Neowaskularyzacja tęczówki wywołana nakłuciem jako mysi model rubeozy tęczówki
8 marca 2018
Neowaskularyzacja tęczówki, częste powikłanie choroby niedokrwiennej siatkówki, może prowadzić do zagrażającej wzrokowi jaskry neowaskularnej. W tym miejscu opisujemy mysi protokół indukowania eksperymentalnej neowaskularyzacji tęczówki, który może być wykorzystany do nieinwazyjnej oceny substancji modulujących angiogenezę.
Ogólnym celem tej procedury jest indukcja unaczynienia tęczówki, co umożliwia bezpośrednią wizualizację procesów angiogennych in vivo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie okulistyki, szczególnie w chorobach neowaskularnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje myszy albinosy, aby umożliwić bezpośrednią wizualizację naczyń krwionośnych vivo.
Dzięki tej metodzie może dać wgląd w chorobę neowaskularną oka. Może być również stosowany jako ogólny model angiogenezy, na przykład do testowania nowych terapii angiogennych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ rozwarstwienie tęczówki jest trudne ze względu na mały rozmiar oka myszy.
Przy odrobinie wprawy można to jednak opanować. Po znieczuleniu myszy P12.5 i przygotowaniu jej do zabiegu, umieść ją w bocznej pozycji leżącej pod stereoskopem i upewnij się, że maska jest dobrze ustawiona. Oko powinno wypełniać pole widzenia.
Konieczne jest wyraźne skupienie oka. Następnie, za pomocą małych kleszczy do wiązania w dłoni niedominującej, ostrożnie wysuń oko, wywierając nacisk w dół na powieki, grzbietową i brzuszną do oka. Pomaga mocne trzymanie powieki.
Zanim przejdziesz dalej, udokumentuj na zdjęciu układ naczyniowy przy 40X. Następnie użyj stereoskopu, aby zlokalizować rąbek rogówki. Rąbek myszy albinosów BALB/c można łatwo zidentyfikować jako okrężny splot naczyniowy za rogówką.
Teraz, w dominującej ręce, trzymaj igłę ze skosem o rozmiarze 30 i użyj jej do wykonania małego nakłucia błony naczyniowej oka w pobliżu tylnej granicy rąbka błony naczyniowej między ciałem rzęskowym a orą serrata. Wykonaj nakłucie, używając tylko końcówki igły i nie więcej niż połowy skosu. Unikaj pęknięcia soczewki.
Nakłucie powinno być samouszczelniające, ale nadal umożliwiać wstrzyknięcie do gałki ocznej badanych substancji przez ranę. Następnie należy wykonać drugie nakłucie błony naczyniowej oka w przeciwległym miejscu oka. Zoptymalizuj nakłucia, aby znajdowały się w najbardziej grzbietowej i brzusznej pozycji.
Powtarzaj nakłucia błony naczyniowej oka w tych samych dwóch pozycjach co cztery dni, aż do P24.5. A przed powtórzeniem nakłucia zawsze sprawdź, czy nie ma zaćmy pourazowej. Po wyłuszczeniu oka i utrwaleniu go zgodnie z opisem w protokole tekstowym, usunąć roztwór utrwalający i trzykrotnie przepłukać oko świeżym PBS.
Następnie umieść oko na gładkiej, suchej powierzchni przednią komorą do góry. Następnie włóż skośną igłę o rozmiarze 30 z tyłu do rąbka, aby utworzyć punkt wejścia. Następnie zabezpiecz przedni odcinek małymi kleszczami do wiązania i użyj prostych nożyczek Clayman-Vannas, aby przeciąć rąbek, jednocześnie obracając oko.
Stosowanie częściowych cięć może ułatwić ten proces. Po zakończeniu tylny odcinek oka powinien się zwolnić. Następnie ustaw przedni odcinek w dół, aby odsłonić soczewkę.
Ostrożnie wyjmij soczewkę, chwytając ją małymi kleszczami i pociągając do góry. Teraz ustaw przedni odcinek z rogówką skierowaną w dół i z nacięciem prostopadłym do pola widzenia. Następnie delikatnie chwyć tkankę za ciałem rzęskowym za pomocą małych kleszczy do wiązania w ręce niedominującej.
