Name: Ekspresja transgenu za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem w genetycznie zdefiniowanych neuronach rdzenia kręgowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Poznaj metodę wstrzyknięcia wirusa AAV do rdzenia kręgowego myszy w celu manipulacji genetycznie zdefiniowanymi neuronami. Technika umożliwia precyzyjne badanie obwodów neuronalnych związanych z percepcją bólu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Hannsowi Ulrichowi Zeilhoferowi za hojne wsparcie tej pracy. Hendrika Wildnera wsparła fundacja Olgi Mayenfisch. Dziękujemy Carmen Birchmeier za przeciwciało Lmx1b.

<ol><li>Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+downunder%3A+an+update+from+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition downunder: an update from the spinal cord.</a> Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).</li>
<li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).</li>
<li>Sandkuhler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+and+mechanisms+of+hyperalgesia+and+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia.</a> Physiol Rev. 89 (2), 707-758 (2009).</li>
<li>Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+synaptic+inhibition+in+spinal+sensory+processing+and+pain+control%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control.</a> Physiol Rev. 92 (1), 193-235 (2012).</li>
<li>Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skilled+reaching+relies+on+a+V2a+propriospinal+internal+copy+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit.</a> Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).</li>
<li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Early+RET%2B+Deep+Dorsal+Spinal+Cord+Interneurons+in+Gating+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain.</a> Neuron. 91 (6), 1413(2016).</li>
<li>Foster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation%2C+silencing%2C+and+activation+establish+glycinergic+dorsal+horn+neurons+as+key+components+of+a+spinal+gate+for+pain+and+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch.</a> Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).</li>
<li>Francois, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brainstem-Spinal+Cord+Inhibitory+Circuit+for+Mechanical+Pain+Modulation+by+GABA+and+Enkephalins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins.</a> Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).</li>
<li>Peirs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Horn+Circuits+for+Persistent+Mechanical+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain.</a> Neuron. 87 (4), 797-812 (2015).</li>
<li>Petitjean, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Horn+Parvalbumin+Neurons+Are+Gate-Keepers+of+Touch-Evoked+Pain+after+Nerve+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury.</a> Cell Rep. 13 (6), 1246-1257 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+local+and+descending+inputs+for+primary+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons.</a> J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).</li>
<li>Haenraets, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+nociceptive+circuit+analysis+with+recombinant+adeno-associated+viruses%3A+the+impact+of+serotypes+and+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters.</a> J Neurochem. , (2017).</li>
<li>Abraira, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cellular+and+Synaptic+Architecture+of+the+Mechanosensory+Dorsal+Horn%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn.</a> Cell. 168 (1-2), 295-310 (2017).</li>
<li>Wildner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analysis+of+Ptf1a-+and+Ascl1-deficient+mice+reveals+new+markers+for+distinct+dorsal+horn+interneuron+populations+contributing+to+nociceptive+reflex+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity.</a> J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).</li>
<li>Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+injection+of+a+viral+vector+for+conditional+gene+manipulation+in+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord.</a> J Vis Exp. (73), e50313(2013).</li>
<li>Kohro, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+minimally-invasive+method+for+microinjection+into+the+mouse+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn.</a> Sci Rep. 5, 14306(2015).</li>
<li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gate+control+of+mechanical+itch+by+a+subpopulation+of+spinal+cord+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons.</a> Science. 350 (6260), 550-554 (2015).</li>
<li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+spinal+circuit+for+light+touch+and+fine+motor+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control.</a> Cell. 160 (3), 503-515 (2015).</li>
<li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+spinal+circuits+transmitting+and+gating+mechanical+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain.</a> Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).</li>
<li>Gutierrez-Mecinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preprotachykinin+A+is+expressed+by+a+distinct+population+of+excitatory+neurons+in+the+mouse+superficial+spinal+dorsal+horn+including+cells+that+respond+to+noxious+and+pruritic+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli.</a> Pain. 158 (3), 440-456 (2017).</li>
<li>Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptic+boundaries+in+roof+plate+and+choroid+plexus+identified+by+intersectional+gene+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation.</a> Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).</li>
<li>Kim, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+genetically+defined+neurons+to+behavior+through+a+broadly+applicable+silencing+allele%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele.</a> Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).</li>
<li>Kim, J. C., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+fate-mapping+approaches%3A+new+means+to+explore+the+embryonic+origins+of+the+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus.</a> Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dordzeniowe wstrzyknięcie AAV może stać się potężną techniką w laboratorium badawczym, umożliwiającą analizę komórek rdzenia kręgowego z wysokim roztworem czasowym i przestrzennym. Protokół ten umożliwia transdukcję trzech głównych segmentów kręgosłupa unerwionych przez neurony czuciowe, przedłużając ich aksony obwodowe do kończyny tylnej. Przekształcenie trzech segmentów daje solidne i powtarzalne dane behawioralne. Umożliwia również badanie większego obszaru czuciowego niż jest to możliwe po pojedynczym wstrzyknięciu d...

