Name: Wysokoprzepustowe badania przesiewowe SiRNA w kierunku uszkodzenia komórek nabłonka rogówki wywołanego chloropikryną i fluorowodorem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 20 s
Description: Poznaj metody wysokoprzepustowego badania przesiewowego siRNA w modelu uszkodzenia komórek nabłonka rogówki wywołanego toksykantami. Ta technika pozwala szybko identyfikować szlaki molekularne i regulatory odpowiedzi komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez National Institutes of Health CounterACT Program Interagency Agreement # AOD13015-001. Chcielibyśmy podziękować Stephanie Froberg i Peterowi Hurstowi za ich wysiłek i wiedzę na temat produkcji wideo.

<ol><li>Randleman, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRandleman%2C+B+%22Drugs%2C+Diseases+and+Procedures%22">Drugs, Diseases and Procedures</a>. Hampton, R. , Medscape. (2011).</li>
<li>Fish, R., Davidson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+ocular+thermal+and+chemical+injuries%2C+including+amniotic+membrane+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+treatment+strategies+for+hydrofluoric+acid+burns%3A+current+status+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">A review of treatment strategies for hydrofluoric acid burns: current status and future prospects.</a> Burns. 40 (8), 1447-1457 (2014).</li>
<li>Gaytan, B. D., Vulpe, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+toxicology%3A+tools+to+advance+the+future+of+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Functional toxicology: tools to advance the future of toxicity testing.</a> Frontiers in Genetics. 5, 110(2014).</li>
<li>North, M., Vulpe, C. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3100848/">Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 4796-4813 (2010).</li>
<li>McManus, M. T., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+mammals+by+small+interfering+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in mammals by small interfering RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (10), 737-747 (2002).</li>
<li>Bassik, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+mammalian+genetic+interaction+map+reveals+pathways+underlying+ricin+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility.</a> Cell. 152 (4), 909-922 (2013).</li>
<li>Solaimani, P., Damoiseaux, R., Hankinson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+high-throughput+screen+identifies+proteins+necessary+for+the+AHR-dependent+induction+of+CYP1A1+by+2%2C3%2C7%2C8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi high-throughput screen identifies proteins necessary for the AHR-dependent induction of CYP1A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Toxicological Sciences. 136 (1), 107-119 (2013).</li>
<li>Cox, J. A., Gooding, R., Kolakowski, J. E., Whitmire, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCox%2C+JA+%22Chemical+Terrorism+Risk+Assessment%3B+CSAC+12-006%22">Chemical Terrorism Risk Assessment; CSAC 12-006</a>. , U.S. Department of Homeland Security, Science and Technology Directorate, Chemical Security Analysis Center. Aberdeen Proving Ground, MD. (2012).</li>
<li>Zang, R., Li, D., Tang, I., Wang, J., Yang, S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/267200748_Cell-Based_Assays_in_High-Throughput_Screening_for_Drug_Discovery">Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery.</a> International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 1, 31-51 (2012).</li>
<li>Ray, R., Hauck, S., Kramer, R., Benton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+convenient+fluorometric+method+to+study+sulfur+mustard-induced+apoptosis+in+human+epidermal+keratinocytes+monolayer+microplate+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">A convenient fluorometric method to study sulfur mustard-induced apoptosis in human epidermal keratinocytes monolayer microplate culture.</a> Drug and Chemical Toxicology. 28 (1), 105-116 (2005).</li>
<li>Ruff, A. L., Dillman, J. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfur+mustard+induced+cytokine+production+and+cell+death%3A+investigating+the+potential+roles+of+the+p38%2C+p53%2C+and+NF-kappaB+signaling+pathways+with+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Molecular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Sulfur mustard induced cytokine production and cell death: investigating the potential roles of the p38, p53, and NF-kappaB signaling pathways with RNA interference.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 24 (3), 155-164 (2010).</li>
<li>Smith, W. J., Gross, C. L., Chan, P., Meier, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+human+epidermal+keratinocytes+in+culture+as+a+model+for+studying+the+biochemical+mechanisms+of+sulfur+mustard+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for studying the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity.</a> Cell Biology and Toxicology. 6 (3), 285-291 (1990).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Toxnet%22">Toxnet</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://toxnet.nlm.nih.gov/">https://toxnet.nlm.nih.gov/</a> (2016).</li>
<li>Bancroft, W. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBancroft%2C+WD+%22The+Medical+Department+of+the+United+States+Army+in+the+World+War%22">The Medical Department of the United States Army in the World War</a>. 14, Otis Historical Archives, National Museum of Health and Medicine. (1926).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Chloropicrin+Risk+Characterization+Document%22">Chloropicrin Risk Characterization Document</a>. , California Environmental Protection Agency. (2012).</li>
<li>Aigueperse, J., et al. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14356007.a11_307">Fluorine Compounds, Inorganic. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry</a>. , Wiley-VCH. (2000).</li>
<li>Sotozono, C. <a target="_blank" href="https://journals.lww.com/corneajrnl/Abstract/2000/11003/Second_Injury_in_the_Cornea__The_Role_of.4.aspx">Second Injury in the Cornea: The Role of Inflammatory Cytokines in Corneal Damage and Repair.</a> Cornea. 19 (6), S155-S159 (2000).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+and+Recommendations+for+Dharmacon+siRNA+Libraries%22">Guidelines and Recommendations for Dharmacon siRNA Libraries</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/sirna-libraries-guidelines.pdf">http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/sirna-libraries-guidelines.pdf</a> (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Lipofectamine+RNAiMAX+Reagent%22">Lipofectamine RNAiMAX Reagent</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-culture/pdfs.par.72509.file.dat/Lipofectamine%20rnaimax%20protocol%20v2.0.pdf
">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-culture/pdfs.par.72509.file.dat/Lipofectamine%20rnaimax%20protocol%20v2.0.pdf
</a> (2017).</li>
<li>Denizot, F., Lang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+colorimetric+assay+for+cell+growth+and+survival.+Modifications+to+the+tetrazolium+dye+procedure+giving+improved+sensitivity+and+reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability.</a> Journal of Immunological Methods. 89 (2), 271-277 (1986).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22IL-8+%28human%29+AlphaLISA+Detection+Kit%2C+5%2C000+Assay+Points%22">IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit, 5,000 Assay Points</a>. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.perkinelmer.com/searchresult?searchName=AL224F&_csrf=dd35c533-8dc4-4005-a87f-c5ab3a519bf3">http://www.perkinelmer.com/searchresult?searchName=AL224F&_csrf=dd35c533-8dc4-4005-a87f-c5ab3a519bf3</a> (2016).</li>
