Test mikromacierzy białkowej do serologicznego oznaczania odpowiedzi przeciwciał specyficznych dla antygenu po zakażeniu Clostridium difficile

Metoda ta może pomóc w optymalizacji i doborze klinicznie użytecznych immunoterapii zakażenia Clostridium difficile w sposób specyficzny dla pacjenta oraz w wyjaśnieniu odpowiedzi immunologicznej człowieka na Clostridium difficile. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona dokładne i jednoczesne oznaczanie ilościowe odpowiedzi przeciwciał swoistych dla wielu izotypów i szczepów na antygeny C.difficile. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ wymagana jest wiedza specjalistyczna w tworzeniu i optymalizacji panelu wysoce oczyszczonych antygenów oraz tworzeniu platformy technologicznej.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ typy list metodologicznych związanych z przygotowaniem płytki mikrofalowej, drukowaniem tablic, bezpieczną procedurą i analizą danych wymagają zwrócenia uwagi na szczegóły. Część procedury zademonstruje Sam Greenwood, technik z mojego laboratorium. Na początek rozcieńczyć antygeny Clostridium difficile i bufor drukarski do optymalnego stężenia.

Następnie przenieś 10 mikrolitrów roztworu antygenu na płytkę 384-dołkową. Przykryj płytkę uszczelką płytkową i odwiruj przy 300-krotności grawitacji przez pięć minut w temperaturze pokojowej. W przypadku drukowania z mikromacierzy użyj ręcznego palnika gazowego, aby podgrzać silikonowy kod PIN trzy razy przez dwie sekundy każdy.

Następnie opłucz silikonowy PIN w czystej wodzie trzy razy przez trzy sekundy każdy. Umieść płytkę mikromacierzy w kasecie ładującej matrycy. Wysuń tackę, a następnie umieść szkiełka aminosilanowe w tacy na suwak i naciśnij przycisk OK, aby włączyć próżnię.

Upewnij się, że wszystkie slajdy są zabezpieczone, a następnie kliknij przycisk OK. Umieść tacę z powrotem w punkcie początkowym i zamknij pokrywę. Następnie uruchom odpowiedni program i przejdź do Plik, następnie Parametry mikromacierzy, a następnie Otwórz. Wybierz plik Clostridium difficile, aby wydrukować wszystkie antygeny w poczwórnym powiększeniu.

W tym oknie otwórz kartę Źródło, aby wskazać magazyn próbki, i kartę Cel, aby wprowadzić szczegóły mikromacierzy. Następnie otwórz kartę Opcje, aby wybrać narzędzie do mycia. Na karcie Ogólne w oknie Preferencje uruchamiania na pasku narzędzi pakietu aplikacji TAS wybierz opcję Umyj na początku uruchamiania i Umyj na końcu uruchomienia.

Otwórz kartę Klimat i ustaw poziom wilgotności w zakresie od 55 do 60%Teraz rozpocznij bieg i okresowo sprawdzaj tablicę, aby zapewnić prawidłowe działanie. Po wydrukowaniu ostrożnie umieść wydrukowane szkiełka w uchwycie na szkiełka z 16 komorami wielodołkowymi. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 5% BSAT do każdego bloku.

Przykryj szkiełka i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej, potrząsając. Użyj 120 mikrolitrów PBST, aby umyć każdy blok pięć razy po jednej minutę z potrząsaniem. Następnie rozmrażaj próbki surowicy uzyskane od pacjentów zakażonych C. difficile i zdrowych osób z grupy kontrolnej na lodzie przez 20 minut.

Dodaj dostępny w handlu rozcieńczalnik przeciwciał do bloku głównego, a następnie dodaj próbki do bloku głównego i wymieszaj. Odrzucić bufor do przemywania i dodać 100 mikrolitrów każdej rozcieńczonej próbki do bloków doświadczalnych. Do bloku kontroli ujemnej dodać 100 mikrolitrów samego rozcieńczalnika przeciwciał.

Następnie inkubuj szkiełka przez godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Następnie użyj 120 mikrolitrów PBST, aby umyć każdy blok pięć razy przez trzy minuty, każdy z potrząsaniem. Następnie do każdego bloku dodać 100 mikrolitrów biotynylowanego koziego przeciwciała anty-ludzkiego rozcieńczonego w rozcieńczalniku przeciwciał.

