Name: Neowaskularyzacja tęczówki wywołana nakłuciem jako mysi model rubeozy tęczówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Poznaj metodę indukcji neowaskularyzacji tęczówki u myszy albino, umożliwiającą bezinwazyjną wizualizację procesów angiogenezy in vivo. Technika ta pozwala badać mechanizmy neowaskularyzacji oka i testować nowe terapie przeciwnaczyniowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Linnei Tankred i Dianie Rydholm za hodowlę zwierząt.

BALB/c mysie szczenięta obu płci zostały użyte zgodnie z oświadczeniem o wykorzystaniu zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych, a protokoły zostały zatwierdzone przez sztokholmski Komitet ds. Etycznych Badań nad Zwierzętami. Myszy były trzymane w miotach, razem z matką karmiącą, z 12-godzinnym cyklem dnia i nocy, swobodnym dostępem do pożywienia i wody oraz monitorowane codziennie.
UWAGA: Podczas zabiegu chirurgicznego, myszy były znieczulone lotnym izofluranem. Podczas zabiegów okulistycznych odradza się stosowanie maści do oczu, ponieważ mogą one zakłócać działanie zabiegów i stosowanych substancji. W razie potrzeby, aby zapobiec suchemu oku, można zastosować kroplę sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Chociaż nakłucia błony naczyniowej oka są samoregenerujące, podczas nakłuwania błony naczyniowej oka zachowano ostrożność, aby zapewnić sterylność za pomocą narzędzi chirurgicznych. Leczenie pooperacyjne obejmowało podskórne nawodnienie zwykłym roztworem soli fizjologicznej oraz analgezję polegającą na miejscowym podawaniu do oka chlorowodorku tetrakainy. Szczeniętom pozwolono dojść do stanu leżenia mostka na poduszce grzewczej, zanim zostały zwrócone karmiącej matce w czystej klatce. Mioty były trzymane z tą samą matką karmiącą, aby uniknąć stresu.
1. Znieczulenie
<ol>
	<li>Przygotuj komorę indukcyjną znieczulenia do podania znieczulenia izofluranem i upewnij się, że podłączona jest również mała maska myszy. 
	UWAGA: Wszystkie eksperymenty na zwierzętach należy przeprowadzać zgodnie ze wszystkimi obowiązującymi zezwoleniami etycznymi.</li>
	<li>Wstępnie napełnij komorę indukcyjną 3-4% lotnym izofluranem w powietrzu atmosferycznym. 
	UWAGA: Można stosować różne substancje znieczulające inne niż izofluran, zgodnie z zezwoleniami etycznymi. Lotne zabiegi znieczulające powinny być przeprowadzane na wentylowanej ławce lub okapie wyciągowym.</li>
	<li>Umieść 12,5-dniowe szczenię myszy BALB/c w komorze indukcyjnej w wieku poporodowym (P). Upewnij się, że aparat anestezjologiczny jest gotowy do podania izofluranu do komory indukcyjnej. 
	UWAGA: Szczenięta myszy są delikatne i najlepiej radzić sobie z karkiem. Trzymaj szczenięta razem jako miot lub z matką karmiącą, aby uniknąć stresu.</li>
	<li>Pozwól, aby szczenię było w pełni znieczulone.</li>
	<li>Delikatnie podnieś szczeniaka myszy za kark. 
	UWAGA: Komora indukcyjna powinna być zawsze zamknięta, aby zapewnić bezpieczną i stabilną indukcję.</li>
	<li>Przenieś mysz do maski gryzonia. Upewnij się, że przełączasz przepływ środka znieczulającego z komory indukcyjnej na maskę podczas poruszania myszą.</li>
	<li>Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby potwierdzić znieczulenie.</li>
</ol>
2. Procedura nakłucia pod stereoskopem chirurgicznym
<ol>
	<li>Ustaw mysz w bocznej pozycji leżącej. Upewnij się, że maska jest dobrze ustawiona, tak aby oko myszy znajdowało się w polu view stereoskopu.</li>
	<li>Delikatnie obróć głowicę myszy tak, aby oko było skierowane do góry w kierunku stereoskopu. 
	UWAGA: Wyraźna ostrość oka powinna być uzyskana pod stereoskopem. Do pozycjonowania zalecane jest powiększenie 16X, natomiast do wykonania zabiegu chirurgicznego należy użyć 40X. Jeśli pozwala na to etyka, przycinanie czubka wąsów może ułatwić wizualizację oka.</li>
	<li>Używając małych kleszczy do wiązania, ostrożnie wysuń oko szczeniaka, wywierając nacisk w dół na powieki grzbietowe i brzuszne do oka.</li>
	<li>Trzymaj delikatnie, ale mocno powiekę szczeniaka małymi kleszczami. 
	UWAGA: Zaleca się wykonanie wysunięcia oka i przytrzymania powieki ręką niedominującą, ponieważ ręka dominująca powinna wykonać zabieg nakłucia.</li>
	<li>Użyj stereoskopu, aby zlokalizować rąbek rogówki. Rąbek albinosa BALB/c można łatwo zidentyfikować po okrężnym splocie naczyniowym za rogówką.</li>
	<li>Za pomocą igły ze skosem o średnicy 0,25 mm (30 G) wykonaj małe nakłucie błony naczyniowej oka, w pobliżu tylnej granicy rąbka błony naczyniowej oka. Używaj tylko końcówki igły i nie więcej niż połowy skosu (co odpowiada 0,5 mm), nakłuj błonę naczyniową oka. Przy prawidłowym wykonaniu nakłucia błony naczyniowej oka są samouszczelniające, jednak wstrzyknięcie do gałki ocznej badanych substancji może być podawane przez tę samą ranę kłutą. 
	UWAGA: W przypadku anatomii oka myszy, nakłucie błony naczyniowej oka wykonuje się między ciałem rzęskowym a orą serrata. Należy zachować ostrożność podczas wykonywania nakłucia błony naczyniowej oka, aby uniknąć pęknięcia soczewki.</li>
	<li>Wykonaj drugie nakłucie błony naczyniowej oka w przeciwległym miejscu oka niż pierwsze miejsce nakłucia. Zoptymalizuj odległość i położenie nakłuć; Rozważ nakłucia na godzinie 12 i 6, przy czym godzina 12 jest jak najbardziej grzbietowa.</li>
	<li>Powtarzaj procedurę nakłucia błony naczyniowej oka co cztery dni aż do P24.5. Przed każdym kolejnym punkcją błony naczyniowej oka należy monitorować stan zwierzęcia, zwracając szczególną uwagę na obecność zaćmy pourazowej spowodowanej uszkodzeniem soczewki podczas nakłucia błony naczyniowej oka lub wyraźnym obniżeniem ciśnienia w oku. Staraj się wykonywać wielokrotne nakłucia w tych samych pozycjach, co poprzednie nakłucia, aby uzyskać optymalne efekty.</li>
</ol>
3. Nieinwazyjne monitorowanie in vivo
<ol>
	<li>Przed nakłuciem lub wstrzyknięciem w każdym dniu eksperymentalnym należy znieczulić mysz zgodnie z powyższymi ćwiczeniami.</li>
	<li>Trzymając mysz w bocznej pozycji leżącej, delikatnie wysuń oko.</li>
	<li>Skoncentruj się na unaczynieniu tęczówki za pomocą stereoskopu chirurgicznego.</li>
	<li>Zrób zdjęcie unaczynienia tęczówki za pomocą kamery zamontowanej na stereoskopie chirurgicznym. 
