Wysokoprzepustowe badania przesiewowe SiRNA w kierunku uszkodzenia komórek nabłonka rogówki wywołanego chloropikryną i fluorowodorem

Ten film przedstawia nasze metody wysokoprzepustowych badań przesiewowych siRNA w modelu komórek nabłonka rogówki pod kątem toksycznego uszkodzenia. Praca ta jest ważna, ponieważ wysokoprzepustowe badania przesiewowe siRNA są opłacalną i efektywną czasowo metodą wyjaśniania szlaków i regulatorów odpowiedzi komórkowej na substancje toksyczne. Ta praca może pomóc nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób rogówka reaguje na toksyczne obelgi.

Przygotować zawiesinę komórek nabłonka rogówki we wstępnie podgrzanym podłożu zawierającym 0,5 mikrograma na mililitr hydrokortyzonu w jednorazowej butelce z podłożem. Zakręć butelką, aby równomiernie zawiesić komórki, i wlej do zbiornika na gnieździe wytrząsarki orbitalnej automatycznego urządzenia do obsługi cieczy. Utrzymuj zawiesinę komórek na płycie grzewczej o temperaturze 37 stopni podczas procesu powlekania komórek.

Użyj automatycznego urządzenia do obsługi cieczy, aby dodać komórki do płytek o gęstości tysiąca komórek na dołek w 70 mikrolitrach pożywki na dołku na płytce 96-dołkowej. Zasiaj co najmniej 14 96-dołkowych płytek z komórkami dla każdej płytki biblioteki siRNA, która ma być badana. Podczas procesu wysiewu należy stale uruchamiać wytrząsarkę orbitalną z prędkością 100 cykli na minutę i używać prędkości pipetowania 50 mikrolitrów na sekundę na wszystkich etapach.

Wymieszaj zawiesinę komórkową za pomocą automatycznego urządzenia do obsługi cieczy przed wysiewem pierwszej płytki. Odessać 140 mikrolitrów zawiesiny komórkowej i dozować 70 mikrolitrów do każdej studzienki z dwiema płytkami do hodowli komórkowych. Powtarzaj mieszanie i dozowanie, aż wszystkie płytki zostaną zasiane komórkami.

razie potrzeby napełnij zbiornik zawiesiny komórek. Po wysianiu płytek należy je wyjąć z pojemnika do obsługi płynów i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś je do inkubatora do hodowli komórkowych.

Następnego ranka należy ocenić gęstość komórek na wszystkich płytkach za pomocą zautomatyzowanego systemu obrazowania, który znajduje się w inkubatorze do hodowli komórkowych. Wyklucz z badania płyty, które mają wewnętrzne studzienki, które nie są w 15 procentach do 22 procent zlewających się. Transfekować komórki 24 godziny po wysiewie z czterema komolami na studzienkę siRNA i 0,3 mikrolitra na studzienkę odczynnika do transfekcji, w następujący sposób.

Uzyskaj płytki biblioteki siRNA od dostawcy, skonfigurowane tak, aby zawierały 80 celów siRNA na płytkę, z kolumnami pierwszą i dwunastą pozostawionymi pustymi. Rozpuść płytkę biblioteki siRNA z buforem siRNA zgodnie z instrukcjami producenta do końcowego stężenia dwóch pikomoli na mikrolitr dla każdej studzienki siRNA. Wszystkie transfekcje należy wykonać za pomocą automatycznego urządzenia do obsługi cieczy i pipetowania z prędkością 25 mikrolitrów na sekundę na wszystkich etapach.

Użyj wstępnie skonfigurowanych skrzynek na końcówki, aby zaadresować tylko te dołki, które będą transfekowane. Użyj górnej połowy płytki bibliotecznej, aby transfekować zestaw sześciu replikowanych płytek, zwanych zestawem płyt górnych"Użyj dolnej połowy płytki bibliotecznej, aby transfekować inny zestaw sześciu płyt replik, określany jako zestaw płyt dolnych"Razem, dwanaście płyt składa się na pełny zestaw płyt, a każda płytka komórki zawiera ten sam zestaw elementów sterujących. Studnie transfekcyjne od B2 do B6 wszystkich płytek z ujemną pulą siRNA po transfekowaniu wszystkich górnych i dolnych zestawów płytek biblioteką siRNA.

