Name: Obrazowanie żywych komórek segregacji chromosomów podczas mitozy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Poznaj metodę obrazowania żywych chromosomów podczas mitozy w komórkach MEF przy użyciu Histone2B-GFP i mikroskopii konfokalnej. Technika umożliwia badanie segregacji chromosomów w warunkach żywych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Dr. Guo-Chiuan Hung i Dr. Bharatkumar Joshi za cenne komentarze, które poprawiły rękopis.

Wszystkie eksperymenty przeprowadzone w ramach tych badań zostały wykonane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) w placówce badawczej Food and Drug Administration (FDA).
1. Izolacja i hodowla fibroblastów embrionalnych myszy (MEFs)
<ol>
	<li>Wyizolować mysie fibroblasty embrionalne (MEF) z linii myszy PP2A-B56γ- oraz z dzikich littermates zgodnie ze standardowym protokołem 7,8,9.</li>
	<li>Namnażać MEF przez 3 pasaże, następnie zamrozić i przechowywać do czasu rozpoczęcia eksperymentów 8.</li>
</ol>
2. Hodowla MEF-ów w 2-dołkowym szkiełku nakrywkowym z komorą do obrazowania na żywo
<ol>
	<li>Przygotować 500 mL pożywki wzrostowej dla MEF zawierającej DMEM/F12 (Dulbecco Modified Eagle Medium) z 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), antybiotykami penicylina/streptomycyna 1X, L-glutaminą (200 mM) oraz 1X nieessentialnymi aminokwasami (NEAA) w butelce na pożywki o pojemności 500 mL.</li>
	<li>Rozmrozić fiolki z zamrożonymi MEF od myszy typu dzikiego oraz myszy PP2A-B56γ- w trzecim pasażu w podgrzanej wcześniej kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przenieść rozmrożone MEF do probówek 15-mL i powoli dodawać kroplami 20 mL pożywki DMEM/F12 do probówek 15-mL, używając pipety 10-mL.</li>
	<li>Przenieść MEF wraz z 20 mL pożywki wzrostowej DMEM/F12 do kolb T75 i namnażać aż do osiągnięcia 70% konfluencji. Konfluencję ocenia się za pomocą mikroskopu odwróconego przy powiększeniu 4x lub 10x.</li>
	<li>Odssać pożywkę wzrostową za pomocą szklanej pipety Pasteura podłączonej do systemu próżniowego w dygestorium, dodać 3 mL 0,25% trypsyny/EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 min. Dodać 3 mL pożywki wzrostowej DMEM/F12, aby zatrzymać reakcję.</li>
	<li>Odwirować komórki przy niskiej prędkości (300 x g) przez 5 min w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant i resuspender osad komórkowy w 1 mL pożywki wzrostowej DMEM/F12 uprzednio podgrzanej do 37 °C w kąpieli wodnej.</li>
	<li>Policzyć komórki metodą wykluczania trypan blue lub inną odpowiednią metodą liczenia komórek 8.</li>
	<li>Zasiać około 20 000 MEF/studzienkę na pokrywkach szklanych z dwiema komorami. Dodać 200 µL/studzienkę pożywki wzrostowej DMEM/F12 i pozwolić komórkom przyrosnąć, inkubując je przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
</ol>
3. Synchronizacja
<ol>
	<li>Zsynchronizuj MEF w fazie G0/G1 poprzez inkubację komórek w pożywce wzrostowej DMEM/F12 zawierającej 0,1% FBS przez 24 h, aby uzyskać maksymalną liczbę komórek w fazie G0/G1. 
