Name: Ekspresja transgenu za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem w genetycznie zdefiniowanych neuronach rdzenia kręgowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Poznaj metodę wstrzyknięcia wirusa AAV do rdzenia kręgowego myszy w celu manipulacji genetycznie zdefiniowanymi neuronami. Technika umożliwia precyzyjne badanie obwodów neuronalnych związanych z percepcją bólu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Hannsowi Ulrichowi Zeilhoferowi za hojne wsparcie tej pracy. Hendrika Wildnera wsparła fundacja Olgi Mayenfisch. Dziękujemy Carmen Birchmeier za przeciwciało Lmx1b.

<ol><li>Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+downunder%3A+an+update+from+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition downunder: an update from the spinal cord.</a> Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).</li>
<li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).</li>
<li>Sandkuhler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+and+mechanisms+of+hyperalgesia+and+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia.</a> Physiol Rev. 89 (2), 707-758 (2009).</li>
<li>Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+synaptic+inhibition+in+spinal+sensory+processing+and+pain+control%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control.</a> Physiol Rev. 92 (1), 193-235 (2012).</li>
<li>Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skilled+reaching+relies+on+a+V2a+propriospinal+internal+copy+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit.</a> Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).</li>
<li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Early+RET%2B+Deep+Dorsal+Spinal+Cord+Interneurons+in+Gating+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain.</a> Neuron. 91 (6), 1413(2016).</li>
<li>Foster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation%2C+silencing%2C+and+activation+establish+glycinergic+dorsal+horn+neurons+as+key+components+of+a+spinal+gate+for+pain+and+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch.</a> Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).</li>
<li>Francois, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brainstem-Spinal+Cord+Inhibitory+Circuit+for+Mechanical+Pain+Modulation+by+GABA+and+Enkephalins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins.</a> Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).</li>
<li>Peirs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Horn+Circuits+for+Persistent+Mechanical+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain.</a> Neuron. 87 (4), 797-812 (2015).</li>
<li>Petitjean, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Horn+Parvalbumin+Neurons+Are+Gate-Keepers+of+Touch-Evoked+Pain+after+Nerve+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury.</a> Cell Rep. 13 (6), 1246-1257 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+local+and+descending+inputs+for+primary+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons.</a> J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).</li>
<li>Haenraets, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+nociceptive+circuit+analysis+with+recombinant+adeno-associated+viruses%3A+the+impact+of+serotypes+and+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters.</a> J Neurochem. , (2017).</li>
<li>Abraira, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cellular+and+Synaptic+Architecture+of+the+Mechanosensory+Dorsal+Horn%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn.</a> Cell. 168 (1-2), 295-310 (2017).</li>
<li>Wildner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analysis+of+Ptf1a-+and+Ascl1-deficient+mice+reveals+new+markers+for+distinct+dorsal+horn+interneuron+populations+contributing+to+nociceptive+reflex+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity.</a> J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).</li>
<li>Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+injection+of+a+viral+vector+for+conditional+gene+manipulation+in+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord.</a> J Vis Exp. (73), e50313(2013).</li>
<li>Kohro, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+minimally-invasive+method+for+microinjection+into+the+mouse+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn.</a> Sci Rep. 5, 14306(2015).</li>
<li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gate+control+of+mechanical+itch+by+a+subpopulation+of+spinal+cord+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons.</a> Science. 350 (6260), 550-554 (2015).</li>
<li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+spinal+circuit+for+light+touch+and+fine+motor+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control.</a> Cell. 160 (3), 503-515 (2015).</li>
<li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+spinal+circuits+transmitting+and+gating+mechanical+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain.</a> Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).</li>
<li>Gutierrez-Mecinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preprotachykinin+A+is+expressed+by+a+distinct+population+of+excitatory+neurons+in+the+mouse+superficial+spinal+dorsal+horn+including+cells+that+respond+to+noxious+and+pruritic+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli.</a> Pain. 158 (3), 440-456 (2017).</li>
<li>Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptic+boundaries+in+roof+plate+and+choroid+plexus+identified+by+intersectional+gene+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation.</a> Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).</li>
<li>Kim, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+genetically+defined+neurons+to+behavior+through+a+broadly+applicable+silencing+allele%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele.</a> Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).</li>
<li>Kim, J. C., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+fate-mapping+approaches%3A+new+means+to+explore+the+embryonic+origins+of+the+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus.</a> Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dordzeniowe wstrzyknięcie AAV może stać się potężną techniką w laboratorium badawczym, umożliwiającą analizę komórek rdzenia kręgowego z wysokim roztworem czasowym i przestrzennym. Protokół ten umożliwia transdukcję trzech głównych segmentów kręgosłupa unerwionych przez neurony czuciowe, przedłużając ich aksony obwodowe do kończyny tylnej. Przekształcenie trzech segmentów daje solidne i powtarzalne dane behawioralne. Umożliwia również badanie większego obszaru czuciowego niż jest to możliwe po pojedynczym wstrzyknięciu d...

