Synteza wielościennych nanorurek węglowych modyfikowanych nanocząstkami srebra oraz ocena ich działania przeciwbakteryjnego i właściwości cytotoksycznych

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie nanokompleksów przeciwbakteryjnych składających się z nanorurek węglowych z nanocząstkami srebra syntetyzowanymi na powierzchni nanorurki. Metoda ta może być wykorzystana do opracowania nowych nanomateriałów bakteryjnych, które mają niską toksyczność dla ludzi, a jednocześnie mają silne właściwości septyczne dla różnych rodzajów bakterii i biofilmów. Protokół opisuje ocenę nanokompleksów w zwalczaniu bakterii przy zachowaniu ich bioporównywalności z ludźmi.

Aby rozpocząć procedurę, umieść od 30 do 50 miligramów MWCNT w 50-mililitrowej fiolce. Używając mikropipety wyposażonej w jednomililitrowe końcówki do pipet, powoli dodaj osiem mililitrów objętościowego roztworu kwasu siarkowego i kwasu azotowego w proporcji trzy do jednego do jednego do MWCNT. Odczekaj 30 minut na zakończenie reakcji egzotermicznej, a następnie poddaj roztwór sonikacji w temperaturze od 60 do 80 stopni Celsjusza i mocy 160 watów, aż MWCNT osiądą na dnie fiolki, co zwykle trwa około godziny.

Przenieść mieszaninę do probówki wirówkowej. Za pomocą mikropipety ostrożnie dodaj kroplami 30 mililitrów wody destylowanej do MWCNT funkcjonalizowanych kwasem karboksylowym, zatrzymując się, aby mieszanina ostygła w razie potrzeby. Następnie odwirować mieszaninę o stężeniu 12 000 G przez 15 minut.

Usunąć supernatant za pomocą pipety wyposażonej w końcówkę do pipety o pojemności jednego mililitra. Dodać pięć mililitrów etanolu do ciała stałego i przepłukać ścianki fiolki dodatkowym etanolem. Ponownie odwirować mieszaninę z tymi samymi ustawieniami i sprawdzić pH supernatantu za pomocą bibuły do pomiaru pH.

Kontynuować płukanie ciał stałych przez odwirowanie w etanolu, aż pH supernatantu stanie się neutralne, następnie usunąć supernatant i dodać jeden mililitr wody destylowanej do osadu. Rozproszyć MWCNT funkcjonalizowane kwasem karboksylowym w wodzie i wysuszyć dyspersję na zimno w temperaturze minus 60 stopni Celsjusza w próżni. Umieść 10 miligramów liofilizowanych kwasem karboksylowym MWCNT w 50-mililitrowej stożkowej probówce wirówkowej.

Dodaj 30 mililitrów wody destylowanej do probówki. Połącz sześć mililitrów 0,1 normalnego azotanu srebra i 18 mililitrów wody destylowanej w innej 50-mililitrowej stożkowej probówce. Sonikuj obie mieszaniny w temperaturze 60 stopni Celsjusza i mocy 160 watów przez jedną godzinę.

Następnie, nadal sonifikując dyspersję MWCNT w temperaturze 60 stopni Celsjusza i 160 watach, dodaj roztwór azotanu srebra kroplami do dyspersji MWCNT za pomocą pipety wyposażonej w jednomililitrową końcówkę do pipety. Po zakończeniu dodawania należy kontynuować sonikację mieszaniny przez godzinę, a następnie odwirować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze 12 000 G w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Ponownie rozproszyć srebrne MWCNT w 30 mililitrach wody destylowanej przez sonikację w temperaturze 24 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Powtórzyć wirowanie w 30 mililitrach wody destylowanej i dwukrotnie usunąć supernatant. Następnie rozprowadź umyte srebrne MWCNT w jednym mililitrze wody destylowanej za pomocą sonikacji przez pięć minut. Dodaj pięć mililitrów etanolu do dyspersji i mieszaj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez godzinę.

Następnie odwirować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze 12 000 G w temperaturze pokojowej i sprawdzić pH supernatantu. Usunąć supernatant i ponownie rozproszyć mieszaninę w pięciu mililitrach etanolu przez wirowanie. Kontynuować płukanie osadu w etanolu przez odwirowanie, aż pH sklarowanego osadu stanie się neutralne.

Na koniec rozprowadź umyte srebrne MWCNT w jednym mililitrze wody destylowanej. Liofilizować dyspersję w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza w próżni przez 24 godziny i przechowywać dyspersję w szczelnie zamkniętym pojemniku. Aby rozpocząć przygotowanie testu, wymieszaj i autoklawuj 18,12 grama agaru R2A i jeden litr wody destylowanej.

Pozostaw żel do ostygnięcia w temperaturze pokojowej. Gdy żel będzie gotowy do nalewania, umieść 10 mililitrów żelu na 90-milimetrowych szalkach Petriego i pozwól agarowi stwardnieć. W dygestorium użyj pętli i igły wysterylizowanych w płomieniu alkoholowym, aby rozprowadzić 100 mikrolitrów mieszaniny gatunków methylobacterium na powierzchni pożywki hodowlanej.