	Uwaga: Choć preferowaną metodą było głodzenie seryjne, można zastosować różne inne metody, w zależności od etapu mitozy, na którym wymagane jest zatrzymanie cyklu komórkowego 10.</li>
</ol>
4. znakowanie
<ol>
	<li>Przygotować roztwór zapasowy nocodazolu w DMSO o stężeniu 1,5 mg/mL. Nocodazol zatrzymuje komórki w fazie G2/M poprzez hamowanie tworzenia mikrotubul 10.</li>
	<li>Trzy dni po synchronizacji dodać 200 µL pożywki wzrostowej (z 10% FCS), 200 ng/mL nocodazolu oraz odczynnik CL-HB (Histone 2B-GFP BacMam 2.0).</li>
	<li>Obliczyć liczbę cząsteczek na komórkę (Particles Per Cell – PPC) odczynnika CL-HB, które należy dodać do komórek, według następującego wzoru: 
	<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq1.jpg" /> 
	Gdzie liczba komórek to szacowana całkowita liczba komórek w momencie znakowania, PPC to liczba cząsteczek na komórkę, a 1 × 108 to liczba cząsteczek na mL odczynnika. Na przykład, aby oznakować 20 000 komórek przy PPC wynoszącym 30: 
	<img alt="Równanie 2" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq2.jpg" /> 
	UWAGA: Odczynnik CL-HB działa dobrze w większości typów komórek przy PPC od 10 do 50. Jednak w niniejszym badaniu najlepsze wyniki uzyskano dla 30 PPC.</li>
	<li>Inkubować MEF przez 18 h w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. 
	UWAGA: W obecnym eksperymencie wizualizacja chromosomów w komórkach mitotycznych omijających punkt kontrolny montażu wrzeciona nastąpiła 18 h po zatrzymaniu cyklu komórkowego za pomocą nocodazolu.</li>
</ol>
5. Wizualizacja chromosomów opóźnionych
<ol>
	<li>Wizualizuj embrionalne fibroblasty mysie (MEFs) przy użyciu konfokalnego systemu mikroskopowego z dyskiem wirującym, wyposażonego w komorę inkubacyjną oraz obiektyw imersyjny 63x.
	<ol>
		<li>Do akwizycji obrazów w kanale GFP zastosuj długość fali wzbudzenia 488 nm oraz długość fali emisji 450 nm.</li>
		<li>W tej technice wykorzystaj konfokalny system mikroskopowy z dyskiem wirującym, posiadający zmotoryzowane stoły skanujące, wkładki Z-Piezo, inkubator na stole oraz funkcję bezpośredniego odzyskiwania fluorescencji po fotobleachingu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na jeden dzień przed obrazowaniem włącz zasilanie komory inkubacyjnej i pozostaw ją do ogrzania do 37 °C przez całą noc.</li>
	<li>Włącz zasilanie statywu mikroskopu, kamery, jednostki dysku wirującego, iluminatora, lasera argonowego, komputera oraz zmotoryzowanego stołu.</li>
	<li>Pozostaw system do rozgrzania na 3 min; uruchom laser argonowy, przekręcając kluczyk zapłonowy. Przełącz przełącznik lasera argonowego z pozycji &#34;standby&#34; na &#34;laser run&#34;.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie do akwizycji i przetwarzania danych.</li>
	<li>Uruchom kontroler CO2 inkubatora na stole i ustaw stężenie CO2 na poziomie 5%. Należy to zrobić przed rozpoczęciem obrazowania.</li>
	<li>Wyjmij szkiełko nakrywki z komorą z inkubatora i umieść je na stole w celu wizualizacji. Obserwuj komórki przez obiektyw imersyjny 63x (NA1.4).</li>
	<li>Patrząc przez okularowe soczewki, ustaw ostrość obrazu i zidentyfikuj komórkę w fazie rozpadu otoczki jądrowej (NEBD).</li>