Proste nożyczki Clayman-Vannas do przycinania tylko przed ciałem rzęskowym w celu usunięcia siatki beleczkowej i odizolowania tęczówki. Tęczówka powinna wtedy poruszać się w rogówce. Następnie użyj małych kleszczy do wiązania, aby chwycić rogówkę i ostrożnie przenieś przednią muszlę oczną na 96-dołkową płytkę zawierającą 200 mikrolitrów PBS.
Utrzymuj uchwyt na rogówce i kontynuuj preparowanie tęczówki, przepłukując tkankę PBS. W razie potrzeby można użyć igły o rozmiarze 30, aby pomóc w przemieszczeniu tęczówki. Teraz usuń rogówkę za pomocą małych kleszczy do wiązania.
Wyizolowana tęczówka może być następnie tymczasowo przechowywana w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu eksperymentów. Myszy albinosowe BALB / c w P12,5 poddano nakłuciom błony naczyniowej oka powtarzanym co czwarty dzień aż do P24,5, zgodnie z opisem. Ze względu na przezroczystość rogówki i niedobór melaniny u myszy BALB/c, unaczynienie tęczówki jest łatwo widoczne u szczeniąt P16,5 i nasila się przez cały czas trwania protokołu.
W P27.5 myszy zostały poddane eutanazji, a ich tęczówki zostały starannie wypreparowane. Nakłucia wywołały reakcję naczyniową tęczówki, uruchamiając system gojenia się ran. Przeprowadzono immunohistochemię przeciwko PECAM1.
Powstałe plamy wykazały wzrost ogólnego unaczynienia tęczówek przebitych oczu w porównaniu z grupą kontrolną. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać angiogenezę tęczówki i skutecznie wyizolować tęczówkę myszy. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak QBCR, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania molekularne i komórkowe, takie jak testowanie skuteczności substancji proangiogennych lub antyangiogennych.
Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do badania chorób neowaskularnych za pomocą nieinwazyjnych metod in vivo z wykorzystaniem małych gryzoni jako modelu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół mysi służący do indukowania neowaskularyzacji tęczówki, stanu powiązanego z niedokrwienną chorobą siatkówki oraz jaskrą neowaskularną. Metoda ta umożliwia nieinwazyjną ocenę substancji modulujących angiogenezę poprzez bezpośrednią wizualizację in-vivo naczyń krwionośnych tęczówki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Okulistyka
- Angiogeneza
- Choroby naczyniowe
Wstęp
- Neowaskularyzacja tęczówki może zagrażać wzrokowi.
- Zrozumienie angiogenezy jest kluczowe dla opracowania terapii.
- Użycie myszy albinosów ułatwia wizualizację naczyń krwionośnych.
- Wyzwaniem jest sekcja tęczówki ze względu na niewielki rozmiar oka myszy.
Cel badania
- W celu indukcji naczyń tęczówki do badań in-vivo.
- W celu uzyskania wiedzy na temat naczyniowych chorób neowaskularyzacyjnych oka.
- W celu przetestowania nowych terapii angiogennych.
Zastosowane metody
- Indukcja neowaskularyzacji tęczówki u myszy albinosów.
- Techniki wizualizacji in vivo.
- Eksperymentalna ocena substancji modulujących angiogenezę.
- Prezentacja technik sekcji tęczówki.
Główne wyniki
- Skuteczna indukcja neowaskularyzacji tęczówki.
- Efektywna wizualizacja procesów angiogennych.
- Pozyskanie wiedzy na temat mechanizmów chorób neowaskularnych.
- Potencjalne zastosowania w testowaniu nowych terapii.
Wnioski
- Metoda ta stanowi wartościowe narzędzie do badania neowaskularyzacji tęczówki.
- Umożliwia ona lepsze zrozumienie naczyniowych chorób oka.