<li>Araki-Sasaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Ruff, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+mouse+model+for+sulfur+mustard-induced+ocular+injury+and+long-term+clinical+analysis+of+injury+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cutaneous+and+Ocular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Development of a mouse model for sulfur mustard-induced ocular injury and long-term clinical analysis of injury progression.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 32 (2), 140-149 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22GeneTitan+MC+Instrument+North+America%2FJapan+%28110V%29%22">GeneTitan MC Instrument North America/Japan (110V)</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/00-0372?SID=srch-srp-00-0372">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/00-0372?SID=srch-srp-00-0372</a> (2018).</li>
<li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pair+of+new+statistical+parameters+for+quality+control+in+RNA+interference+high-throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays.</a> Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).</li>
<li>He, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Sodium+Fluoride+on+the+Proliferation+and+Gene+Differential+Expression+in+Human+RPMI8226+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Trace+Element+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of Sodium Fluoride on the Proliferation and Gene Differential Expression in Human RPMI8226 Cells.</a> Biological Trace Element Research. 167 (1), 11-17 (2015).</li>
<li>Tabuchi, Y., Yunoki, T., Hoshi, N., Suzuki, N., Kondo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+gene+networks+involved+in+sodium+fluoride-elicited+cell+death+accompanying+endoplasmic+reticulum+stress+in+oral+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genes and gene networks involved in sodium fluoride-elicited cell death accompanying endoplasmic reticulum stress in oral epithelial cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (5), 8959-8978 (2014).</li>
<li>Pesonen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloropicrin-induced+toxic+responses+in+human+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Chloropicrin-induced toxic responses in human lung epithelial cells.</a> Toxicology Letters. 226 (2), 236-244 (2014).</li>
<li>Wilhelm, S. N., Shepler, K., Lawrence, L. J., Lee, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilhelm%2C+SN+%22Fumigants%3A+Environmental+Fate%2C+Exposure%2C+and+Analysis%22">Fumigants: Environmental Fate, Exposure, and Analysis</a>. Seiber, J. N., et al. 652, American Chemical Society. Ch. 8 (1997).</li>
<li>Adamek, E., Pawlowska-Goral, K., Bober, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+effects+of+fluoride+ions+on+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annales+Academiae+Medicae+Stetinensis%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity.</a> Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 69-85 (2005).</li>
<li>Heard, K., Hill, R. E., Cairns, C. B., Dart, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+neutralizes+fluoride+bioavailability+in+a+lethal+model+of+fluoride+poisoning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicology%3A+Clinical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Calcium neutralizes fluoride bioavailability in a lethal model of fluoride poisoning.</a> Journal of Toxicology: Clinical Toxicology. 39 (4), 349-353 (2001).</li>
<li>Sparks, S. E., Quistad, G. B., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloropicrin%3A+reactions+with+biological+thiols+and+metabolism+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Chloropicrin: reactions with biological thiols and metabolism in mice.</a> Chemical Research in Toxicology. 10 (9), 1001-1007 (1997).</li>
<li>Sparks, S. E., Quistad, G. B., Li, W., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloropicrin+dechlorination+in+relation+to+toxic+action%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Molecular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Chloropicrin dechlorination in relation to toxic action.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 14 (1), 26-32 (2000).</li>
<li>Byron, K. A., Varigos, G., Wootton, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1421657/">Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4.</a> Immunology. 77 (4), 624-626 (1992).</li>
<li>van der Poll, T., Lowry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+interleukin+8+production+by+human+whole+blood+is+enhanced+by+epinephrine+and+inhibited+by+hydrocortisone%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced interleukin 8 production by human whole blood is enhanced by epinephrine and inhibited by hydrocortisone.</a> Infection and Immunity. 65 (6), 2378-2381 (1997).</li>
<li>Solomon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline+inhibition+of+interleukin-1+in+the+corneal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (9), 2544-2557 (2000).</li>
<li>Mishra, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+oxidative+stress-induced+epigenetic+modifications+in+pancreatic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial oxidative stress-induced epigenetic modifications in pancreatic epithelial cells.</a> International Journal of Toxicology. 33 (2), 116-129 (2014).</li>
<li>Stockholm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+phenotypic+heterogeneity+in+a+clonal+cell+population+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The origin of phenotypic heterogeneity in a clonal cell population in vitro.</a> PLoS One. 2 (4), e394(2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ATCC+Animal+Cell+Culture+Guide%22">ATCC Animal Cell Culture Guide</a>. , American Type Culture Collection. Manassas, VA. (2014).</li>
<li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li>
<li>Mpindi, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+normalization+methods+on+high-throughput+screening+data+with+high+hit+rates+and+drug+testing+with+dose-response+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Impact of normalization methods on high-throughput screening data with high hit rates and drug testing with dose-response data.</a> Bioinformatics. 31 (23), 3815-3821 (2015).</li>
<li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illustration+of+SSMD%2C+z+score%2C+SSMD%2A%2C+z%2A+score%2C+and+t+statistic+for+hit+selection+in+RNAi+high-throughput+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16 (7), 775-785 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
ZASTRZEŻENIE: Poglądy wyrażone w tym artykule są poglądami autora (autorów) i nie odzwierciedlają oficjalnej polityki Departamentu Armii, Departamentu Obrony ani rządu USA. Badania te były wspierane przez umowę międzyagencyjną między NIH/NIAID a USAMRICD, a częściowo przez powołanie do Programu Uczestnictwa w Badaniach Podyplomowych w Instytucie Badań Medycznych Armii Stanów Zjednoczonych Obrony Chemicznej, administrowanym przez Oak Ridge Institute for Science and Education na mocy umowy międzyagencyjnej między Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych a USAMRMC.