	<li>Uruchom odpowiedni laser (laser argonowy 488 nm do wizualizacji Histone2B-GFP).</li>
	<li>Otwórz okno sterowania akwizycją i ustaw czas ekspozycji dla kanału GFP. Zidentyfikuj komórkę w fazie NEBD.
	<ol>
		<li>Ręcznie określ górną i dolną płaszczyznę ogniskową komórki docelowej, a następnie wprowadź ustawienia sekcjonowania optycznego xyz.</li>
		<li>Obserwuj komórkę przez 20 min; jeśli komórka nie przejdzie do podziału, przerwij akwizycję obrazu po 20 min i przejdź do kolejnej komórki w fazie NEBD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie chromosomów zapóźnionych podczas mitozy w komórkach PP2A-B56γ-, które uniknęły działania SAC, zajmuje około 1 h na komórkę. Aby uzyskać materiał do filmu, wykonuj zdjęcia co 3 min. 
	UWAGA: Komórki typu dzikiego ulegają zatrzymaniu i nie posuwają się poza fazę NEBD po potraktowaniu nocodazolem.</li>
	<li>Zapisz obrazy w formacie pliku zvi do dalszej analizy.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie i analiza obrazów
Uwaga: Przetwarzanie i analizę obrazów trójwymiarowych należy przeprowadzić przy użyciu dowolnego dostępnego oprogramowania, takiego jak Axiovision wersja 4.8.2 lub Imaris wersja 8.2. W niniejszym badaniu wykorzystano oprogramowanie ImageJ.
<ol>
	<li>Otwórz sekwencję obrazów. Jeśli obrazy są już w formacie stosu (stack), przejdź do następnego kroku. W przeciwnym razie połącz wszystkie odpowiednie obrazy w stos, korzystając z opcji „Image &gt; Stacks &gt; Images to Stack” w pasku menu.</li>
	<li>Wykonaj ewentualne niezbędne korekty jasności/kontrastu oraz poziomów.</li>
	<li>Aby dodać znacznik czasu do filmu:
	<ol>
		<li>Przejdź do „Image &gt; Stacks &gt; Label…” w pasku menu.</li>
		<li>Wybierz odpowiedni format, wartość czasu początkowego oraz interwał czasowy między poszczególnymi obrazami.</li>
		<li>Zaznacz pole „Preview” i dostosuj ustawienia lokalizacji oraz formatu. Naciśnij „OK”, aby zastosować znacznik czasu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby dodać pasek skali do filmu:
	<ol>
		<li>Ustaw skalowanie obrazu w menu „Analyze &gt; Set Scale” w pasku menu.</li>
		<li>W polu „Distance in pixels” wprowadź liczbę pikseli dla znanej odległości, a w polu „Known distance” wprowadź tę odległość. Ustaw odpowiednią jednostkę długości, np. µm. Naciśnij „OK”, aby zastosować skalę do stosu.</li>
		<li>Przejdź do „Analyze &gt; Tools &gt; Scale Bar…”, aby dodać pasek skali. Ustaw rozmiar paska w polu „Width in µm” i dostosuj pozostałe opcje formatowania. Zaznacz pole „Label all slices”, aby dodać pasek skali do całego stosu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przejrzyj film, klikając trójkątny przycisk odtwarzania w lewym dolnym rogu okna obrazu. Dostosuj liczbę klatek na sekundę, korzystając z opcji „Image &gt; Stacks &gt; Animation &gt; Animation Options” w pasku menu.</li>
	<li>Wyeksportuj plik filmu, wybierając „File &gt; Save As &gt; AVI…”, a następnie określ liczbę klatek na sekundę i kompresję.</li>
	<li>Naciśnij „OK”, aby wybrać lokalizację zapisu i nazwę pliku. Naciśnij „Save”, aby zapisać plik filmu.</li>
</ol>