	UWAGA: Chociaż nie jest to konieczne, wywołanie mejozy może być pomocne w normalizacji obszaru tęczówki na zwierzę. Przy wyborze środka indukującego mejozę należy wziąć pod uwagę pozwolenia etyczne. Staranne skupienie się na unaczynieniu tęczówki ułatwi dalszą analizę ilościową. Zalecana jest wielkość 40X.</li>
</ol>
4. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Wyjmij szczeniaka BALB/c z maski gryzoni i delikatnie przenieś go na poduszkę grzewczą pokrytą matą chirurgiczną.</li>
	<li>Nanieś jedną kroplę 1% roztworu tetrakainy na przebite oczy. 
	UWAGA: Można stosować inne roztwory przeciwbólowe, zgodnie z pozwoleniami etycznymi.</li>
	<li>Nawodnić zwierzę za pomocą podskórnego wstrzyknięcia 200 μl sterylnego normalnego roztworu soli fizjologicznej.</li>
	<li>Zwróć szczenię matce karmiącej w czystej klatce dla myszy.</li>
	<li>Monitoruj proces odzyskiwania. Szczenię powinno być w stanie odprowadzić się i wrócić do miotu.</li>
</ol>
5. Wyłuszczenie oka
<ol>
	<li>Poddaj zwierzę eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Wykonaj enukleację i preparację pod stereoskopem, aby lepiej zobrazować procedurę. 
	UWAGA: Można stosować różne procedury eutanazji. Zaleca się ścisłe przestrzeganie pozwoleń etycznych.</li>
	<li>Rozsuń powieki, aby poprawić ekspozycję na oko.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie (około 0,5 cm) w pobliżu kantu powiek za pomocą zakrzywionych nożyczek do oczu Bonn.</li>
	<li>Użyj odsłoniętej przestrzeni okołogałkowej, aby umieścić mikrokleszcze wiążące za (pod) kulą ziemską na orbicie.</li>
	<li>Chwyć chusteczkę otaczającą oko i delikatnie pociągnij do góry. Unikaj trzymania się gałki ocznej, używaj otaczających tkanek bliżej oczodołu.</li>
	<li>Włóż zakrzywione nożyczki do oczu Bonn za kulę oka na orbicie.</li>
	<li>Przeciąć otaczające tkanki, aż oko zostanie uwolnione z oczodołu. 
	UWAGA: Ta technika preparacji zachowuje anatomię oka i przynosi korzyści późniejszej analizie.</li>
	<li>Przystąp do usuwania obcych tkanek z oka. Usunięcie obcych tkanek można wykonać po utrwaleniu, jeśli jest to preferowane. 
	UWAGA: Myszy BALB/c mają niedobór melaniny, dlatego w celu zwiększenia kontrastu zaleca się ciemne tło, aby ułatwić procedurę sekcji.</li>
	<li>Krótko przepłukać całe oko na szalce Petriego wypełnionej sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Przenieść oko do probówki o pojemności 2 ml zawierającej 1,5 ml 4% roztworu buforowanej formaliny.</li>
	<li>Utrwalić oko na 6 godzin w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Mocowanie nadaje sztywność tkance i ułatwia rozwarstwienie tęczówki. Czas mocowania powinien być przetestowany i dostosowany do różnych zastosowań.</li>
</ol>
6. Procedura rozwarstwienia tęczówki pod stereoskopem
<ol>
	<li>Usunąć roztwór utrwalający z probówki za pomocą plastikowej pipety Pasteura o pojemności 1,5 ml (lub podobnej) i trzykrotnie przepłukać oko świeżym PBS.</li>
	<li>Umieść stałe oko na gładkiej, suchej powierzchni (stanowisko do preparacji) z przednią komorą skierowaną do góry.</li>
	<li>Za pomocą skośnej igły 30 G wykonaj punkt wejścia za rąbkiem.</li>
	<li>Trzymając przedni odcinek małymi kleszczami do wiązania, włóż jedną końcówkę prostych nożyczek Clayman-Vannas w wcześniej utworzony otwór. 
	UWAGA: Zaleca się kontrolowanie kleszczy ręką niedominującą, a nożyczek ręką dominującą.</li>
	<li>Obracając oko za pomocą kleszczy do wiązania, przeciąć wokół rąbka, aby usunąć tylny segment oka. 
	UWAGA: Wykonywanie częściowych cięć pozwoli wewnętrznej końcówce nożyczek na kontynuowanie w tkance i znacznie ułatwi ten proces.</li>
	<li>Ustaw przedni odcinek skierowany w dół, odsłaniając soczewkę.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij soczewkę, chwytając ją małymi kleszczami i pociągając do góry. 
	UWAGA: Do nakłucia i pociągnięcia soczewki można użyć skośnej igły.</li>
	<li>Ustaw przedni odcinek z rogówką skierowaną w dół i nacięciem prostopadłym do pola widzenia.</li>
	<li>Delikatnie chwyć tkankę z tyłu ciała rzęskowego za pomocą małych kleszczy do wiązania.</li>
	<li>Za pomocą prostych nożyczek Clayman-Vannas przystąp do przycinania tuż przed ciałem rzęskowym, aby usunąć siatkę beleczkową i odizolować tęczówkę. Upewnij się, że siatka beleczkowa została usunięta; Tęczówka powinna poruszać się w rogówce.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś przednią muszlę oczną za pomocą małych kleszczy wiążących, przytrzymując rogówkę, na 96-dołkową płytkę zawierającą 200 μl PBS.</li>
	<li>Kontynuuj trzymanie rogówki w studzience i wypreparuj tęczówkę, przepłukując ją PBS pipetą. 
	UWAGA: Jeśli tęczówka nadal przylega do rogówki, może być obecna pewna siatka beleczkowa, a skos igły 30 G może być użyty, aby pomóc w przemieszczeniu tęczówki.</li>
	<li>Usuń rogówkę z 96-dołka za pomocą małych kleszczy do wiązania i trzymaj izolowaną tęczówkę w studzience do dalszej analizy.</li>
	<li>Swobodnie pływające próbki tęczówki należy przechowywać w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Pomimo zamocowania, nie zaleca się długotrwałego przechowywania swobodnie pływających próbek tęczówki.</li>
</ol>
7. Możliwe odczyty eksperymentalne
<ol>
	<li>Aby uwidocznić naczynia krwionośne w wypreparowanych tęczówkach, należy użyć swobodnie unoszących się metod barwienia immunohistochemicznego w całości dla markerów, takich jak cząsteczka adhezji komórek śródbłonka płytek krwi (PECAM)-1 lub izolektyna B4. Alternatywnie można zastosować perfuzję całego ciała z barwieniem naczyniowym, takim jak znakowany fluorescencyjnie dektrans o wysokiej masie cząsteczkowej.</li>
	<li>Nieinwazyjne obrazy in vivo można wykorzystać do płaskiego montażu in silico i określić ilościowo pełne unaczynienie tęczówki za pomocą odpowiedniego oprogramowania do obrazowania. 
	UWAGA: Układ naczyniowy można określić ilościowo, zarówno in vivo, jak i in vitro, za pomocą densytometrii lub oprogramowania do analizy naczyniowej9.</li>
	<li>Przetwórz całą gałkę oczną pod kątem kwasów nukleinowych i ekstrakcji białek, a następnie metodami PCR lub immunoblotting, aby przeprowadzić analizę molekularną przebitych oczu. 
	UWAGA: Analizę molekularną tkanek najlepiej przeprowadza się na nieutrwalonej tkance, ale rozwarstwienie nieutrwalonej tęczówki jest niezwykle trudne, a użycie całego oka dało statystycznie istotne wyniki w poprzednich badaniach8.</li>
</ol>

