Name: Wysokoprzepustowe badania przesiewowe SiRNA w kierunku uszkodzenia komórek nabłonka rogówki wywołanego chloropikryną i fluorowodorem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 20 s
Description: Poznaj metody wysokoprzepustowego badania przesiewowego siRNA w modelu uszkodzenia komórek nabłonka rogówki wywołanego toksykantami. Ta technika pozwala szybko identyfikować szlaki molekularne i regulatory odpowiedzi komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez National Institutes of Health CounterACT Program Interagency Agreement # AOD13015-001. Chcielibyśmy podziękować Stephanie Froberg i Peterowi Hurstowi za ich wysiłek i wiedzę na temat produkcji wideo.

<ol><li>Randleman, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRandleman%2C+B+%22Drugs%2C+Diseases+and+Procedures%22">Drugs, Diseases and Procedures</a>. Hampton, R. , Medscape. (2011).</li>
<li>Fish, R., Davidson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+ocular+thermal+and+chemical+injuries%2C+including+amniotic+membrane+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+treatment+strategies+for+hydrofluoric+acid+burns%3A+current+status+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">A review of treatment strategies for hydrofluoric acid burns: current status and future prospects.</a> Burns. 40 (8), 1447-1457 (2014).</li>
<li>Gaytan, B. D., Vulpe, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+toxicology%3A+tools+to+advance+the+future+of+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Functional toxicology: tools to advance the future of toxicity testing.</a> Frontiers in Genetics. 5, 110(2014).</li>
<li>North, M., Vulpe, C. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3100848/">Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 4796-4813 (2010).</li>
<li>McManus, M. T., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+mammals+by+small+interfering+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in mammals by small interfering RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (10), 737-747 (2002).</li>
<li>Bassik, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+mammalian+genetic+interaction+map+reveals+pathways+underlying+ricin+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility.</a> Cell. 152 (4), 909-922 (2013).</li>
<li>Solaimani, P., Damoiseaux, R., Hankinson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+high-throughput+screen+identifies+proteins+necessary+for+the+AHR-dependent+induction+of+CYP1A1+by+2%2C3%2C7%2C8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi high-throughput screen identifies proteins necessary for the AHR-dependent induction of CYP1A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Toxicological Sciences. 136 (1), 107-119 (2013).</li>
<li>Cox, J. A., Gooding, R., Kolakowski, J. E., Whitmire, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCox%2C+JA+%22Chemical+Terrorism+Risk+Assessment%3B+CSAC+12-006%22">Chemical Terrorism Risk Assessment; CSAC 12-006</a>. , U.S. Department of Homeland Security, Science and Technology Directorate, Chemical Security Analysis Center. Aberdeen Proving Ground, MD. (2012).</li>
<li>Zang, R., Li, D., Tang, I., Wang, J., Yang, S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/267200748_Cell-Based_Assays_in_High-Throughput_Screening_for_Drug_Discovery">Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery.</a> International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 1, 31-51 (2012).</li>
<li>Ray, R., Hauck, S., Kramer, R., Benton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+convenient+fluorometric+method+to+study+sulfur+mustard-induced+apoptosis+in+human+epidermal+keratinocytes+monolayer+microplate+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">A convenient fluorometric method to study sulfur mustard-induced apoptosis in human epidermal keratinocytes monolayer microplate culture.</a> Drug and Chemical Toxicology. 28 (1), 105-116 (2005).</li>
<li>Ruff, A. L., Dillman, J. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfur+mustard+induced+cytokine+production+and+cell+death%3A+investigating+the+potential+roles+of+the+p38%2C+p53%2C+and+NF-kappaB+signaling+pathways+with+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Molecular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Sulfur mustard induced cytokine production and cell death: investigating the potential roles of the p38, p53, and NF-kappaB signaling pathways with RNA interference.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 24 (3), 155-164 (2010).</li>
<li>Smith, W. J., Gross, C. L., Chan, P., Meier, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+human+epidermal+keratinocytes+in+culture+as+a+model+for+studying+the+biochemical+mechanisms+of+sulfur+mustard+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for studying the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity.</a> Cell Biology and Toxicology. 6 (3), 285-291 (1990).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Toxnet%22">Toxnet</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://toxnet.nlm.nih.gov/">https://toxnet.nlm.nih.gov/</a> (2016).</li>
<li>Bancroft, W. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBancroft%2C+WD+%22The+Medical+Department+of+the+United+States+Army+in+the+World+War%22">The Medical Department of the United States Army in the World War</a>. 14, Otis Historical Archives, National Museum of Health and Medicine. (1926).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Chloropicrin+Risk+Characterization+Document%22">Chloropicrin Risk Characterization Document</a>. , California Environmental Protection Agency. (2012).</li>
<li>Aigueperse, J., et al. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14356007.a11_307">Fluorine Compounds, Inorganic. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry</a>. , Wiley-VCH. (2000).</li>
<li>Sotozono, C. <a target="_blank" href="https://journals.lww.com/corneajrnl/Abstract/2000/11003/Second_Injury_in_the_Cornea__The_Role_of.4.aspx">Second Injury in the Cornea: The Role of Inflammatory Cytokines in Corneal Damage and Repair.</a> Cornea. 19 (6), S155-S159 (2000).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+and+Recommendations+for+Dharmacon+siRNA+Libraries%22">Guidelines and Recommendations for Dharmacon siRNA Libraries</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/sirna-libraries-guidelines.pdf">http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/sirna-libraries-guidelines.pdf</a> (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Lipofectamine+RNAiMAX+Reagent%22">Lipofectamine RNAiMAX Reagent</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-culture/pdfs.par.72509.file.dat/Lipofectamine%20rnaimax%20protocol%20v2.0.pdf
">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-culture/pdfs.par.72509.file.dat/Lipofectamine%20rnaimax%20protocol%20v2.0.pdf
</a> (2017).</li>
<li>Denizot, F., Lang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+colorimetric+assay+for+cell+growth+and+survival.+Modifications+to+the+tetrazolium+dye+procedure+giving+improved+sensitivity+and+reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability.</a> Journal of Immunological Methods. 89 (2), 271-277 (1986).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22IL-8+%28human%29+AlphaLISA+Detection+Kit%2C+5%2C000+Assay+Points%22">IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit, 5,000 Assay Points</a>. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.perkinelmer.com/searchresult?searchName=AL224F&_csrf=dd35c533-8dc4-4005-a87f-c5ab3a519bf3">http://www.perkinelmer.com/searchresult?searchName=AL224F&_csrf=dd35c533-8dc4-4005-a87f-c5ab3a519bf3</a> (2016).</li>