W niniejszym artykule opisano nasze metody i wyniki dotyczące opracowania wysokoprzepustowego modelu przesiewowego komórek nabłonka rogówki do badania urazów HF i CP. Przedstawiamy również wyniki pierwotnego badania przesiewowego siRNA w kierunku uszkodzenia HF. Opracowanie modeli HTS do badania urazów TIC wiązało się z wieloma wyzwaniami. Metody, które udało nam się znaleźć w literaturze związanej z badaniem HF, HFA lub CP w modelach hodowli komórkowych były mało pomocne. Większość badań in vitro nad jonami flu...

Uraz oka wywołany przez toksyny jest prawdziwym zagrożeniem dla oka, ponieważ chemikalia mogą szybko spowodować znaczne uszkodzenia tkanek. Niestety, leczenie uszkodzeń rogówki wywołanych toksynami jest tylko ogólnie wspomagające, ponieważ nie istnieją żadne specyficzne terapie do leczenia tych urazów. Obecna strategia leczenia jest niespecyficzna i obejmuje przede wszystkim miejscowe leczenie terapeutyczne, takie jak lubrykanty, antybiotyki i cykloplegia, a następnie leki przeciwzapalne (np. sterydy) po ponownym nabłonku rogówki1,2. Pomimo najlepszych obecnie dostępnych opcji terapeutycznych, długoterminowe rokowanie jest na ogół złe z powodu postępującego zmętnienia rogówki i neowaskularyzacji2,3.
Modele zwierzęce były tradycyjnie używane do badania toksyczności chemicznej i zrozumienia mechanizmów urazów. Jednak badania na zwierzętach są czasochłonne i kosztowne. Podejmowane są również wysiłki na rzecz ograniczenia testów na zwierzętach. Na przykład przepisy REACH (WE 1907/2006) w Unii Europejskiej zawierają przepisy mające na celu ograniczenie testów na zwierzętach. Przepisy obejmują wymóg, aby przedsiębiorstwa dzieliły się danymi w celu uniknięcia testów na zwierzętach i uzyskania zgody Europejskiej Agencji Chemikaliów przed przeprowadzeniem proponowanych testów na zwierzętach. Zgodnie z przepisami rozporządzenia REACH testy na zwierzętach powinny być stosowane w ostateczności. Istnieje również europejskie rozporządzenie w sprawie kosmetyków (WE 1223/2009), które stopniowo zniosło testowanie kosmetyków na zwierzętach. Kiedy przeprowadzane są badania na zwierzętach, kierują się zasadami 3R (Refinement, Reduction, and Replacement), które zapewniają ramy do prowadzenia bardziej humanitarnych badań na zwierzętach, zmniejszania liczby wykorzystywanych zwierząt i stosowania alternatyw bez udziału zwierząt, jeśli to możliwe. Z tych powodów dziedzina toksykologii starała się przyjąć testy in vitro, które mogą zapewnić wgląd w molekularne mechanizmy toksyczności i mogą być wykonywane w wyższej przepustowości4. Jest to podejście toksykologiczne funkcjonalne, w którym substancje toksyczne są definiowane na podstawie ich funkcji, a nie wyłącznie na podstawie ich składu chemicznego. Idąc o krok dalej, toksykogenomika funkcjonalna stara się zrozumieć rolę, jaką określone geny odgrywają w działaniu substancji toksycznych5. Dzięki zastosowaniu technologii siRNA, badania przesiewowe w celu zbadania funkcji genów w molekularnych i komórkowych odpowiedziach na substancje toksyczne mogą być wykonywane z dużą przepustowością. siRNA to dwuniciowe cząsteczki RNA o długości 19-25 nukleotydów, które wykorzystują potranskrypcyjny szlak wyciszania genów obecny we wszystkich komórkach ssaków6. Są one wytwarzane syntetycznie i zaprojektowane tak, aby celować w określony gen. Po wprowadzeniu do komórki siRNA jest przetwarzane, a jedna nić, nić prowadząca, jest ładowana do kompleksu wyciszającego indukowanego RNA (RISC). SiRNA kieruje RISC do komplementarnego regionu w cząsteczce mRNA, a RISC degraduje mRNA. Powoduje to zmniejszenie ekspresji określonego genu. Wynikające z tego zmniejszenie ekspresji określonego genu można następnie badać w komórkach narażonych na działanie substancji toksycznych, aby ustalić funkcję tego genu w odpowiedzi komórkowej na substancję toksyczną. Takie podejście zostało wykorzystane do lepszego zrozumienia mechanizmów wrażliwości na rycynę i zależnej od AHR indukcji CYP1A17,8.