Grzbietowy rdzeń kręgowy jest niezbędny do wymiany informacji między peryferiami ciała a mózgiem. Bodźce sensoryczne, takie jak ciepło, zimno, dotyk lub bodźce szkodliwe, są wykrywane przez wyspecjalizowane neurony obwodowe, które przekazują tę informację do neuronów rogu grzbietowego rdzenia kręgowego. W tym przypadku złożona sieć interneuronów hamujących i pobudzających moduluje i ostatecznie przekazuje informacje sensoryczne za pośrednictwem neuronów projekcyjnych rdzenia do miejsc nadrdzeniowych1,2. Obliczenia przeprowadzane przez neurony międzyrdzeniowe i projekcyjne bramkują informacje sensoryczne, określając w ten sposób, które informacje są tłumione lub przekazywane z jaką intensywnością. Zmiany w integracji bodźców sensorycznych, takie jak zmieniona równowaga między hamowaniem a pobudzeniem, mogą powodować dysfunkcje sensoryczne, takie jak nadwrażliwość lub allodynia (bolesne odczucia po normalnie niebolesnej stymulacji). Uważa się, że zmiany te są podstawową przyczyną różnych przewlekłych stanów bólowych3,4. W związku z tym obwody rdzeniowe mają duże znaczenie w przetwarzaniu sensorycznym, a co za tym idzie, w percepcji środowiska i siebie organizmu. Wraz z niedawnym pojawieniem się i połączeniem technik molekularnych, genetycznych i chirurgicznych, które pozwalają na precyzyjną manipulację genetycznie zidentyfikowanymi subpopulacjami neuronów rdzeniowych, naukowcy zaczynają teraz rozumieć podstawowe obwody rdzeniowe odpowiedzialne za przetwarzanie różnych modalności czuciowych.
Wstrzyknięcie dordzeniowe rAAV myszom typu dzikiego lub transgenicznego znacznie przyczyniło się do manipulacji, analizy i zrozumienia funkcji określonych podzbiorów neuronów rdzeniowych5,6,7,8,9,10,11. Technika ta umożliwia dostarczanie białek markerowych (takich jak białka fuzyjne GFP/GFP), białek reporterowych (takich jak GCaMP) lub białek efektorowych (takich jak toksyny bakteryjne, rodopsyna kanałowa lub receptory farmakogenetyczne) w sposób ograniczony przestrzennie do neuronów rdzeniowych. Miejscowe wstrzyknięcie zależnych od Cre rAAV do myszy transgenicznych wykazujących ekspresję rekombinazy Cre w określonym podzbiorze neuronów rdzeniowych pozwala na specyficzną analizę odpowiedniej populacji neuronów. Zastosowaliśmy tę technikę do znakowania, ablacji, hamowania lub aktywacji rdzeniowych neuronów glicynergicznych, wykazując, że są one istotną częścią bramki rdzeniowej kontrolującej transmisję bólu i swędzenia7. W tych eksperymentach dordzeniowe wstrzyknięcie zależnego od Cre rAAV do myszy GlyT2::Cre umożliwiło selektywną manipulację neuronami glicynergicznymi w lędźwiowym rdzeniu kręgowym. W ten sposób można uniknąć jednoczesnej manipulacji obwodami nadrdzeniowymi, które zawierają neurony glicynergiczne krytyczne dla przetrwania zwierzęcia.
Podczas gdy dordzeniowe wstrzyknięcie rAAV ogranicza infekcję do miejsca wstrzyknięcia, transdukcja wirusa może wystąpić nie tylko w lokalnych neuronach, ale także w neuronach, które łączą się z miejscem wstrzyknięcia za pomocą projekcji aksonalnych. Ten ostatni jest często używany do śledzenia obszarów OUN dostarczających dane neuronalne do określonego jądra w mózgu. Zakażenie wypustek aksonalnych może być jednak również czynnikiem zakłócającym, gdy określona populacja neuronów ma być badana w określonym miejscu. Aby rozwiązać te problemy, przeprowadziliśmy niedawno kompleksową analizę serotypów AAV i kaset ekspresyjnych w celu zidentyfikowania serotypów i promotorów, które można wykorzystać do zminimalizowania lub maksymalizacji transdukcji wstecznej. W kontekście tych konkretnych badań w obwodach rdzeniowych przeanalizowaliśmy zdolność różnych serotypów i promotorów do wstecznej transdukcji neuronów w zwojach korzenia grzbietowego (DRG), rdzeniu rostralnym brzuszno-przyśrodkowym (RVM) i korze somatosensorycznej12. Technika opisana w tym protokole może być zatem wykorzystana zarówno do analizy neuronów rdzeniowych w miejscu wstrzyknięcia, jak i do analizy neuronów projekcyjnych, które dostarczają dane wejściowe do miejsca wstrzyknięcia rdzenia kręgowego. W opisanym tutaj protokole wykonuje się trzy wstrzyknięcia rAAV po lewej stronie lędźwiowego rdzenia kręgowego, aby umożliwić transdukcję neuronów w trzech odcinkach lędźwiowych (L3-L5). Segmenty L3-L5 otrzymują większość bodźców czuciowych od kończyny tylnej ipsilateralnie do miejsca wstrzyknięcia. Wykazaliśmy, że funkcjonalna manipulacja genetycznie znakowanymi neuronami w L3-L5 jest wystarczająca do wywołania silnych zmian w zachowaniu, dostarczając w ten sposób funkcjonalnych dowodów na funkcję obwodu takiego genetycznie znakowanego podtypu neuronu.