Grzbietowy rdzeń kręgowy jest niezbędny do wymiany informacji między peryferiami ciała a mózgiem. Bodźce sensoryczne, takie jak ciepło, zimno, dotyk lub bodźce szkodliwe, są wykrywane przez wyspecjalizowane neurony obwodowe, które przekazują tę informację do neuronów rogu grzbietowego rdzenia kręgowego. W tym przypadku złożona sieć interneuronów hamujących i pobudzających moduluje i ostatecznie przekazuje informacje sensoryczne za pośrednictwem neuronów projekcyjnych rdzenia do miejsc nadrdzeniowych1,2. Obliczenia przeprowadzane przez neurony międzyrdzeniowe i projekcyjne bramkują informacje sensoryczne, określając w ten sposób, które informacje są tłumione lub przekazywane z jaką intensywnością. Zmiany w integracji bodźców sensorycznych, takie jak zmieniona równowaga między hamowaniem a pobudzeniem, mogą powodować dysfunkcje sensoryczne, takie jak nadwrażliwość lub allodynia (bolesne odczucia po normalnie niebolesnej stymulacji). Uważa się, że zmiany te są podstawową przyczyną różnych przewlekłych stanów bólowych3,4. W związku z tym obwody rdzeniowe mają duże znaczenie w przetwarzaniu sensorycznym, a co za tym idzie, w percepcji środowiska i siebie organizmu. Wraz z niedawnym pojawieniem się i połączeniem technik molekularnych, genetycznych i chirurgicznych, które pozwalają na precyzyjną manipulację genetycznie zidentyfikowanymi subpopulacjami neuronów rdzeniowych, naukowcy zaczynają teraz rozumieć podstawowe obwody rdzeniowe odpowiedzialne za przetwarzanie różnych modalności czuciowych.
Wstrzyknięcie dordzeniowe rAAV myszom typu dzikiego lub transgenicznego znacznie przyczyniło się do manipulacji, analizy i zrozumienia funkcji określonych podzbiorów neuronów rdzeniowych5,6,7,8,9,10,11. Technika ta umożliwia dostarczanie białek markerowych (takich jak białka fuzyjne GFP/GFP), białek reporterowych (takich jak GCaMP) lub białek efektorowych (takich jak toksyny bakteryjne, rodopsyna kanałowa lub receptory farmakogenetyczne) w sposób ograniczony przestrzennie do neuronów rdzeniowych. Miejscowe wstrzyknięcie zależnych od Cre rAAV do myszy transgenicznych wykazujących ekspresję rekombinazy Cre w określonym podzbiorze neuronów rdzeniowych pozwala na specyficzną analizę odpowiedniej populacji neuronów. Zastosowaliśmy tę technikę do znakowania, ablacji, hamowania lub aktywacji rdzeniowych neuronów glicynergicznych, wykazując, że są one istotną częścią bramki rdzeniowej kontrolującej transmisję bólu i swędzenia7. W tych eksperymentach dordzeniowe wstrzyknięcie zależnego od Cre rAAV do myszy GlyT2::Cre umożliwiło selektywną manipulację neuronami glicynergicznymi w lędźwiowym rdzeniu kręgowym. W ten sposób można uniknąć jednoczesnej manipulacji obwodami nadrdzeniowymi, które zawierają neurony glicynergiczne krytyczne dla przetrwania zwierzęcia.
Podczas gdy dordzeniowe wstrzyknięcie rAAV ogranicza infekcję do miejsca wstrzyknięcia, transdukcja wirusa może wystąpić nie tylko w lokalnych neuronach, ale także w neuronach, które łączą się z miejscem wstrzyknięcia za pomocą projekcji aksonalnych. Ten ostatni jest często używany do śledzenia obszarów OUN dostarczających dane neuronalne do określonego jądra w mózgu. Zakażenie wypustek aksonalnych może być jednak również czynnikiem zakłócającym, gdy określona populacja neuronów ma być badana w określonym miejscu. Aby rozwiązać te problemy, przeprowadziliśmy niedawno kompleksową analizę serotypów AAV i kaset ekspresyjnych w celu zidentyfikowania serotypów i promotorów, które można wykorzystać do zminimalizowania lub maksymalizacji transdukcji wstecznej. W kontekście tych konkretnych badań w obwodach rdzeniowych przeanalizowaliśmy zdolność różnych serotypów i promotorów do wstecznej transdukcji neuronów w zwojach korzenia grzbietowego (DRG), rdzeniu rostralnym brzuszno-przyśrodkowym (RVM) i korze somatosensorycznej12. Technika opisana w tym protokole może być zatem wykorzystana zarówno do analizy neuronów rdzeniowych w miejscu wstrzyknięcia, jak i do analizy neuronów projekcyjnych, które dostarczają dane wejściowe do miejsca wstrzyknięcia rdzenia kręgowego. W opisanym tutaj protokole wykonuje się trzy wstrzyknięcia rAAV po lewej stronie lędźwiowego rdzenia kręgowego, aby umożliwić transdukcję neuronów w trzech odcinkach lędźwiowych (L3-L5). Segmenty L3-L5 otrzymują większość bodźców czuciowych od kończyny tylnej ipsilateralnie do miejsca wstrzyknięcia. Wykazaliśmy, że funkcjonalna manipulacja genetycznie znakowanymi neuronami w L3-L5 jest wystarczająca do wywołania silnych zmian w zachowaniu, dostarczając w ten sposób funkcjonalnych dowodów na funkcję obwodu takiego genetycznie znakowanego podtypu neuronu.