<ol><li>Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+in+CIN%3A+Mitotic+Infidelity+and+Its+Consequences+for+Tumor+Promotion+and+Suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression.</a> Dev Cell. 39, 638-652 (2016).</li>
<li>Etemad, B., Kops, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+issues%3A+kinetochore+transformations+and+spindle+checkpoint+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing.</a> Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).</li>
<li>Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+assembly+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The spindle assembly checkpoint.</a> Curr Biol. 22, 966-980 (2012).</li>
<li>Jallepalli, P. V., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+segregation+and+cancer%3A+cutting+through+the+mystery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery.</a> Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+protein+CSPP1+interacts+with+CENP-H+protein+to+coordinate+accurate+chromosome+oscillation+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis.</a> J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).</li>
<li>Pikor, L., Thu, K., Vucic, E., Lam, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+detection+and+implication+of+genome+instability+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The detection and implication of genome instability in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 32 (3-4), 341-352 (2013).</li>
<li>Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+phosphatase+2A+B56%CE%B3+regulatory+subunit+is+required+for+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The protein phosphatase 2A B56γ regulatory subunit is required for heart development.</a> Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells+Suitable+for+Culturing+Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (64), e3854(2012).</li>
<li>Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP2A-B56%CE%B3+is+required+for+an+efficient+spindle+assembly+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">PP2A-B56γ is required for an efficient spindle assembly checkpoint.</a> Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).</li>
<li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).</li>
<li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Tech%22%5BJournal%5D)">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).</li>
<li>Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+LINC+complex+recruitment+at+nuclear+indentation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites.</a> Sci Rep. 8 (4), 7362(2014).</li>
<li>Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26904940">The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity.</a> Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).</li>
<li>Iuso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+Expression+of+Human+Protamine+1+%28hPrm1%29+Remodels+Fibroblast+Nuclei+into+Spermatid-like+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures.</a> Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).</li>
<li>Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+perspectives+on+stem+cell-based+therapies+undergoing+clinical+trials+for+regenerative+medicine%3A+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+Bull%22%5BJournal%5D)">Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies.</a> Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Punkty kontrolne kontroli cyklu komórkowego, które zapewniają dokładną segregację chromosomów, zapobiegają aneuploidii i transformacji komórek 1,2,3. W niniejszym badaniu stwierdziliśmy, że inaktywacja PP2A-B56γ spowodowała osłabienie punktu kontrolnego montażu wrzeciona. Obrazowanie żywych komórek pozwoliło zaobserwować błędną segregację chromosomów podczas mitozy u MEF-ów PP2A-B56γ leczonych nokodazolem 9</su...