<ol><li>Morrison, J. C., Van Buskirk, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+collateral+circulation+in+the+primate+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Anterior collateral circulation in the primate eye.</a> Ophthalmology. 90 (6), 707-715 (1983).</li>
<li>Dreyfuss, J. L., Giordano, R. J., Regatieri, C. V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4600930/">Ocular Angiogenesis.</a> J Ophthalmol. 2015, 892043(2015).</li>
<li>Breuss, J. M., Uhrin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-initiated+angiogenesis+and+the+uPA%2FuPAR+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">VEGF-initiated angiogenesis and the uPA/uPAR system.</a> Cell Adh Migr. 6 (6), 535-615 (2012).</li>
<li>Rodrigues, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neovascular+glaucoma%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Retina+Vitreous%22%5BJournal%5D)">Neovascular glaucoma: a review.</a> Int J Retina Vitreous. 2, 26(2016).</li>
<li>Stahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+retina+as+an+angiogenesis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophth+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The mouse retina as an angiogenesis model.</a> Invest Ophth Vis Sci. 51 (6), 2813-2826 (2010).</li>
<li>DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+and+wound+repair%3A+when+enough+is+enough%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukocy+Biol%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis and wound repair: when enough is enough.</a> J Leukocy Biol. 100 (5), 979-984 (2016).</li>
<li>Eming, S., Brachvogel, B., Odorisio, T., Koch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+angiogenesis%3A+Wound+healing+as+a+model%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Histochem+Cytoc%22%5BJournal%5D)">Regulation of angiogenesis: Wound healing as a model.</a> Prog Histochem Cytoc. 42 (3), 115-170 (2007).</li>
<li>Beaujean, O., Locri, F., Aronsson, M., Kvanta, A., André, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vivo+model+of+puncture-induced+iris+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A novel in vivo model of puncture-induced iris neovascularization.</a> PloS One. 12 (6), e0180235(2017).</li>
<li>Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Computational+Tool+for+Quantitative+Analysis+of+Vascular+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A Computational Tool for Quantitative Analysis of Vascular Networks.</a> PloS One. 6 (11), (2011).</li>
<li>Dorrell, M., Uusitalo-Jarvinen, H., Aguilar, E., Friedlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+neovascularization%3A+basic+mechanisms+and+therapeutic+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Ocular neovascularization: basic mechanisms and therapeutic advances.</a> Surv Ophthalmol. 52 Suppl 1, S3-S19 (2007).</li>
<li>Kvanta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+angiogenesis%3A+the+role+of+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Ocular angiogenesis: the role of growth factors.</a> Acta Ophthalmol. 84 (3), 282-288 (2006).</li>
<li>Salman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrasilicone+Bevacizumab+Injection+for+Iris+Neovascularization+after+Vitrectomy+for+Proliferative+Diabetic+Retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">Intrasilicone Bevacizumab Injection for Iris Neovascularization after Vitrectomy for Proliferative Diabetic Retinopathy.</a> Ophthalmic Res. 49 (1), 20-24 (2013).</li>
<li>Jeong, Y. C., Hwang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etiology+and+Features+of+Eyes+with+Rubeosis+Iridis+among+Korean+Patients%3A+A+Population-Based+Single+Center+Study%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Etiology and Features of Eyes with Rubeosis Iridis among Korean Patients: A Population-Based Single Center Study.</a> PloS One. 11 (8), e0160662(2016).</li>
<li>Speier, S., Nyqvist, D., Köhler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. -O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nat Protoc. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li>
<li>Stefansson, E., Landers, M. B., Wolbarsht, M. L., Klintworth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neovascularization+of+the+Iris+-+an+Experimental-Model+in+Cats%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophth+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Neovascularization of the Iris - an Experimental-Model in Cats.</a> Invest Ophth Vis Sci. 25 (3), 361-364 (1984).</li>
<li>Nork, T. M., Tso, M., Duvall, J., Hayreh, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Mechanisms+of+Iris+Neovascularization+Secondary+to+Retinal+Vein+Occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol-Chic%22%5BJournal%5D)">Cellular Mechanisms of Iris Neovascularization Secondary to Retinal Vein Occlusion.</a> Arch Ophthalmol-Chic. 107 (4), 581-586 (1989).</li>
<li>Hjelmeland, L. M., Stewart, M. W., Li, J. W., Toth, C. A., Burns, M. S., Landers, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Experimental-Model+of+Ectropion+Uveae+and+Iris+Neovascularization+in+the+Cat%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophth+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">An Experimental-Model of Ectropion Uveae and Iris Neovascularization in the Cat.</a> Invest Ophth Vis Sci. 33 (5), 1796-1803 (1992).</li>
<li>Tolentino, M. J., Miller, J. W., Gragoudas, E. S., Chatzistefanou, K., Ferrara, N., Adamis, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+is+sufficient+to+produce+iris+neovascularization+and+neovascular+glaucoma+in+a+nonhuman+primate%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol-Chic%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor is sufficient to produce iris neovascularization and neovascular glaucoma in a nonhuman primate.</a> Arch Ophthalmol-Chic. 114 (8), 964-970 (1996).</li>
<li>Paula, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+Rubeosis+Iridis+Induced+by+Intravitreal+Latex-derived+Angiogenic+Fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Rabbit Rubeosis Iridis Induced by Intravitreal Latex-derived Angiogenic Fraction.</a> Curr Eye Res. 36 (9), 857-859 (2011).</li>
<li>Takei, A., Ekström, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Transfer+of+Prolyl+Hydroxylase+Domain+2+Inhibits+Hypoxia-inducible+Angiogenesis+in+a+Model+of+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gene Transfer of Prolyl Hydroxylase Domain 2 Inhibits Hypoxia-inducible Angiogenesis in a Model of Choroidal Neovascularization.</a> Sci Rep. 7, 42546(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym protokole przedstawiono nowatorską metodę indukcji odpowiedzi naczyniowej tęczówki poprzez nakłucie błony naczyniowej oka. Nakłucie uruchamia mechanizmy gojenia się ran i wspomaga reakcje naczyniowe w tęczówce10,11. Jest to zgodne z patologiami oczu, takimi jak PDR i NVG, w których zaostrzone odpowiedzi angiogenne z siatkówki w tylnym segmencie oka kończą się stanem klinicznym rubeozy tęczówki, zwiększonym unaczynieniem tęczówki12,1...