<table><tbody><tr><td><mocny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ściągacz do mikropipet: DMZ-Uniwersalny-ściągacz elektrod</td><td>Zeitz</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>jednostka anestezjologiczna: Koncentrator tlenu Oxymat3</td><td>Weinmann</td><td>NA</td><td></td></tr> jednostka <tr><td>anestezjologiczna: VIP 3000 Waporyzator weterynaryjny</td><td>Midmark</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mata grzewcza: Mio Star Thermocare 100</td><td>Migros</td><td></td><td></td>717614700000</tr><tr><td>Golarka elektryczna</td><td>Mikroskop</td> chirurgiczny <td>Philips BT9290</td><td></td></tr><tr><td>(OPMI pico)</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Aparat stereotaktyczny dla małych zwierząt</td><td>Kopf</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Neurostar StereoDrive (opcjonalnie)</td><td>Neurostar</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Model 51690 Adapter kręgosłupa myszy Cunningham</td><td>Aparat Harvard</td><td>72-4811</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa PHD Ultra z nanoroztami</td><td>Aparat Harvard</td><td>70-3601</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 701 RN 10 &mu; l szklana strzykawka mikrolitrowa</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Wyjmowana igła (RN) złączka kompresyjna 1 mm</td><td>Hamilton</td><td>55750-01</td><td></td></tr><tr><td>aparatura do wiercenia w stomatologii precyzyjnej: Osada success 40</td><td>Frez sferyczny Osada</td><td>OS-40</td><td></td></tr><tr><td>, 0,5 mm</td><td>Busch</td><td>12001005B</td><td></td></tr><tr><td>elektroniczny anestezjometr von Freya</td><td>IITC</td><td>23905</td><td></td></tr>elastyczny mikroskop konfokalny <tr><td>von Frey</td><td>IITC</td><td>#7</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 Pascal</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>0.8 NA & times; 20 Obiektyw planapochromatyczny</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>1.3 NA & times; 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Narzędzia chirurgiczne</td>Rękojeść do skalpela #4, 13cm <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Adson, 1 x 2 zęby, 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs Friedmana-Pearsona, zakrzywione, miseczka 0,7 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do laminektomii Dumont #2</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyty do igieł Olsen-Hegar, ząbkowane, długość zacisku 8,5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Szczypce do drobnych drobnoustrojów #5</td><td>Narzędzia do nauki o nauce</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Materiały eksploatacyjne i chemikalia</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Cienkościenna szklana kapilara, średnica zewnętrzna 1 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW 100-3</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki (1, 5 i 20 ml)</td><td>B. Braun</td><td>(9166917V, 4606051V, 4606205V)</td><td></td></tr><tr><td>Igła skośna 26G</td><td>B. Braun</td><td>4665457</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne ostrza skalpela</td><td>B. Braun</td><td>BB523</td><td></td></tr><tr><td>Nici chirurgiczne Safil Quick+ 4/0, wchłanialne</td><td>B. Braun</td><td>C1046220</td><td></td></tr><tr><td>Nici chirurgiczne Premilene 5/0, niewchłanialne</td><td>B. Braun</td><td>C0932191</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny PBS lub sól fizjologiczna (0,9%)</td><td></td><td>BRAK DANYCH</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 70% (środek dezynfekujący)</td><td></td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór jodu (np. Braunol)</td><td>B. Braun</td><td>18380</td><td></td></tr><tr><td>Środki znieczulające (np. Attane isoflurane)</td><td>Provet</td><td>2222</td><td></td></tr><tr><td>Aldasorber</td><td>Provet</td><td>333526</td><td></td></tr><tr><td>leki przeciwbólowe (np. buprenorfina: temgesic)</td><td>Indywidualny</td><td>GTIN: 7680419310018</td><td></td></tr><tr><td>Okulistyczny maść (np. vita-pos)</td><td>Pharma medica</td><td>GTIN: 4031626710635</td><td></td></tr><tr><td>Waciki bawełniane (np. z)</td><td>IVF Hartmann</td><td>1628100</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki do twarzy (np. z)</td><td>Uehlinger AG</td><td>2015.10018</td><td></td></tr><tr><td>Preparaty mikroskopowe Superfrost plus</td><td>ThermoScientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company </td><td>Numer katalogowy</strong</td><td>>Komentarze</td></tr><tr><td>Myszy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myszy C57BL/6J (typ dziki)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID:IMSR_JAX:000664</td><td></td></tr><tr><td>Myszy Rorbtm1.1(cre)Hze/J (ROR&beta; Cre)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID:IMSR_JAX:023526</td><td></td></tr><tr><td>Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Myszy Hze/J (R26Tom)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID: IMSR_JAX:007914</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>>Wektory wirusowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV1. Zobacz materiał CB7. CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1. CAG.eGFP)</td><td>Rdzeń wektorowy Penn</td><td>AV-1-PV1963</td><td></td></tr><tr><td>AAV1. CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1. CAG.flex.eGFP)</td><td>Rdzeń wektorowy Penn</td><td>AV-1-ALL854</td><td></td></tr><tr><td>AAV1. CAG.flex.tdTomato.WPRE .bGH (AAV1. CAG.flex.tdTomato)</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-1-ALL864</td><td></td></tr><tr><td>AAV1. Akcje EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1. EF1a.flex.DTA)</td><td>Penn Vector Core</td><td>Produkcja</td><td></td>niestandardowa</tr><tr><td>AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi))</td><td>Penn Vector Core</td><td>Produkcja</td><td></td> niestandardowa</tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Plasmidy </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry</td><td>Addgene</td><td>44361</td><td></td></tr><tr><td>pAAV.EF1&alpha;. flex.hChR2(H134R)-eYFP</td><td>Addgene</td><td>20298</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</strong</td><td>>Firma</td><td>Numer katalogowy</strong</td><td>>Komentarze</td></tr><tr><td>Bacteria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MDS42</td><td>ScarabGenomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stbl3</td><td>ThermoScientific</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa<</td><td>strong>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Quiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond PC 500</td><td>Machery & Nagel</td><td>740574</td><td></td></tr><tr><td>N-tlenek klozapiny (CNO)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BBL-NS105-0025</td><td></td></tr><tr><td>sól difosforanu chlorochiny</td><td>Sigma</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>histamina</td><td>Sigma</td><td>H7125</td><td></td></tr><tr><td>Dapi</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Przeciwciała (rozcieńczenie)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anty-GFP (1:1000)</td><td>Sondy molekularne</td><td>RRID:AB_221570</td><td></td></tr><tr><td>Anty-NeuN królika (1:3000)</td><td>Abcam</td><td>RRID:AB_10711153</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-Pax2 (1: 200)</td><td>R & D Systems</td><td>RRID:AB_10889828</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Lmx1b świnka morska (1 : 10 000)</td><td>Dr Carmen Birchmeier</td><td>Muller i in. 2002</td><td></td></tr><tr><td>Anty-GFAP królika (1 : 1000)</td><td>DakoCytomation</td><td>RRID:AB_10013382</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe wyhodowane u osła (1:800)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