W poniższym protokole opisujemy wygodną metodę wizualizacji segregacji chromosomów i progresji mitotycznej podczas cyklu komórkowego w mysich fibroblastach embrionalnych za pomocą histonu 2B-GFP, znakowania BacMam 2.0 i obrazowania żywych komórek.
Punkty kontrolne kontroli cyklu komórkowego monitorują segregację chromosomów i odgrywają ważną rolę w utrzymaniu integralności genetycznej komórki 1,2,3. Nagromadzenie nieprawidłowo posegregowanych chromosomów może prowadzić do aneuploidii, która jest cechą charakterystyczną większości guzów litych 4. W związku z tym wykrywanie opóźnionych chromosomów może być stosowane jako metoda badania niestabilności chromosomowej.
Białka znakowane fluorescencyjnie mogą być używane do wizualizacji segregacji chromosomów na żywo i opóźnień chromosomowych, ale generowanie białka znakowanego mCherry lub H2B-GFP wymaga znacznej wiedzy na temat dostarczania genów i biologii molekularnej 5. Dla uproszczenia opisujemy zastosowanie odczynnika CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0, zwanego dalej CL-HB regent. Odczynnik ten może być użyty natychmiast, co eliminuje obawy o jakość i integralność wektora. Ponadto odczynnik ten nie wymaga stosowania potencjalnie szkodliwych zabiegów ani lipidów i chemikaliów obciążających barwnikiem. W przeciwieństwie do konwencjonalnych etykiet fluorescencyjnych, regent CL-HB barwi niezależnie od funkcji (tj. potencjału błonowego). Regent CL-HB można po prostu dodać do komórek i inkubować przez noc w celu ekspresji białka. Regent CL-HB nie replikuje się w komórkach ssaków i może być stosowany w warunkach laboratoryjnych na poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL) 1. Również ta przejściowa transfekcja może być wykryta po całonocnej inkubacji przez okres do 5 dni, co wystarcza na przeprowadzenie większości dynamicznych analiz komórkowych.
Alternatywnie, nieprawidłowości chromosomalne mogą być badane za pomocą różnych technik, takich jak cytometria przepływowa, immunohistochemia lub fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) 6. Cytometria przepływowa może być stosowana do badania aneuploidii, którą można zmierzyć na podstawie zawartości DNA i fazy komórek w cyklu komórkowym. Chociaż cytometria przepływowa może być stosowana do pomiaru aneuploidii, nie dostarcza informacji na temat błędnej segregacji chromosomów. FISH i techniki immunohistochemiczne wykorzystują sondy fluorescencyjne do wiązania się z DNA lub chromosomami. Chociaż techniki te zapewniają migawkę stanu populacji komórek, nie pozwalają na obrazowanie żywych komórek, tracąc tym samym wszelkie informacje uzyskane dzięki czasoprzestrzennej wizualizacji cytokinezy w określonych komórkach obserwowanej przez pewien okres czasu.
Ten protokół został użyty do badania opóźnionych chromosomów lub błędnej segregacji chromosomów u mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) leczonych nokodazolem wyizolowanych od myszy PP2A-B56γ. Oprócz powyższej aplikacji, protokół ten zapewnia proste narzędzie do oznaczania i wizualizacji segregacji chromosomów w różnych typach komórek, które można wykorzystać do badania regulacji cyklu komórkowego lub niestabilności chromosomalnej w komórkach nowotworowych. Ponadto może być również stosowany do badania niestabilności chromosomowej spowodowanej różnymi terapiami farmakologicznymi lub do badania skutków nokautu genu skutkującego błędną segregacją chromosomów.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>EMD Millipore</td><td>MX 1458-6</td><td></td></tr><tr><td>Kriogeniczne pudełka do przechowywania fiolek</td><td>Fisherbrand</td><td>10-500-28</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki kriogeniczne</td><td>Corning/costar</td><td>431416</td><td></td></tr><tr><td>Kolby T75</td><td>Cellstar</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>2 dobrze komorowe szkło nakrywkowe</td><td>Nunc</td><td>155380PK</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Vision Cell Profiler</td><td>Nexcelom Bioscience LLC</td><td>Cellometer Vision Trio</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>C10594</td><td></td></tr><tr><td>System mikroskopu konfokalnego Zeiss Cell Observer z wirującym dyskiem</td> Carl <td>Zeiss Mikroskopia</td><td>Zeiss Cell Observer SD</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Inkubator</td> serii <td>Thermoscientific 280</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Rozwiązania komercyjne Sanyo</td><td>MCO-18AIC (UV)</td><td></td></tr> <tr><td>Klasa II Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>The Baker Company</td><td>SterilGard</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Axiovision</td><td>Zeiss</td><td>Ver.4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td>Ver. 1.51r</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie żywych komórek segregacji chromosomów podczas mitozy

