Badanie roli plazmidów wielokopijnych w ewolucji oporności na antybiotyki
May 2nd, 2018
Tutaj prezentujemy eksperymentalną metodę testowania roli wielokopijnych plazmidów w ewolucji oporności na antybiotyki.
Ogólnym celem tej metody eksperymentalnej jest zbadanie roli plazmidów wielokopijnych w ewolucji oporności na antybiotyki. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny mikrobiologii, takie jak rola plazmidów wielokopijnych w ewolucji innowacji bakteryjnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że wymaga ona jedynie podstawowych metod biologii molekularnej i prostego projektu eksperymentalnego.
To jest naprawdę fajne. Najpierw skonstruuj szczep E coli MG1655, który będzie przenosił gen oporności na przeciwciała w chromosomie faga lambda po stronie równania ATTB. Aby to zrobić, PCR amplifikuje 500 podstawowych regionów paralongowych po obu stronach miejsca ATTB.
Następnie PCR amplifikuje gen oporności na antybiotyki. Następnie użyj montażu izotermicznego w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby połączyć regiony homologii z produktem PCR. Po montażu izotermicznym przenieś jeden mikrolitr produktu do 40 mikrolitrów elektrokompetentnych ogniw MG1655 do dwumilimetrowej kuwety.
Następnie elektroportuj ogniwa w temperaturze 4 stopni Celsjusza i 2,5 kilowolta. Po elektroporacji przenieś komórki w jednym mililitrze bulionu LB z 0,2% arabinozą. Następnie pipetować bulion LB zawierający komórki do probówki do mikrofuge.
Intensywnie wstrząsaj probówką przez dwie godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Po dwóch godzinach umieść 100 mikrolitrów kultury na płytce agarowej LB, uzupełnionej antybiotykami. Następnie odwiruj pozostałe komórki.
I ponownie zawiesić granulat w 100 mikrolitrach świeżego bulionu LB. Ponownie pokryj te komórki na innej płytce agarowej LB. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez noc.
Następnego dnia PCR amplifikuje klony w celu zweryfikowania konstruktu przy użyciu zewnętrznych starterów ybhC extern i ybhB extern. Następnie potwierdź wielkość amplikonu za pomocą elektroforezy otoczki agarozowej. Równolegle przeprowadź sekwencjonowanie DNA, aby zweryfikować sekwencję wstawionego genu.
Aby skonstruować szczep przenoszący gen oporności na przeciwciała w plazmidzie wielokopijnym, najpierw PCR amplifikuje gen oporności na antybiotyki blaTEM-1. Po zakończeniu PCR fosforylować amplifikowany produkt za pomocą kinazy polinukleotydowej T4. Następnie użyj polimerazy o wysokiej wierności i oligonukleotydów PBAD FINV i PBAD RINV, aby PCR amplifikować szkielet plazmidu PBAD.
Następnie podwiązaj dwa fragmenty PCR za pomocą ligazy T4. Następnie należy poddać elektropostacji 40 mikrolitrów ogniw alfa DH5 za pomocą 1 mikrolitra produktu ligacji. Następnie należy dobrać odpowiedni antybiotyk dla genu oporności na antybiotyki i szkieletu plazmidowego na płytkach agarowych.
Następnie wykonaj ekstrakcję plazmidu za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie należy przeprowadzić sekwencjonowanie Sangera interesującego genu oporności, aby potwierdzić brak jakichkolwiek możliwych mutacji przed eksperymentami ewolucyjnymi. Po weryfikacji sekwencji należy naelektryzować plazmid w szczepie E coli MG1655, aby ostatecznie uzyskać plazmid przenoszący szczep MG1655.
Najbardziej krytycznymi etapami tego protokołu są budowa szczepów systemów modelowych oraz rekonstrukcja mutacji zaobserwowanych podczas ewolucji eksperymentalnej. Najpierw nałóż interesujące szczepy MG1655 na płytki agarowe LB. Następnie dodaj 200 mikrolitrów pożywki LB do każdego dołka 96-dołkowej płytki.