ekspresja transgenu za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem w genetycznie zdefiniowanych neuronach rdzenia kręgowego

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selektywna manipulacja subpopulacjami neuronów rdzeniowych została głównie osiągnięta za pomocą dwóch różnych metod: 1) Genetyka intersekcjonalna, dzięki której generowane są podwójne lub potrójne myszy transgeniczne w celu osiągnięcia selektywnej ekspresji genu reporterowego lub efektorowego (np. z locus Rosa26) w pożądanej populacji kręgosłupa. 2) Wstrzyknięcie dordzeniowe rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem zależnym od Cre (rAAV); tutaj zależne od Cre wektory AAV kodujące wybrany gen reporterowy lub efektorowy są wstrzykiwane do rdzenia kręgowego myszy eksprymujących rekombinazę Cre w pożądanej subpopulacji neuronalnej. Protokół ten opisuje, jak generować zależne od Cre wektory rAAV i jak transdukować neurony w rogu grzbietowym odcinka lędźwiowego rdzenia kręgowego L3-L5 za pomocą rAAV. Ponieważ odcinki kręgosłupa lędźwiowego L3-L5 są unerwione przez te obwodowe neurony czuciowe, które przekazują informacje sensoryczne z kończyn tylnych, spontaniczne zachowanie i reakcje na testy sensoryczne stosowane do kończyny tylnej ipsilateralnie po stronie iniekcji mogą być analizowane w celu zbadania funkcji manipulowanych neuronów w przetwarzaniu sensorycznym. Podajemy przykłady, w jaki sposób ta technika może być wykorzystana do analizy genetycznie zdefiniowanych podzbiorów neuronów rdzeniowych. Główne zalety ekspresji transgenu za pośrednictwem wirusa u myszy transgenicznych Cre w porównaniu z klasyczną ekspresją transgenu indukowaną przez mysz reporterową są następujące: 1) Różne zależne od Cre rAAV kodujące różne białka reporterowe lub efektorowe mogą być wstrzykiwane do jednej linii transgenicznej Cre, pokonując w ten sposób potrzebę tworzenia kilku wielu linii transgenicznych myszy. 2) Iniekcja dordzeniowa ogranicza manipulację komórkami wykazującymi ekspresję Cre do miejsca wstrzyknięcia i do czasu po wstrzyknięciu. Główne wady to: 1) Ekspresja genu reporterowego z rAAV jest bardziej zmienna. 2) Operacja jest wymagana w celu transdukcji neuronów rdzeniowych, które są przedmiotem zainteresowania. To, która z tych dwóch metod jest bardziej odpowiednia, zależy od populacji neuronów i pytania badawczego, którym należy się zająć.

Aby zilustrować poziomy ekspresji, jakie można uzyskać poprzez wewnątrzrdzeniowe wstrzyknięcie rAAV kodującego białko markerowe, w pierwszej kolejności wstrzyknięto AAV1.CAG.eGFP do lędźwiowego odcinka rdzenia kręgowego myszy typu dzikiego. Trzy iniekcje wykonane w odstępach około 1 mm doprowadziły do niemal ciągłej infekcji lędźwiowych segmentów rdzenia od L3 do L5 (Rysunek 1A-C). Iniekcja wirusa na głębokości 300 µm z powierzchni rdzenia pr...

Wstrzyknięcie dordzeniowe rekombinowanego rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) może być użyte do manipulowania dowolnym genetycznie znakowanym typem komórki w rdzeniu kręgowym. Tutaj opisujemy, jak transdukować neurony w rogu grzbietowym lędźwiowego rdzenia kręgowego. Technika ta umożliwia funkcjonalne badanie zmanipulowanego podtypu neuronu.

Ekspresja transgenu za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem w genetycznie zdefiniowanych neuronach rdzenia kręgowego