Lista Oceny Ryzyka Terroryzmu Chemicznego (CTRA) oraz lista toksycznych chemikaliów przemysłowych (TIC) zawierają wyszczególnione wybrane substancje chemiczne na podstawie ich toksyczności i potencjału do uwolnienia podczas zdarzenia terrorystycznego, wojennego lub wypadku przemysłowego9. Stosujemy podejście toksykogenomiczne oparte na wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych siRNA (HTS) do badania substancji toksycznych z listy CTRA, które zostały zidentyfikowane jako narażone na wysokie ryzyko użycia w incydencie terrorystycznym. Tradycyjna toksykologia ma na celu zrozumienie niekorzystnego wpływu, jaki chemikalia wywierają na organizmy żywe; Mamy jednak dalsze pragnienie zrozumienia mechanizmów urazu, aby pomóc w rozwoju terapii i podejść terapeutycznych, a być może także odkryć cząsteczki, które mogą być celem rozwoju terapeutycznego. Wysiłek ten pod pewnymi względami można uznać za analogiczny do zastosowania wysokoprzepustowych badań przesiewowych siRNA i testów komórkowych w procesie odkrywania leków10. Główna różnica polega na tym, że odkrywanie leków zazwyczaj poszukuje pojedynczego celu do odkrycia terapeutycznego, podczas gdy w naszym podejściu jest raczej mało prawdopodobne, aby istniał pojedynczy cel o wysokiej wartości terapeutycznej w leczeniu narażenia na toksyny. Przewidujemy, że każdy skuteczny paradygmat leczenia narażenia na toksyny będzie wymagał wieloaspektowego podejścia w celu osiągnięcia wysokiej wartości terapeutycznej, a dane toksykogenomiczne mogą stanowić istotną informację o skutecznym paradygmacie leczenia.
Automatyzacja laboratoryjna wprowadza metodologię wysokiej przepustowości do laboratoriów spoza przemysłu farmaceutycznego lub biotechnologicznego. Badania in vitro w naszym instytucie były historycznie tradycyjnymi testami o niskiej przepustowości11,12,13. W ciągu ostatnich kilku lat nasze laboratorium przestawiło się na wykorzystanie robotyki laboratoryjnej do wykonywania wysokoprzepustowych badań przesiewowych siRNA. W niniejszym artykule przedstawiono udoskonalenie modeli komórek oka oraz opracowanie metod ekspozycji in vitro na fluorowodór (HF) i chloropikrynę (CP) odpowiednich do wysokoprzepustowych badań przesiewowych siRNA. Naszym celem jest zidentyfikowanie cząsteczek, które regulują uszkodzenia komórek w odpowiedzi na te toksyny. Cele wybranej przez nas biblioteki siRNA obejmują receptory sprzężone z białkiem G, kinazy białkowe, proteazy, fosfatazy, kanały jonowe i inne potencjalnie ulegające uleczanie cele. HF i CP zostały wybrane do badania poprzez porównanie agentów z listy CTRA z raportami ToxNet dotyczącymi wypadków przemysłowych w celu znalezienia tych, którzy stwarzają największe ryzyko urazu oka poprzez ekspozycję na opary9,14. CP (wzór chemiczny Cl3CNO2, numer CAS 76-06-2) był pierwotnie używany jako gaz łzawiący w klasie WWI<sup="xref">15. Obecnie jest używany jako fumigant rolniczy i działa jako nematocyd, fungicyd i insektycyd16. Fluorowodór (HF) jest stosowany w procesach takich jak alkilowanie w rafineriach ropy naftowej i elektrochemiczne fluorowanie związków organicznych17. HF (wzór chemiczny HF, numer CAS 62778-11-4) jest gazem, ale w postaci wodnej jest kwasem fluorowodorowym (HFA, numer CAS 7664-39-3). Dlatego zdecydowaliśmy się na użycie HFA w naszych modelach ekspozycji w komórkach. Do badania wybrano dużą linię komórkową nabłonka rogówki SV40 z dużym antygenem T unieśmiertelnionym ludzkim nabłonkiem rogówki SV40-HCEC. Żywotność komórek i marker stanu zapalnego IL-8 zostały wybrane jako punkty końcowe, ponieważ cele, które są zaangażowane w uszkodzenie komórki, powinny być odzwierciedlone w śmierci komórki i odpowiedzi zapalnej. W szczególności, jeśli cel miałby odgrywać rolę ochronną w ekspozycji na toksyny, śmierć komórki i/lub produkcja cytokin zapalnych powinna wzrosnąć, gdy ekspresja docelowa jest hamowana przez siRNA. Odwrotnie byłoby w przypadku celów, które odgrywają negatywną rolę. Ponadto przewlekły stan zapalny wydaje się odgrywać rolę w patologii rogówki po ekspozycji, a interwencja w szlaki śmierci komórki może poprawić wyniki kliniczne2,18.