<table><tbody><tr><td><mocny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ściągacz do mikropipet: DMZ-Uniwersalny-ściągacz elektrod</td><td>Zeitz</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>jednostka anestezjologiczna: Koncentrator tlenu Oxymat3</td><td>Weinmann</td><td>NA</td><td></td></tr> jednostka <tr><td>anestezjologiczna: VIP 3000 Waporyzator weterynaryjny</td><td>Midmark</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mata grzewcza: Mio Star Thermocare 100</td><td>Migros</td><td></td><td></td>717614700000</tr><tr><td>Golarka elektryczna</td><td>Mikroskop</td> chirurgiczny <td>Philips BT9290</td><td></td></tr><tr><td>(OPMI pico)</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Aparat stereotaktyczny dla małych zwierząt</td><td>Kopf</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Neurostar StereoDrive (opcjonalnie)</td><td>Neurostar</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Model 51690 Adapter kręgosłupa myszy Cunningham</td><td>Aparat Harvard</td><td>72-4811</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa PHD Ultra z nanoroztami</td><td>Aparat Harvard</td><td>70-3601</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 701 RN 10 &mu; l szklana strzykawka mikrolitrowa</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Wyjmowana igła (RN) złączka kompresyjna 1 mm</td><td>Hamilton</td><td>55750-01</td><td></td></tr><tr><td>aparatura do wiercenia w stomatologii precyzyjnej: Osada success 40</td><td>Frez sferyczny Osada</td><td>OS-40</td><td></td></tr><tr><td>, 0,5 mm</td><td>Busch</td><td>12001005B</td><td></td></tr><tr><td>elektroniczny anestezjometr von Freya</td><td>IITC</td><td>23905</td><td></td></tr>elastyczny mikroskop konfokalny <tr><td>von Frey</td><td>IITC</td><td>#7</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 Pascal</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>0.8 NA & times; 20 Obiektyw planapochromatyczny</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>1.3 NA & times; 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Narzędzia chirurgiczne</td>Rękojeść do skalpela #4, 13cm <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Adson, 1 x 2 zęby, 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs Friedmana-Pearsona, zakrzywione, miseczka 0,7 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do laminektomii Dumont #2</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyty do igieł Olsen-Hegar, ząbkowane, długość zacisku 8,5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Szczypce do drobnych drobnoustrojów #5</td><td>Narzędzia do nauki o nauce</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Materiały eksploatacyjne i chemikalia</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Cienkościenna szklana kapilara, średnica zewnętrzna 1 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW 100-3</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki (1, 5 i 20 ml)</td><td>B. Braun</td><td>(9166917V, 4606051V, 4606205V)</td><td></td></tr><tr><td>Igła skośna 26G</td><td>B. Braun</td><td>4665457</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne ostrza skalpela</td><td>B. Braun</td><td>BB523</td><td></td></tr><tr><td>Nici chirurgiczne Safil Quick+ 4/0, wchłanialne</td><td>B. Braun</td><td>C1046220</td><td></td></tr><tr><td>Nici chirurgiczne Premilene 5/0, niewchłanialne</td><td>B. Braun</td><td>C0932191</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny PBS lub sól fizjologiczna (0,9%)</td><td></td><td>BRAK DANYCH</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 70% (środek dezynfekujący)</td><td></td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór jodu (np. Braunol)</td><td>B. Braun</td><td>18380</td><td></td></tr><tr><td>Środki znieczulające (np. Attane isoflurane)</td><td>Provet</td><td>2222</td><td></td></tr><tr><td>Aldasorber</td><td>Provet</td><td>333526</td><td></td></tr><tr><td>leki