<li>Araki-Sasaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Ruff, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+mouse+model+for+sulfur+mustard-induced+ocular+injury+and+long-term+clinical+analysis+of+injury+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cutaneous+and+Ocular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Development of a mouse model for sulfur mustard-induced ocular injury and long-term clinical analysis of injury progression.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 32 (2), 140-149 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22GeneTitan+MC+Instrument+North+America%2FJapan+%28110V%29%22">GeneTitan MC Instrument North America/Japan (110V)</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/00-0372?SID=srch-srp-00-0372">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/00-0372?SID=srch-srp-00-0372</a> (2018).</li>
<li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pair+of+new+statistical+parameters+for+quality+control+in+RNA+interference+high-throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays.</a> Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).</li>
<li>He, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Sodium+Fluoride+on+the+Proliferation+and+Gene+Differential+Expression+in+Human+RPMI8226+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Trace+Element+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of Sodium Fluoride on the Proliferation and Gene Differential Expression in Human RPMI8226 Cells.</a> Biological Trace Element Research. 167 (1), 11-17 (2015).</li>
<li>Tabuchi, Y., Yunoki, T., Hoshi, N., Suzuki, N., Kondo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+gene+networks+involved+in+sodium+fluoride-elicited+cell+death+accompanying+endoplasmic+reticulum+stress+in+oral+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genes and gene networks involved in sodium fluoride-elicited cell death accompanying endoplasmic reticulum stress in oral epithelial cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (5), 8959-8978 (2014).</li>
<li>Pesonen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloropicrin-induced+toxic+responses+in+human+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Chloropicrin-induced toxic responses in human lung epithelial cells.</a> Toxicology Letters. 226 (2), 236-244 (2014).</li>
<li>Wilhelm, S. N., Shepler, K., Lawrence, L. J., Lee, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilhelm%2C+SN+%22Fumigants%3A+Environmental+Fate%2C+Exposure%2C+and+Analysis%22">Fumigants: Environmental Fate, Exposure, and Analysis</a>. Seiber, J. N., et al. 652, American Chemical Society. Ch. 8 (1997).</li>
<li>Adamek, E., Pawlowska-Goral, K., Bober, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+effects+of+fluoride+ions+on+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annales+Academiae+Medicae+Stetinensis%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity.</a> Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 69-85 (2005).</li>
<li>Heard, K., Hill, R. E., Cairns, C. B., Dart, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+neutralizes+fluoride+bioavailability+in+a+lethal+model+of+fluoride+poisoning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicology%3A+Clinical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Calcium neutralizes fluoride bioavailability in a lethal model of fluoride poisoning.</a> Journal of Toxicology: Clinical Toxicology. 39 (4), 349-353 (2001).</li>
<li>Sparks, S. E., Quistad, G. B., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloropicrin%3A+reactions+with+biological+thiols+and+metabolism+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Chloropicrin: reactions with biological thiols and metabolism in mice.</a> Chemical Research in Toxicology. 10 (9), 1001-1007 (1997).</li>
<li>Sparks, S. E., Quistad, G. B., Li, W., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloropicrin+dechlorination+in+relation+to+toxic+action%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Molecular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Chloropicrin dechlorination in relation to toxic action.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 14 (1), 26-32 (2000).</li>
<li>Byron, K. A., Varigos, G., Wootton, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1421657/">Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4.</a> Immunology. 77 (4), 624-626 (1992).</li>
<li>van der Poll, T., Lowry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+interleukin+8+production+by+human+whole+blood+is+enhanced+by+epinephrine+and+inhibited+by+hydrocortisone%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced interleukin 8 production by human whole blood is enhanced by epinephrine and inhibited by hydrocortisone.</a> Infection and Immunity. 65 (6), 2378-2381 (1997).</li>
<li>Solomon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline+inhibition+of+interleukin-1+in+the+corneal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (9), 2544-2557 (2000).</li>
<li>Mishra, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+oxidative+stress-induced+epigenetic+modifications+in+pancreatic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial oxidative stress-induced epigenetic modifications in pancreatic epithelial cells.</a> International Journal of Toxicology. 33 (2), 116-129 (2014).</li>
<li>Stockholm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+phenotypic+heterogeneity+in+a+clonal+cell+population+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The origin of phenotypic heterogeneity in a clonal cell population in vitro.</a> PLoS One. 2 (4), e394(2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ATCC+Animal+Cell+Culture+Guide%22">ATCC Animal Cell Culture Guide</a>. , American Type Culture Collection. Manassas, VA. (2014).</li>
<li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li>
<li>Mpindi, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+normalization+methods+on+high-throughput+screening+data+with+high+hit+rates+and+drug+testing+with+dose-response+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Impact of normalization methods on high-throughput screening data with high hit rates and drug testing with dose-response data.</a> Bioinformatics. 31 (23), 3815-3821 (2015).</li>
<li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illustration+of+SSMD%2C+z+score%2C+SSMD%2A%2C+z%2A+score%2C+and+t+statistic+for+hit+selection+in+RNAi+high-throughput+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16 (7), 775-785 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
ZASTRZEŻENIE: Poglądy wyrażone w tym artykule są poglądami autora (autorów) i nie odzwierciedlają oficjalnej polityki Departamentu Armii, Departamentu Obrony ani rządu USA. Badania te były wspierane przez umowę międzyagencyjną między NIH/NIAID a USAMRICD, a częściowo przez powołanie do Programu Uczestnictwa w Badaniach Podyplomowych w Instytucie Badań Medycznych Armii Stanów Zjednoczonych Obrony Chemicznej, administrowanym przez Oak Ridge Institute for Science and Education na mocy umowy międzyagencyjnej między Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych a USAMRMC.