Tęczówka, wraz z ciałem rzęskowym i naczyniówką, obejmuje błonę naczyniową oka, która jest najbardziej unaczynioną tkanką oka. Unaczynienie tęczówki jest niezbędne do utrzymania homeostazy w przedniej komorze oka. W wyniku licznych połączeń zespoleniowych między tętnicami i żyłami, naczynia krwionośne tęczówki dostarczają składniki odżywcze i tlen nie tylko do samej tęczówki, ale do całego przedniego odcinka oka1.
Tworzenie nowych naczyń krwionośnych, czyli angiogeneza z wcześniej istniejących, ma fundamentalne znaczenie w procesach fizjologicznych, takich jak rozwój i gojenie się ran2. Angiogeneza jest precyzyjnie regulowana przez wiele czynników kanonicznych, takich jak czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) i inhibitor aktywatora plazminogenu (PAI), a także wiele czynników zapalnych, a brak równowagi tych czynników może prowadzić do patologicznej angiogenezy3.
W oku, neowaskularyzacja jest przyczyną chorób zagrażających wzrokowi, takich jak proliferacyjna retinopatia cukrzycowa (PDR) i jaskra neowaskularna (NVG). W tych chorobach oczu ogniskowa neowaskularyzacja jest zwykle zlokalizowana w tkankach siatkówki, jednak brak równowagi w czynnikach zapalnych i angiogennych zarówno w tylnej, jak i przedniej komorze oka oka jest związany z rubeozą tęczówki, klinicznym terminem określającym patologiczną neoangiogenezę tęczówki<klasa sup = "xref">4. Te patologie wskazują na zdolność dorosłej tęczówki do ulegania angiogenezie. U myszy unaczynienie oka jest niedojrzałe po urodzeniu i kontynuuje dojrzewanie po porodzie. Ta osobliwość rozwoju jest wykorzystywana w mysim modelu retinopatii indukowanej tlenem, modelu, który ściśle naśladuje stan kliniczny retinopatii wcześniaków5. Ponadto angiogeneza i stan zapalny odgrywają kluczową rolę w mechanizmach gojenia się ran6, a samo gojenie się ran zostało powiązane z modelami angiogenezy7.
W tym badaniu opisujemy model neowaskularyzacji tęczówki wywołanej nakłuciem. Nakłucia błony naczyniowej oka wykonuje się w pobliżu zewnętrznej granicy rąbka, które indukują neowaskularyzację tęczówki poprzez uruchomienie systemu gojenia się ran. Ze względu na przezroczystość rogówki, unaczynienie tęczówki można łatwo analizować in vivo metodami nieinwazyjnymi. Przebite oczy wykazują wzrost łożyska naczyniowego w tęczówce, co wiąże się ze wzrostem markerów aktywujących plazminogen i stanu zapalnego8. Prezentowany model ma ogromny potencjał jako nowe narzędzie do badania angiogenezy i badań przesiewowych związków angiogennych, a także umożliwia bezpośrednią wizualizację procesów angiogennych in vivo.

