADE jest związane z gorączką krwotoczną denga (DHF). Niedawno wykazaliśmy, że zakażenie wirusem Zika (ZIKV) wywołało znacznie wysoki poziom odpowiedzi przeciwciał reagujących krzyżowo DENV, które spowodowały ADE DENV in vitro i prawdopodobnie przyczyniło się do wzmocnienia wiremii DENV in vivo1,2. Testy wzmacniające zależne od przeciwciał są cennym narzędziem do oceny zdolności przeciwciał do wzmacniania wtórnego zakażenia pokrewnymi wirusami i dostarczają cennych informacji na temat patogenezy zakażeń flawiwirusami oraz dostarczają informacji na temat opracowywania szczepionek.
Opisany tutaj test wykorzystuje RVP DENV wraz z komórkami K562, które są normalnie niedopuszczalne dla infekcji. RVP to strukturalnie nienaruszone, niekompetentne replikacyjnie cząsteczki wirusa DENV, które kodują subgenomowy replikon zielonego białka fluorescencyjnego (GFP), który ulega ekspresji po pojedynczej rundzie replikacji3. W związku z tym komórki, które zostaną zakażone RVP, fluoryzują na zielono i można je łatwo wykryć za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii. RVP użyte w tym teście zostały uzyskane ze źródeł komercyjnych. Mogą one być jednak generowane przeciwko innym wirusom i wykorzystywane w teście opisanym w tym manuskrypcie. Tymczasem komórki K562 są linią komórkową białaczki z ekspresją receptora FcγIII, która wiąże się z regionem Fc przeciwciał i ulega zakażeniu w obecności subneutralizujących stężeń przeciwciała4,5.
Testy ADE były szeroko stosowane w badaniach nad czynnikami ryzyka ciężkiej gorączki denga oraz do nakreślenia mechanizmów in vitro ADE6,7,8. Opisany tutaj test ADE może być szybko i łatwo wykorzystany do określenia zdolności surowicy do wzmacniania infekcji in vitro przy użyciu RVP i cytometrii przepływowej, w porównaniu z innymi testami stosowanymi obecnie, które wymagają albo oznaczenia jednostek tworzących płytkę miażdżycową (pfu) w komórkach Vero, albo barwienia przeciwciałami zakażonych komórek6,7,8, 9,10,11, które są czasochłonne i pracochłonne.

<table><tbody><tr><td>DENV 1-4 RVP</td><td>Integralny molekularny</td><td>RVP-501</td><td></td></tr><tr><td>K562 komórki</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE lifesceinces</td><td>SH 30910.03</td><td>10% FBS w RPMI-10</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>MP biomedyczne</td><td>1670049</td><td>100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/ml w RPMI-10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellegro</td><td>25-060-Cl</td><td>0,025M w RPMI-10</td></tr><tr><td>MEM Nieistotny roztwór aminokwasów (100 razy;)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>1x w RPMI-10</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Cellegro</td><td>25-000-Cl</td><td>1mM w RPMI-10</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25005CI&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne płytki z dnem w kształcie litery V</td><td>Thomas Scientific</td><td>333-8001-01V</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Polipropylenowe probówki FACS 5 ml</td><td>VWR</td><td>60819-728</td><td></td></tr><tr><td>Niesterylne płytki dolne w kształcie litery U</td><td>Falcon</td><td>Ref 353910</td><td>Wysokoprzepustowa alternatywa dla probówek FACS</td></tr><tr><td>5 ml, sterylna, serologiczna</td><td>pipeta Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>200uL sterylne końcówki</td> <td>do pipetSterylne</td> końcówki do pipet Denville <td>P3020 CPS</td><td></td></tr><tr><td>20uL</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa 50-200uL</td><td>Denville</td><td>P3975-8-B</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa 5-50uL</td><td>Denville</td><td>P3975-9-B</td><td></td></tr><tr><td>20% formadehyde</td><td>Tousimis</td><td>&nbsp;#1008B</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>ThermoFisher</td><td>TSCOL35</td><td></td></tr><tr><td>termomikser</td><td>Eppendorf</td><td>2231000387</td><td>Alternatywa dla kąpieli wodnej do inaktywacji ciepła</td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>ThermoFisher</td><td>13-998-213</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Wybielacz w płynie</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo 9.8</td><td>TreeStar, Inc.</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>BD FACSDiva 6.1.2</td><td>Cytometr przepływowy Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Bleach</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr></tbody></table>

prosty test oparty na cytometrii przepływowej do określenia zależnego od przeciwciał wzmocnienia wirusa dengi in vitro przy użyciu surowicy rekonwalescencyjnej wirusa zika