W niniejszym artykule opisano nasze metody i wyniki dotyczące opracowania wysokoprzepustowego modelu przesiewowego komórek nabłonka rogówki do badania urazów HF i CP. Przedstawiamy również wyniki pierwotnego badania przesiewowego siRNA w kierunku uszkodzenia HF. Opracowanie modeli HTS do badania urazów TIC wiązało się z wieloma wyzwaniami. Metody, które udało nam się znaleźć w literaturze związanej z badaniem HF, HFA lub CP w modelach hodowli komórkowych były mało pomocne. Większość badań in vitro nad jonami flu...

Uraz oka wywołany przez toksyny jest prawdziwym zagrożeniem dla oka, ponieważ chemikalia mogą szybko spowodować znaczne uszkodzenia tkanek. Niestety, leczenie uszkodzeń rogówki wywołanych toksynami jest tylko ogólnie wspomagające, ponieważ nie istnieją żadne specyficzne terapie do leczenia tych urazów. Obecna strategia leczenia jest niespecyficzna i obejmuje przede wszystkim miejscowe leczenie terapeutyczne, takie jak lubrykanty, antybiotyki i cykloplegia, a następnie leki przeciwzapalne (np. sterydy) po ponownym nabłonku rogówki1,2. Pomimo najlepszych obecnie dostępnych opcji terapeutycznych, długoterminowe rokowanie jest na ogół złe z powodu postępującego zmętnienia rogówki i neowaskularyzacji2,3.
Modele zwierzęce były tradycyjnie używane do badania toksyczności chemicznej i zrozumienia mechanizmów urazów. Jednak badania na zwierzętach są czasochłonne i kosztowne. Podejmowane są również wysiłki na rzecz ograniczenia testów na zwierzętach. Na przykład przepisy REACH (WE 1907/2006) w Unii Europejskiej zawierają przepisy mające na celu ograniczenie testów na zwierzętach. Przepisy obejmują wymóg, aby przedsiębiorstwa dzieliły się danymi w celu uniknięcia testów na zwierzętach i uzyskania zgody Europejskiej Agencji Chemikaliów przed przeprowadzeniem proponowanych testów na zwierzętach. Zgodnie z przepisami rozporządzenia REACH testy na zwierzętach powinny być stosowane w ostateczności. Istnieje również europejskie rozporządzenie w sprawie kosmetyków (WE 1223/2009), które stopniowo zniosło testowanie kosmetyków na zwierzętach. Kiedy przeprowadzane są badania na zwierzętach, kierują się zasadami 3R (Refinement, Reduction, and Replacement), które zapewniają ramy do prowadzenia bardziej humanitarnych badań na zwierzętach, zmniejszania liczby wykorzystywanych zwierząt i stosowania alternatyw bez udziału zwierząt, jeśli to możliwe. Z tych powodów dziedzina toksykologii starała się przyjąć testy in vitro, które mogą zapewnić wgląd w molekularne mechanizmy toksyczności i mogą być wykonywane w wyższej przepustowości4. Jest to podejście toksykologiczne funkcjonalne, w którym substancje toksyczne są definiowane na podstawie ich funkcji, a nie wyłącznie na podstawie ich składu chemicznego. Idąc o krok dalej, toksykogenomika funkcjonalna stara się zrozumieć rolę, jaką określone geny odgrywają w działaniu substancji toksycznych5. Dzięki zastosowaniu technologii siRNA, badania przesiewowe w celu zbadania funkcji genów w molekularnych i komórkowych odpowiedziach na substancje toksyczne mogą być wykonywane z dużą przepustowością. siRNA to dwuniciowe cząsteczki RNA o długości 19-25 nukleotydów, które wykorzystują potranskrypcyjny szlak wyciszania genów obecny we wszystkich komórkach ssaków6. Są one wytwarzane syntetycznie i zaprojektowane tak, aby celować w określony gen. Po wprowadzeniu do komórki siRNA jest przetwarzane, a jedna nić, nić prowadząca, jest ładowana do kompleksu wyciszającego indukowanego RNA (RISC). SiRNA kieruje RISC do komplementarnego regionu w cząsteczce mRNA, a RISC degraduje mRNA. Powoduje to zmniejszenie ekspresji określonego genu. Wynikające z tego zmniejszenie ekspresji określonego genu można następnie badać w komórkach narażonych na działanie substancji toksycznych, aby ustalić funkcję tego genu w odpowiedzi komórkowej na substancję toksyczną. Takie podejście zostało wykorzystane do lepszego zrozumienia mechanizmów wrażliwości na rycynę i zależnej od AHR indukcji CYP1A17,8.
Lista Oceny Ryzyka Terroryzmu Chemicznego (CTRA) oraz lista toksycznych chemikaliów przemysłowych (TIC) zawierają wyszczególnione wybrane substancje chemiczne na podstawie ich toksyczności i potencjału do uwolnienia podczas zdarzenia terrorystycznego, wojennego lub wypadku przemysłowego9. Stosujemy podejście toksykogenomiczne oparte na wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych siRNA (HTS) do badania substancji toksycznych z listy CTRA, które zostały zidentyfikowane jako narażone na wysokie ryzyko użycia w incydencie terrorystycznym. Tradycyjna toksykologia ma na celu zrozumienie niekorzystnego wpływu, jaki chemikalia wywierają na organizmy żywe; Mamy jednak dalsze pragnienie zrozumienia mechanizmów urazu, aby pomóc w rozwoju terapii i podejść terapeutycznych, a być może także odkryć cząsteczki, które mogą być celem rozwoju terapeutycznego. Wysiłek ten pod pewnymi względami można uznać za analogiczny do zastosowania wysokoprzepustowych badań przesiewowych siRNA i testów komórkowych w procesie odkrywania leków10. Główna różnica polega na tym, że odkrywanie leków zazwyczaj poszukuje pojedynczego celu do odkrycia terapeutycznego, podczas gdy w naszym podejściu jest raczej mało prawdopodobne, aby istniał pojedynczy cel o wysokiej wartości terapeutycznej w leczeniu narażenia na toksyny. Przewidujemy, że każdy skuteczny paradygmat leczenia narażenia na toksyny będzie wymagał wieloaspektowego podejścia w celu osiągnięcia wysokiej wartości terapeutycznej, a dane toksykogenomiczne mogą stanowić istotną informację o skutecznym paradygmacie leczenia.
Automatyzacja laboratoryjna wprowadza metodologię wysokiej przepustowości do laboratoriów spoza przemysłu farmaceutycznego lub biotechnologicznego. Badania in vitro w naszym instytucie były historycznie tradycyjnymi testami o niskiej przepustowości11,12,13. W ciągu ostatnich kilku lat nasze laboratorium przestawiło się na wykorzystanie robotyki laboratoryjnej do wykonywania wysokoprzepustowych badań przesiewowych siRNA. W niniejszym artykule przedstawiono udoskonalenie modeli komórek oka oraz opracowanie metod ekspozycji in vitro na fluorowodór (HF) i chloropikrynę (CP) odpowiednich do wysokoprzepustowych badań przesiewowych siRNA. Naszym celem jest zidentyfikowanie cząsteczek, które regulują uszkodzenia komórek w odpowiedzi na te toksyny. Cele wybranej przez nas biblioteki siRNA obejmują receptory sprzężone z białkiem G, kinazy białkowe, proteazy, fosfatazy, kanały jonowe i inne potencjalnie ulegające uleczanie cele. HF i CP zostały wybrane do badania poprzez porównanie agentów z listy CTRA z raportami ToxNet dotyczącymi wypadków przemysłowych w celu znalezienia tych, którzy stwarzają największe ryzyko urazu oka poprzez ekspozycję na opary9,14. CP (wzór chemiczny Cl3CNO2, numer CAS 76-06-2) był pierwotnie używany jako gaz łzawiący w klasie WWI<sup="xref">15. Obecnie jest używany jako fumigant rolniczy i działa jako nematocyd, fungicyd i insektycyd16. Fluorowodór (HF) jest stosowany w procesach takich jak alkilowanie w rafineriach ropy naftowej i elektrochemiczne fluorowanie związków organicznych17. HF (wzór chemiczny HF, numer CAS 62778-11-4) jest gazem, ale w postaci wodnej jest kwasem fluorowodorowym (HFA, numer CAS 7664-39-3). Dlatego zdecydowaliśmy się na użycie HFA w naszych modelach ekspozycji w komórkach. Do badania wybrano dużą linię komórkową nabłonka rogówki SV40 z dużym antygenem T unieśmiertelnionym ludzkim nabłonkiem rogówki SV40-HCEC. Żywotność komórek i marker stanu zapalnego IL-8 zostały wybrane jako punkty końcowe, ponieważ cele, które są zaangażowane w uszkodzenie komórki, powinny być odzwierciedlone w śmierci komórki i odpowiedzi zapalnej. W szczególności, jeśli cel miałby odgrywać rolę ochronną w ekspozycji na toksyny, śmierć komórki i/lub produkcja cytokin zapalnych powinna wzrosnąć, gdy ekspresja docelowa jest hamowana przez siRNA. Odwrotnie byłoby w przypadku celów, które odgrywają negatywną rolę. Ponadto przewlekły stan zapalny wydaje się odgrywać rolę w patologii rogówki po ekspozycji, a interwencja w szlaki śmierci komórki może poprawić wyniki kliniczne2,18.