<table><tbody><tr><td>Nożyczki do oczu Bonn</td><td>Bausch & Lomb</td><td>23060</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki zakrzywione Clayman-Vannas</td><td>Bausch & Nożyczki proste Lomb</td><td>E3383 C</td><td></td></tr><tr><td>Clayman-Vannas</td><td>Bausch & Lomb</td><td>E3383 S</td><td></td></tr><tr><td>Adapter obiektywu do aparatu</td><td>Ręcznie robione</td><td>Nie dotyczy</td><td>Lub dowolny system, który umożliwia dostosowanie kamery do mikroskopu</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza 100-110 watów</td><td>Nie dotyczy</td><td></td><td>Dostępne w sklepach zoologicznych/weterynaryjnych</td></tr><tr><td>Igła skośna podskórna 30g</td><td>KDM GmBH niemcy</td><td>911914</td><td></td></tr><tr><td>Iphone 4S</td><td>Apple</td><td>Nie dotyczy</td><td>Lub inne urządzenie do pozyskiwania obrazów o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>KDG 9623</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do wiązania McPhersona</td><td>Bausch & Lomb</td><td>E1815 S</td><td></td></tr><tr><td>Mikro kleszczyki do wiązania</td><td>Bausch & Lomb</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>Minims chlorowodorek tetrakainy</td><td>Bausch & Lomb</td><td>N/A</td><td>1 % (w/v) Krople do oczu</td></tr><tr><td>Formalina buforowana neutralnie</td><td>Bioreagens</td><td>0018-40</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór soli fizjologicznej</td><td>Fresenius Kabi</td><td>210352</td><td>0,9 % (w/v) NaCl w wodzie do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>Zbilansowany i buforowany PBS pH 7,4</td></tr><tr><td>szalka Petriego 10 cm</td><td>Starstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr>szalka <tr><td>Petriego 3 cm</td><td>Starstedt</td><td>83.3900</td><td></td></tr><tr><td>Bezpieczna probówka uszczelniająca 2,0 ml</td><td>Starstedt</td><td>72.685.200</td><td>Lub dowolna probówka typu eppendorf</td></tr><tr><td>Płytka TC 96-dołkowa</td><td>Starstedt</td><td>83.3924</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa 3,5 ml</td><td>Starstedt</td><td>86.1171</td><td>Lub dowolna inna pipeta Pasteura</td></tr><tr><td>Jednostka anestezjologiczna Univentor 400</td><td>Univentor Limited</td><td>N/A</td><td>Lub równoważny regulator przepływu z komorą indukcyjną i maską do znieczulenia lotnego</td></tr><tr><td>Mikroskop chirurgiczny Wild M650</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>N/A</td><td>Lub inny stereoskop chirurgiczny lub powiększający</td></tr></tbody></table>