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Ogólnym celem dordzeniowego dostarczania rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusem jest umożliwienie znakowania histologicznego i funkcjonalnej manipulacji genetycznie zdefiniowanych neuronów w grzbietowym rdzeniu kręgowym. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie bólu, takie jak to, które obwody neuronalne są wymagane do postrzegania różnych modalności bólu. Główną zaletą tej techniki jest to, że genetycznie znakowane neurony mogą być manipulowane w specjalnie ograniczony i kontrolowany czasowo sposób.Zlokalizuj najbardziej ogonową parę żeber, dotykając palpacyjnie wzdłuż kręgosłupa znieczulonej myszy. Następnie wykonaj podłużne nacięcie o długości od 1,5 do 2,5 centymetra w skórze, zaczynając od samego rostralu do najbardziej ogonowej pary żeber. Podnieś skórę kleszczami i odłącz ją od leżącego poniżej mięśnia nożyczkami.Przez cały czas trwania zabiegu należy utrzymywać odsłonięte tkanki wilgotne sterylnym 0,9% chlorkiem sodu. Za pomocą cienkich kleszczy i małych nożyczek wykonaj nacięcie w sąsiedniej cienkiej warstwie błoniastej, tuż obok linii środkowej i odetnij ją od wyrostków kolczystych. Kilka anatomicznych punktów orientacyjnych może pomóc w identyfikacji właściwych kręgów, które należy wybrać.Tutaj opisujemy trzy alternatywy. Badanie palpacyjne wzdłuż kręgosłupa. Najbardziej ogonowa para żeber znajduje się tuż rostralnie do kręgów T13, a kość miednicy na poziomie bioder znajduje się na poziomie kręgów L6.Alternatywnie odciągnij skórę w kierunku ogona, aby odsłonić grzebień biodrowy. Na tym samym poziomie najbardziej ogonowa para widocznych więzadeł wewnątrzpoprzecznych łączy się z wyrostkiem rdzeniowym L6. Policz wstecz w kierunku ogonowym do rostralnego, aby zidentyfikować interesujące Cię kręgi.W przeciwnym razie zlokalizuj miejsce, w którym ścięgno wzdłuż boku kręgosłupa jest najbielsze i najbardziej przyśrodkowe. Kręgi T13 znajdują się tylko w rostralu. Odcinek lędźwiowy rdzenia kręgowego L4 znajduje się w obrębie tych kręgów.Następnie umieść zwierzę na poduszce ze zwiniętych tkanek, aby podnieść je do zacisków rdzeniowych ramy stereotaktycznej. Wyrównaj zaciski przylegające do docelowych kręgów. Zamocuj jeden zacisk na miejscu, a następnie przytrzymaj kręgosłup za pomocą kleszczy Adson podczas mocowania drugiego zacisku.Potwierdź prawidłowe zaciśnięcie, ostrożnie naciskając na docelowe kręgi. Następnie usuń mięsień przykolcowy powyżej kręgów będących przedmiotem zainteresowania. Najpierw wykonaj nacięcie przyśrodkowe do ścięgien równoległych do kręgosłupa.Następnie wykonaj prostopadłe nacięcia rostralne i ogonowe do docelowych kręgów. Następnie użyj rongeurs, aby rozerwać lub odciąć mięsień przykolcowy powyżej kręgów będących przedmiotem zainteresowania. W razie potrzeby użyj kleszczy, aby usunąć tkankę pozostałą na kręgach lub nad oponą twardą w przestrzeni wewnątrzkręgowej.Grzbietowe naczynie krwionośne powinno być teraz widoczne, wyznaczając linię środkową rdzenia kręgowego. W przypadku wstrzyknięć jednostronnych należy wykonać częściową laminektomię za pomocą precyzyjnego wiertła dentystycznego wyposażonego w kulisty nóż o średnicy 0,5 milimetra, aby bardzo ostrożnie wywiercić otwór w środku docelowej strony kręgów. Usuń wszelkie pozostałe fragmenty kości za pomocą igły ze skosem o rozmiarze 26, aby odsłonić rdzeń kręgowy.Użyj igły, aby przebić oponę twardą w przestrzeniach wewnątrzkręgowych rostralnie i ogonowo do docelowych kręgów, około 300 mikronów bocznie do grzbietowego naczynia krwionośnego. Następnie przebij oponę twardą pod wywierconym otworem. W tym momencie płyn mózgowo-rdzeniowy powinien wydostać się z otworów, a rdzeń kręgowy