Optymalizacja wykorzystania robota do obsługi cieczy w celu przeprowadzenia wysokoprzepustowego badania przesiewowego genetyki chemicznej Arabidopsis thaliana

Ogólnym celem tego protokołu jest przeprowadzenie wysokoprzepustowego badania genetycznego genetyki chemicznej na siewkach rzodkiewnika. Dzięki tej metodzie możemy sprawnie i skutecznie odkrywać nowe małe cząsteczki, które wpływają na fizjologię roślin. Odkrycia te będą stanowić podstawę do dalszych badań nad procesami fizjologicznymi, takimi jak synteza ściany komórkowej.

Główną zaletą tej techniki jest to, że w krótkim czasie można przesiać dziesiątki tysięcy małych cząsteczek. Chociaż protokół ten jest przeznaczony dla modelowego gatunku rośliny Arabidopsis, można go łatwo dostosować do innych organizmów, takich jak owady, mikroorganizmy lub hodowle komórkowe. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tego protokołu, gdy dowiedzieliśmy się, że uniwersyteckie centrum genomiczne musi znaleźć dom dla robota obsługującego nadwyżki płynów.

Natychmiast zgłosiliśmy się na ochotnika, aby zdjąć go z ich rąk. Przygotuj bibliotekę rozcieńczeń i wielokanałowy automatyczny pozycjoner naczyń laboratoryjnych do mycia końcówek lub ALP zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Ręcznie załaduj wózek Stacker 10s podłączony do karuzeli układarki.

W hotelach od A do D najpierw załaduj jedno pudełko końcówek do pipet AP96 P20 do pokoju pierwszego. Następnie załaduj cztery 96-dołkowe płytki z dnem w kształcie litery V w pokojach od drugiej do piątej, przy czym dwie górne płytki zawierają stężenia zapasów z zamówionej biblioteki, a pozostałe dwie dolne płytki są puste. Dodatkowo załaduj jedno pudełko końcówek do pipet AP96 P20 do pomieszczenia szóstego.

Załaduj cztery 96-dołkowe płytki z dnem w kształcie litery V w pokojach od siódmej do dziewiątej, przy czym dwie górne płytki zawierają stężenia zapasów zamówionej biblioteki, a dwie dolne płytki są puste. Ustaw pokład z 300 mililitrami wody w zbiorniku na P3, 300-mililitrową kąpielą 70% etanolu na P7, ładowarką do końcówek ALP i wielokanałową myjką końcówek ALP. Korzystając z oprogramowania operacyjnego robota do obsługi cieczy, zaprezentuj końcówki do pipet AP96 P20 z Stacker 10 i przenieś je do Tip Loader ALP.

Umieść pokój numer dwa z hotelu A i oddziel wszystkie cztery 96-dołkowe płyty denne w kształcie litery V na pokładzie, umieszczając dwie dolne na P4 i P8, a dwie górne na P5 i P9. Załaduj końcówki do pipet AP96 P20 za pomocą podajnika końcówek ALP na 96-kanałową głowicę o pojemności 200 mikrolitrów. Odessać 90 mikrolitrów z 300-mililitrowego zbiornika na wodę i dozować do 96-dołkowej płytki rozcieńczającej z dnem w kształcie litery V na P4. Powtórz ten krok dla tabliczki na P8. Wymieszaj płytkę biblioteki chemicznej na P5, powtarzając zasysanie i trzykrotne dozowanie 15 mikrolitrów. Dodatkowo odessać 10 mikrolitrów z płytki biblioteki chemicznej na P5 i dozować 10 mikrolitrów do płytki rozcieńczającej na P4. Wymieszaj roztwory z płytki na P4, wielokrotnie zasysając i dozując łącznie 50 mikrolitrów trzy razy.

Po wymieszaniu wyczyść końcówki pipet AP96 P20, zasysając i dozując 70 mikrolitrów 70% etanolu z P7, a następnie umyj je w Multichannel Tip Wash ALP, zasysając i dozując czterokrotnie 110% objętości wody. Powtórz te czynności dla drugiej pary płytek na P8 i P9. Po utworzeniu drugiej 96-dołkowej płytki rozcieńczającej z dnem w kształcie litery V, ułóż płytki P9, P5, P8 i P4 w tej kolejności od dołu do góry. Następnie umieść stos na jednym pustym statycznym ALP.

