Procedura ściągania RNA w celu identyfikacji celów RNA długiego niekodującego RNA
10 kwietnia 2018
Ta metoda ściągania RNA pozwala na identyfikację celów RNA długiego niekodującego RNA (lncRNA). Opierając się na hybrydyzacji domowej roboty, zaprojektowanych antysensownych sond oligonukleotydowych DNA specyficznych dla tego lncRNA w odpowiednio utrwalonej tkance lub linii komórkowej, skutecznie umożliwia wychwycenie wszystkich celów RNA lncRNA.
Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie w hodowanych komórkach lub w tkance partnerów molekularnych RNA długiego niekodującego RNA, będącego przedmiotem zainteresowania. Metoda ta może pomóc w rozszyfrowaniu funkcji biologicznych długiego niekodującego RNA, dostarczając nowej istotnej wiedzy na temat regulacji RNA przez długie niekodujące RNA. Główną zaletą tej metody jest to, że można ją stosować w większości zastosowań, ponieważ ją zoptymalizowaliśmy, po pierwsze dla kilku długich niekodujących RNA, a po drugie dla hodowanych komórek i ekstraktów tkankowych.
Nasza metoda opiera się na połączeniu dwóch poprzednich metod, ChIRP, co oznacza izolację chromatyny przez oczyszczanie RNA, oraz CHART, czyli analizę hybrydyzacji wychwytywania celów RNA. Specyfika naszej metody polega na tym, że sondy oligonukleotydowe zostały zaprojektowane z wykorzystaniem bioinformatycznego modelowania drugorzędowej struktury długiego niekodującego RNA, a jej celem była identyfikacja celów RNA. Procedurę zademonstrują dwie techniki z mojego zespołu, Benedicte Boyer i Severine Guillen.
Po wyhodowaniu komórek GH4C1 zgodnie z protokołem tekstowym, należy usunąć pożywkę z płytki do hodowli komórkowej i użyć jednej objętości PBS do przepłukania komórek. Dodaj 10 mililitrów 1% PFA w PBS, aby utrwalić komórki. Następnie sieciuj komórki pod mieszaniem w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
Ugasić działanie PFA, dodając 1 mililitr glicyny molowej o stężeniu 1,25 i mieszać próbkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie wyrzuć roztwór przez aspirację i użyj 10 mililitrów PBS, aby przepłukać płytkę dwa razy przez pięć minut każdy. Następnie dodaj jeden mililitr PBS, użyj skrobaka do komórek, aby zebrać komórki i przenieś je do probówki wirówkowej.
Obracać próbkę w temperaturze 510 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Następnie usuń jak najwięcej supernatantu i przechowuj granulki w nieskończoność w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić sieciowanie tkanek, zanurz pięć miligramów świeżo uzyskanej tkanki przysadki mózgowej myszy w 10-krotnie większej objętości 1% PFA w PBS i mieszaj próbkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
Ugasić PFA, dodając 0,05 mililitra 1,25 molowego roztworu glicyny i mieszać tkankę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Odessać pożywkę i użyć 0,5 mililitra PBS do dwukrotnego przepłukania tkanki. Po usunięciu jak największej ilości supernatantu przechowuj usieciowaną tkankę przez czas nieokreślony w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Następnie należy przygotować bufor do lizy próbek bez uprzedniego rozmrażania. Użyj buforu, aby ponownie zawiesić próbki w około jednym mililitrze na 100 miligramów osadu komórkowego lub tkanki. Umieść zlizowane próbki w łaźni wodnej o temperaturze czterech stopni Celsjusza i rozpocznij serię sonikacji zoptymalizowaną zgodnie z protokołem tekstowym.
Natychmiast po sonikacji należy odwirować próbki w temperaturze 12 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Następnie przenieś supernatanty do nowych probówek. Seria sonikacji musi być zoptymalizowana, aby była wystarczająco wydajna, aby zmniejszyć lepkość DNA bez uzyskiwania innych pofragmentowanych RNA.
Aby przeprowadzić hybrydyzację na próbkach poddanych sonikacji, dodaj dwie objętości buforu hybrydyzacyjnego do probówek i odwiruj. Przenieść 20 mikrolitrów każdej próbki do probówek wirówkowych i przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Do każdej próbki dodać 100 pikomoli biotynylowanych sond oligonukleotydowych.