Następnie zaszczepij 48 izolowanych kolonii każdego szczepu w indywidualnych dołkach płytki. Po inokulacji inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza na wytrząsarce z prędkością 200 obrotów na minutę. Ponownie zaszczepij dwa mikrolitry kultury z każdej studzienki z populacją założyciela na nową 96-dołkową płytkę ze 198 mikrolitrami pożywki LB w indywidualnych studzienkach.
W ten sposób rozpocznie się ewolucyjny eksperyment ratunkowy. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na wytrząsarce z prędkością 200 obrotów na minutę przez 20 godzin. Każdego dnia należy podwoić stężenie antybiotyku w stosunku do poprzedniego dnia.
Następnego dnia przenieś 2 mikrolitry odpowiedniej kultury na świeżą 96-dołkową płytkę i kontynuuj to codziennie. Zapisz odczyt gęstości optycznej w odległości 600 nanometrów z poszczególnych studzienek na czytniku płytkowym. Kluczowym etapem protokołu jest eksperymentalna ewolucja i rosnące stężenie antybiotyków.
Szybkość zmian stężeń antybiotyków jest jednym z parametrów, które można modyfikować w celu wspierania ewolucji oporności na antybiotyki. Ponownie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na wytrząsarce z prędkością 200 obrotów na minutę przez 20 godzin. Następnie codziennie mierz odczyt gęstości optycznej przy 600 nanometrach dla każdej ocalałej populacji na czytniku płytkowym.
Zamrażaj populacje okresowo, co trzy do pięciu dni. Wyekstrahuj całkowite DNA z wyewoluowanych populacji i klonów z różnych szczepów i zabiegów. Następnie zmierz współczynniki absorbancji w 260:280 i 260:230 nanometrach na spektrofotometrze, aby określić jakość DNA.
Następnie użyj fluorescencyjnego barwnika wiążącego DNA i potwierdź stężenie DNA, mierząc fluorescencję na czytniku płytek. Dodatkowo poddaj DNA elektroforezie w żelu agarozowym, aby potwierdzić, że nie ma degradacji DNA ani zanieczyszczenia RNA. Następnie wykonaj głębokie sekwencjonowanie DNA z próbkami uzyskanymi z całych populacji i pojedynczych klonów, aby zbadać genetyczne podstawy oporności na antybiotyki.
Badanie to jest przykładem możliwych wyników systemu eksperymentalnego z wykorzystaniem trzech szczepów E. coli. Szczepy te to E coli MG1655, MG1655 przenoszący gen oporności w chromosomie MG1655 resA i MG1655 przenoszący gen oporności w plazmidzie wielokopijnym, MG1655 pRESA. Stosowane antybiotyki to ceftazydym i meropenem.
Ten lewy panel pokazuje krzywe przeżycia przy rosnących stężeniach ceftazydymu. Z wykresu jasno wynika, że podzbiór populacji szczepu MG1655 pRESA jest w stanie rosnąć dłużej niż 14 dni nawet po podwojeniu stężenia ceftazydymu każdego dnia. Wręcz przeciwnie, inne szczepy nie przeżywają dłużej niż 8 dni, gdy są wystawione na działanie podobnych stężeń ceftazydymu.
Jednak te same szczepy nie wykazują istotnych różnic w okresie przeżycia przy ekspozycji na podobne stężenie innego antybiotyku, meropenemu. Wszystkie trzy szczepy przeżywają tylko od 6 do 8 dni po wystawieniu na działanie meropenemu. Wskazuje to, że obecność genu resA w plazmidzie wielokopijnym nasila ewolucję oporności na ceftazydym, ale nie meropenem.
Po opanowaniu, pełny protokół eksperymentalny można wykonać w ciągu kilku tygodni, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać rolę plazmidów wielokopijnych w ewolucji innowacji u bakterii.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia eksperymentalną metodę badania roli plazmidów wielokopianych w ewolucji oporności na antybiotyki. Metoda została zaprojektowana, aby odpowiedzieć na ważne pytania w mikrobiologii dotyczące innowacji bakteryjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Opornie na antybiotyki
- Biologia plazmidów
Tło
- Plazmidy wielokopiane mogą wpływać na ewolucję bakterii.