przeciwbólowe (np. buprenorfina: temgesic)</td><td>Indywidualny</td><td>GTIN: 7680419310018</td><td></td></tr><tr><td>Okulistyczny maść (np. vita-pos)</td><td>Pharma medica</td><td>GTIN: 4031626710635</td><td></td></tr><tr><td>Waciki bawełniane (np. z)</td><td>IVF Hartmann</td><td>1628100</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki do twarzy (np. z)</td><td>Uehlinger AG</td><td>2015.10018</td><td></td></tr><tr><td>Preparaty mikroskopowe Superfrost plus</td><td>ThermoScientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company </td><td>Numer katalogowy</strong</td><td>>Komentarze</td></tr><tr><td>Myszy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myszy C57BL/6J (typ dziki)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID:IMSR_JAX:000664</td><td></td></tr><tr><td>Myszy Rorbtm1.1(cre)Hze/J (ROR&beta; Cre)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID:IMSR_JAX:023526</td><td></td></tr><tr><td>Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Myszy Hze/J (R26Tom)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID: IMSR_JAX:007914</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>>Wektory wirusowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV1. Zobacz materiał CB7. CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1. CAG.eGFP)</td><td>Rdzeń wektorowy Penn</td><td>AV-1-PV1963</td><td></td></tr><tr><td>AAV1. CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1. CAG.flex.eGFP)</td><td>Rdzeń wektorowy Penn</td><td>AV-1-ALL854</td><td></td></tr><tr><td>AAV1. CAG.flex.tdTomato.WPRE .bGH (AAV1. CAG.flex.tdTomato)</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-1-ALL864</td><td></td></tr><tr><td>AAV1. Akcje EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1. EF1a.flex.DTA)</td><td>Penn Vector Core</td><td>Produkcja</td><td></td>niestandardowa</tr><tr><td>AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi))</td><td>Penn Vector Core</td><td>Produkcja</td><td></td> niestandardowa</tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Plasmidy </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry</td><td>Addgene</td><td>44361</td><td></td></tr><tr><td>pAAV.EF1&alpha;. flex.hChR2(H134R)-eYFP</td><td>Addgene</td><td>20298</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</strong</td><td>>Firma</td><td>Numer katalogowy</strong</td><td>>Komentarze</td></tr><tr><td>Bacteria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MDS42</td><td>ScarabGenomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stbl3</td><td>ThermoScientific</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa<</td><td>strong>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Quiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond PC 500</td><td>Machery & Nagel</td><td>740574</td><td></td></tr><tr><td>N-tlenek klozapiny (CNO)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BBL-NS105-0025</td><td></td></tr><tr><td>sól difosforanu chlorochiny</td><td>Sigma</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>histamina</td><td>Sigma</td><td>H7125</td><td></td></tr><tr><td>Dapi</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Przeciwciała (rozcieńczenie)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anty-GFP (1:1000)</td><td>Sondy molekularne</td><td>RRID:AB_221570</td><td></td></tr><tr><td>Anty-NeuN królika (1:3000)</td><td>Abcam</td><td>RRID:AB_10711153</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-Pax2 (1: 200)</td><td>R & D Systems</td><td>RRID:AB_10889828</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Lmx1b świnka morska (1 : 10 000)</td><td>Dr Carmen Birchmeier</td><td>Muller i in. 2002</td><td></td></tr><tr><td>Anty-GFAP królika (1 : 1000)</td><td>DakoCytomation</td><td>RRID:AB_10013382</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe wyhodowane u osła (1:800)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

