Ekspresja transgenu za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem w genetycznie zdefiniowanych neuronach rdzenia kręgowego

Ogólnym celem dordzeniowego dostarczania rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusem jest umożliwienie znakowania histologicznego i funkcjonalnej manipulacji genetycznie zdefiniowanych neuronów w grzbietowym rdzeniu kręgowym. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie bólu, takie jak to, które obwody neuronalne są wymagane do postrzegania różnych modalności bólu. Główną zaletą tej techniki jest to, że genetycznie znakowane neurony mogą być manipulowane w specjalnie ograniczony i kontrolowany czasowo sposób.

Zlokalizuj najbardziej ogonową parę żeber, dotykając palpacyjnie wzdłuż kręgosłupa znieczulonej myszy. Następnie wykonaj podłużne nacięcie o długości od 1,5 do 2,5 centymetra w skórze, zaczynając od samego rostralu do najbardziej ogonowej pary żeber. Podnieś skórę kleszczami i odłącz ją od leżącego poniżej mięśnia nożyczkami.

Przez cały czas trwania zabiegu należy utrzymywać odsłonięte tkanki wilgotne sterylnym 0,9% chlorkiem sodu. Za pomocą cienkich kleszczy i małych nożyczek wykonaj nacięcie w sąsiedniej cienkiej warstwie błoniastej, tuż obok linii środkowej i odetnij ją od wyrostków kolczystych. Kilka anatomicznych punktów orientacyjnych może pomóc w identyfikacji właściwych kręgów, które należy wybrać.

Tutaj opisujemy trzy alternatywy. Badanie palpacyjne wzdłuż kręgosłupa. Najbardziej ogonowa para żeber znajduje się tuż rostralnie do kręgów T13, a kość miednicy na poziomie bioder znajduje się na poziomie kręgów L6.

Alternatywnie odciągnij skórę w kierunku ogona, aby odsłonić grzebień biodrowy. Na tym samym poziomie najbardziej ogonowa para widocznych więzadeł wewnątrzpoprzecznych łączy się z wyrostkiem rdzeniowym L6. Policz wstecz w kierunku ogonowym do rostralnego, aby zidentyfikować interesujące Cię kręgi.

W przeciwnym razie zlokalizuj miejsce, w którym ścięgno wzdłuż boku kręgosłupa jest najbielsze i najbardziej przyśrodkowe. Kręgi T13 znajdują się tylko w rostralu. Odcinek lędźwiowy rdzenia kręgowego L4 znajduje się w obrębie tych kręgów.

Następnie umieść zwierzę na poduszce ze zwiniętych tkanek, aby podnieść je do zacisków rdzeniowych ramy stereotaktycznej. Wyrównaj zaciski przylegające do docelowych kręgów. Zamocuj jeden zacisk na miejscu, a następnie przytrzymaj kręgosłup za pomocą kleszczy Adson podczas mocowania drugiego zacisku.

Potwierdź prawidłowe zaciśnięcie, ostrożnie naciskając na docelowe kręgi. Następnie usuń mięsień przykolcowy powyżej kręgów będących przedmiotem zainteresowania. Najpierw wykonaj nacięcie przyśrodkowe do ścięgien równoległych do kręgosłupa.

Następnie wykonaj prostopadłe nacięcia rostralne i ogonowe do docelowych kręgów. Następnie użyj rongeurs, aby rozerwać lub odciąć mięsień przykolcowy powyżej kręgów będących przedmiotem zainteresowania. W razie potrzeby użyj kleszczy, aby usunąć tkankę pozostałą na kręgach lub nad oponą twardą w przestrzeni wewnątrzkręgowej.

Grzbietowe naczynie krwionośne powinno być teraz widoczne, wyznaczając linię środkową rdzenia kręgowego. W przypadku wstrzyknięć jednostronnych należy wykonać częściową laminektomię za pomocą precyzyjnego wiertła dentystycznego wyposażonego w kulisty nóż o średnicy 0,5 milimetra, aby bardzo ostrożnie wywiercić otwór w środku docelowej strony kręgów. Usuń wszelkie pozostałe fragmenty kości za pomocą igły ze skosem o rozmiarze 26, aby odsłonić rdzeń kręgowy.

Użyj igły, aby przebić oponę twardą w przestrzeniach wewnątrzkręgowych rostralnie i ogonowo do docelowych kręgów, około 300 mikronów bocznie do grzbietowego naczynia krwionośnego. Następnie przebij oponę twardą pod wywierconym otworem. W tym momencie płyn mózgowo-rdzeniowy powinien wydostać się z otworów, a rdzeń kręgowy powinien być lekko wybrzuszony.