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomy muszą być niezawodnie i równomiernie segregowane na komórki potomne podczas podziału komórek mitotycznych. Wierność segregacji chromosomów jest kontrolowana przez wiele mechanizmów, w tym punkt kontrolny montażu wrzeciona (SAC). SAC jest częścią złożonego systemu sprzężenia zwrotnego, który jest odpowiedzialny za zapobieganie postępowi komórki poprzez mitozę, chyba że wszystkie kinetochory chromosomowe są przyłączone do mikrotubul wrzeciona. Opóźnienia chromosomowe i nieprawidłowa segregacja chromosomów są wskaźnikiem dysfunkcyjnych punktów kontrolnych kontroli cyklu komórkowego i mogą być wykorzystywane do pomiaru stabilności genomowej dzielących się komórek. Deregulacja SAC może spowodować przekształcenie normalnej komórki w komórkę złośliwą poprzez nagromadzenie błędów podczas segregacji chromosomów. Wdrożenie SAC i tworzenie kompleksu kinetochorowego są ściśle regulowane przez interakcje między kinazami a fosfatazą, taką jak fosfataza białkowa 2A (PP2A). Protokół ten opisuje obrazowanie żywych komórek opóźnionych chromosomów w fibroblastach embrionalnych myszy wyizolowanych od myszy, które miały nokaut podjednostki regulatorowej PP2A-B56γ. Metoda ta przezwycięża niedociągnięcia innych technik obrazowania kontroli cyklu komórkowego, takich jak cytometria przepływowa lub immunocytochemia, które zapewniają jedynie migawkę stanu cytokinezy komórki, zamiast dynamicznej czasoprzestrzennej wizualizacji chromosomów podczas mitozy.