neowaskularyzacja tęczówki wywołana nakłuciem jako mysi model rubeozy tęczówki

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

Opisujemy model neowaskularyzacji tęczówki wywołanej nakłuciem jako ogólny model do nieinwazyjnej oceny angiogenezy. Model jest również przydatny w zwalczaniu jaskry neowaskularnej, zagrażającego wzrokowi powikłania retinopatii cukrzycowej. Metoda ta opiera się na indukcji odpowiedzi naczyniowej tęczówki poprzez serię samouszczelniających się nakłuć błony naczyniowej oka u myszy BALB / c i wykorzystuje dojrzewanie naczyń naczyniowych oka myszy po porodzie. Młode myszy przechodzą nakłucie błony naczyniowej oka od 12,5 dnia po urodzeniu, kiedy młode naturalnie otwierają oczy, do 24,5 dnia po urodzeniu. Ze względu na przezroczystość rogówki, unaczynienie tęczówki można łatwo analizować w czasie za pomocą nieinwazyjnych metod in vivo. Co więcej, półprzezroczysta tęczówka myszy BALB/c może być montowana płasko w celu szczegółowej analizy immunohistologicznej przy minimalnym niespecyficznym barwieniu tła. W tym modelu angiogeneza jest napędzana głównie przez układ zapalny i aktywujący plazminogen. Model indukowany nakłuciem jest pierwszym, który indukuje neowaskularyzację tęczówki u małych gryzoni i ma tę zaletę, że umożliwia bezpośrednią, nieinwazyjną analizę procesu angiogennego in vivo. Co więcej, model może być łączony z substancjami modulującymi angiogenność, co podkreśla jego potencjał w badaniach nad angiogenezą z perspektywy in vivo.

Szczury myszy albinos BALB/c w wieku P12,5 poddano nakłuciom błony naczyniowej, powtarzanym co czwarty dzień (dzień eksperymentalny 0, 4, 8, 12), aż do dnia P24,5. W dniu P27,5 myszy zostały uśmiercone, a tęczówki ostrożnie wypreparowane (dzień eksperymentalny 15). Przed każdą serią nakłuć w każdym dniu eksperymentalnym wykonywano zdjęcia oczu myszy za pomocą kamery przymocowanej do stereoskopu chirurgicznego, aby przeprowadzić nieinwazyjną ocenę odpowiedzi naczyniowej tęczówki. Nakłucia ...

Neowaskularyzacja tęczówki, częste powikłanie choroby niedokrwiennej siatkówki, może prowadzić do zagrażającej wzrokowi jaskry neowaskularnej. W tym miejscu opisujemy mysi protokół indukowania eksperymentalnej neowaskularyzacji tęczówki, który może być wykorzystany do nieinwazyjnej oceny substancji modulujących angiogenezę.