- Rozumienie ich roli jest kluczowe dla zagadnienia oporności na antybiotyki.
- To badanie wykorzystuje podstawowe techniki biologii molekularnej.
- Projekt eksperymentu jest prosty i dostępny.
Cel badania
- Aby przetestować rolę plazmidów wielokopianych w ewolucji oporności na antybiotyki.
- Aby zbadać, jak plazmidy przyczyniają się do innowacji bakteryjnych.
- Aby zapewnić wgląd w mechanizmy oporności na antybiotyki.
Stosowane metody
- Konstrukcja szczepu E. coli MG1655 z genem odporności na antybiotyki.
- Amplifikowanie PCR regionów flankujących miejsce ATTB.
- Wykorzystanie faga lambda do integracji genu.
- Prosty projekt eksperymentu wymagający podstawowych metod biologii molekularnej.
Główne wyniki
- Wykazano wykonalność stosowania plazmidów wielokopianych w eksperymentach.
- Zadbały o metodę analizy wpływu plazmidów na oporność na antybiotyki.
- Podkreślono potencjał dalszych badań w dziedzinie ewolucji bakteryjnej.
- Pokazano, że podstawowe techniki mogą przynieść istotne wnioski.
Wnioski
- Plazmidy wielokopiane odgrywają znaczącą rolę w ewolucji oporności na antybiotyki.
- Ta metoda może ułatwić dalsze badania w dziedzinie mikrobiologii.
- Zrozumienie dynamiki plazmidów jest niezbędne do zwalczania oporności na antybiotyki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding how multicopy plasmids accelerate the evolution of antibiotic resistance genes is critical for de-risking early anti-infective discovery and portfolio triage. This experimental system enables direct interrogation of gene copy number effects on resistance acquisition, informing predictive models of bacterial adaptation. The approach supports strategic decision-making at the intersection of target validation and resistance mechanism assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic de-risking of resistance gene evolution in bacterial systems.
- Clarifies the impact of gene dosage on functional target validation for resistance pathways.
- Supports predictive confidence in selecting anti-infective targets less prone to rapid resistance.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated E. coli strains for resistance evolution assays.
- Standardizes experimental evolution protocols for reproducible resistance acquisition studies.
- Generates quantitative survival and growth data under defined antibiotic pressures.
Translational & Preclinical Research
- Aligns experimental outputs with translational biomarker discovery for resistance mechanisms.
- Provides continuity from molecular evolution studies to preclinical resistance validation.
- Informs risk-adjusted advancement of anti-infective candidates based on resistance potential.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven testing of resistance gene evolution and supporting downstream screening and analytics.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing on the role of gene copy number in resistance acquisition.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative survival data for comparative analysis of strain constructs.
- Analytics: Provides deep sequencing outputs to identify and confirm resistance-conferring mutations.
- Translational Research: Bridges molecular evolution findings to preclinical resistance risk assessment.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, scalable system for repeated resistance evolution studies across targets and antibiotics.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in resistance mechanism identification and target validation.
- Operational Value: Standardizes resistance evolution workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions by quantifying resistance acquisition risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of anti-infective assets based on resistance evolution data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, bacterial genetics, and experimental evolution.
- Needs access to PCR, electroporation, plate readers, and deep sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of strain construction and evolution protocols.
- Adaptable to different resistance genes and antibiotics with protocol modifications.
- Dependent on accurate phenotypic and genotypic validation of evolved strains.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:33
Construction of the Experimental System Encoding the Antibiotic Resistance Gene
4:19
Evolutionary Rescue Approach to Experimentally Evolve Antibiotic Resistance
6:14
Molecular Basis of the Evolution of Antibiotic Resistance
7:05
Results: Study of Evolutionary Rescue and Molecular Basis Underlying the Plasmid Mediated Evolution using DNA Sequencing
8:35
Conclusion