- W przyszłych badaniach model ten można wykorzystać do testowania terapii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Model ten umożliwia nieinwazyjną, podłużną ocenę procesów angiogennych w tęczówce, wspierając wczesną walidację celów dla terapii naczyniowo-nowotworowych. Wykorzystując przezroczystość oczu myszy albinosów, zapewnia on skalowalną platformę do oceny modulatorów angiogenezy w istotnym dla choroby kontekście okulistycznym. Podejście to zmniejsza zależność od histologii końcowej i zwiększa pewność prognostyczną w przedklinicznym przesiewie angiogenezy.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie szlaków angiogennych poprzez indukowalną neowaskularyzację tęczówki wywołaną przez układy zapalne i aktywatorów plazminogenu.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez powtarzalne, samouszczelniające się nakłucia naczyniówki, które wywołują mierzalną odpowiedź naczyniową.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie bezpośredniej wizualizacji in-vivo modulacji angiogenezy w czasie.
Przesiewanie i opracowywanie testu
- Wartość naukowa: Zapewnia mierzalny odczyt angiogenny za pomocą immunohistochemii PECAM1 oraz nieinwazyjnego obrazowania in vivo przez przezroczystą rogówkę.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzowaną, powtarzalną indukcję naczyniową co cztery dni od P12.5 do P24.5, co wspiera powtarzalność testu.
- Wartość skalowalności: Jest kompatybilna z przygotowaniem preparatów płaskich z półprzezroczystych tęczówek myszy BALB/c do wysokorozdzielczej analizy immunohistochemicznej z niskim tłem.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Modeluje patogenezę jaskry neowaskularnej, będącej zagrażającą wzrokowi powikłaniem retinopatii cukrzycowej, co zwiększa istotność badawczą w kontekście choroby.
- Ciągłość przedkliniczna: Umożliwia testowanie substancji pro- lub antyangiogennych in vivo, stanowiąc pomost między fazą odkryć a oceną terapeutyczną.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Pozwala na podłużny monitoring odpowiedzi naczyniowej, wspierając decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o skuteczność angiogenną.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkrywania procesów angiogenezy, od testowania hipotez dotyczących celów molekularnych po przedkliniczną walidację skuteczności modulatorów, szczególnie w programach badawczych nad naczyniowymi chorobami oczu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez indukcję angiogenezy za pomocą gojenia ran i wyzwalaczy zapalnych w tęczówce.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki naczyniowe, odpowiednie do przesiewowego badania substancji angiogennych w kontekście żywej tkanki.
- Analityka: Umożliwia analizę gęstości i morfologii naczyń poprzez barwienie PECAM1 oraz obrazowanie in-vivo, co ułatwia porównawczą ocenę warunków.
- Badania translacyjne: Modeluje mechanizmy ludzkiego jaskry neowaskularnej, wspierając przedkliniczną walidację zgodną z biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę indukcji naczyniowej, możliwą do zastosowania w wielu projektach skoncentrowanych na angiogenezie.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność w odniesieniu do celu poprzez modelowanie neowaskularyzacji tęczówki przypominającej ludzką, napędzanej przez zachowane szlaki angiogenne.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji czasu nakłucia, wyboru miejsca oraz monitorowania pooperacyjnego w przypadku zaćmy urazowej.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego, nieinwazyjnego odczytu skuteczności, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnym etapie.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów angiogennych skorygowaną o ryzyko, w oparciu o in-vivo odpowiedź naczyniową tęczówki.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach mikrochirurgicznych, w tym w nakłuciu naczyniówki i izolacji tęczówki pod kontrolą stereoskopową.
- Zależne od instrumentarium, takiego jak igły skośne 30G, pincety do wiązania i nożyczki Claymana-Vannasa, niezbędne do precyzyjnej manipulacji tkankami.
- Wymaga standaryzacji protokołów dotyczących czasu nakłuć (co 4 dni od P12.5 do P24.5) oraz monitorowania pooperacyjnego w celu zapewnienia spójności modelu.
- Kwestie adaptacyjne obejmują różnice w pigmentacji szczepów myszy oraz przezroczystość rogówki, co wpływa na jakość wizualizacji naczyń.
- Ograniczenia praktyczne obejmują trudności techniczne przy dysekcji tęczówki ze względu na niewielki rozmiar oka, co wymaga przeszkolenia w celu niezawodnej izolacji tkanek.