Neowaskularyzacja tęczówki wywołana nakłuciem jako mysi model rubeozy tęczówki

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Ogólnym celem tej procedury jest indukcja unaczynienia tęczówki, co umożliwia bezpośrednią wizualizację procesów angiogennych in vivo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie okulistyki, szczególnie w chorobach neowaskularnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje myszy albinosy, aby umożliwić bezpośrednią wizualizację naczyń krwionośnych vivo.Dzięki tej metodzie może dać wgląd w chorobę neowaskularną oka. Może być również stosowany jako ogólny model angiogenezy, na przykład do testowania nowych terapii angiogennych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ rozwarstwienie tęczówki jest trudne ze względu na mały rozmiar oka myszy.Przy odrobinie wprawy można to jednak opanować. Po znieczuleniu myszy P12.5 i przygotowaniu jej do zabiegu, umieść ją w bocznej pozycji leżącej pod stereoskopem i upewnij się, że maska jest dobrze ustawiona. Oko powinno wypełniać pole widzenia.Konieczne jest wyraźne skupienie oka. Następnie, za pomocą małych kleszczy do wiązania w dłoni niedominującej, ostrożnie wysuń oko, wywierając nacisk w dół na powieki, grzbietową i brzuszną do oka. Pomaga mocne trzymanie powieki.Zanim przejdziesz dalej, udokumentuj na zdjęciu układ naczyniowy przy 40X. Następnie użyj stereoskopu, aby zlokalizować rąbek rogówki. Rąbek myszy albinosów BALB/c można łatwo zidentyfikować jako okrężny splot naczyniowy za rogówką.Teraz, w dominującej ręce, trzymaj igłę ze skosem o rozmiarze 30 i użyj jej do wykonania małego nakłucia błony naczyniowej oka w pobliżu tylnej granicy rąbka błony naczyniowej między ciałem rzęskowym a orą serrata. Wykonaj nakłucie, używając tylko końcówki igły i nie więcej niż połowy skosu. Unikaj pęknięcia soczewki.Nakłucie powinno być samouszczelniające, ale nadal umożliwiać wstrzyknięcie do gałki ocznej badanych substancji przez ranę. Następnie należy wykonać drugie nakłucie błony naczyniowej oka w przeciwległym miejscu oka. Zoptymalizuj nakłucia, aby znajdowały się w najbardziej grzbietowej i brzusznej pozycji.Powtarzaj nakłucia błony naczyniowej oka w tych samych dwóch pozycjach co cztery dni, aż do P24.5. A przed powtórzeniem nakłucia zawsze sprawdź, czy nie ma zaćmy pourazowej. Po wyłuszczeniu oka i utrwaleniu go zgodnie z opisem w protokole tekstowym, usunąć roztwór utrwalający i trzykrotnie przepłukać oko świeżym PBS.Następnie umieść oko na gładkiej, suchej powierzchni przednią komorą do góry. Następnie włóż skośną igłę o rozmiarze 30 z tyłu do rąbka, aby utworzyć punkt wejścia. Następnie zabezpiecz przedni odcinek małymi kleszczami do wiązania i użyj prostych nożyczek Clayman-Vannas, aby przeciąć rąbek, jednocześnie obracając oko.Stosowanie częściowych cięć może ułatwić ten proces. Po zakończeniu tylny odcinek oka powinien się zwolnić. Następnie ustaw przedni odcinek w dół, aby odsłonić soczewkę.Ostrożnie wyjmij soczewkę, chwytając ją małymi kleszczami i pociągając do góry. Teraz ustaw przedni odcinek z rogówką skierowaną w dół i z nacięciem prostopadłym do pola widzenia. Następnie delikatnie chwyć tkankę za ciałem rzęskowym za pomocą małych kleszczy do wiązania w ręce niedominującej.Proste nożyczki Clayman-Vannas do przycinania tylko przed ciałem rzęskowym w celu usunięcia siatki beleczkowej i odizolowania tęczówki. Tęczówka powinna wtedy poruszać się w rogówce. Następnie użyj małych kleszczy do wiązania, aby chwycić rogówkę i ostrożnie przenieś przednią muszlę oczną na 96-dołkową płytkę zawierającą 200 mikrolitrów PBS.Utrzymuj uchwyt na rogówce i kontynuuj preparowanie tęczówki, przepłukując tkankę PBS. W razie potrzeby można użyć igły o rozmiarze 30, aby pomóc w przemieszczeniu tęczówki. Teraz usuń rogówkę za pomocą małych kleszczy do wiązania.Wyizolowana tęczówka może być następnie tymczasowo przechowywana w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu eksperymentów. Myszy albinosowe BALB / c w P12,5 poddano nakłuciom błony naczyniowej oka powtarzanym co czwarty dzień aż do P24,5, zgodnie z opisem. Ze względu na przezroczystość rogówki i niedobór melaniny u myszy BALB/c, unaczynienie tęczówki jest łatwo widoczne u szczeniąt P16,5 i nasila się przez cały czas trwania protokołu.W P27.5 myszy zostały poddane eutanazji, a ich tęczówki zostały starannie wypreparowane. Nakłucia wywołały reakcję naczyniową tęczówki, uruchamiając system gojenia się ran. Przeprowadzono immunohistochemię przeciwko PECAM1.Powstałe plamy wykazały wzrost ogólnego unaczynienia tęczówek przebitych oczu w porównaniu z grupą kontrolną. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać angiogenezę tęczówki i skutecznie wyizolować tęczówkę myszy. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak QBCR, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania molekularne i komórkowe, takie jak testowanie skuteczności substancji proangiogennych lub antyangiogennych.Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do badania chorób neowaskularnych za pomocą nieinwazyjnych metod in vivo z wykorzystaniem małych gryzoni jako modelu.

puncture-induced-iris-neovascularization-as-mouse-model-rubeosis

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W tym filmie znieczulony szczur przechodzi zabieg okulistyczny, w którym kulki magnetyczne są wstrzykiwane do przedniej komory pod wpływem pola magnetycznego w celu zablokowania kąta tęczówkowo-rogówkowego. Blokada ta blokuje siatkę beleczkową, uniemożliwiając drenaż cieczy wodnistej i prowadząc do wzrostu ciśnienia wewnątrzgałkowego, uszkadzając komórki zwojowe siatkówki i nerw wzrokowy. W ten sposób rozwija się stan podobny do jaskry.