<table><tbody><tr><td>Platforma do przenoszenia płynów Bravo</td><td>Agilent lub odpowiednik</td><td>G5409A Wytrząsarka</td> płytkowa Bravo Agilent lub odpowiednik Opcja 159 Jednorazowa głowica końcówki Bravo 96LT Agilent lub odpowiednik Opcja 178 96-kanałowa głowica pipetująca z dużą końcówką Jednorazowa głowica <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>pipetująca</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Bravo 96ST Agilent lub odpowiednik Opcja 177 96-kanałowe pipetowanie z małą końcówką <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> jednostka główna</td></tr><tr><td>Bravo 384ST jednorazowa głowica końcówki</td><td>Agilent lub równoważna</td><td>Opcja 179</td><td>384-kanałowa głowica do pipetowania z małą końcówką</td></tr><tr><td>Bravo 96 250 &mu; L sterylne końcówki barierowe</td><td>Agilent lub odpowiednik</td><td>19477-022</td><td></td></tr><tr><td>Bravo 384 30 &mu; L sterylne końcówki barierowe</td><td>Agilent lub odpowiednik</td><td>19133-212</td><td></td></tr><tr><td>Bravo 384 70 &mu; L sterylne końcówki barierowe</td><td>Agilent lub odpowiednik</td><td>19133-212</td><td></td></tr><tr><td>Wielomodowy czytnik płytek EnSpire</td><td>Perkin Elmer lub odpowiednik</td><td>2300-0000</td><td>Detektor testowy AlphaLISA ze wzbudzeniem laserowym dużej mocy</td></tr><tr><td>IL-8 (człowiek) Zestaw detekcyjny AlphaLISA&nbsp;</td><td>Perkin Elmer lub równoważny</td><td>AL224F</td> test <td>na bazie kulek bez mycia</td></tr><tr><td>ProxiPlate-384 Plus białe mikropłytkie dołek 384</td><td>Perkin Elmer lub równoważny</td><td>6008359</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen lub równoważny</td><td>13778500</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>Opti-MEM 1 Reduced Serum</td><td>Medium Invitrogen lub równoważny</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco lub równoważny</td><td>12605010</td><td>Roztwór do odrywania komórek</td></tr><tr><td>IncuCyte Zoom</td><td>Essen Instruments lub równoważny</td><td>ESSEN BIOSCI 4473</td><td>Mikroskop automatyczny w inkubatorze</td></tr><tr><td>Chloropikryna</td><td>Trinity Produkcja lub równoważna</td><td>Nie dotyczy</td><td>Toksyczność ostra i działanie drażniące</td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli komórkowych DMEM-F12</td><td>Invitrogen lub równoważny</td><td>11330-057</td><td>Zawiera HEPES</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Invitrogen lub 1891471</td><td></td><td></td>równoważna</tr><tr><td>Ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (stopień hodowli komórkowej)</td><td>Invitrogen lub równoważny</td><td>E9644-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana insulina ludzka (klasa hodowli komórkowej)</td><td>Invitrogen lub równoważny</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny i streptomycyny (stopień czystości w hodowli komórkowej)</td><td>Invitrogen lub równoważny</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon (klasa hodowli komórkowej)</td><td>Sigma lub równoważny</td><td>H0888-10G</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza&nbsp; (klasa hodowli komórkowej)</td><td>Sigma lub odpowiednik</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp; (klasa hodowli komórkowej)</td><td>Sigma lub równoważny</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Dharmacon lub równoważny</td><td>różne</td><td></td></tr><tr><td>bromek tetrazolowy błękitu tiazolylowego</td><td>Sigma lub równoważny</td><td>M5655</td><td>Podłoże do oznaczania MTT</td></tr><tr><td>Bufor siRNA</td><td>Termiczne lub równoważne</td><td>B002000</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych</td><td>Corning lub równoważne</td><td>CLS3595</td><td></td></tr><tr><td>hodowla komórkowa T150 kolby</td><td>Corning lub odpowiednik</td><td>CLS430825</td><td></td></tr><tr><td>kaptur do hodowli komórkowych BSL-2</td><td>Nuaire lub równoważny</td><td>NU-540</td><td></td></tr><tr><td>300 mL zbiorniki robotyczne</td><td>Thermo lub odpowiednik</td><td>12-565-572&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>96 zbiorników automatyki z przegrodami</td><td>Thermo lub