Przygotować strzykawkę do wstrzykiwań, najpierw montując szklaną kapilarnę na mikrolitrowej strzykawce. Mocno dokręć nakrętkę, aby zapewnić mocne i bezpieczne dopasowanie. Napełnić strzykawkę mikrolitrową sterylną wodą destylowaną, a następnie wcisnąć tłok.

Jeśli woda nie jest łatwo usuwana z końcówki, mikropipeta jest prawdopodobnie zablokowana i należy ją wymienić. Zamontować strzykawkę na mikromanipulatorze podłączonym do elektronicznie sterowanego mikroiniektora. Następnie za pomocą mikrowstrzykiwacza należy pobrać około jednego mikrolitra powietrza w celu oddzielenia wody od wirusa.

Następnie odpipetować 2,5 mikrolitra kropli rozcieńczonego roztworu wirusa na kawałek folii parafinowej. Ostrożnie wsunąć końcówkę mikropipety do kropli za pomocą ramki sterotaksyjnej i wciągnąć ją do mikropipety. Następnie naciśnij dozowanie, aż na końcówce pojawi się kropla roztworu wirusa.

Wyjąć strzykawkę i za pomocą pisaka oznaczyć mikropipetę skalą w celu monitorowania dozowanej objętości. Użyj ramienia stereotaktycznego, aby przesunąć końcówkę mikropipety nad jednym z otworów w oponie twardej, a następnie w dół, aż na powierzchni odsłoniętego rdzenia kręgowego pojawi się lekkie wgłębienie. Aby skierować wstrzyknięcie do rogu grzbietowego kręgosłupa, należy przesunąć końcówkę w dół na głębokość 500 mikronów w odstępach co 100 mikronów, a następnie w górę o 200 mikronów, aby umożliwić mechaniczną stabilizację tkanki.

Ostateczna głębokość końcówki wynosi 300 mikronów. Po zaprogramowaniu pompy tak, aby wstrzykiwała 300 nanolitrów z prędkością wstrzykiwania 50 nanolitrów na minutę, naciśnij przycisk start, aby rozpocząć infuzję. Po zakończeniu wstrzykiwania należy sprawdzić skalę na mikropipecie, aby zobaczyć, czy poziom wirusa spadł.

Pozostaw mikropipetę na miejscu przez dodatkowe trzy minuty, aby ciśnienie się wyrównało. Po trzech minutach powoli wycofać mikropipetę, a następnie powtórzyć procedurę dla pozostałych dwóch miejsc wstrzyknięcia. Po ostatnim wstrzyknięciu należy usunąć zaciski kręgosłupa i poduszkę znajdującą się pod myszą.

Zamknij warstwy nacięć przerwanymi szwami, zszywając powierzchowne warstwy tkanek szwami wchłanialnymi, a skórę szwami niewchłanialnymi. Nałóż jodowy środek dezynfekujący na zszytą ranę. Przerwij znieczulenie i pozostaw zwierzę na macie grzewczej, aż dojdzie do siebie, zanim wróci do swojej domowej klatki.

Tkanka rdzenia kręgowego w miejscu wstrzyknięcia ma być zbadana na końcu doświadczenia. Jest to konieczne, aby zweryfikować powodzenie wstrzyknięcia i transdukcji oraz wykluczyć nadmierne uszkodzenie tkanek w wyniku operacji. Aby zilustrować poziomy ekspresji, które można uzyskać przez dordzeniowe wstrzyknięcie rekombinowanego AAV, wirus kodujący białko fluorescencyjne eGFP został wstrzyknięty do lędźwiowego rdzenia kręgowego myszy typu dzikiego.

Trzy zastrzyki w odstępie około jednego milimetra powodowały prawie ciągłą infekcję odcinka lędźwiowego kręgosłupa od L3 do L5. Wstrzyknięcie wirusa na głębokość 300 mikronów od powierzchni rdzenia prowadzi do dominującego zakażenia komórek rogu grzbietowego rdzenia kręgowego. Jednak zainfekowane komórki można również znaleźć w rogu brzusznym. Zależny od cre wektor elastyczny eksprymujący eGFP został wstrzyknięty do rdzenia kręgowego transgenicznych myszy GlyT2: Cre.

Spowodowało to bardziej ograniczoną ekspresję eGFP odzwierciedlającą rozmieszczenie neuronów GLYT2 dodatnich. Postępowanie zgodnie z tym protokołem pozwoli na celowanie w trzy kolejne segmenty kręgosłupa. Stwierdziliśmy, że jest to wystarczające do uzyskania solidnych wyników zachowania.

Technika ta pozwoli na badanie funkcji określonych populacji neuronów i komórek oraz ścieżek sensorycznych.