Name: Test mikromacierzy białkowej do serologicznego oznaczania odpowiedzi przeciwciał specyficznych dla antygenu po zakażeniu Clostridium difficile (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj metodę mikromacierzy białkowej do profilowania odpowiedzi immunologicznych przeciwko antygenom Clostridium difficile w surowicach ludzkich. Technika umożliwia jednoczesną ilościową analizę przeciwciał wielu izotypów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez stypendium Hermesa dla Oli Negm i Tanyi Monaghan oraz przez oddzielne fundusze z Centrum Chorób Trawiennych w Nottingham i Centrum Badań Biomedycznych Chorób Trawiennych NIHR w Nottingham.

1. Przygotowanie płytki z mikromacierzą
<ol>
	<li>Rozcieńczyć antygeny C. difficile buforem drukującym [PBS-Tween-trehaloza (50 mM)] w optymalnym stężeniu (które zostało wstępnie określone przed uruchomieniem surowic pacjenta): toksyna A (200 μg/ml) i toksyna B (100 μg/ml), pCDTb (200 μg/ml) oraz oczyszczone natywne całe SLP pochodzące z rybotypów 001, 002 i 027 (200 μg/ml). 
	UWAGA: Toksyna B została uzyskana ze szczepu CCUG 20309 wykazującego ekspresję toksyny B (90 μg/ml).
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć kontrole pozytywne, lizaty C. albicans i toksoid tężcowy buforem drukującym o stężeniu 100 μg/ml. Na koniec rozcieńczyć oczyszczoną ludzką immunoglobulinę pasującą do badanego izotypu przeciwciała szeregowo, zaczynając od 50 μg/ml w 10 rozcieńczeniach w buforze drukującym, aby utworzyć krzywą kalibracyjną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść 10 μl rozcieńczeń z buforu drukarskiego do płytki 384-dołkowej.</li>
	<li>Przykryć płytkę uszczelką płytkową i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.</li>
</ol>
2. Drukowanie tablic za pomocą robota kontaktowego
<ol>
	<li>Podgrzej silikonowy kołek za pomocą ręcznego palnika gazowego 3x 2 s każdy i spłucz w czystej wodzie 3x 3 s każdy.</li>
	<li>Umieść płytkę mikromacierzy w kasecie ładującej matrycy.</li>
	<li>Umieścić szkiełka aminozylowe na tacy na szkiełka. 
	UWAGA: Taca na slajdy może pomieścić 27 slajdów: trzy rzędy po dziewięć szkiełek. Szkiełka są ułożone w orientacji pionowej, zaczynając od lewej strony dolnego rzędu, a reszta przestrzeni jest pokryta pustymi slajdami, aby upewnić się, że wszystkie otwory na tacy na suwak są zakryte.
	<ol>
		<li>Naciśnij OK i sprawdź, czy odkurzacz został włączony i czy wszystkie prowadnice są zabezpieczone. Pozostaw szkiełka w wilgotnym środowisku na co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem drukowania. 
		UWAGA: Szkiełka aminozlane są dostarczane w szczelnie zamkniętym woreczku ze środkiem osuszającym. Po otwarciu wszelkie niewykorzystane szkiełka należy natychmiast zwrócić do eksykatora w celu przechowywania do upływu terminu ważności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj odpowiedni program drukowania, aby wydrukować antygeny Clostridium difficile. Uruchom pakiet aplikacji TAS i otwórz wymagany plik parametrów drukowania z katalogu "My Gridding Runs". Wybierz plik Clostridium difficile, aby wydrukować wszystkie antygeny Clostridium difficile w kwadransie.</li>
	<li>Po dwukrotnym kliknięciu ikony MicroArray w oknie głównym pojawi się okno z trzema zakładkami o nazwie "Parametry mikromacierzy". Trzy zakładki to "Źródło", "Cel" i "Opcje". Zakładka "Źródło" pokazuje szczegóły dotyczące liczby próbek użytych w płytce mikromacierzy. Zakładka "Cel" pokazuje szczegóły dotyczące sposobu wczytywania slajdów, miejsca, w którym należy wydrukować tablicę na slajdzie i edytować układ slajdu (16 formatów podtablic). Zakładka "Opcje" zawiera szczegółowe informacje na temat protokołu prania i narzędzia, którego należy użyć, np. umyć po każdej wypełnionej próbce. Wyczyść silikonową szpilkę między próbkami, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego między różnymi próbkami. </li>