Również transfekuj studzienki B2 do B6 kolejnych dwóch płytek, które nie otrzymują biblioteki siRNA z ujemną pulą siRNA. Będą one służyć jako nieujawnione kontrolki. Inkubować wszystkie płytki komórkowe w inkubatorze do hodowli komórkowych przez cztery godziny po dodaniu mieszanek transfekcyjnych i mieszać przez delikatne stukanie co godzinę.

Użyj automatycznego urządzenia do obsługi cieczy, aby dwukrotnie umyć płytki wstępnie podgrzanym podłożem, rozcieńczonym od jednego do pięciu w PBS i ponownie podawanym w ilości 100 mikrolitrów na dobrze podgrzane podłoże. Na wszystkich etapach należy stosować pipetowanie z prędkością 50 mikrolitrów na sekundę. Użyj studzienek od C2 do C6 jako kontroli nietransfekowanych.

Studzienki od B7 do B11 i od C7 do C11 należy przechowywać w stanie nietransfekowanym, aby mogły być używane jako kontrole narkotyków i nośników pod kątem narażenia na działanie substancji toksycznych. 24 godziny po transfekcji należy użyć automatycznego urządzenia do obsługi cieczy, aby ponownie podać płytki. Na wszystkich etapach należy stosować pipetowanie z prędkością 50 mikrolitrów na sekundę.

Odessaj 100 mikrolitrów z każdej studzienki i wyrzuć je do zbiornika na odpady. Ponownie napełnij każdą studzienkę 100 mikrolitrami na dobrze podgrzany H-Cort.medium. W razie potrzeby opróżnij zbiornik na odpady.

W razie potrzeby napełnij zbiornik pożywką. Dwa dni po transfekcji i dwie godziny przed ekspozycją przygotować 62,5 mikromolowy roztwór kardamoniny kontroli pozytywnej w H-Cort. pożywki i dodać do rzędu B 8-rzędowego zbiornika rozcieńczającego.

Przygotować 06,25% roztwór DMSO w H-Cort. meduim i dodać do rzędu C tego samego zbiornika. DMSO służy jako sterowanie pojazdem.

Za pomocą automatycznego urządzenia do obsługi cieczy usunąć 10 mikrolitrów pożywki z dołków B7 do B11 i C7 do C11 z każdej płytki komórkowej i wyrzucić ją do rzędów G i H zbiornika. Upewnij się, że używasz wstępnie skonfigurowanych końcówek, aby adresować tylko te studzienki, które otrzymają kontrolę dodatnią i kontrolną pojazdu, a na wszystkich etapach używaj prędkości pipetowania 50 mikrolitrów na sekundę. Przenieś 10 mikrolitrów dodatniego i nośnika kontrolnego do tych studzienek i wymieszaj trzykrotnie.

Umieść te płytki komórkowe z powrotem w inkubatorze. Powtórz te kroki dla wszystkich dodatkowych płytek ogniw. Wszystkie czynności związane z ekspozycją na chemikalia należy wykonywać w okapie oparów chemicznych, nosząc podwójne rękawice nitrylowe, fartuch laboratoryjny, jednorazowe ochraniacze rękawów z polietylenu i okulary ochronne.

Odkaż końcówki i zbiorniki pipet, które miały kontakt z kwasem fluorowodorowym oraz ciekłym kwasem fluorowodorowym z 2,5-procentowym glukonianem wapnia przed usunięciem do strumienia odpadów niebezpiecznych. Dla każdej badanej płyty bibliotecznej przygotuj 0,0036-procentowy roztwór pożywki z kwasem fluorowodorowym, dodając 288 mikrolitrów jednoprocentowego kwasu fluorowodorowego do 80 mililitrów wstępnie podgrzanego H-Cort. podłoże w butelce o pojemności 150 mililitrów.

Zakręć butelką i inkubuj rozcieńczony kwas fluorowodorowy w inkubatorze o temperaturze 37 stopni w okapie oparów chemicznych przez dziesięć minut. Dodać roztwór pożywki z kwasem fluorowodorowym do zbiornika odczynnika umieszczonego na podgrzewaczu do płytek. Wykonaj ekspozycję z dwoma technikami pracującymi w tandemie.