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Wykazano, że zależne od przeciwciał wzmocnienie infekcji odgrywa główną rolę w patogenezie wirusa dengi. Tradycyjne testy, które mierzą zdolność przeciwciał lub surowicy do wzmacniania infekcji w niedopuszczalnych liniach komórkowych, opierały się na wykorzystaniu produkcji wirusa w pożywce, a następnie testów płytki nazębnej w celu ilościowego określenia infekcji. Niedawno testy te badały zakażenie wirusem dengi (DENV) w liniach komórkowych przy użyciu przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie. Oba te podejścia mają ograniczenia, które ograniczają powszechne stosowanie tych technik. W tym miejscu opisujemy prosty test in vitro z wykorzystaniem reporterowych cząstek wirusa dengi (RVP), które eksprymują białko zielonej fluorescencji i komórki K562, w celu zbadania wzmocnienia zależnego od przeciwciał (ADE) infekcji DENV przy użyciu surowicy uzyskanej od makaków rezusów 16 tygodni po zakażeniu wirusem Zika (ZIKV). Technika ta jest niezawodna, wymaga minimalnej manipulacji komórkami, nie wymaga użycia wirusa kompetentnego do replikacji na żywo i może być wykonywana w formacie o wysokiej przepustowości w celu uzyskania odczytu ilościowego za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto test ten można łatwo dostosować do badania wzmocnienia zależnego od przeciwciał (ADE) innych infekcji flawiwirusowych, takich jak wirus żółtej gorączki (YFV), wirus japońskiego zapalenia mózgu koni (JEEV), wirus Zachodniego Nilu (WNV) itp., gdzie dostępne są RVP. Łatwość konfiguracji testu, analizowania danych i interpretowania wyników sprawia, że jest on wysoce podatny na większość warunków laboratoryjnych.

Sera od 4 makaków rhesus pobrano 16 tygodni po zakażeniu ZIKV i przetestowano pod kątem potencjału do wzmacniania infekcji DENV-1, 2, 3 i 4 w komórkach K562. Zwierzęta osiągnęły szczytową wiremię na poziomie ~1 x 105 kopii RNA ZIKV/mL osocza w 3. dniu po zakażeniu, która następnie spadła poniżej granicy wykrywalności do 7. dnia po zakażeniu. W 16. tygodniu po zakażeniu w osoczu nie stwierdzono wiremii. Następnie przeprowadzono test RVP, a zebrane dane przeanalizowano zgodnie z ...

Opisujemy prosty i łatwy protokół pomiaru zależnego od przeciwciał wzmocnienia infekcji przez surowicę rekonwalescencyjną wirusa Zika za pomocą Reporter Virus Particles.

Prosty test oparty na cytometrii przepływowej do określenia zależnego od przeciwciał wzmocnienia wirusa dengi in vitro przy użyciu surowicy rekonwalescencyjnej wirusa Zika