ekspresja transgenu za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem w genetycznie zdefiniowanych neuronach rdzenia kręgowego

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selektywna manipulacja subpopulacjami neuronów rdzeniowych została głównie osiągnięta za pomocą dwóch różnych metod: 1) Genetyka intersekcjonalna, dzięki której generowane są podwójne lub potrójne myszy transgeniczne w celu osiągnięcia selektywnej ekspresji genu reporterowego lub efektorowego (np. z locus Rosa26) w pożądanej populacji kręgosłupa. 2) Wstrzyknięcie dordzeniowe rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem zależnym od Cre (rAAV); tutaj zależne od Cre wektory AAV kodujące wybrany gen reporterowy lub efektorowy są wstrzykiwane do rdzenia kręgowego myszy eksprymujących rekombinazę Cre w pożądanej subpopulacji neuronalnej. Protokół ten opisuje, jak generować zależne od Cre wektory rAAV i jak transdukować neurony w rogu grzbietowym odcinka lędźwiowego rdzenia kręgowego L3-L5 za pomocą rAAV. Ponieważ odcinki kręgosłupa lędźwiowego L3-L5 są unerwione przez te obwodowe neurony czuciowe, które przekazują informacje sensoryczne z kończyn tylnych, spontaniczne zachowanie i reakcje na testy sensoryczne stosowane do kończyny tylnej ipsilateralnie po stronie iniekcji mogą być analizowane w celu zbadania funkcji manipulowanych neuronów w przetwarzaniu sensorycznym. Podajemy przykłady, w jaki sposób ta technika może być wykorzystana do analizy genetycznie zdefiniowanych podzbiorów neuronów rdzeniowych. Główne zalety ekspresji transgenu za pośrednictwem wirusa u myszy transgenicznych Cre w porównaniu z klasyczną ekspresją transgenu indukowaną przez mysz reporterową są następujące: 1) Różne zależne od Cre rAAV kodujące różne białka reporterowe lub efektorowe mogą być wstrzykiwane do jednej linii transgenicznej Cre, pokonując w ten sposób potrzebę tworzenia kilku wielu linii transgenicznych myszy. 2) Iniekcja dordzeniowa ogranicza manipulację komórkami wykazującymi ekspresję Cre do miejsca wstrzyknięcia i do czasu po wstrzyknięciu. Główne wady to: 1) Ekspresja genu reporterowego z rAAV jest bardziej zmienna. 2) Operacja jest wymagana w celu transdukcji neuronów rdzeniowych, które są przedmiotem zainteresowania. To, która z tych dwóch metod jest bardziej odpowiednia, zależy od populacji neuronów i pytania badawczego, którym należy się zająć.

Aby zilustrować poziomy ekspresji, jakie można uzyskać poprzez dokanałową iniekcję rAAV kodującego białko markerowe, w pierwszej kolejności wstrzyknięto AAV1.CAG.eGFP do lędźwiowego odcinka rdzenia kręgowego myszy typu dzikiego. Trzy iniekcje w odstępach około 1 mm spowodowały niemal ciągłą infekcję lędźwiowych segmentów rdzenia od L3 do L5 (Rycina 1A-C). Iniekcja wirusa na głębokości 300 &#181;m z powierzchni rdzenia prowadzi do przeważające...