Poproś technika po prawej stronie, aby usunął pożywkę do hodowli komórkowych z płytki komórkowej za pomocą dwunastokanałowego pipetera, a następnie przekazał płytkę technikowi po lewej stronie. Poproś technika po lewej stronie, aby dodał 100 mikrolitrów na studzienkę roztworu pożywki z kwasem fluorowodorowym. Powtórz ten proces dla wszystkich płytek komórkowych, które mają być narażone na działanie substancji toksycznych.

Powtórz również ten proces dla nienaświetlonych płytek kontrolnych, używając świeżego podłoża zamiast roztworu kwasu fluorowodorowego. Umieścić płytki w inkubatorze pod wyciągiem chemicznym na 20 minut, a następnie umieścić je z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych. Powtórzyć etap dodawania kontroli dodatniej, jak pokazano wcześniej, po naświetleniu wszystkich płytek i powrocie do inkubatora do hodowli komórkowych.

Zebrać supernatant hodowli komórkowej i ocenić żywotność komórek za pomocą testu MTT 24 godziny po ekspozycji. Przygotuj roztwór 0,5 miligrama na mililitr substratu MTT w PBS zawierającym 10 gramów na litr glukozy i podgrzej do 37 stopni. Dodaj roztwór substratu MTT do zbiornika na zautomatyzowanym urządzeniu do obsługi cieczy.

Na wszystkich etapach należy stosować pipetowanie z prędkością 50 mikrolitrów na sekundę. Wstępnie skonfiguruj skrzynki końcówek, aby adresować tylko te dołki, które mają być badane. Użyj automatycznego urządzenia do obsługi cieczy, aby zassać 95 mikrolitrów pożywki z wewnętrznych 60 dołków płytki ogniwa i umieścić 42.5 mikrolitra na każdej z dwóch 384-dołkowych płytek do przechowywania.

Natychmiast dodaj 100 mikrolitrów roztworu substratu MTT na studzienkę do płytek komórkowych i inkubuj je w temperaturze 37 stopni w inkubatorze do hodowli komórkowych przez godzinę. Zapieczętować 384-dołkowe płytki do przechowywania i przechowywać je w temperaturze minus 80 do późniejszej analizy. Powtórz ten proces dla wszystkich zestawów blach górnych i dolnych oraz skojarzonych niewidocznych elementów sterujących.

W razie potrzeby napełnij zbiornik substratu MTT. W razie potrzeby należy ponownie użyć końcówek między powtórzeniami, ale umyć je podczas dodawania roztworu substratu MTT i podczas przełączania między zestawami płytek. Po godzinnej inkubacji użyj automatycznego urządzenia do obsługi cieczy, aby usunąć roztwór substratu MTT z wewnętrznych 60 dołków każdej płytki do hodowli komórkowej i zastąpić 100 mikrolitrami na studzienkę DMSO.

Na wszystkich etapach należy stosować pipetowanie z prędkością 50 mikrolitrów na sekundę i wstępnie skonfigurować skrzynki końcówek tak, aby adresowały tylko te dołki, które mają być badane. Opróżnij zbiornik na odpady i w razie potrzeby napełnij zbiornik DMSO. Potrząsaj talerzami na wytrząsarce przez trzy minuty.

Zmierzyć absorbancję przy 570 i 690 nanometrach za pomocą spektrofotometru płytkowego. Odejmij absorbancję tła przy 690 nanometrach od absorbancji przy 570 nanometrach i uśrednij wartości dla każdej grupy kontrolnej na nienaświetlonej płytce. Obliczyć procentową żywotność, dzieląc wartości absorbancji dla każdego celu przez średnią wartość absorbancji nienarażonych prób kontrolnych.

Użyj średniej nieeksponowanej puli ujemnej, aby obliczyć procent żywotności komórek dla wszystkich celów. Zmierzyć stężenie IL-8 w supernatantach z hodowli komórkowych za pomocą testu na bazie kulek bez płukania, zgodnie z instrukcjami producenta. Utwórz układ płytki testowej, aby pomieścić próbki i wzorce.