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Ogólnym celem tej procedury jest określenie zdolności surowic pobranych od makaków rezusów zakażonych wirusem Zika do pośredniczenia w zależnym od przeciwciał wzmocnieniu zakażenia wirusem dengi in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z zależnym od przeciwciał wzmocnieniem zakażenia dengą wywołanego przez przeciwciała krzyżowe indukowane wirusem Zika. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest wysoka, prosta i łatwa do wykonania.Tę procedurę zademonstruje William Valiant, świeżo upieczony doktorant chorób zakaźnych, w moim laboratorium. Rozpocząć od rozmrożenia próbek surowicy w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu przenieś 100 mikrolitrów każdej próbki surowicy do sterylnej probówki, podgrzewaj i aktywuj przez 30 minut w temperaturze 56 stopni Celsjusza.Następnie wykonaj 10-krotne seryjne rozcieńczenia próbki surowicy w zakresie od jeden do jednego do jednego w zimnym RPMI 10. Następnie przenieś 10 mikrolitrów każdej rozcieńczonej próbki surowicy do studzienek sterylnej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Następnie rozmrozić jedną, dwie, trzy i cztery cząsteczki wirusa dengi w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, zapewniając objętość około 170 mikrolitrów każdego RVP na próbkę surowicy.Po rozmrożeniu natychmiast przenieś probówki RVP na lód. Następnie odpipetować 10 mikrolitrów RVP do studzienek zawierających rozcieńczenia próbki surowicy do studzienek kontrolnych bez surowicy. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół od pięciu do dziesięciu razy.Przenieść 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V do inkubatora i inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, w obecności 5% dwutlenku węgla. Podczas inkubacji 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery V, oczyść powierzchnię szafy bezpieczeństwa biologicznego 70% etanolem i uruchom światło UV na 15 minut. Następnie wyjąć z inkubatora w pełni zlewającą się kolbę T-75 z komórkami K562.Dobrze wymieszaj komórki za pomocą sterylnej pięciomilimetrowej pipety i przenieś pięć mililitrów do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Następnie wyjmij 10 mikrolitrów komórek z probówki, wymieszaj z 10 mikrolitrami błękitu trypanowego i załaduj do hemocytometru. Policz komórki i oblicz łączną liczbę komórek.Po odwirowaniu komórek w temperaturze 12 sto razy G przez 10 minut, zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w ciepłym RPMI 10 w stężeniu 80 tysięcy komórek na 30 mikrolitrów pożywki. Po wyjęciu 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery V z inkubatora, przenieś 30 mikrolitrów komórek K562 na każdą ścianę 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery V. I dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół pięć do dziesięciu razy.Następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze na godzinę. Po inkubacji odwirować płytkę z ciśnieniem 12 sto razy G przez pięć minut. Po odwirowaniu zdekantować pożywkę z dołków, obracając płytkę do góry nogami do pojemnika zawierającego 10% wybielacza.Następnie umyj komórki w każdej ścianie, zawieszając je ponownie w 125 mikrolitrach ciepłego RPMI 10 i odwirowując jak poprzednio. Po dekantacji ostatniego prania dodaj 100 mikrolitrów ciepłego RPMI 10 do każdej studzienki. Mieszać w górę i w dół pipetą i inkubować płytkę przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w obecności 5% dwutlenku węgla.Dwa dni później wyjmij płytkę z inkubatora i przenieś do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą pipety wielokanałowej wymieszaj zawartość każdej studzienki i przenieś na 96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery U. Przepłukać każdą studzienkę 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery V 100 mikrolitrami 1% paraformaldehydu i PBS i przenieść pozostałe komórki i PBS do odpowiednich dołków w 96-dołkowej płytce dolnej w kształcie litery U.Dokładnie wymieszać za pomocą pipety wielokanałowej. Przykryj płytkę folią aluminiową i pozostaw ją w inkubatorze na 30 minut, aby utrwalić komórki. Przygotuj cytometr przepływowy, uruchamiając niebarwione komórki K562 w celu skalibrowania ustawień rozpraszania bocznego i przedniego przy użyciu kanału etylo-onowego do fluorescencji GFP.Następnie pobierz od 30 tysięcy do 50 tysięcy komórek z każdej próbki. Korzystając z oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej, ustaw pierwszą bramkę na podstawie obszaru rozproszenia do przodu w funkcji wysokości rozproszenia do przodu, aby uwzględnić pojedyncze komórki i wykluczyć dublety autofluorescencyjne z analizy. Oblicz średni odsetek komórek GFP dodatnich dla każdego stanu, a następnie oblicz krotne zwiększenie infekcji dla każdego rozcieńczenia surowicy.Poprawa zagięcia wykresu na osi y w porównaniu z rozcieńczeniem na osi x i przeprowadzenie analizy statystycznej przy użyciu ANOVA, a następnie testu post-hoc Tukeya w celu wielokrotnych porównań. Przedstawiono tutaj dane pochodzące od reprezentatywnego zwierzęcia wykorzystującego cząstki wirusa reporterowego one wirusa dengi. Odsetek komórek dodatnich GFP w próbce kontrolnej bez surowicy wynosił 0,253%Nierozcieńczona próbka surowicy była 2,58% dodatnia GFP.Odsetek komórek GFP dodatnich osiągnął wysoki poziom 12,8% przy rozcieńczeniu surowicy od jednego do dziesięciu po 0,735% przy rozcieńczeniu od jednego do stu i 0,022% przy rozcieńczeniu od jednego do tysiąca. Zależne od przeciwciał wzmocnienie zakażenia dengą badano dla czterech typów surowic wirusa dengi. Dane pokazują, że surowica pobrana 16 tygodni po zakażeniu znacznie zwiększyła zakażenie komórek K562 przez wszystkie typy surowic wirusa dengi w rozcieńczeniu od jednego do dziesięciu.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 48 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby uzyskać dane w ciągu jednej do dwóch godzin po zakończeniu ostatniego etapu fiksacji trwającego 30 minut. Nie zapominaj, że praca z zakażoną surowicą może być bardzo niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak środki ochrony osobistej i praktyki na poziomie BSL2, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania tej procedury.

a-simple-flow-cytometry-based-assay-to-determine-vitro-antibody

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Source: Asad, S., et al. Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates antibody-dependent enhancement of Zika virus infection in human primary macrophages, using dengue antibody–virus complexes to model how cross-reactive antibodies facilitate Fcγ receptor–mediated viral entry and replication for studying infection mechanisms and immune interactions.