Przykryj szkiełka i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Użyj 120 mikrolitrów PBST, aby umyć każdy blok pięć razy przez trzy minuty, każdy z potrząsaniem. Następnie dodaj 100 mikrolitrów koniugatu streptawidyny SY5 rozcieńczonego w 5% BSAT, w stosunku od jednego do dwóch tysięcy na każdy blok.

Przykryj szkiełka folią i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Najpierw umyj szkiełka 120 mikrolitrami PBST pięć razy po jednej minucie każde, a następnie umyj je jeszcze dwa razy po jednej minutę za pomocą PBS. Aby wysuszyć szkiełka, obracaj je przez pięć minut przy 300-krotności grawitacji.

Włącz skaner laserowy na 30 minut przed skanowaniem, aby mógł się rozgrzać. Następnie umieść szkiełko w skanerze zadrukowaną powierzchnią skierowaną do góry, aż kontrolka płytki zaświeci się na zielono. Następnie naciśnij przycisk Ustawienia.

Na pierwszej karcie upewnij się, że opcje Automatyczne przewijanie i Kod kreskowy nie są zaznaczone. Następnie ustaw rozmiar piksela na 10, tryb skanowania na średni, akwizycję tylko na 635, tryb akwizycji na ręczny, wzmocnienie na 20 i moc na niską. Na drugiej karcie upewnij się, że typ slajdu nie jest oznaczony etykietą.

Na trzeciej karcie ustaw Ostrość na Autofokus. Naciśnij przycisk importu siatki, aby wybrać odpowiednią listę macierzy powiązaną z zeskanowanym obrazem. Następnie naciśnij przycisk automatycznego wyszukiwania, aby wyrównać siatkę do miejsc na slajdzie.

Na koniec naciśnij przycisk Proces kwantyfikacji, aby zmierzyć intensywność fluorescencji każdej plamki. Następnie zapisz wyniki w odpowiednim formacie do dalszej analizy. W tym protokole mikromacierz białkowa jest porównywana z testem ELISA w celu oceny odtwarzalności między tymi dwiema technikami.

Analiza współczynnika korelacji Spearmana wykazuje istotną zgodność między mikromacierzą a testem ELISA w wykrywaniu poziomów IgG, antytoksyny A i antytoksyny B w próbkach surowicy. Odtwarzalność testu wstępnego i testu międzytestowego mikromacierzy białkowej oblicza się na podstawie próbek surowicy siedmiu pacjentów. Próbki analizowane na dwóch różnych szkiełkach macierzystych przeciwko antygenom toksyny A, toksyny B, SLP001, SLP002, SLP027, toksyny B z toksyny B wytwarzającej tylko szczep CCUG i antygenów pCDTb wykazują dobrą odtwarzalność.

Mikromacierz białkowa jest wykonywana w celu wykrycia specyficznej dla izotypu odpowiedzi przeciwciał przeciwko toksynom Clostridium difficile. Próbki surowicy pacjentów i osób zdrowych służą do wykrywania poziomów IgG i IgA wobec toksyny A, toksyny B, toksyny B z toksyny C difficile wykazującej tylko ekspresję szczepu B oraz formy prekursorowej fragmentu B toksyny binarnej. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu siedmiu godzin.

W eksperymencie kontroli jakości, przed uruchomieniem próbek należy ocenić różne parametry, takie jak dobór odpowiedniej chemii powierzchni, drukarskie, blokujące oraz rozcieńczenia próbek surowicy i przeciwciał drugorzędowych. Drukowanie tablicy wysokiej jakości wymaga dobrego zrozumienia macierzy lub oprogramowania w celu dostosowania drukowania parametrów zgodnie z protokołem eksperymentalnym. Kluczowe znaczenie ma utrzymanie optymalnej wydajności macierzy i środowiska wolnego od kurzu przez cały czas trwania eksperymentu.

Technika ta utoruje drogę naukowcom w dziedzinie immunologii i biologii molekularnej, w zakresie charakteryzowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej na infekcję i odkrywania antygenów serodiagnostycznych. Nie zapominaj, że praca z zakażonymi próbkami krwi i toksynami bakteryjnymi może być niebezpieczna. Ogólnie rzecz biorąc, w laboratorium podczas wykonywania tej procedury należy zawsze brać pod uwagę bezpieczeństwo i standardowe środki ostrożności.