Następnie inkubować próbki pod umiarkowanym mieszaniem na rotatorze probówkowym w temperaturze pokojowej przez cztery do sześciu godzin. Po inkubacji dodać do próbek 50 mikrolitrów magnetycznych kulek streptawidyny uzupełnionych 200 jednostkami na mililitr roztworu inhibitora RNazy i koktajlem inhibitora proteazy 5 mikrolitrów na mililitr. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przy umiarkowanym mieszaniu na rotatorze probówki przez noc.
Następnego dnia przeprowadzić izolację RNA, umieszczając probówki na nośniku magnetycznym i wyrzucić supernatant. Następnie dodaj 900 mikrolitrów buforu do płukania do kulek i umieść probówki na rotatorze w temperaturze pokojowej na pięć minut. Następnie umieść próbki na magnesie, wyrzuć bufor i powtórz mycie pięć razy.
Po usunięciu ostatniego płukania dodaj do próbki 95 mikrolitrów buforu proteinazy K i pięć mikrolitrów po 20 miligramów na mililitr proteinazy-K. Następnie, na lodzie, rozmrozić próbki wejściowe i dodać 75 mikrolitrów buforu proteinazy K i pięć mikrolitrów proteinazy-K. Próbki inkubować w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 45 minut, a następnie w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut.
Schładzać próbki na lodzie przez trzy minuty, następnie umieścić je na magnesie i zebrać supernatant zawierający RNA i wyrzucić kulki. Użyj zestawu do oczyszczania RNA, aby oczyścić RNA. Na koniec przechowuj RNA w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza i przeprowadzaj RT i qPCR oraz konstruuj biblioteki DNA zgodnie z protokołem tekstowym.
Opierając się na zilustrowanym tutaj modelowaniu bioinformatycznym struktury drugorzędowej lncRNA, zaprojektowano sondy przeciwko dwóm lncRNA, szczurom Neat1 lub Malat1 dla komórek hodowanych GH4C1 i mysim Neat1 dla ekstraktów tkanki przysadki mózgowej. Względne wzbogacenie Neat1 lub Malat1 obliczono dla sond niespecyficznych i swoistych w stosunku do próbek wejściowych. Rysunek ten pokazuje skuteczność specyficznych sond w celu obniżenia Neat1 w linii komórkowej przysadki GH4C1 szczura oraz w ekstraktach z tkanki przysadki myszy.
Gdy protokół dla określonych oligonukleotydów lub sond SO został skierowany do Malat1, wygenerowano jedną wydajną sondę wraz z jedną nieefektywną sondą, która została odrzucona. Po pull-down RNA i RT qPCR, RNA związane z Neat1 w ekstraktach komórkowych GH4C1 były również związane z Neat1 w ekstraktach z tkanki przysadki. Rzeczywiście, po ściągnięciu RNA Neat1, stwierdzono, że Malat1 jest celem Neat1 zarówno w linii komórkowej GH4C1, jak i w ekstraktach z tkanek przysadki myszy.
Ponadto Neat1 został znacznie wzbogacony po przeprowadzeniu ekstrakcji RNA Malat1 za pomocą sondy w komórkach GH4C1. Bliski związek zidentyfikowany między dwoma lncRNA jest zgodny z potencjalną współregulacyjną rolą Neat1 i Malat1, sugerowaną przez myszy z nokautem Malat1, które wykazują różnice w ekspresji RNA Neat1. Po opanowaniu, technika ta umożliwia w ciągu dwóch lub trzech dni wychwycenie celów RNA z pożądanego długiego, niekodującego RNA.
W przypadku podejścia bioinformatycznego ważne jest, aby zaprojektować kilka sond antysensownych, a następnie eksperymentalnie porównać ich skuteczność, ponieważ wydajność sondy może być zmieniona przez preparaty lizatu komórkowego. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić sekwencjonowanie RNA o wysokiej przepustowości w celu uzyskania całego interaktomu RNA długiego niekodującego RNA będącego przedmiotem zainteresowania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uchwycić partnerów RNA długiego niekodującego RNA za pomocą wydajnych, specyficznych sond, które hybrydyzują z dostępnymi regionami długiego niekodującego RNA, zgodnie z modelowaniem bioinformatycznym jego struktury drugorzędowej.
Przegląd
Ta metoda pull-down RNA identyfikuje docelowe RNA długich niekodujących RNA (lncRNA) za pomocą specyficznych sond oligonukleotydowych DNA przeciwko antysensowi. Jest zastosowania zarówno dla hodowli komórek, jak i ekstraktów tkankowych, poprawiając nasze zrozumienie regulacji RNA.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia molekularna
- Biologia RNA
Tło
- Długie niekodujące RNA odgrywają istotne role w regulacji genów.