Antibody-Dependent Enhancement of Zika Virus by Dengue Antibodies in Human Primary Macrophages

Ten film demonstruje test do pomiaru zależnego od przeciwciał wzmocnienia (ADE) infekcji wirusem dengi za pomocą surowicy rekonwalescencyjnej wirusa Zika. Test wykorzystuje cząstki reporterowe wirusa dengi (RVP) kodujące zielone białko fluorescencyjne. Przeciwciała w surowicy przeciwko wirusowi Zika reagują krzyżowo z RVP, tworząc kompleks. Związane przeciwciała zwiększają wychwyt RVP przez komórki wyrażające receptor Fc, który jest wykrywany za pomocą cytometrii przepływowej.

Test in vitro w celu zbadania zależnego od przeciwciał wzmocnienia infekcji wirusowej

Wideo demonstruje test in vitro do badania interferonów o działaniu przeciwwirusowym przeciwko wirusowi Zika, ludzkiemu patogenowi. W komórce gospodarza wirus Zika ulega namnażaniu po internalizacji, infekując sąsiednie komórki i tworząc odrębne strefy lub blaszki wirusowe. Interferon typu I, działając jako środek przeciwwirusowy, hamuje namnażanie się wirusa, zapobiegając w ten sposób tworzeniu się blaszek wirusowych w monowarstwie komórki gospodarza.

Test in vitro do badań przesiewowych interferonów jako silnych inhibitorów wzrostu wirusa Zika

Wirus Zika (ZIKV), nowy patogen, jest powiązany z nieprawidłowościami rozwojowymi płodu i małogłowiem. Stworzenie skutecznego systemu hodowli komórek zakaźnych ma kluczowe znaczenie dla badań nad replikacją ZIKV, a także dla opracowywania szczepionek i leków. W niniejszej pracy zilustrowano i omówiono różne testy wirusologiczne dotyczące ZIKV.

System zakaźnych hodowli komórek wirusa Zika i profilaktyczne działanie interferonów in vitro

Wirusy lub pęcherzyki zewnątrzkomórkowe były wychwytywane immunologicznie za pomocą nanocząsteczek magnetycznych 15 nm sprzężonych z przeciwciałami rozpoznającymi antygeny powierzchniowe. Uchwycone wiriony lub pęcherzyki znakowano fluorescencyjnymi przeciwciałami przeciwko innym antygenom powierzchniowym. Powstałe kompleksy rozdzielono w silnym polu magnetycznym i przeanalizowano za pomocą konwencjonalnych cytometrów przepływowych wyzwalanych fluorescencją.

Wirometria przepływowa do analizy widm antygenowych wirionów i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

Opisano protokół oceny odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu w narządach immunouprzywilejowanych mysiego modelu Ifnar1-/- dla infekcji wirusem Zika (ZIKV). Metoda ta ma kluczowe znaczenie dla badania komórkowych mechanizmów ochrony i immunopatogenezy szczepionek ZIKV, a także jest cenna dla oceny ich skuteczności.

Ocena odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla wirusa Zika w narządach z uprawnieniami immunologicznymi zakażonych myszy Ifnar1-/-

Opisujemy metodę oceny wpływu istniejącej wcześniej odporności na wirusa dengi na infekcję wirusem Zika za pomocą ludzkiej surowicy, pierwotnych komórek ludzkich i kwantyfikacji infekcji za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym.

Kwantyfikacja zależnego od przeciwciał wzmocnienia wirusa Zika w pierwotnych komórkach ludzkich

Obecny protokół opisuje rozprzestrzenianie się wirusa Zika (ZIKV) w komórkach nerkowych afrykańskiej zielonej małpy Vero oraz kwantyfikację ZIKV za pomocą komórkowych metod immunodetekcji kolorymetrycznej w formatach 24-dołkowych i 96-dołkowych (o wysokiej przepustowości).

Namnażanie wirusa i kwantyfikacja kolorymetryczna na podstawie komórek

Tutaj pokazujemy użycie komórkowej impedancji elektrycznej (CEI) jako bardzo łatwej i prostej metody badania infekcji wirusem Zika i jego replikacji w ludzkich komórkach w czasie rzeczywistym. Ponadto test CEI jest przydatny do oceny związków przeciwwirusowych.

Komórkowa platforma impedancji elektrycznej do oceny inhibitorów wirusa Zika w czasie rzeczywistym

Poznaj metodę cytometrii przepływowej do oceny wzmocnienia zależnego od przeciwciać infekcji wirusem dengi przy użyciu surowicy rekonwalescencyjnej wirusa Zika. Protokół umożliwia szybkie badania ADE in vitro.

Prosty test oparty na cytometrii przepływowej do określenia zależnego od przeciwciał wzmocnienia wirusa dengi in vitro przy użyciu surowicy rekonwalescencyjnej wirusa Zika (Wideo) | JoVE Journal

Prosty test oparty na cytometrii przepływowej do określenia zależnego od przeciwciał wzmocnienia wirusa dengi in vitro przy użyciu surowicy rekonwalescencyjnej wirusa Zika

Przeglądaj więcej filmów