<table><tbody><tr><td>Platforma do przenoszenia płynów Bravo</td><td>Agilent lub odpowiednik</td><td>G5409A Wytrząsarka</td> płytkowa Bravo Agilent lub odpowiednik Opcja 159 Jednorazowa głowica końcówki Bravo 96LT Agilent lub odpowiednik Opcja 178 96-kanałowa głowica pipetująca z dużą końcówką Jednorazowa głowica <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>pipetująca</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Bravo 96ST Agilent lub odpowiednik Opcja 177 96-kanałowe pipetowanie z małą końcówką <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> jednostka główna</td></tr><tr><td>Bravo 384ST jednorazowa głowica końcówki</td><td>Agilent lub równoważna</td><td>Opcja 179</td><td>384-kanałowa głowica do pipetowania z małą końcówką</td></tr><tr><td>Bravo 96 250 &mu; L sterylne końcówki barierowe</td><td>Agilent lub odpowiednik</td><td>19477-022</td><td></td></tr><tr><td>Bravo 384 30 &mu; L sterylne końcówki barierowe</td><td>Agilent lub odpowiednik</td><td>19133-212</td><td></td></tr><tr><td>Bravo 384 70 &mu; L sterylne końcówki barierowe</td><td>Agilent lub odpowiednik</td><td>19133-212</td><td></td></tr><tr><td>Wielomodowy czytnik płytek EnSpire</td><td>Perkin Elmer lub odpowiednik</td><td>2300-0000</td><td>Detektor testowy AlphaLISA ze wzbudzeniem laserowym dużej mocy</td></tr><tr><td>IL-8 (człowiek) Zestaw detekcyjny AlphaLISA&nbsp;</td><td>Perkin Elmer lub równoważny</td><td>AL224F</td> test <td>na bazie kulek bez mycia</td></tr><tr><td>ProxiPlate-384 Plus białe mikropłytkie dołek 384</td><td>Perkin Elmer lub równoważny</td><td>6008359</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen lub równoważny</td><td>13778500</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>Opti-MEM 1 Reduced Serum</td><td>Medium Invitrogen lub równoważny</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco lub równoważny</td><td>12605010</td><td>Roztwór do odrywania komórek</td></tr><tr><td>IncuCyte Zoom</td><td>Essen Instruments lub równoważny</td><td>ESSEN BIOSCI 4473</td><td>Mikroskop automatyczny w inkubatorze</td></tr><tr><td>Chloropikryna</td><td>Trinity Produkcja lub równoważna</td><td>Nie dotyczy</td><td>Toksyczność ostra i działanie drażniące</td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli komórkowych DMEM-F12</td><td>Invitrogen lub równoważny</td><td>11330-057</td><td>Zawiera HEPES</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Invitrogen lub 1891471</td><td></td><td></td>równoważna</tr><tr><td>Ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (stopień hodowli komórkowej)</td><td>Invitrogen lub równoważny</td><td>E9644-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana insulina ludzka (klasa hodowli komórkowej)</td><td>Invitrogen lub równoważny</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny i streptomycyny (stopień czystości w hodowli komórkowej)</td><td>Invitrogen lub równoważny</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon (klasa hodowli komórkowej)</td><td>Sigma lub równoważny</td><td>H0888-10G</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza&nbsp; (klasa hodowli komórkowej)</td><td>Sigma lub odpowiednik</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp; (klasa hodowli komórkowej)</td><td>Sigma lub równoważny</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Dharmacon lub równoważny</td><td>różne</td><td></td></tr><tr><td>bromek tetrazolowy błękitu tiazolylowego</td><td>Sigma lub równoważny</td><td>M5655</td><td>Podłoże do oznaczania MTT</td></tr><tr><td>Bufor siRNA</td><td>Termiczne lub równoważne</td><td>B002000</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych</td><td>Corning lub równoważne</td><td>CLS3595</td><td></td></tr><tr><td>hodowla komórkowa T150 kolby</td><td>Corning lub odpowiednik</td><td>CLS430825</td><td></td></tr><tr><td>kaptur do hodowli komórkowych BSL-2</td><td>Nuaire lub równoważny</td><td>NU-540</td><td></td></tr><tr><td>300 mL zbiorniki robotyczne</td><td>Thermo lub odpowiednik</td><td>12-565-572&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>96 zbiorników automatyki z przegrodami</td><td>Thermo lub równoważny</td><td>1064-15-8</td><td></td></tr><tr><td>500 ml sterylne jednorazowe butelki do przechowywania</td><td>Corning lub równoważny</td><td>CLS430282</td><td></td></tr><tr><td>Zgrzewarka mikropłytkowa</td><td>Thermo lub równoważna</td><td>AB-1443A Folia</td><td></td></tr><tr><td>termozgrzewalna Microplate</td><td>Thermo lub równoważna</td><td>AB-0475</td><td></td></tr><tr><td>Kardamonina</td><td>Tocris lub odpowiednik</td><td>2509</td><td>Przeciwzapalny, stosowany jako kontrola pozytywna</td></tr><tr><td>SKF 86002&nbsp;</td><td>Tocris lub równoważny</td><td>2008</td><td>Przeciwzapalny, stosowany jako kontrola pozytywna</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma lub równoważny</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>48% kwas fluorowodorowy</td><td>Sigma lub równoważny</td><td>339261</td><td>Toksyczność i ostra</td></tr><tr><td>1000 &mu; L Pipety jednokanałowe</td><td>Rainin lub równoważne</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Pipetery jednokanałowe</td><td>Rainin lub równoważne</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; L Pipety jednokanałowe</td><td>Rainin lub równoważne</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu; L Pipetery 12-kanałowe</td><td>Rainin lub równoważne</td><td>17014497</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Pipety 12-kanałowe</td><td>Rainin lub równoważne</td><td>17013810</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; L Pipety 12-kanałowe</td><td>Rainin lub równoważne</td><td>17013808</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 1000 &mu; L</td><td>Rainin lub równoważne</td><td>17002920</td><td></td></tr><tr><td>końcówki do pipet 200 &mu; L</td><td>Rainin lub równoważny</td><td>17014294</td><td></td></tr><tr><td>końcówki do pipet 20 &mu; L</td><td>Rainin lub równoważny</td><td>17002928</td><td></td></tr><tr><td>Wyciąg chemiczny</td><td>Jamestown Metal Products</td><td>MHCO_229</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowe płytki do przechowywania próbek</td><td>Termiczne lub równoważne</td><td>262261</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma lub równoważny</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>Rurki stożkowe 50 ml</td><td>Thermo lub równoważne</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 50 ml</td><td>Corning lub równoważny</td><td>07-200-576</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 25 ml</td><td>Corning lub równoważne</td><td>07-200-575</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 10 ml</td><td>Corning lub równoważne</td><td>07-200-574</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 5 ml</td><td>Corning lub równoważne</td><td>07-200-573</td><td></td></tr><tr><td>SV40-HCEC unieśmiertelnione ludzkie komórki nabłonka rogówki</td><td>N/A N/A</td> N<td>/A</td><td>Ogniwa te nie są dostępne na rynku, ale można je uzyskać od badaczy cytowanych w artykule</td></tr><tr><td>Sceptor Handheld Automated Cell Counter</td><td>Millipore lub równoważny</td><td>PHCC20060</td><td></td></tr><tr><td>GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument</td><td>Affymetrix lub równoważny</td><td>00-0372</td><td></td></tr><tr><td>Affymetrix 24- i 96-matrycowe płytki</td><td>Affymetrix lub równoważne</td><td>901257; 901434</td><td></td></tr><tr><td>Draegger rurka HF</td><td>Draeger lub równoważna</td><td>8103251</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Draegger CP</td><td>Draeger lub równoważna</td><td>8103421</td><td></td></tr><tr><td>Pompa</td><td>Draeger lub równoważna</td><td>6400000</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste uszczelki płytkowe</td><td>Resesarch Products International lub równoważne</td><td>202502</td><td></td></tr><tr><td>Zbiorniki odczynników</td><td>VistaLab Technologies lub równoważne</td><td>3054-1000</td><td></td></tr><tr><td>Xlfit</td><td>IDBS lub równoważny</td> dodatek Excel <td>N/A</td><td>używany do automatycznego dopasowywania krzywych</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowe badania przesiewowe sirna w kierunku uszkodzenia komórek nabłonka rogówki wywołanego chloropikryną i fluorowodorem