MEF z myszy typu dzikiego oraz myszy PP2A-B56γ- wysiano na szkiełka nakrywkowe w komorach dwudzielnych i pozostawiono do przywarcia. W 2. dniu MEF zsynchronizowano, stosując 0,1% FBS przez 24 h. W 3. dniu MEF w pożywce z dodatkiem 200 ng/mL nocodazolu i 30 PPC CL-HB reagent inkubowano przez 18 h w temperaturze 37°C and 5% CO2. W 4. dniu komórki obrazowano przy użyciu konfokalnego systemu mikroskopowego z dyskiem obrotowym (Rysunek 1). Ob...

Ten protokół opisuje łatwą i wygodną metodę oznaczania i wizualizacji żywych chromosomów w komórkach mitotycznych za pomocą etykiety Histone2B-GFP BacMam 2.0 i systemu mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.

Obrazowanie żywych komórek segregacji chromosomów podczas mitozy

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Ogólnym celem tej metody jest znakowanie i wizualizacja żywych chromosomów w komórkach mitotycznych przy użyciu znacznika Histone 2B-GFP BacMam 2.0 i systemu mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem. Metoda ta może być wykorzystana do wizualizacji chromosomów mitotycznych w hodowanych komórkach w celu zbadania wpływu modyfikacji genetycznych lub leczenia farmakologicznego na segregację chromosomów. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia łatwą i wygodną metodę oznaczania i wizualizacji żywych chromosomów w komórkach mitotycznych.Procedurę obrazowania na żywo zademonstruje doktor Kazuyo Takeda, który prowadzi Główny Ośrodek Mikroskopii i Obrazowania w Wydziale Produktów Wirusowych w Centrum Oceny i Badań Biologicznych FDA. Mysie fibroblasty embrionalne (MEF) użyte w tym eksperymencie są hodowane w dwukomorowym szkle nakrywkowym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez noc, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnego dnia zsynchronizuj MEF w fazie G0/G1 poprzez inkubację w pożywce wzrostowej DMEM/F12 zawierającej 0,1% FBS.W dniu etykietowania należy przygotować 1,5 miligrama na mililitr roztworu podstawowego nokodazolu w DMSO. Kluczowym krokiem jest obliczenie odpowiedniej ilości cząstek CL-HB na komórkę, aby uzyskać wystarczające znakowanie do wizualizacji chromosomów bez toksyczności dla komórek. Wcześniej ustaliliśmy, za pomocą eksperymentów miareczkowych, że 30 PPC działa najlepiej.Dodaj do MEF 200 mikrolitrów pożywki wzrostowej z 10% FCS, 200 nanogramów na mililitr nokodazolu i odczynnik CL-HB przy 30 cząstkach na komórkę. Inkubuj MEF-y w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez 18 godzin. Wizualizacja MEF odbywa się za pomocą systemu mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem, wyposażonego w komorę środowiskową i soczewkę obiektywową 63X z zanurzeniem w olejku.Dzień przed obrazowaniem włącz zasilanie komory środowiskowej i rozgrzej całą komorę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia włącz zasilanie statywu mikroskopu, kamery, obracającego się zespołu dyskowego, oświetlacza, lasera argonowego, komputera i zmotoryzowanego stolika. Po rozgrzaniu systemu przez trzy minuty uruchom laser argonowy, przekręcając kluczyk zapłonu.Przełącz przełącznik lasera argonowego z trybu czuwania na bieg lasera. Uruchom oprogramowanie do akwizycji i przetwarzania danych. Zainicjuj kontroler CO2 dla inkubatora stage top i ustaw stężenie CO2 na 5%Wyjmij szklaną pokrywę z komorą z inkubatora, umieść ją na stoliku mikroskopu i wybierz soczewkę obiektywu 63X zanurzoną w oleju.Spójrz przez soczewki okularowe, ustaw ostrość obrazu i zidentyfikuj komórkę w fazie rozpadu otoczki jądrowej lub NEBD. Zainicjuj działanie 488-nanometrowego lasera argonowego, aby uwidocznić histon 2B-GFP. Otwórz okno kontroli akwizycji i ustaw czas ekspozycji dla kanału GFP.Zidentyfikuj komórkę, która znajduje się w NEBD. Następnie ręcznie określ górną i dolną płaszczyznę ogniskowej komórki i wprowadź ustawienia sekcji optycznej XYZ. Obserwuj komórkę przez 20 minut.Ważne jest, aby mieć świadomość, że ponieważ nie wszystkie komórki przejdą mitozę, postęp mitotyczny musi być aktywnie monitorowany. Jeśli komórka nie przejdzie przez podział komórkowy po 20 minutach, przerwij akwizycję obrazu i przejdź do następnej komórki, która znajduje się w NEBD. Aby uzyskać dane do filmu, rób zdjęcia co trzy minuty.Około jednej godziny na komórkę potrzeba około jednej godziny na komórkę, aby zobrazować opóźnione chromosomy podczas mitozy w komórkach gamma PP2A-B56, które uciekły z punktu kontrolnego montażu wrzeciona. Zapisz obrazy w formacie pliku ZVI do dalszej analizy. Obrazowanie żywych komórek wykorzystano do wizualizacji losu poszczególnych komórek w miarę ich postępu od NEBD do mitozy.Po leczeniu nokodazolem wszystkie 21 obserwowanych komórek typu dzikiego zostało zatrzymanych w metafazie. Natomiast z 21 zaobserwowanych komórek pozbawionych PP2A-B56-gamma, 16 było w stanie przejść mitozę po leczeniu nokodazolem. Ponadto nieprawidłową segregację chromosomową wykryto w 13 z tych MEF.Przykład komórki gamma PP2A-B56 ulegającej błędnej segregacji chromosomowej pokazano w tym klipie wideo. Po opanowaniu ta technika zajmie od trzech do czterech dni, w zależności od leczenia komórkami przed protokołem znakowania. Należy pamiętać, że jest to transfekcja przejściowa, a sygnały można wykryć tylko do pięciu dni.Protokół ten może być wykorzystany do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania związane z regulacją cyklu komórkowego, niestabilnością genomu i jakością produktów terapii komórkowej. Po opracowaniu technika ta może być wykorzystana do badania obrazowania na żywo chromosomów w wielu różnych liniach komórkowych, takich jak pierwotne linie komórkowe, komórki macierzyste, neurony i unieśmiertelnione limfocyty T. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak łatwo oznaczać i wizualizować żywe chromosomy w komórkach mitotycznych za pomocą etykiety Histone 2B-GFP BacMam 2 i systemu mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.

live-cell-imaging-of-chromosome-segregation-during-mitosis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszej pracy opisujemy podstawowy protokół obrazowania i kwantyfikacji czasu trwania mitozy w żywych komórkach ssaków hodowlanych po transfekcji siRNA.