Inkubuj naczynia w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 48 godzin, a następnie wymieszaj 3,12 grama bulionu R2A z jednym litrem wody destylowanej i autoklawuj pożywkę w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut. Użyj wysterylizowanej pętli i igły, aby przenieść kolonie do pożywki wzrostowej R2A. Inkubować próbkę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 180 obr./min.

Mierz gęstość optyczną z prędkością 600 nanometrów co godzinę, aż gęstość optyczna będzie większa niż 0,7. Następnie przygotuj kolejną szalkę Petriego zawierającą 10 mililitrów agaru R2A. Następnie wymieszaj 3,12 grama bulionu R2A i osiem gramów agaru z jednym litrem wody destylowanej.

Mieszaninę należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut. Wymieszaj 100 mikrolitrów kultury methylobacterium z mieszaniną agarów. Wlać 10 mililitrów żelu zawierającego metylobakterię na dolną warstwę agaru R2A na szalce Petriego, a następnie przygotować dyspersję pożądanego stężenia liofilizowanych srebrnych MWCNT w wodzie destylowanej.

Za pomocą mikropipety załadować 50 mikrolitrów tej dyspersji na sterylny dysk papierowy o wymiarach sześć na jeden milimetr. Nałóż wodę destylowaną na inny sterylny krążek papierowy jako kontrolę. Wysuszyć i wysterylizować oba dyski w komorze próżniowej pod wpływem światła UV przez 30 minut.

Następnie umieść srebrną próbkę MWCNT i kontrolę na agarze i inkubuj płytkę agarową w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Zmierz strefę inhibicji wokół próbki srebra MWCNT po zakończeniu. Przed badaniem należy autoklawować potrójnie destylowaną wodę o temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Przygotuj dyspersję 1000 mikrogramów na mililitr MWCNT funkcjonalizowanych kwasem karboksylowym i 50 mikrogramów na mililitr, 40 mikrogramów na mililitr i 30 mikrogramów na mililitr dyspersji srebra MWCNT w tej sterylnej wodzie. Aby rozpocząć procedurę testowania przeciwbakteryjnego, należy przygotować kulturę methylobacterium zgodnie z wcześniejszym opisem i monitorować jej gęstość optyczną przy 600 nanometrach. Gdy gęstość optyczna osiągnie maksimum, zaintruj 100 mikrolitrów kultury methylobacterium w trzech mililitrach świeżej pożywki hodowlanej R2A.

Umieść 500 mikrolitrów tego roztworu w każdej z pięciu 15-mililitrowych stożkowych probówek. Dodaj 100 mikrolitrów metanolu do jednej z probówek, aby przygotować próbkę referencyjną metanolu. Przygotować próbkę dla każdej z czterech dyspersji w ten sam sposób.

Inkubować próbki i pozostałą kulturę kontrolną methylobacterium przy prędkości 180 obr./min i w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż gęstość optyczna próby kontrolnej wskaże maksymalną aktywność. Użyj wysterylizowanego rozsiewacza, aby rozprowadzić każdą próbkę na stałym żelu agarowym R2A na szalkach Petriego. Inkubuj naczynia w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 48 godzin.

Policz powstałe kolonie bakterii i określ minimalne stężenie bakteriobójcze. Srebro MWCNT udało się zsyntetyzować przy użyciu opisanej procedury. Średnia wielkość osadzonych cząstek srebra wynosiła około 3,83 nanometra.

Nie zaobserwowano wzrostu Methylobacterium w przypadku hodowli z dyspersjami srebra MWCNT o stężeniu 50 mikrogramów na mililitr lub 40 mikrogramów na mililitr. Populacja bakterii została zmniejszona 100 000 razy w stosunku do próbki kontrolnej, gdy była hodowana z dyspersją srebra MWCNT o stężeniu 30 mikrogramów na mililitr. Strefę inhibicji zaobserwowano wokół próbki przygotowanej z dyspersji MWCNT srebra o stężeniu 10 mikrogramów na mililitr

Nie zaobserwowano żadnej strefy inhibicji dla próbki przygotowanej z dyspersji o stężeniu jednego mikrograma na mililitr. Pewną cytotoksyczność zaobserwowano po dodaniu dyspersji MWCNT srebra w ilości 40 mikrogramów na mililitr. Nie zaobserwowano istotnej cytotoksyczności po dodaniu dyspersji 30 mikrogramów na mililitr

Test błękitu trypanowego potwierdził, że cytotoksyczność była minimalna po dodaniu 30 mikrogramów na mililitr dyspersji MWCNT srebra. Protokół ten pomógłby naukowcom w przygotowaniu nanokompleksów zawierających nanocząstki metali, które działają bezpośrednio na nanomateriały węglowe. Zgodnie z tym protokołem naukowcy będą mogli również ocenić właściwości przeciwbakteryjne przygotowanych nanokompleksów.