High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury

Uraz oka wywołany przez toksyny jest prawdziwym zagrożeniem dla oka, ponieważ chemikalia mogą szybko spowodować znaczne uszkodzenia tkanek. Leczenie uszkodzenia rogówki wywołanego przez toksyny jest na ogół wspomagające, ponieważ nie istnieją żadne specyficzne terapie do leczenia tych urazów. W wysiłkach na rzecz opracowania metod leczenia i terapii w celu ochrony przed narażeniem, ważne może być zrozumienie molekularnych i komórkowych mechanizmów tych urazów. Sugerujemy, że wykorzystanie wysokoprzepustowych badań przesiewowych małego hamującego RNA (siRNA) może być ważnym narzędziem, które może pomóc w szybszym wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki. siRNA to dwuniciowe cząsteczki RNA, które mają długość 19-25 nukleotydów i wykorzystują potranskrypcyjny szlak wyciszania genów do degradacji mRNA, które mają homologię do siRNA. Wynikające z tego zmniejszenie ekspresji określonego genu można następnie badać w komórkach narażonych na działanie substancji toksycznych, aby ustalić funkcję tego genu w odpowiedzi komórkowej na substancję toksyczną. W artykule przedstawiono opracowanie i walidację modeli i metod ekspozycji in vitro w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych (HTS) uszkodzeń oczu wywołanych fluorowodorem (HF) i chloropikryną (CP). Chociaż wybraliśmy te dwie substancje toksyczne, nasze metody mają zastosowanie do badania innych substancji toksycznych z niewielkimi modyfikacjami protokołu narażenia na substancje toksyczne. Do badania wybrano dużą linię komórkową nabłonka rogówki SV40 z dużym antygenem T unieśmiertelnionym ludzkim nabłonkiem rogówki SV40-HCEC. Żywotność komórek i produkcja IL-8 zostały wybrane jako punkty końcowe w protokole badań przesiewowych. Przedstawiono kilka wyzwań związanych z opracowaniem metod ekspozycji na substancje toksyczne i hodowli komórkowych odpowiednich do badań HTS. Ustanowienie modeli HTS dla tych substancji toksycznych pozwala na dalsze badania w celu lepszego zrozumienia mechanizmu uszkodzenia i badań przesiewowych w poszukiwaniu potencjalnych metod leczenia chemicznego uszkodzenia oczu.

Opracowanie metody ekspozycji
Udoskonaliliśmy i oceniliśmy przydatność ludzkiej linii komórkowej nabłonka rogówki SV40-HCEC do zastosowania w badaniach HTS. Komórki SV40-HCEC zostały unieśmiertelnione przy użyciu dużego antygenu T SV-40 i zostały przekazane przez Dhanajaya Pala23. W procesie opracowywania metodologii ekspozycji zbadano zbyt wiele zmiennych, aby przedstawić je tutaj zwięźl...

Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe RNA hamującego małą próbę jest ważnym narzędziem, które może pomóc w szybszym wyjaśnieniu molekularnych mechanizmów chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki. W niniejszym artykule przedstawiono rozwój i walidację modeli i metod ekspozycji do wysokoprzepustowych badań przesiewowych uszkodzeń nabłonka rogówki wywołanych fluorowodorem i chloropikryną.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe SiRNA w kierunku uszkodzenia komórek nabłonka rogówki wywołanego chloropikryną i fluorowodorem

Toxicant-induced ocular injury is a true ocular emergency because chemicals have the potential to rapidly inflict significant tissue damage. Treatments ...