Wstrzyknięcie dordzeniowe rekombinowanego rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) może być użyte do manipulowania dowolnym genetycznie znakowanym typem komórki w rdzeniu kręgowym. Tutaj opisujemy, jak transdukować neurony w rogu grzbietowym lędźwiowego rdzenia kręgowego. Technika ta umożliwia funkcjonalne badanie zmanipulowanego podtypu neuronu.

Ekspresja transgenu za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem w genetycznie zdefiniowanych neuronach rdzenia kręgowego

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Ogólnym celem dostarczania rekombinowanych wirusów adeno-zależnych drogą wewnątrzrdzeniową jest umożliwienie znakowania histologicznego i manipulacji funkcjonalnej genetycznie zdefiniowanych neuronów w tylnych rogach rdzenia kręgowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad bólem, takie jak ustalenie, które obwody neuronalne są niezbędne do percepcji różnych rodzajów bólu. Główną zaletą tej techniki jest możliwość manipulowania genetycznie znakowanymi neuronami w sposób ściśle ograniczony przestrzennie i kontrolowany czasowo.Zlokalizuj najbardziej guzową parę żeber, badając paleacyjnie wzdłuż kręgosłupa znieczurzonej myszy. Następnie wykonaj podłużne nacięcie skóry o długości od 1,5 do 2,5 cm, zaczynając od miejsca bezpośrednio rostralnie w stosunku do najbardziej guzowej pary żeber. Unieś skórę pęsetą i oddziel ją od leżącego poniżej mięśnia za pomocą nożyczek. Przez cały czas trwania zabiegu utrzymuj odsłonięte tkanki w stanie wilgotnym, używając sterylnego 0,9% roztworu chlorku sodu. Za pomocą precyzyjnej pęsety i małych nożyczek wykonaj nacięcie w następnej cienkiej warstwie błonowej, tuż przy linii środkowej, i odetnij ją od wyrostków kolc

adeno-associated-virus-mediated-transgene-expression-genetically

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Smit, R. D., et al. Celowanie w przewód korowo-rdzeniowy u noworodków szczurów za pomocą podwójnego wektora wirusowego przy użyciu połączonej chirurgii mózgu i kręgosłupa. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje ukierunkowane dostarczanie wektorów wirusowych do neuronów korowo-rdzeniowych u nowonarodzonego szczura. Protokół umożliwia precyzyjną ekspresję genów za pomocą następczych i wstecznych iniekcji wirusowych, ułatwiając badania nad regeneracją i plastycznością neuronów po urazie...

Ukierunkowane dostarczanie wirusa do neuronów korowo-rdzeniowych u nowonarodzonego szczura w celu zbadania urazu rdzenia kręgowego

W tym filmie pokazujemy dostarczanie rekombinowanego genu związanego z adeno na bazie wirusa u szczeniaka myszy. Metoda ta pomaga w badaniu ekspresji genów w docelowych komórkach.

Dostarczanie genów na podstawie rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem: technika dostarczania transgenu i ekspresji specyficznej dla serca w modelu gryzoni

Źródło: Tadokoro, T., et al. Dostarczanie wektorów subpialnego wirusa Adeno-associated 9 (AAV9) u dorosłych myszy. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia technikę iniekcji podskórnej w celu dostarczenia genu do rdzenia kręgowego u myszy. Procedura polega na odsłonięciu opony twardej, nakłuciu opony twardej i wstrzyknięciu rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) przenoszącego gen eksprymujący białko fluorescencyjne do przestrzeni subpialnej. Po wstrzyknięciu i rekonwalescencji...

Subpialne dostarczanie genów w rdzeniu kręgowym myszy w celu oceny ekspresji genów

Źródło:Pourshafie, N., et al. Ogólnoustrojowe dostarczanie mikroRNA przy użyciu rekombinowanego serotypu 9 wirusa związanego z adenowirusem w leczeniu chorób nerwowo-mięśniowych u gryzoni. J. Vis. Exp. (2018).W tym filmie mysz z rdzeniowym i opuszkowym zanikiem mięśni lub dotknięta SBMA przechodzi wstrzyknięcie do żyły ogonowej rekombinowanych wektorów AAV (wektorów związanych z adeno) przenoszących plazmid kodujący terapeutyczne mikroRNA. Wektor wytwarza mikroRNA, które wiąże się ze zmutowanym...