Wyjmij 384-dołkowe płytki do przechowywania z zamrażarki minus 80 i rozmroź w temperaturze pokojowej. Krótko odwirować płytki, aby zebrać próbkę na dnie studzienek. Dodaj kulki akceptorowe anty-IL-8 i biotynylowane przeciwciało do czarnej 384-dołkowej płytki do przechowywania.

Dodać mieszaninę kulek i przeciwciał do studzienek przeznaczonych do użycia dla próbek i krzywej wzorcowej, zgodnie z układem płytki testowej. Rozpuścić wzorzec w pożywce zawierającej 354 mikromolowy chlorek sodu. Wykonać dwukrotne seryjne rozcieńczenia krzywej wzorcowej i dodać trzykrotnie do innej czarnej 384-dołkowej płytki do przechowywania.

Użyj zautomatyzowanej obsługi cieczy, aby wykonać test. Użyj wstępnie skonfigurowanych skrzynek na końcówki, aby zaadresować studzienki zgodnie z układem płytki testowej. Na wszystkich etapach należy stosować pipetowanie z prędkością 50 mikrolitrów na sekundę.

Przenieść 8 mikrolitrów mieszaniny akceptorowo-perełkowej przeciwciała na białe, 384-dołkowe, płytkie płytkie płytkie płytkie testy. Dodać mieszaninę kulek i przeciwciał do studzienek przeznaczonych do użycia dla próbek i krzywej wzorcowej zgodnie z układem płytki testowej. Następnie przenieś krzywą wzorcową do odpowiednich dołków na płytkich płytkach testowych.

Następnie przygotuj 3,54-molowy roztwór chlorku sodu w płytkim zbiorniku. Dostosuj stężenie soli w próbkach do stężenia krzywej wzorcowej, przenosząc 4,5 mikrolitra roztworu chlorku sodu do próbek na czarnych 384-dołkowych płytkach do przechowywania. Wymieszaj próbki trzykrotnie, używając objętości mieszania 30 mikrolitrów, a następnie przenieś dwa mikrolitry próbek na białe płytkie płytkie płytkie testowe zgodnie z układem płytki testowej.

Inkubować przez godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej. Dodaj koraliki wtórne do czarnej 384-dołkowej płytki do przechowywania. Dodać kulki do dołków przeznaczonych do użycia dla próbek i krzywej wzorcowej zgodnie z układem płytki testowej.

Przenieś 10 mikrolitrów wtórnych kulek do studzienek białej płytkiej płytkiej studzienki z 384 dołkami, które otrzymają standardową krzywą lub próbki zgodnie z układem płytki testowej. Umyj końcówki między każdą płytą. Inkubować przez kolejną godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej.

Uszczelnij płytki testowe przezroczystymi uszczelkami i zeskanuj za pomocą czytnika płytek kompatybilnego z testem opartym na kulkach. Użyj odległości 0,2 milimetra między płytką a detektorem, czasu wzbudzenia 180 milisekund dla skanowania i czasu pomiaru 550 milisekund. Zaimportuj surowe dane z testów IL-8 do arkusza kalkulacyjnego.

Użyj automatycznego dopasowania krzywej dla standardowej krzywej testów IL-8, a następnie przekonwertuj surowe dane na pikogramy na mililitr dla każdej próbki. Obliczyć średnią z sześciu powtórzeń dla każdego celu. Następnie należy obliczyć wartości SSMD i zmienić krotność względem narażonych kontroli ujemnych.

Wyświetlaj dane na wykresie podwójnej latarki, który pokazuje zmianę zagięcia wzdłuż osi x i SSMD wzdłuż osi y dla każdego celu. Podsumowując, opracowaliśmy metody i warunki hodowli odpowiednie do wysokoprzepustowego badania przesiewowego uszkodzenia oka przez substancje toksyczne. Udowodniliśmy przydatność tych metod, wypełniając pierwotne badanie przesiewowe biblioteki siRNA w modelu uszkodzenia kwasu fluorowodorowego.

Wysokoprzepustowe zbiory danych genomowych mogą w znacznym stopniu przyczynić się do zrozumienia roli, jaką określone geny odgrywają w urazach lub chorobach, co może pomóc w skuteczniejszym ukierunkowaniu dalszych badań in vitro lub in vivo.