Ten film przedstawia nasze metody wysokoprzepustowych badań przesiewowych siRNA w modelu komórek nabłonka rogówki pod kątem toksycznego uszkodzenia. Praca ta jest ważna, ponieważ wysokoprzepustowe badania przesiewowe siRNA są opłacalną i efektywną czasowo metodą wyjaśniania szlaków i regulatorów odpowiedzi komórkowej na substancje toksyczne. Ta praca może pomóc nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób rogówka reaguje na toksyczne obelgi.Przygotować zawiesinę komórek nabłonka rogówki we wstępnie podgrzanym podłożu zawierającym 0,5 mikrograma na mililitr hydrokortyzonu w jednorazowej butelce z podłożem. Zakręć butelką, aby równomiernie zawiesić komórki, i wlej do zbiornika na gnieździe wytrząsarki orbitalnej automatycznego urządzenia do obsługi cieczy. Utrzymuj zawiesinę komórek na płycie grzewczej o temperaturze 37 stopni podczas procesu powlekania komórek.Użyj automatycznego urządzenia do obsługi cieczy, aby dodać komórki do płytek o gęstości tysiąca komórek na dołek w 70 mikrolitrach pożywki na dołku na płytce 96-dołkowej. Zasiaj co najmniej 14 96-dołkowych płytek z komórkami dla każdej płytki biblioteki siRNA, która ma być badana. Podczas procesu wysiewu należy stale uruchamiać wytrząsarkę orbitalną z prędkością 100 cykli na minutę i używać prędkości pipetowania 50 mikrolitrów na sekundę na wszystkich etapach.Wymieszaj zawiesinę komórkową za pomocą automatycznego urządzenia do obsługi cieczy przed wysiewem pierwszej płytki. Odessać 140 mikrolitrów zawiesiny komórkowej i dozować 70 mikrolitrów do każdej studzienki z dwiema płytkami do hodowli komórkowych. Powtarzaj mieszanie i dozowanie, aż wszystkie płytki zostaną zasiane komórkami.W razie potrzeby napełnij zbiornik zawiesiny komórek. Po wysianiu płytek należy je wyjąć z pojemnika do obsługi płynów i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś je do inkubatora do hodowli komórkowych.Następnego ranka należy ocenić gęstość komórek na wszystkich płytkach za pomocą zautomatyzowanego systemu obrazowania, który znajduje się w inkubatorze do hodowli komórkowych. Wyklucz z badania płyty, które mają wewnętrzne studzienki, które nie są w 15 procentach do 22 procent zlewających się. Transfekować komórki 24 godziny po wysiewie z czterema komolami na studzienkę siRNA i 0,3 mikrolitra na studzienkę odczynnika do transfekcji, w następujący sposób.Uzyskaj płytki biblioteki siRNA od dostawcy, skonfigurowane tak, aby zawierały 80 celów siRNA na płytkę, z kolumnami pierwszą i dwunastą pozostawionymi pustymi. Rozpuść płytkę biblioteki siRNA z buforem siRNA zgodnie z instrukcjami producenta do końcowego stężenia dwóch pikomoli na mikrolitr dla każdej studzienki siRNA. Wszystkie transfekcje należy wykonać za pomocą automatycznego urządzenia do obsługi cieczy i pipetowania z prędkością 25 mikrolitrów na sekundę na wszystkich etapach.Użyj wstępnie skonfigurowanych skrzynek na końcówki, aby zaadresować tylko te dołki, które będą transfekowane. Użyj górnej połowy płytki bibliotecznej, aby transfekować zestaw sześciu replikowanych płytek, zwanych zestawem płyt górnych"Użyj dolnej połowy płytki bibliotecznej, aby transfekować inny zestaw sześciu płyt replik, określany jako zestaw płyt dolnych"Razem, dwanaście płyt składa się na pełny zestaw płyt, a każda płytka komórki zawiera ten sam zestaw elementów sterujących. Studnie transfekcyjne od B2 do B6 wszystkich płytek z ujemną pulą siRNA po transfekowaniu wszystkich górnych i dolnych zestawów płytek biblioteką siRNA.Również transfekuj studzienki B2 do B6 kolejnych dwóch płytek, które nie otrzymują biblioteki siRNA z ujemną pulą siRNA. Będą one służyć jako nieujawnione kontrolki. Inkubować wszystkie płytki komórkowe w inkubatorze do hodowli komórkowych przez cztery godziny po dodaniu mieszanek transfekcyjnych i mieszać przez delikatne stukanie co godzinę.Użyj automatycznego urządzenia do obsługi cieczy, aby dwukrotnie umyć płytki wstępnie podgrzanym podłożem, rozcieńczonym od jednego do pięciu w PBS i ponownie podawanym w ilości 100 mikrolitrów na dobrze podgrzane podłoże. Na wszystkich etapach należy stosować pipetowanie z prędkością 50 mikrolitrów na sekundę. Użyj studzienek od C2 do C6 jako kontroli nietransfekowanych.Studzienki od B7 do B11 i od C7 do C11 należy przechowywać w stanie nietransfekowanym, aby mogły być używane jako kontrole narkotyków i nośników pod kątem narażenia na działanie substancji toksycznych. 24 godziny po transfekcji należy użyć automatycznego urządzenia do obsługi cieczy, aby ponownie podać płytki. Na wszystkich etapach należy stosować pipetowanie z prędkością 50 mikrolitrów na sekundę.Odessaj 100 mikrolitrów z każdej studzienki i wyrzuć je do zbiornika na odpady. Ponownie napełnij każdą studzienkę 100 mikrolitrami na dobrze podgrzany H-Cort.medium. W razie potrzeby opróżnij zbiornik na odpady.W razie potrzeby napełnij zbiornik pożywką. Dwa dni po transfekcji i dwie godziny przed ekspozycją przygotować 62,5 mikromolowy roztwór kardamoniny kontroli pozytywnej w H-Cort. pożywki i dodać do rzędu B 8-rzędowego zbiornika rozcieńczającego.Przygotować 06,25% roztwór DMSO w H-Cort. meduim i dodać do rzędu C tego samego zbiornika. DMSO służy jako sterowanie pojazdem.Za pomocą automatycznego urządzenia do obsługi cieczy usunąć 10 mikrolitrów pożywki z dołków B7 do B11 i C7 do C11 z każdej płytki komórkowej i wyrzucić ją do rzędów G i H zbiornika. Upewnij się, że używasz wstępnie skonfigurowanych końcówek, aby adresować tylko te studzienki, które otrzymają kontrolę dodatnią i kontrolną pojazdu, a na wszystkich etapach używaj prędkości pipetowania 50 mikrolitrów na sekundę. Przenieś 10 mikrolitrów dodatniego i nośnika kontrolnego do tych studzienek i wymieszaj trzykrotnie.Umieść te płytki komórkowe z powrotem w inkubatorze. Powtórz te kroki dla wszystkich dodatkowych płytek ogniw. Wszystkie czynności związane z ekspozycją na chemikalia należy wykonywać w okapie oparów chemicznych, nosząc podwójne rękawice nitrylowe, fartuch laboratoryjny, jednorazowe ochraniacze rękawów z polietylenu i okulary ochronne.Odkaż końcówki i zbiorniki pipet, które miały kontakt z kwasem fluorowodorowym oraz ciekłym kwasem fluorowodorowym z 2,5-procentowym glukonianem wapnia przed usunięciem do strumienia odpadów niebezpiecznych. Dla każdej badanej płyty bibliotecznej przygotuj 0,0036-procentowy roztwór pożywki z kwasem fluorowodorowym, dodając 288 mikrolitrów jednoprocentowego kwasu fluorowodorowego do 80 mililitrów wstępnie podgrzanego H-Cort. podłoże w butelce o pojemności 150 mililitrów.Zakręć butelką i inkubuj rozcieńczony kwas fluorowodorowy w inkubatorze o temperaturze 37 stopni w okapie oparów chemicznych przez dziesięć minut. Dodać roztwór pożywki z kwasem fluorowodorowym do zbiornika odczynnika umieszczonego na podgrzewaczu do płytek. Wykonaj ekspozycję z dwoma technikami pracującymi w tandemie.Poproś technika po prawej stronie, aby usunął pożywkę do hodowli komórkowych z płytki komórkowej