Użyj P1, P2, P6, P10, P11, P12 lub P13. Powtarzaj te czynności, aż pokój piąty w hotelu A będzie pusty, a następnie rozpocznij proces ponownie po dotarciu do pokoju szóstego, przenosząc nowe końcówki do pipet AP96 P20 do podajnika końcówek ALP i umieszczając zużyte końcówki do pipet AP96 P20 na pustym statycznym ALP. Powtarzaj procedurę, aż pokój 9 w hotelu A będzie pusty.

Aby udać się do hotelu B, talerze i końcówki na pokładzie muszą zostać ponownie załadowane do hotelu A. Chociaż robot może pracować bez nadzoru, konieczne jest uzupełnianie zbiornika na wodę po każdym cyklu rozcieńczania. Jeśli cykl zostanie wznowiony z niewystarczającą ilością wody, robot zasysa powietrze, a chemikalia nie zostaną rozcieńczone. Ręcznie napełnij 300-mililitrowy zbiornik na wodę.

Program komputerowy może włączyć pauzę szczegółowo opisującą ten komunikat, wymagając od użytkownika naciśnięcia przycisku Kontynuuj przed wykonaniem następnego kroku. Powtórz kroki rozcieńczania dla pozostałych trzech hoteli. Ręcznie dodaj nasiona do podłoża o gęstości 0,1 grama na 100 mililitrów.

Gęstość ta daje średnio 3-10 nasion na dołek na 96-dołkowej płytce. Ręcznie umieść cztery 96-dołkowe płytki z płaskim dnem w pokojach pierwszym i drugim hotelu A.Umieść pudełko końcówek do pipet AP96 P250 na ładowarce końcówek ALP, 300-mililitrowym zbiorniku wypełnionym mieszanką pożywki i nasion na P3 oraz 300-mililitrowym zbiorniku wypełnionym 70% etanolem na P7. Za pomocą oprogramowania operacyjnego zaprezentuj pokoje pierwszy i drugi w hotelu A i oddziel stosy czterech płyt. Umieść jedną płytkę na każdym z pustych statycznych ALP, a następnie załaduj końcówki do pipet AP96 P250 na 96-kanałową głowicę o pojemności 200 mikrolitrów.

Zassać 90 mikrolitrów z 300-mililitrowego zbiornika na nasiona pożywki na P3 i dozować je do pierwszej 96-dołkowej płaskiej płytki dennej. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie osiem płytek będzie zawierało mieszaninę pożywki i nasion. Wyczyść końcówki pipet AP96 P250, zasysając i dozując 70 mikrolitrów z 300-mililitrowego zbiornika wypełnionego 70% etanolem na P7. Umyj końcówki w Multichannel Tip Wash ALP, zasysając i dozując czterokrotnie 110% objętości wody, a następnie rozładuj końcówki w TL1.

Na koniec zbierz talerze ręcznie. Ręcznie załaduj pudełko końcówek do pipet AP96 P250 do pokoju pierwszego w hotelu A. Załaduj również dwie 96-dołkowe płytki z biblioteki rozcieńczeń w kształcie litery V do pomieszczeń drugiego, czwartego, szóstego i ósmego. Załaduj dwie 96-dołkowe płaskodenne płytki sitowe do pomieszczeń trzeciego, piątego, siódmego i dziewiątego.

Korzystając z oprogramowania operacyjnego, skonfiguruj pokład tak, aby zawierał zbiornik myjący o pojemności 300 mililitrów 70% etanolu w P7. Zbiornik na nasiona pożywki można pozostawić na pokładzie w punkcie P3. Dodatkowo włącz napęd konsoli poprzez podłączenie kontrolera urządzenia, aby cyrkulować wodę przez Multichannel Tip Wash ALP. Spowoduje to automatyczne wyłączenie po zakończeniu protokołu. Przedstaw pudełko na końcówki do pipet AP96 P250 z hotelu A i przenieś je do podajnika końcówek ALP.