Eksperymentalna indukcja jaskry przez niedrożność kąta tęczówkowo-rogówkowego w modelu mysim

Źródło: Lani-Louzada, R.,  i wsp., Kauteryzacja pełnego koła rąbkowego splotu naczyniowego w przypadku chirurgicznie wywołanej jaskry u gryzoni. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje indukcję i monitorowanie podwyższonego ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) w modelu szczurzym. Proces ten polega na kauteryzacji rąbkowych naczyń krwionośnych, co skutkuje niedrożnością naczyń i podwyższonym ciśnieniem wewnątrzgałkowym. Szczur może następnie wyzdrowieć, a ciśnienie wewnątrzgałkowe jest regularnie...

 Indukcja podwyższonego ciśnienia wewnątrzgałkowego w modelu szczurzym

Tutaj prezentujemy protokół neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem myszy (CNV), eksperymentalny model, który odtwarza naczyniowe cechy neowaskularnego zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD). Po opanowaniu może niezawodnie i skutecznie indukować CNV jako system modelowy do testowania różnych środków eksperymentalnych.

Mysi model do neowaskularyzacji naczyniówkowej indukowanej laserem

Ten artykuł opisuje procedurę wywoływania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego siatkówki przez podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe u myszy. Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne siatkówki spowodowane podwyższonym ciśnieniem wewnątrzgałkowym służy do modelowania ludzkich patologii charakteryzujących się upośledzonym dostarczaniem tlenu i składników odżywczych do siatkówki, umożliwiając naukowcom zbadanie potencjalnych mechanizmów komórkowych i metod leczenia chorób układu...

Mysi model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego siatkówki poprzez podniesienie ciśnienia wewnątrzgałkowego

Tutaj prezentujemy przydatność podłużnego obrazowania in vivo w obserwacji zmian morfologicznych wywołanej laserem neowaskularyzacji naczyniówkowej u myszy.

In vivo (in vivo) Multimodalne obrazowanie i analiza mysiego modelu neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem

Przewlekłe nadciśnienie oczne jest wywoływane przez zastosowanie szwu okołokończynowego u szczurów i myszy, co prowadzi do funkcjonalnego i strukturalnego pogorszenia komórek zwojowych siatkówki zgodnego z jaskrą.

Model jaskry indukowanej szwem okołolimbowym u szczurów i myszy

Retinopatia indukowana tlenem (OIR) może być używana do modelowania chorób niedokrwiennych siatkówki, takich jak retinopatia wcześniaków i proliferacyjna retinopatia cukrzycowa, a także służyć jako model dla badań potwierdzających słuszność koncepcji w ocenie leków antyangiogennych w chorobach neowaskularnych. OIR indukuje solidną i powtarzalną neowaskularyzację w siatkówce, którą można określić ilościowo.

Model retinopatii indukowanej tlenem w chorobach niedokrwiennych siatkówki u gryzoni

W tym raporcie prezentujemy protokół, który pozwala badaczowi na wygenerowanie mysiego modelu wewnątrzgałkowego zapalenia błony naczyniowej oka. Ten uznany model, częściej określany jako eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka (EAU), obejmuje wiele aspektów chorób u ludzi. W tym miejscu opiszemy, jak indukować i monitorować postęp choroby za pomocą kilku odczytów.

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka: wewnątrzgałkowy model zapalny myszy

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół do zamykania żył siatkówki za pomocą róży bengalskiej i sterowanego laserowo systemu obrazowania siatkówki z zaleceniami maksymalizacji jego odtwarzalności w genetycznie modyfikowanych szczepach.

Optymalizacja mysiego modelu niedrożności żyły siatkówki w celu ograniczenia zmienności

Celem tego protokołu jest scharakteryzowanie nowego modelu neurodegeneracji jaskry opartej na 360° termicznej kauteryzacji rąbkowego splotu naczyniowego, wywołującej podostre nadciśnienie oczne.

Kauteryzacja pełnego koła rąbka splotu naczyniowego w przypadku jaskry wywołanej chirurgicznie u gryzoni

Ten protokół modeluje uszkodzenie niedokrwienia siatkówki i reperfuzji w oku myszy poprzez wywołanie niedokrwienia siatkówki poprzez kaniulację przedniej komory i podniesienie ciśnienia wewnątrzgałkowego, a następnie normalizację ciśnienia wewnątrzgałkowego w celu zainicjowania reperfuzji.

Indukcja uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego siatkówki w modelu oka myszy

Poznaj metodę indukcji neowaskularyzacji tęczówki u myszy albino, umożliwiającą bezinwazyjną wizualizację procesów angiogenezy in vivo. Technika ta pozwala badać mechanizmy neowaskularyzacji oka i testować nowe terapie przeciwnaczyniowe.

Neowaskularyzacja tęczówki wywołana nakłuciem jako mysi model rubeozy tęczówki

Przeglądaj więcej filmów