Obrazowanie time-lapse mitozy po transfekcji siRNA

Źródło: Schumacher, D., i Sogaard-Andersen, L. Obrazowanie żywymi komórkowymi fluorescencji pełnego wegetatywnego cyklu komórkowego wolno rosnącej bakterii społecznej Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje wykorzystanie obrazowania żywych komórek do śledzenia pochodzenia chromosomów oznaczonych fluorescencją podczas podziału komórek bakteryjnych. Rejestruje dynamikę segregacji chromosomów za pomocą mikroskopii poklatkowej fazowo-kontrastowej oraz fluorescencji.

Obrazowanie poklatkowe segregacji chromosomów u bakterii znakowanych fluorescencją

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Przedstawiamy protokół podwójnej synchronizacji komórek HeLa z tymidyną, a następnie analizę za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta jest kluczem do uzyskania dużej liczby komórek, które przechodzą synchronicznie z fazy S do mitozy, umożliwiając badania nad mitotycznymi rolami wielofunkcyjnych białek, które również pełnią funkcje interfazowe.

Połączenie mitotycznej synchronizacji komórek i mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania roli wielofunkcyjnych białek cyklu komórkowego podczas mitozy

Obrazowanie żywych komórek dostarcza bogactwa informacji o pojedynczych komórkach lub całych populacjach, które są nieosiągalne przez samo obrazowanie komórek stałych. W tym miejscu opisano protokoły obrazowania żywych komórek w celu oceny decyzji dotyczących losu komórek po leczeniu lekiem antymitotycznym paklitakselem.

Długoterminowe obrazowanie żywych komórek w celu oceny losu komórek w odpowiedzi na paklitaksel

Tutaj prezentujemy obrazowanie żywych komórek, które jest nietoksyczną metodą mikroskopii, która pozwala badaczom badać zachowanie białek i dynamikę jądrową w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych podczas mitozy i mejozy.

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Podziały komórek mogą być wizualizowane w czasie rzeczywistym za pomocą fluorescencyjnie znakowanych białek i mikroskopii poklatkowej. Korzystając z przedstawionego tutaj protokołu, użytkownicy mogą analizować dynamikę czasu podziału komórki, składanie wrzeciona mitotycznego oraz kongresację i segregację chromosomów. Defekty tych zdarzeń po knockdownie genu za pośrednictwem interferencji RNA (RNAi) można ocenić i określić ilościowo.

Zastosowanie komórek Drosophila S2 do obrazowania podziału komórek na żywo

Tutaj prezentujemy protokół do oceny dynamiki powstawania wrzeciona i progresji mitotycznej. Nasze zastosowanie obrazowania poklatkowego umożliwia użytkownikowi identyfikację komórek na różnych etapach mitozy, śledzenie i identyfikację defektów mitotycznych oraz analizę dynamiki wrzeciona i losu komórek mitotycznych po ekspozycji na leki antymitotyczne.

Obrazowanie żywych komórek w celu oceny dynamiki czasu metafazy i losu komórki po perturbacjach wrzeciona mitotycznego

Mikroskopia poklatkowa jest cennym narzędziem do badania mejozy u pączkujących drożdży. Protokół ten opisuje metodę, która łączy synchronizację cyklu komórkowego, mikroskopię poklatkową i warunkowe wyczerpanie białka docelowego, aby zademonstrować, jak badać funkcję określonego białka podczas segregacji chromosomów mejotycznych.

Zastosowanie mikroskopii poklatkowej i specyficznego dla etapu zubożenia komórek białek do badania mejozy u S. cerevisiae

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Poznaj metodę obrazowania żywych chromosomów podczas mitozy w komórkach MEF przy użyciu Histone2B-GFP i mikroskopii konfokalnej. Technika umożliwia badanie segregacji chromosomów w warunkach żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek segregacji chromosomów podczas mitozy

Przeglądaj więcej filmów