Obrazowanie żywych komórek segregacji chromosomów podczas mitozy

Ogólnym celem tej metody jest znakowanie i wizualizacja żywych chromosomów w komórkach mitotycznych przy użyciu znacznika Histone 2B-GFP BacMam 2.0 i systemu mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem. Metoda ta może być wykorzystana do wizualizacji chromosomów mitotycznych w hodowanych komórkach w celu zbadania wpływu modyfikacji genetycznych lub leczenia farmakologicznego na segregację chromosomów. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia łatwą i wygodną metodę oznaczania i wizualizacji żywych chromosomów w komórkach mitotycznych.

Procedurę obrazowania na żywo zademonstruje doktor Kazuyo Takeda, który prowadzi Główny Ośrodek Mikroskopii i Obrazowania w Wydziale Produktów Wirusowych w Centrum Oceny i Badań Biologicznych FDA. Mysie fibroblasty embrionalne (MEF) użyte w tym eksperymencie są hodowane w dwukomorowym szkle nakrywkowym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez noc, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnego dnia zsynchronizuj MEF w fazie G0/G1 poprzez inkubację w pożywce wzrostowej DMEM/F12 zawierającej 0,1% FBS.

W dniu etykietowania należy przygotować 1,5 miligrama na mililitr roztworu podstawowego nokodazolu w DMSO. Kluczowym krokiem jest obliczenie odpowiedniej ilości cząstek CL-HB na komórkę, aby uzyskać wystarczające znakowanie do wizualizacji chromosomów bez toksyczności dla komórek. Wcześniej ustaliliśmy, za pomocą eksperymentów miareczkowych, że 30 PPC działa najlepiej.

Dodaj do MEF 200 mikrolitrów pożywki wzrostowej z 10% FCS, 200 nanogramów na mililitr nokodazolu i odczynnik CL-HB przy 30 cząstkach na komórkę. Inkubuj MEF-y w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez 18 godzin. Wizualizacja MEF odbywa się za pomocą systemu mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem, wyposażonego w komorę środowiskową i soczewkę obiektywową 63X z zanurzeniem w olejku.

Dzień przed obrazowaniem włącz zasilanie komory środowiskowej i rozgrzej całą komorę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia włącz zasilanie statywu mikroskopu, kamery, obracającego się zespołu dyskowego, oświetlacza, lasera argonowego, komputera i zmotoryzowanego stolika. Po rozgrzaniu systemu przez trzy minuty uruchom laser argonowy, przekręcając kluczyk zapłonu.

Przełącz przełącznik lasera argonowego z trybu czuwania na bieg lasera. Uruchom oprogramowanie do akwizycji i przetwarzania danych. Zainicjuj kontroler CO2 dla inkubatora stage top i ustaw stężenie CO2 na 5%Wyjmij szklaną pokrywę z komorą z inkubatora, umieść ją na stoliku mikroskopu i wybierz soczewkę obiektywu 63X zanurzoną w oleju.

Spójrz przez soczewki okularowe, ustaw ostrość obrazu i zidentyfikuj komórkę w fazie rozpadu otoczki jądrowej lub NEBD. Zainicjuj działanie 488-nanometrowego lasera argonowego, aby uwidocznić histon 2B-GFP. Otwórz okno kontroli akwizycji i ustaw czas ekspozycji dla kanału GFP.

Zidentyfikuj komórkę, która znajduje się w NEBD. Następnie ręcznie określ górną i dolną płaszczyznę ogniskowej komórki i wprowadź ustawienia sekcji optycznej XYZ. Obserwuj komórkę przez 20 minut.

Ważne jest, aby mieć świadomość, że ponieważ nie wszystkie komórki przejdą mitozę, postęp mitotyczny musi być aktywnie monitorowany. Jeśli komórka nie przejdzie przez podział komórkowy po 20 minutach, przerwij akwizycję obrazu i przejdź do następnej komórki, która znajduje się w NEBD. Aby uzyskać dane do filmu, rób zdjęcia co trzy minuty.

Około jednej godziny na komórkę potrzeba około jednej godziny na komórkę, aby zobrazować opóźnione chromosomy podczas mitozy w komórkach gamma PP2A-B56, które uciekły z punktu kontrolnego montażu wrzeciona. Zapisz obrazy w formacie pliku ZVI do dalszej analizy. Obrazowanie żywych komórek wykorzystano do wizualizacji losu poszczególnych komórek w miarę ich postępu od NEBD do mitozy.

Po leczeniu nokodazolem wszystkie 21 obserwowanych komórek typu dzikiego zostało zatrzymanych w metafazie. Natomiast z 21 zaobserwowanych komórek pozbawionych PP2A-B56-gamma, 16 było w stanie przejść mitozę po leczeniu nokodazolem. Ponadto nieprawidłową segregację chromosomową wykryto w 13 z tych MEF.

Przykład komórki gamma PP2A-B56 ulegającej błędnej segregacji chromosomowej pokazano w tym klipie wideo. Po opanowaniu ta technika zajmie od trzech do czterech dni, w zależności od leczenia komórkami przed protokołem znakowania. Należy pamiętać, że jest to transfekcja przejściowa, a sygnały można wykryć tylko do pięciu dni.

Protokół ten może być wykorzystany do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania związane z regulacją cyklu komórkowego, niestabilnością genomu i jakością produktów terapii komórkowej. Po opracowaniu technika ta może być wykorzystana do badania obrazowania na żywo chromosomów w wielu różnych liniach komórkowych, takich jak pierwotne linie komórkowe, komórki macierzyste, neurony i unieśmiertelnione limfocyty T. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak łatwo oznaczać i wizualizować żywe chromosomy w komórkach mitotycznych za pomocą etykiety Histone 2B-GFP BacMam 2 i systemu mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.