Wstrzykiwanie rekombinowanych wektorów związanych z adenowirusem w mysim modelu rdzeniowego i opuszkowego zaniku mięśni

Wektory wirusowe pozwalają na celową manipulację genami. Demonstrujemy metodę warunkowej ekspresji genów lub ablacji w rdzeniu kręgowym myszy, wykorzystując stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego do rogu grzbietowego, widocznego miejsca kontaktu synaptycznego między pierwotnymi aferentami somatosensorycznymi a neuronami ośrodkowego układu nerwowego.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego w celu warunkowej manipulacji genami w rdzeniu kręgowym myszy

Ten protokół przedstawia użycie iniekcji do zwoju korzenia grzbietowego (DRG) z wektorem wirusowym i równoczesnym uszkodzeniem zmiażdżenia korzenia grzbietowego u dorosłego szczura jako model do badania regeneracji aksonów czuciowych. Model ten nadaje się do badania zastosowania terapii genowej w celu promowania regeneracji aksonów czuciowych.

Iniekcja zwoju korzenia grzbietowego i uraz zmiażdżenia korzenia grzbietowego jako model regeneracji aksonów czuciowych

Celem obecnego badania było opracowanie i potwierdzenie siły działania oraz bezpieczeństwa dostarczania genów za pośrednictwem wirusa AAV9 (ang. spinal adeno-associated virus 9) za pośrednictwem metody u dorosłych myszy.

Dostarczanie wektorów subpialnego wirusa Adeno-associated 9 (AAV9) u dorosłych myszy

Omówiono metody dostarczania genów na szeroką skalę do ośrodkowego układu nerwowego u szczurów. W tym przykładzie celem jest naśladowanie choroby, która wpływa na cały rdzeń kręgowy. Rozległa transdukcja może być wykorzystana do dostarczenia białka terapeutycznego do OUN z jednorazowego podania obwodowego.

Metody i wskazówki dotyczące dożylnego podawania szczurom wirusa związanego z adenowirusem oraz ocena transdukcji ośrodkowego układu nerwowego

Ten protokół demonstruje wstrzyknięcie wstecznie transportowalnego wektora wirusowego do tkanki rdzenia kręgowego szczura. Wektor jest wychwytywany w synapsie i transportowany do ciała komórkowego docelowych neuronów. Model ten nadaje się do wstecznego śledzenia ważnych ścieżek rdzeniowych lub celowania w komórki do zastosowań w terapii genowej.

Bezpośrednie wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego uwydatnia wiele ścieżek motorycznych w rdzeniu kręgowym szczura

Ten protokół demonstruje nowatorską metodę stosowania terapii genowych do subpopulacji komórek u noworodków szczurów w wieku postnatalnym 5-10 dni poprzez wstrzyknięcie następczego modyfikatora chemogenetycznego do kory somatomotorycznej i wstecznie transportowanej rekombinazy Cre do rdzenia kręgowego szyjnego.

Celowanie w korowo-rdzeniowy przewód moczowy u noworodków szczurów za pomocą podwójnego wektora wirusowego przy użyciu połączonej chirurgii mózgu i kręgosłupa

Opisano nową technikę powszechnego dostarczania wirusa związanego z adenowirusem, która wykorzystuje infuzję wirusa podpajęczynówkowego. Metoda ta nie tylko zapewnia szeroką transdukcję mysich neuronów kory nowej w warstwach powierzchownych, ale także powoduje selektywną ekspresję transgenu w neuronach piramidowych warstwy piątej, nawet przy użyciu nieselektywnego promotora.

Rozległa transdukcja mysich neuronów kory nowej przez wstrzyknięcie subbaraczynoidu AAV2

Poznaj metodę wstrzyknięcia wirusa AAV do rdzenia kręgowego myszy w celu manipulacji genetycznie zdefiniowanymi neuronami. Technika umożliwia precyzyjne badanie obwodów neuronalnych związanych z percepcją bólu.

Ekspresja transgenu za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem w genetycznie zdefiniowanych neuronach rdzenia kręgowego

Przeglądaj więcej filmów