- Rozumienie ich partnerów RNA jest kluczowe dla rozszyfrowania ich funkcji biologicznych.
- Ta metoda łączy elementy technik ChIRP i CHART.
- Modelowanie bioinformatyczne pomaga w projektowaniu specyficznych sond dla lncRNA.
Cel badania
- Zidentyfikować docelowych partnerów molekularnych RNA dla określonych lncRNA.
- Poprawić wiedzę na temat regulacji RNA przez lncRNA.
- Optymalizacja metody nadającej się do różnych zastosowań.
Zastosowane metody
- Krosowanie komórek i tkanki z PFA.
- Sonizację w celu lizy próbek i zmniejszenia lepkości.
- Hybrydyzację próbek z biotynylowanymi sondami oligonukleotydowymi.
- Izolację i czyszczenie RNA, następnie RT i qPCR.
Główne wyniki
- Specyficzne sondy skutecznie ściągnęły lncRNA Neat1 zarówno w hodowli komórek, jak i ekstraktów tkankowych.
- Malat1 został zidentyfikowany jako docelowy dla Neat1 w obu kontekstach.
- Wykazano współregulacyjne relacje między Neat1 a Malat1.
Wnioski
- Ta metoda zapewnia niezawodne podejście do badania interakcji lncRNA.
- Wyniki sugerują istotne role regulacyjne dla Neat1 i Malat1.
- Dalsze badania mogą wyjaśnić funkcjonalne implikacje tych interakcji.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Identifying RNA interactors of long non-coding RNAs (lncRNAs) is critical for de-risking target validation in early discovery, particularly for regulatory RNAs with poorly defined mechanisms. This pull-down method enables mechanistic interrogation of lncRNA function by mapping direct and indirect RNA partners, supporting hypothesis-driven target assessment. The approach provides predictive confidence in target selection by revealing co-regulatory networks that may influence disease-relevant pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lncRNA-mediated regulatory hypotheses by identifying associated RNA molecular partners.
- Operational Value: Uses bioinformatics-guided probe design to increase specificity and reduce false-positive interactions in target validation workflows.
- Predictive Value: Supports target de-risking by revealing co-regulatory lncRNA relationships, such as Neat1-Malat1, that may influence phenotypic outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates purified RNA complexes suitable for downstream quantitative analysis, including RT-qPCR and high-throughput sequencing.
- Reproducibility: Standardized cross-linking and wash conditions improve consistency across cell and tissue models, supporting assay transferability.
- Scalability: Compatible with both cultured cells and tissue extracts, enabling flexible application across discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Demonstrated applicability in both rat cell lines and mouse tissue extracts supports cross-species target validation.
- Mechanistic De-risking: Identification of functionally relevant RNA partners, such as Malat1 as a Neat1 target, aids in prioritizing lncRNAs with regulatory impact.
- Predictive Biomarker Alignment: RNA interactome data can inform biomarker strategies when linked to disease-associated expression patterns.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification to lead optimization, providing RNA interaction data that informs target suitability and mechanistic rationale.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing RNA-based mechanisms of lncRNA action, reducing ambiguity in target function.
- Screening: Outputs purified RNA fractions amenable to quantitative profiling, enabling scalable evaluation of lncRNA interactors.
- Analytics: Enables quantitative measurement of RNA enrichment (e.g., via qPCR or sequencing) to compare specific versus control probe conditions.
- Translational Research: Demonstrated consistency between cell and tissue models supports extrapolation to preclinical systems.
- Enterprise Reuse: Standardized probe design and hybridization workflow allows reuse across multiple lncRNA targets with minimal reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic uncertainty in lncRNA target validation by defining RNA interaction networks.
- Operational Value: Standardized fixation, lysis, and hybridization steps enhance reproducibility across laboratories and sample types.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing whether a lncRNA engages in functionally relevant RNA-mediated regulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of lncRNA targets based on demonstrated interactome complexity and disease relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lncRNA bioinformatics to model secondary structure and design effective antisense probes.
- Dependent on access to sonication equipment optimized to reduce viscosity without excessive RNA fragmentation.
- Necessitates standardized cross-linking and quenching protocols to preserve native RNA-protein-RNA interactions.
- Adaptation across model systems may require validation of fixation efficiency and probe accessibility.
- Practical limitation: Probe efficiency can vary with lysate conditions, necessitating empirical testing of multiple candidates.