powinien być lekko wybrzuszony.Przygotować strzykawkę do wstrzykiwań, najpierw montując szklaną kapilarnę na mikrolitrowej strzykawce. Mocno dokręć nakrętkę, aby zapewnić mocne i bezpieczne dopasowanie. Napełnić strzykawkę mikrolitrową sterylną wodą destylowaną, a następnie wcisnąć tłok.Jeśli woda nie jest łatwo usuwana z końcówki, mikropipeta jest prawdopodobnie zablokowana i należy ją wymienić. Zamontować strzykawkę na mikromanipulatorze podłączonym do elektronicznie sterowanego mikroiniektora. Następnie za pomocą mikrowstrzykiwacza należy pobrać około jednego mikrolitra powietrza w celu oddzielenia wody od wirusa.Następnie odpipetować 2,5 mikrolitra kropli rozcieńczonego roztworu wirusa na kawałek folii parafinowej. Ostrożnie wsunąć końcówkę mikropipety do kropli za pomocą ramki sterotaksyjnej i wciągnąć ją do mikropipety. Następnie naciśnij dozowanie, aż na końcówce pojawi się kropla roztworu wirusa.Wyjąć strzykawkę i za pomocą pisaka oznaczyć mikropipetę skalą w celu monitorowania dozowanej objętości. Użyj ramienia stereotaktycznego, aby przesunąć końcówkę mikropipety nad jednym z otworów w oponie twardej, a następnie w dół, aż na powierzchni odsłoniętego rdzenia kręgowego pojawi się lekkie wgłębienie. Aby skierować wstrzyknięcie do rogu grzbietowego kręgosłupa, należy przesunąć końcówkę w dół na głębokość 500 mikronów w odstępach co 100 mikronów, a następnie w górę o 200 mikronów, aby umożliwić mechaniczną stabilizację tkanki.Ostateczna głębokość końcówki wynosi 300 mikronów. Po zaprogramowaniu pompy tak, aby wstrzykiwała 300 nanolitrów z prędkością wstrzykiwania 50 nanolitrów na minutę, naciśnij przycisk start, aby rozpocząć infuzję. Po zakończeniu wstrzykiwania należy sprawdzić skalę na mikropipecie, aby zobaczyć, czy poziom wirusa spadł.Pozostaw mikropipetę na miejscu przez dodatkowe trzy minuty, aby ciśnienie się wyrównało. Po trzech minutach powoli wycofać mikropipetę, a następnie powtórzyć procedurę dla pozostałych dwóch miejsc wstrzyknięcia. Po ostatnim wstrzyknięciu należy usunąć zaciski kręgosłupa i poduszkę znajdującą się pod myszą.Zamknij warstwy nacięć przerwanymi szwami, zszywając powierzchowne warstwy tkanek szwami wchłanialnymi, a skórę szwami niewchłanialnymi. Nałóż jodowy środek dezynfekujący na zszytą ranę. Przerwij znieczulenie i pozostaw zwierzę na macie grzewczej, aż dojdzie do siebie, zanim wróci do swojej domowej klatki.Tkanka rdzenia kręgowego w miejscu wstrzyknięcia ma być zbadana na końcu doświadczenia. Jest to konieczne, aby zweryfikować powodzenie wstrzyknięcia i transdukcji oraz wykluczyć nadmierne uszkodzenie tkanek w wyniku operacji. Aby zilustrować poziomy ekspresji, które można uzyskać przez dordzeniowe wstrzyknięcie rekombinowanego AAV, wirus kodujący białko fluorescencyjne eGFP został wstrzyknięty do lędźwiowego rdzenia kręgowego myszy typu dzikiego.Trzy zastrzyki w odstępie około jednego milimetra powodowały prawie ciągłą infekcję odcinka lędźwiowego kręgosłupa od L3 do L5. Wstrzyknięcie wirusa na głębokość 300 mikronów od powierzchni rdzenia prowadzi do dominującego zakażenia komórek rogu grzbietowego rdzenia kręgowego. Jednak zainfekowane komórki można również znaleźć w rogu brzusznym. Zależny od cre wektor elastyczny eksprymujący eGFP został wstrzyknięty do rdzenia kręgowego transgenicznych myszy GlyT2: Cre.Spowodowało to bardziej ograniczoną ekspresję eGFP odzwierciedlającą rozmieszczenie neuronów GLYT2 dodatnich. Postępowanie zgodnie z tym protokołem pozwoli na celowanie w trzy kolejne segmenty kręgosłupa. Stwierdziliśmy, że jest to wystarczające do uzyskania solidnych wyników zachowania.Technika ta pozwoli na badanie funkcji określonych populacji neuronów i komórek oraz ścieżek sensorycznych.