za pomocą dwunastokanałowego pipetera, a następnie przekazał płytkę technikowi po lewej stronie. Poproś technika po lewej stronie, aby dodał 100 mikrolitrów na studzienkę roztworu pożywki z kwasem fluorowodorowym. Powtórz ten proces dla wszystkich płytek komórkowych, które mają być narażone na działanie substancji toksycznych.Powtórz również ten proces dla nienaświetlonych płytek kontrolnych, używając świeżego podłoża zamiast roztworu kwasu fluorowodorowego. Umieścić płytki w inkubatorze pod wyciągiem chemicznym na 20 minut, a następnie umieścić je z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych. Powtórzyć etap dodawania kontroli dodatniej, jak pokazano wcześniej, po naświetleniu wszystkich płytek i powrocie do inkubatora do hodowli komórkowych.Zebrać supernatant hodowli komórkowej i ocenić żywotność komórek za pomocą testu MTT 24 godziny po ekspozycji. Przygotuj roztwór 0,5 miligrama na mililitr substratu MTT w PBS zawierającym 10 gramów na litr glukozy i podgrzej do 37 stopni. Dodaj roztwór substratu MTT do zbiornika na zautomatyzowanym urządzeniu do obsługi cieczy.Na wszystkich etapach należy stosować pipetowanie z prędkością 50 mikrolitrów na sekundę. Wstępnie skonfiguruj skrzynki końcówek, aby adresować tylko te dołki, które mają być badane. Użyj automatycznego urządzenia do obsługi cieczy, aby zassać 95 mikrolitrów pożywki z wewnętrznych 60 dołków płytki ogniwa i umieścić 42.5 mikrolitra na każdej z dwóch 384-dołkowych płytek do przechowywania.Natychmiast dodaj 100 mikrolitrów roztworu substratu MTT na studzienkę do płytek komórkowych i inkubuj je w temperaturze 37 stopni w inkubatorze do hodowli komórkowych przez godzinę. Zapieczętować 384-dołkowe płytki do przechowywania i przechowywać je w temperaturze minus 80 do późniejszej analizy. Powtórz ten proces dla wszystkich zestawów blach górnych i dolnych oraz skojarzonych niewidocznych elementów sterujących.W razie potrzeby napełnij zbiornik substratu MTT. W razie potrzeby należy ponownie użyć końcówek między powtórzeniami, ale umyć je podczas dodawania roztworu substratu MTT i podczas przełączania między zestawami płytek. Po godzinnej inkubacji użyj automatycznego urządzenia do obsługi cieczy, aby usunąć roztwór substratu MTT z wewnętrznych 60 dołków każdej płytki do hodowli komórkowej i zastąpić 100 mikrolitrami na studzienkę DMSO.Na wszystkich etapach należy stosować pipetowanie z prędkością 50 mikrolitrów na sekundę i wstępnie skonfigurować skrzynki końcówek tak, aby adresowały tylko te dołki, które mają być badane. Opróżnij zbiornik na odpady i w razie potrzeby napełnij zbiornik DMSO. Potrząsaj talerzami na wytrząsarce przez trzy minuty.Zmierzyć absorbancję przy 570 i 690 nanometrach za pomocą spektrofotometru płytkowego. Odejmij absorbancję tła przy 690 nanometrach od absorbancji przy 570 nanometrach i uśrednij wartości dla każdej grupy kontrolnej na nienaświetlonej płytce. Obliczyć procentową żywotność, dzieląc wartości absorbancji dla każdego celu przez średnią wartość absorbancji nienarażonych prób kontrolnych.Użyj średniej nieeksponowanej puli ujemnej, aby obliczyć procent żywotności komórek dla wszystkich celów. Zmierzyć stężenie IL-8 w supernatantach z hodowli komórkowych za pomocą testu na bazie kulek bez płukania, zgodnie z instrukcjami producenta. Utwórz układ płytki testowej, aby pomieścić próbki i wzorce.Wyjmij 384-dołkowe płytki do przechowywania z zamrażarki minus 80 i rozmroź w temperaturze pokojowej. Krótko odwirować płytki, aby zebrać próbkę na dnie studzienek. Dodaj kulki akceptorowe anty-IL-8 i biotynylowane przeciwciało do czarnej 384-dołkowej płytki do przechowywania.Dodać mieszaninę kulek i przeciwciał do studzienek przeznaczonych do użycia dla próbek i krzywej wzorcowej, zgodnie z układem płytki testowej. Rozpuścić wzorzec w pożywce zawierającej 354 mikromolowy chlorek sodu. Wykonać dwukrotne seryjne rozcieńczenia krzywej wzorcowej i dodać trzykrotnie do innej czarnej 384-dołkowej płytki do przechowywania.Użyj zautomatyzowanej obsługi cieczy, aby wykonać test. Użyj wstępnie skonfigurowanych skrzynek na końcówki, aby zaadresować studzienki zgodnie z układem płytki testowej. Na wszystkich etapach należy stosować pipetowanie z prędkością 50 mikrolitrów na sekundę.Przenieść 8 mikrolitrów mieszaniny akceptorowo-perełkowej przeciwciała na białe, 384-dołkowe, płytkie płytkie płytkie płytkie testy. Dodać mieszaninę kulek i przeciwciał do studzienek przeznaczonych do użycia dla próbek i krzywej wzorcowej zgodnie z układem płytki testowej. Następnie przenieś krzywą wzorcową do odpowiednich dołków na płytkich płytkach testowych.Następnie przygotuj 3,54-molowy roztwór chlorku sodu w płytkim zbiorniku. Dostosuj stężenie soli w próbkach do stężenia krzywej wzorcowej, przenosząc 4,5 mikrolitra roztworu chlorku sodu do próbek na czarnych 384-dołkowych płytkach do przechowywania. Wymieszaj próbki trzykrotnie, używając objętości mieszania 30 mikrolitrów, a następnie przenieś dwa mikrolitry próbek na białe płytkie płytkie płytkie testowe zgodnie z układem płytki testowej.Inkubować przez godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej. Dodaj koraliki wtórne do czarnej 384-dołkowej płytki do przechowywania. Dodać kulki do dołków przeznaczonych do użycia dla próbek i krzywej wzorcowej zgodnie z układem płytki testowej.Przenieś 10 mikrolitrów wtórnych kulek do studzienek białej płytkiej płytkiej studzienki z 384 dołkami, które otrzymają standardową krzywą lub próbki zgodnie z układem płytki testowej. Umyj końcówki między każdą płytą. Inkubować przez kolejną godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej.Uszczelnij płytki testowe przezroczystymi uszczelkami i zeskanuj za pomocą czytnika płytek kompatybilnego z testem opartym na kulkach. Użyj odległości 0,2 milimetra między płytką a detektorem, czasu wzbudzenia 180 milisekund dla skanowania i czasu pomiaru 550 milisekund. Zaimportuj surowe dane z testów IL-8 do arkusza kalkulacyjnego.Użyj automatycznego dopasowania krzywej dla standardowej krzywej testów IL-8, a następnie przekonwertuj surowe dane na pikogramy na mililitr dla każdej próbki. Obliczyć średnią z sześciu powtórzeń dla każdego celu. Następnie należy obliczyć wartości SSMD i zmienić krotność względem narażonych kontroli ujemnych.Wyświetlaj dane na wykresie podwójnej latarki, który pokazuje zmianę zagięcia wzdłuż osi x i SSMD wzdłuż osi y dla każdego celu. Podsumowując, opracowaliśmy metody i warunki hodowli odpowiednie do wysokoprzepustowego badania przesiewowego uszkodzenia oka przez substancje toksyczne. Udowodniliśmy przydatność tych metod, wypełniając pierwotne badanie przesiewowe biblioteki siRNA w modelu uszkodzenia kwasu fluorowodorowego.Wysokoprzepustowe zbiory danych genomowych mogą w znacznym stopniu przyczynić się do zrozumienia roli, jaką określone geny odgrywają w urazach lub chorobach, co może pomóc w skuteczniejszym ukierunkowaniu dalszych badań in vitro lub in vivo.