równoważny</td><td>1064-15-8</td><td></td></tr><tr><td>500 ml sterylne jednorazowe butelki do przechowywania</td><td>Corning lub równoważny</td><td>CLS430282</td><td></td></tr><tr><td>Zgrzewarka mikropłytkowa</td><td>Thermo lub równoważna</td><td>AB-1443A Folia</td><td></td></tr><tr><td>termozgrzewalna Microplate</td><td>Thermo lub równoważna</td><td>AB-0475</td><td></td></tr><tr><td>Kardamonina</td><td>Tocris lub odpowiednik</td><td>2509</td><td>Przeciwzapalny, stosowany jako kontrola pozytywna</td></tr><tr><td>SKF 86002&nbsp;</td><td>Tocris lub równoważny</td><td>2008</td><td>Przeciwzapalny, stosowany jako kontrola pozytywna</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma lub równoważny</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>48% kwas fluorowodorowy</td><td>Sigma lub równoważny</td><td>339261</td><td>Toksyczność i ostra</td></tr><tr><td>1000 &mu; L Pipety jednokanałowe</td><td>Rainin lub równoważne</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Pipetery jednokanałowe</td><td>Rainin lub równoważne</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; L Pipety jednokanałowe</td><td>Rainin lub równoważne</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu; L Pipetery 12-kanałowe</td><td>Rainin lub równoważne</td><td>17014497</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Pipety 12-kanałowe</td><td>Rainin lub równoważne</td><td>17013810</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; L Pipety 12-kanałowe</td><td>Rainin lub równoważne</td><td>17013808</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 1000 &mu; L</td><td>Rainin lub równoważne</td><td>17002920</td><td></td></tr><tr><td>końcówki do pipet 200 &mu; L</td><td>Rainin lub równoważny</td><td>17014294</td><td></td></tr><tr><td>końcówki do pipet 20 &mu; L</td><td>Rainin lub równoważny</td><td>17002928</td><td></td></tr><tr><td>Wyciąg chemiczny</td><td>Jamestown Metal Products</td><td>MHCO_229</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowe płytki do przechowywania próbek</td><td>Termiczne lub równoważne</td><td>262261</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma lub równoważny</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>Rurki stożkowe 50 ml</td><td>Thermo lub równoważne</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 50 ml</td><td>Corning lub równoważny</td><td>07-200-576</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 25 ml</td><td>Corning lub równoważne</td><td>07-200-575</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 10 ml</td><td>Corning lub równoważne</td><td>07-200-574</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 5 ml</td><td>Corning lub równoważne</td><td>07-200-573</td><td></td></tr><tr><td>SV40-HCEC unieśmiertelnione ludzkie komórki nabłonka rogówki</td><td>N/A N/A</td> N<td>/A</td><td>Ogniwa te nie są dostępne na rynku, ale można je uzyskać od badaczy cytowanych w artykule</td></tr><tr><td>Sceptor Handheld Automated Cell Counter</td><td>Millipore lub równoważny</td><td>PHCC20060</td><td></td></tr><tr><td>GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument</td><td>Affymetrix lub równoważny</td><td>00-0372</td><td></td></tr><tr><td>Affymetrix 24- i 96-matrycowe płytki</td><td>Affymetrix lub równoważne</td><td>901257; 901434</td><td></td></tr><tr><td>Draegger rurka HF</td><td>Draeger lub równoważna</td><td>8103251</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Draegger CP</td><td>Draeger lub równoważna</td><td>8103421</td><td></td></tr><tr><td>Pompa</td><td>Draeger lub równoważna</td><td>6400000</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste uszczelki płytkowe</td><td>Resesarch Products International lub równoważne</td><td>202502</td><td></td></tr><tr><td>Zbiorniki odczynników</td><td>VistaLab Technologies lub równoważne</td><td>3054-1000</td><td></td></tr><tr><td>Xlfit</td><td>IDBS lub równoważny</td> dodatek Excel <td>N/A</td><td>używany do automatycznego dopasowywania krzywych</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowe badania przesiewowe sirna w kierunku uszkodzenia komórek nabłonka rogówki wywołanego chloropikryną i fluorowodorem