adeno-associated-virus-mediated-transgene-expression-genetically

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ekspresja transgenu pośredniczona przez wirusa Adeno-skojarzonego w genetycznie zdefiniowanych neuronach rdzenia kręgowego

Źródło: Smit, R. D., et al. Celowanie w przewód korowo-rdzeniowy u noworodków szczurów za pomocą podwójnego wektora wirusowego przy użyciu połączonej chirurgii mózgu i kręgosłupa. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje ukierunkowane dostarczanie wektorów wirusowych do neuronów korowo-rdzeniowych u nowonarodzonego szczura. Protokół umożliwia precyzyjną ekspresję genów za pomocą następczych i wstecznych iniekcji wirusowych, ułatwiając badania nad regeneracją i plastycznością neuronów po urazie...

Ukierunkowane dostarczanie wirusa do neuronów korowo-rdzeniowych u nowonarodzonego szczura w celu zbadania urazu rdzenia kręgowego

Źródło: Tadokoro, T., et al. Dostarczanie wektorów subpialnego wirusa Adeno-associated 9 (AAV9) u dorosłych myszy. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia technikę iniekcji podskórnej w celu dostarczenia genu do rdzenia kręgowego u myszy. Procedura polega na odsłonięciu opony twardej, nakłuciu opony twardej i wstrzyknięciu rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) przenoszącego gen eksprymujący białko fluorescencyjne do przestrzeni subpialnej. Po wstrzyknięciu i rekonwalescencji...

Subpialne dostarczanie genów w rdzeniu kręgowym myszy w celu oceny ekspresji genów

Źródło:Pourshafie, N., et al. Ogólnoustrojowe dostarczanie mikroRNA przy użyciu rekombinowanego serotypu 9 wirusa związanego z adenowirusem w leczeniu chorób nerwowo-mięśniowych u gryzoni. J. Vis. Exp. (2018).W tym filmie mysz z rdzeniowym i opuszkowym zanikiem mięśni lub dotknięta SBMA przechodzi wstrzyknięcie do żyły ogonowej rekombinowanych wektorów AAV (wektorów związanych z adeno) przenoszących plazmid kodujący terapeutyczne mikroRNA. Wektor wytwarza mikroRNA, które wiąże się ze zmutowanym...