high-throughput-sirna-screening-for-chloropicrin-hydrogen-fluoride

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje test fluorometryczny in vitro, który ma na celu ocenę wpływu preparatów sztucznych łez na komórkową aktywność metaboliczną komórek nabłonka rogówki przy użyciu roztworu niebieskiego Alamar na bazie resazuryny. Nietoksyczny preparat utrzymuje komórki w zdrowym, metabolicznie aktywnym stanie, ułatwiając redukcję rezazuryny do wysoce fluorescencyjnej rezorufiny.

Test alamarBlue: czuła metoda fluorometryczna do badania cytotoksycznego wpływu preparatów sztucznych łez na aktywność metaboliczną ludzkich komórek nabłonka rogówki

Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Opracowaliśmy test podrażnienia oczu, który wykorzystuje trójwymiarowy zrekonstruowany model tkanki ludzkiego nabłonka przypominającego rogówkę (RhCE). Test jest w stanie odróżnić materiały drażniące i dla oczu (kategorie 1 i 2 GHS łącznie) od tych, które nie wymagają oznakowania (kategoria bez GHS).

Test działania drażniącego na oczy (EIT) w celu identyfikacji zagrożeń związanych z substancjami chemicznymi drażniącymi oczy przy użyciu zrekonstruowanego modelu tkanki nabłonka ludzkiego przypominającego rogówkę (RhCE)

Celem badania była ocena biologicznego wpływu 15 składników dymu papierosowego przy użyciu kombinacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym opartego na impedancji i platformy opartej na badaniach przesiewowych o wysokiej zawartości (HCS) do oceny toksykologicznej in vitro. Badanie to dostarcza informacji na temat skutecznych dawek, toksyczności i sposobów działania badanych związków.

Analiza przesiewowa o wysokiej zawartości w celu oceny skutków toksykologicznych szkodliwych i potencjalnie szkodliwych składników (HPHC)

Niniejszym przedstawiamy protokół wykorzystania małego interferującego RNA specyficznego dla białka szoku cieplnego 27 (HSP27) do oceny funkcji HSP27 podczas gojenia się ran nabłonka rogówki. Interferencja RNA jest najlepszą metodą skutecznego obniżania ekspresji genów w celu zbadania funkcji białek w różnych typach komórek.

Oparte na interferencji RNA badanie funkcji białka szoku cieplnego 27 podczas gojenia się ran nabłonka rogówki

Tutaj opisujemy wysokoprzepustowy test oparty na fluorescencji, który mierzy skuteczność uszczelniania błony plazmatycznej za pomocą analiz fluorometrycznych i obrazowych w żywych komórkach. Test ten może być stosowany do badań przesiewowych leków lub genów docelowych, które regulują ponowne uszczelnianie błony plazmatycznej w komórkach ssaków.

Wysokoprzepustowy pomiar skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków

Ten protokół demonstruje jednoczesne wykrywanie reaktywnych form tlenu (ROS), żywych komórek i martwych komórek w żywych hodowlach pierwotnych z komórek powierzchni oka myszy. 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetat, jodek propidyny i barwienie Hoechst są używane do oceny ROS, martwych komórek i żywych komórek, odpowiednio, a następnie obrazowania i analizy.

Ocena uszkodzeń oksydacyjnych w pierwotnych komórkach powierzchni oka/komórkach macierzystych myszy w odpowiedzi na uszkodzenie ultrafioletem-C (UV-C)

Ten artykuł opisuje procedury używane do oceny toksyczności promieniowania UV i toksyn chemicznych na pierwotnej i nieśmiertelnej linii komórkowej.

Określanie toksyczności promieniowania UV i substancji chemicznych na pierwotne i nieśmiertelne ludzkie komórki nabłonka rogówki

Tutaj tworzone są modele zwierzęce oparte na myszach i królikach do mechanicznego i chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki, aby przebadać nowe terapie i leżący u ich podstaw mechanizm.

Modele zwierzęce ex vivo i in vivo do mechanicznych i chemicznych urazów nabłonka rogówki

Ten protokół opisuje nowatorską metodę ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu dihydroetydydy (DHE) jako sondy barwnika fluorescencyjnego przy użyciu wysokoprzepustowego podejścia przesiewowego. W protokole opisano metody oceny ilościowej wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) w trzech różnych liniach komórkowych raka wątrobowokomórkowego.

Wysokoprzepustowa ocena przesiewowa wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu barwnika fluorescencyjnego Dihydroethidium (DHE)

Hodowla narządów ex vivo rogówki świń i gojenie ran nabłonkowych dostarczają ekonomicznego, etycznego, powtarzalnego i ilościowego sposobu testowania toksyczności ocznej chemikaliów. Pomagają również w wyjaśnieniu mechanizmów leżących u podstaw regulacji nabłonka i naprawy tkanek oraz w ocenie terapii stosowanych w leczeniu keratopatii cukrzycowej i opóźnionego gojenia się ran.

Ocena toksyczności terapeutycznej i chemicznej przy użyciu rogówek świń z hodowli narządowych i gojenie się ran nabłonkowych

Poznaj metody wysokoprzepustowego badania przesiewowego siRNA w modelu uszkodzenia komórek nabłonka rogówki wywołanego toksykantami. Ta technika pozwala szybko identyfikować szlaki molekularne i regulatory odpowiedzi komórkowej.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe SiRNA w kierunku uszkodzenia komórek nabłonka rogówki wywołanego chloropikryną i fluorowodorem (Wideo) | JoVE Journal

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe SiRNA w kierunku uszkodzenia komórek nabłonka rogówki wywołanego chloropikryną i fluorowodorem

Przeglądaj więcej filmów