High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury

Uraz oka wywołany przez toksyny jest prawdziwym zagrożeniem dla oka, ponieważ chemikalia mogą szybko spowodować znaczne uszkodzenia tkanek. Leczenie uszkodzenia rogówki wywołanego przez toksyny jest na ogół wspomagające, ponieważ nie istnieją żadne specyficzne terapie do leczenia tych urazów. W wysiłkach na rzecz opracowania metod leczenia i terapii w celu ochrony przed narażeniem, ważne może być zrozumienie molekularnych i komórkowych mechanizmów tych urazów. Sugerujemy, że wykorzystanie wysokoprzepustowych badań przesiewowych małego hamującego RNA (siRNA) może być ważnym narzędziem, które może pomóc w szybszym wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki. siRNA to dwuniciowe cząsteczki RNA, które mają długość 19-25 nukleotydów i wykorzystują potranskrypcyjny szlak wyciszania genów do degradacji mRNA, które mają homologię do siRNA. Wynikające z tego zmniejszenie ekspresji określonego genu można następnie badać w komórkach narażonych na działanie substancji toksycznych, aby ustalić funkcję tego genu w odpowiedzi komórkowej na substancję toksyczną. W artykule przedstawiono opracowanie i walidację modeli i metod ekspozycji in vitro w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych (HTS) uszkodzeń oczu wywołanych fluorowodorem (HF) i chloropikryną (CP). Chociaż wybraliśmy te dwie substancje toksyczne, nasze metody mają zastosowanie do badania innych substancji toksycznych z niewielkimi modyfikacjami protokołu narażenia na substancje toksyczne. Do badania wybrano dużą linię komórkową nabłonka rogówki SV40 z dużym antygenem T unieśmiertelnionym ludzkim nabłonkiem rogówki SV40-HCEC. Żywotność komórek i produkcja IL-8 zostały wybrane jako punkty końcowe w protokole badań przesiewowych. Przedstawiono kilka wyzwań związanych z opracowaniem metod ekspozycji na substancje toksyczne i hodowli komórkowych odpowiednich do badań HTS. Ustanowienie modeli HTS dla tych substancji toksycznych pozwala na dalsze badania w celu lepszego zrozumienia mechanizmu uszkodzenia i badań przesiewowych w poszukiwaniu potencjalnych metod leczenia chemicznego uszkodzenia oczu.

Opracowanie metody ekspozycji
Udoskonaliliśmy i oceniliśmy przydatność ludzkiej linii komórkowej nabłonka rogówki SV40-HCEC do zastosowania w badaniach HTS. Komórki SV40-HCEC zostały unieśmiertelnione przy użyciu dużego antygenu T SV-40 i zostały przekazane przez Dhanajaya Pala23. W procesie opracowywania metodologii ekspozycji zbadano zbyt wiele zmiennych, aby przedstawić je tutaj zwięźl...

Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe RNA hamującego małą próbę jest ważnym narzędziem, które może pomóc w szybszym wyjaśnieniu molekularnych mechanizmów chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki. W niniejszym artykule przedstawiono rozwój i walidację modeli i metod ekspozycji do wysokoprzepustowych badań przesiewowych uszkodzeń nabłonka rogówki wywołanych fluorowodorem i chloropikryną.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe SiRNA w kierunku uszkodzenia komórek nabłonka rogówki wywołanego chloropikryną i fluorowodorem

Toxicant-induced ocular injury is a true ocular emergency because chemicals have the potential to rapidly inflict significant tissue damage. Treatments ...

Ten film przedstawia nasze metody wysokoprzepustowych badań przesiewowych siRNA w modelu komórek nabłonka rogówki pod kątem toksycznego uszkodzenia. Praca ta jest ważna, ponieważ wysokoprzepustowe badania przesiewowe siRNA są opłacalną i efektywną czasowo metodą wyjaśniania szlaków i regulatorów odpowiedzi komórkowej na substancje toksyczne. Ta praca może pomóc nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób rogówka reaguje na toksyczne obelgi.Przygotować zawiesinę komórek nabłonka rogówki we wstępnie podgrzanym podłożu zawierającym 0,5 mikrograma na mililitr hydrokortyzonu w jednorazowej butelce z podłożem. Zakręć butelką, aby równomiernie zawiesić komórki, i wlej do zbiornika na gnieździe wytrząsarki orbitalnej automatycznego urządzenia do obsługi cieczy. Utrzymuj zawiesinę komórek na płycie grzewczej o temperaturze 37 stopni podczas procesu powlekania komórek.Użyj automatycznego urządzenia do obsługi cieczy, aby dodać komórki do płytek o gęstości tysiąca komórek na dołek w 70 mikrolitrach pożywki na dołku na płytce 96-dołkowej. Zasiaj co najmniej 14 96-dołkowych płytek z komórkami dla każdej płytki biblioteki siRNA, która ma być badana. Podczas procesu wysiewu należy stale uruchamiać wytrzą

high-throughput-sirna-screening-for-chloropicrin-hydrogen-fluoride

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje test fluorometryczny in vitro, który ma na celu ocenę wpływu preparatów sztucznych łez na komórkową aktywność metaboliczną komórek nabłonka rogówki przy użyciu roztworu niebieskiego Alamar na bazie resazuryny. Nietoksyczny preparat utrzymuje komórki w zdrowym, metabolicznie aktywnym stanie, ułatwiając redukcję rezazuryny do wysoce fluorescencyjnej rezorufiny.