Wstrzykiwanie rekombinowanych wektorów związanych z adenowirusem w mysim modelu rdzeniowego i opuszkowego zaniku mięśni

Wektory wirusowe pozwalają na celową manipulację genami. Demonstrujemy metodę warunkowej ekspresji genów lub ablacji w rdzeniu kręgowym myszy, wykorzystując stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego do rogu grzbietowego, widocznego miejsca kontaktu synaptycznego między pierwotnymi aferentami somatosensorycznymi a neuronami ośrodkowego układu nerwowego.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego w celu warunkowej manipulacji genami w rdzeniu kręgowym myszy

Ten protokół przedstawia użycie iniekcji do zwoju korzenia grzbietowego (DRG) z wektorem wirusowym i równoczesnym uszkodzeniem zmiażdżenia korzenia grzbietowego u dorosłego szczura jako model do badania regeneracji aksonów czuciowych. Model ten nadaje się do badania zastosowania terapii genowej w celu promowania regeneracji aksonów czuciowych.

Iniekcja zwoju korzenia grzbietowego i uraz zmiażdżenia korzenia grzbietowego jako model regeneracji aksonów czuciowych

Celem obecnego badania było opracowanie i potwierdzenie siły działania oraz bezpieczeństwa dostarczania genów za pośrednictwem wirusa AAV9 (ang. spinal adeno-associated virus 9) za pośrednictwem metody u dorosłych myszy.

Dostarczanie wektorów subpialnego wirusa Adeno-associated 9 (AAV9) u dorosłych myszy

Omówiono metody dostarczania genów na szeroką skalę do ośrodkowego układu nerwowego u szczurów. W tym przykładzie celem jest naśladowanie choroby, która wpływa na cały rdzeń kręgowy. Rozległa transdukcja może być wykorzystana do dostarczenia białka terapeutycznego do OUN z jednorazowego podania obwodowego.

Metody i wskazówki dotyczące dożylnego podawania szczurom wirusa związanego z adenowirusem oraz ocena transdukcji ośrodkowego układu nerwowego

Tutaj prezentujemy technikę bezpośredniego wstrzykiwania dokanałowego przy użyciu 1% chlorowodorku lidokainy w roztworze wirusa, aby zapewnić efektywne dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem małym zwierzętom i ustanowić system punktacji do przewidywania skuteczności transdukcji w ośrodkowym układzie nerwowym w zależności od stopnia przejściowego osłabienia wywołanego przez lidokainę.

Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy

Ten protokół demonstruje wstrzyknięcie wstecznie transportowalnego wektora wirusowego do tkanki rdzenia kręgowego szczura. Wektor jest wychwytywany w synapsie i transportowany do ciała komórkowego docelowych neuronów. Model ten nadaje się do wstecznego śledzenia ważnych ścieżek rdzeniowych lub celowania w komórki do zastosowań w terapii genowej.

Bezpośrednie wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego uwydatnia wiele ścieżek motorycznych w rdzeniu kręgowym szczura

Ten protokół demonstruje nowatorską metodę stosowania terapii genowych do subpopulacji komórek u noworodków szczurów w wieku postnatalnym 5-10 dni poprzez wstrzyknięcie następczego modyfikatora chemogenetycznego do kory somatomotorycznej i wstecznie transportowanej rekombinazy Cre do rdzenia kręgowego szyjnego.

Celowanie w korowo-rdzeniowy przewód moczowy u noworodków szczurów za pomocą podwójnego wektora wirusowego przy użyciu połączonej chirurgii mózgu i kręgosłupa

Opisano nową technikę powszechnego dostarczania wirusa związanego z adenowirusem, która wykorzystuje infuzję wirusa podpajęczynówkowego. Metoda ta nie tylko zapewnia szeroką transdukcję mysich neuronów kory nowej w warstwach powierzchownych, ale także powoduje selektywną ekspresję transgenu w neuronach piramidowych warstwy piątej, nawet przy użyciu nieselektywnego promotora.

Rozległa transdukcja mysich neuronów kory nowej przez wstrzyknięcie subbaraczynoidu AAV2

Poznaj metodę wstrzyknięcia wirusa AAV do rdzenia kręgowego myszy w celu manipulacji genetycznie zdefiniowanymi neuronami. Technika umożliwia precyzyjne badanie obwodów neuronalnych związanych z percepcją bólu.

Ekspresja transgenu za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem w genetycznie zdefiniowanych neuronach rdzenia kręgowego

Przeglądaj więcej filmów