Następnie przedstaw 96-dołkowe tabliczki biblioteki rozcieńczania z dnem w kształcie litery V z pokoju drugiego hotelu A na pokład. Umieść jedną płytkę na statycznym ALP P4 i jedną płytkę na P8. Następnie przyłóż 96-dołkowe płaskodenne płyty przesiewowe z pokoju trzeciego hotelu A na pokład. Umieść jedną płytkę na statycznym ALP P5 i jedną na P9. Załaduj końcówki do pipet AP96 P250 za pomocą podajnika końcówek ALP na 96-kanałową głowicę o pojemności 200 mikrolitrów.

Wymieszaj 96-dołkową płytkę rozcieńczającą z dnem w kształcie litery V na P4, zasysając i dozując trzykrotnie 50 mikrolitrów. Następnie odessać 10 mikrolitrów z tej płytki i dozować do 96-dołkowej płaskiej płytki sitowej na P5. Wymieszaj roztwory na płytce w P5, zasysając i dozując trzykrotnie 50 mikrolitrów. Wyczyść końcówki pipet AP96 P250 etanolem, zasysając i dozując 70 mikrolitrów 70% etanolu ze zbiornika w P7. Następnie umyj końcówki w Multichannel Tip Wash ALP, zasysając i dozując czterokrotnie 110% objętości wody.

Powtórz te kroki dla drugiej 96-dołkowej płytki biblioteki rozcieńczeń z dnem w kształcie litery V i 96-dołkowej płytki przesiewającej z płaskim dnem. Ułóż razem dwie 96-dołkowe płytki biblioteki rozcieńczania z dnem w kształcie litery V i dwie 96-dołkowe płytki przesiewające z płaskim dnem. Przenieś płytki do statycznych ALP.

Następnie powtórz proces trzy razy, dodając rozcieńczone chemikalia do płytek sitowych w sumie osiem razy. Na koniec sprawdź liczbę nasion w każdym dołku na płytkach sitowych poprzez wizualne potwierdzenie. Uzupełnij studzienki mniej niż trzema nasionami, dodając wysterylizowane i zwernalizowane nasiona.

Bardzo ważne jest, aby podłoże, w którym rosną sadzonki, nie wysychało, ponieważ spowoduje to słabe kiełkowanie. Talerze zawierające sadzonki należy przechowywać w wysokiej wilgotności lub przechowywać w pojemnikach odpornych na wysuszenie. Inkubować 96-dołkowe płaskodenne płytki sitowe przez cztery dni w komorze środowiskowej w temperaturze 22 stopni Celsjusza w cyklu 16/8 światło/ciemność w pojemniku odpornym na wysuszanie.

Wizualizuj 96-dołkowe płaskodenne płytki przesiewowe pod mikroskopem preparacyjnym i rejestruj wszystkie nieprawidłowe fenotypy do dalszych badań. Przykładami normalnych i nieprawidłowych fenotypów są brak widocznych nieprawidłowości morfologicznych, brązowe włośniki, karłowaty korzeń, poważnie skarłowaciały korzeń, bielony, zielony śluz, niepełne kiełkowanie i brak kiełkowania. Widoczne fenotypy według wartości procentowych są wyświetlane na wykresie kołowym.

Siewki wykazywały nieprawidłowości w morfologii korzeni, pigmentacji, włośnikach i kiełkowaniu. Obejmuje również wiele innych, w tym produkcję zielonego śluzu. Po opanowaniu technika ta może znacznie zwiększyć wydajność i dokładność dużych chemicznych badań genetycznych.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o sterylizacji i wernalizacji nasion, uzupełnianiu zbiornika na wodę podczas etapów rozcieńczania, upewnieniu się, że próbki są przechowywane w pojemnikach odpornych na wysuszanie oraz że całe obrazowanie odbywa się na płytkach z płaskim dnem. W zależności od procesu fizjologicznego, który chcesz zbadać, ten wstępny ekran może być poprzedzony dodatkowymi testami, aby pomóc określić sposób działania każdej substancji chemicznej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak korzystać z robota do obsługi cieczy, aby poprawić wydajność i dokładność chemicznego badania genetycznego.