Test alamarBlue: czuła metoda fluorometryczna do badania cytotoksycznego wpływu preparatów sztucznych łez na aktywność metaboliczną ludzkich komórek nabłonka rogówki

Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Opracowaliśmy test podrażnienia oczu, który wykorzystuje trójwymiarowy zrekonstruowany model tkanki ludzkiego nabłonka przypominającego rogówkę (RhCE). Test jest w stanie odróżnić materiały drażniące i dla oczu (kategorie 1 i 2 GHS łącznie) od tych, które nie wymagają oznakowania (kategoria bez GHS).

Test działania drażniącego na oczy (EIT) w celu identyfikacji zagrożeń związanych z substancjami chemicznymi drażniącymi oczy przy użyciu zrekonstruowanego modelu tkanki nabłonka ludzkiego przypominającego rogówkę (RhCE)

Celem badania była ocena biologicznego wpływu 15 składników dymu papierosowego przy użyciu kombinacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym opartego na impedancji i platformy opartej na badaniach przesiewowych o wysokiej zawartości (HCS) do oceny toksykologicznej in vitro. Badanie to dostarcza informacji na temat skutecznych dawek, toksyczności i sposobów działania badanych związków.

Analiza przesiewowa o wysokiej zawartości w celu oceny skutków toksykologicznych szkodliwych i potencjalnie szkodliwych składników (HPHC)

Niniejszym przedstawiamy protokół wykorzystania małego interferującego RNA specyficznego dla białka szoku cieplnego 27 (HSP27) do oceny funkcji HSP27 podczas gojenia się ran nabłonka rogówki. Interferencja RNA jest najlepszą metodą skutecznego obniżania ekspresji genów w celu zbadania funkcji białek w różnych typach komórek.

Oparte na interferencji RNA badanie funkcji białka szoku cieplnego 27 podczas gojenia się ran nabłonka rogówki

Tutaj opisujemy wysokoprzepustowy test oparty na fluorescencji, który mierzy skuteczność uszczelniania błony plazmatycznej za pomocą analiz fluorometrycznych i obrazowych w żywych komórkach. Test ten może być stosowany do badań przesiewowych leków lub genów docelowych, które regulują ponowne uszczelnianie błony plazmatycznej w komórkach ssaków.

Wysokoprzepustowy pomiar skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków

Ten protokół demonstruje jednoczesne wykrywanie reaktywnych form tlenu (ROS), żywych komórek i martwych komórek w żywych hodowlach pierwotnych z komórek powierzchni oka myszy. 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetat, jodek propidyny i barwienie Hoechst są używane do oceny ROS, martwych komórek i żywych komórek, odpowiednio, a następnie obrazowania i analizy.

Ocena uszkodzeń oksydacyjnych w pierwotnych komórkach powierzchni oka/komórkach macierzystych myszy w odpowiedzi na uszkodzenie ultrafioletem-C (UV-C)

Ten artykuł opisuje procedury używane do oceny toksyczności promieniowania UV i toksyn chemicznych na pierwotnej i nieśmiertelnej linii komórkowej.

Określanie toksyczności promieniowania UV i substancji chemicznych na pierwotne i nieśmiertelne ludzkie komórki nabłonka rogówki

Tutaj tworzone są modele zwierzęce oparte na myszach i królikach do mechanicznego i chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki, aby przebadać nowe terapie i leżący u ich podstaw mechanizm.

Modele zwierzęce ex vivo i in vivo do mechanicznych i chemicznych urazów nabłonka rogówki

Ten protokół opisuje nowatorską metodę ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu dihydroetydydy (DHE) jako sondy barwnika fluorescencyjnego przy użyciu wysokoprzepustowego podejścia przesiewowego. W protokole opisano metody oceny ilościowej wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) w trzech różnych liniach komórkowych raka wątrobowokomórkowego.

Wysokoprzepustowa ocena przesiewowa wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu barwnika fluorescencyjnego Dihydroethidium (DHE)

Hodowla narządów ex vivo rogówki świń i gojenie ran nabłonkowych dostarczają ekonomicznego, etycznego, powtarzalnego i ilościowego sposobu testowania toksyczności ocznej chemikaliów. Pomagają również w wyjaśnieniu mechanizmów leżących u podstaw regulacji nabłonka i naprawy tkanek oraz w ocenie terapii stosowanych w leczeniu keratopatii cukrzycowej i opóźnionego gojenia się ran.

Ocena toksyczności terapeutycznej i chemicznej przy użyciu rogówek świń z hodowli narządowych i gojenie się ran nabłonkowych

Poznaj metody wysokoprzepustowego badania przesiewowego siRNA w modelu uszkodzenia komórek nabłonka rogówki wywołanego toksykantami. Ta technika pozwala szybko identyfikować szlaki molekularne i regulatory odpowiedzi komórkowej.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe SiRNA w kierunku uszkodzenia komórek nabłonka rogówki wywołanego chloropikryną i fluorowodorem (Wideo) | JoVE Journal

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe SiRNA w kierunku uszkodzenia komórek nabłonka rogówki wywołanego chloropikryną i fluorowodorem

Przeglądaj więcej filmów