	<li>Opcje programowania znajdują się w obszarze Opcje>Preferencje uruchamiania na pasku narzędzi TAS Application Suite. W tej sekcji znajduje się 9 zakładek do przepracowania, a po zakończeniu jednej karty przejdź do następnej, klikając ją. Kliknięcie przycisku "OK" przeniesie Cię z "Preferencji uruchamiania". W zakładce "Ogólne" w "Preferencjach uruchamiania" w tej sekcji dostępnych jest kilka pól wyboru odnoszących się do tego, jak instrument będzie się zachowywał po uruchomieniu programu. Zaznacz pole "Kąpiel gruntowa przed rozpoczęciem pracy", wszystkie trzy stacje mycia zostaną poddane krótkiej sekwencji zalewania przed rozpoczęciem pracy. Zaznacz pole "Myj na początku pracy", narzędzie do szpilek zostanie umyte przed pierwszą wizytą u źródła. Zaznacz pole "Umyj na końcu przebiegu", narzędzie do szpilek zostanie umyte po ostatniej wizycie u źródła. Użytkownik może ustawić liczbę cykli prania. W zakładce "Klimat" w "Preferencjach uruchamiania" uruchom nawilżanie. Ustawienia, których używamy, są następujące: szybkość startu 55%, szybkość pracy 55%, minimalna wilgotność 55%, wilgotność docelowa 60%. Nie rozpoczynaj biegu, dopóki nie zostanie osiągnięta docelowa wilgotność, w przeciwnym razie plamy będą miały niewłaściwy rozmiar, a biblioteka szybko wyparuje.</li>
	<li>Na pasku menu TAS kliknij zielony przycisk Go. Uruchom przebieg i okresowo obserwuj macierz podczas drukowania, aby upewnić się, że wszystko jest w porządku. 
	Uwaga: Umożliwia to analizę 15 próbek równolegle na każdym szkiełku, ponieważ jedna podtablica jest używana jako kontrola ujemna. Konstrukcja podmacierzy zależy od liczby drukowanych białek (antygenów) i liczby drukowanych kontrprób biologicznych. 
	Uwaga: Po wydrukowaniu każdej próbki głowica przesuwa się w kierunku kąpieli myjących, aby umożliwić wielokrotne zanurzenie szpilki w dwóch kąpielach myjących zawierających wodę destylowaną i 0,002% Tween 20 przez 1,5 s w każdej kąpieli, a następnie płukanie szpilki ultraczystą wodą i suszenie szpilki w głównej stacji mycia przez 4 s.</li>
</ol>
3. Przechowywanie tablic
<ol>
	<li>Wydrukowane szkiełka należy przechowywać przez noc w temperaturze pokojowej w eksykatorze. 
	UWAGA: Wydrukowane preparaty można przechowywać przez okres do jednego tygodnia.</li>
</ol>
4. Sondowanie tablicowe
<ol>
	<li>Ostrożnie umieść wydrukowane szkiełka w uchwycie na szkiełka w formacie 16 komór wielodołkowych. 
	UWAGA: Komory o głębokości około 7,5 mm zapewniają duży stosunek powierzchni do objętości, aby ułatwić etapy mieszania i mycia.</li>
	<li>Przed użyciem pozwól wszystkim odczynnikom ogrzać się do temperatury pokojowej. O ile nie określono inaczej, wykonaj wszystkie poniższe czynności w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 100 μl przefiltrowanej 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSAT; użyć filtra strzykawkowego 0,2 μm) do każdego bloku, przykryć szkiełka i inkubować je wytrząsając przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przemyć szkiełka 5 x po 1 minutę w 120 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami za pomocą Tween 20 (PBST; 0,1% Tween) na studzienkę, wstrząsając. Nie pozwól, aby szkiełka wyschły.</li>
	<li>Rozmrażać próbki surowicy na lodzie przez 20 minut i rozcieńczyć każdą próbkę dostępnym w handlu rozcieńczalnikiem przeciwciał ze składnikiem redukującym tło (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Zoptymalizować rozcieńczenie próbek surowicy zgodnie z badaną immunoglobuliną, jak pokazano w Tabeli 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść 100 μl rozcieńczonych próbek surowicy do wszystkich bloków z wyjątkiem jednego, który będzie użyty jako kontrola ujemna; do tego bloku dodać tylko 100 μl rozcieńczalnika przeciwciał. Inkubować szkiełka z delikatnym mieszaniem przez 1 godzinę.</li>
	<li>Umyj szkiełka 5 x 3 minuty każda w 120 μl PBST (0,1% Tween) na studzienkę, wstrząsając.</li>
	<li>Dodać 100 μl biotynylowanego koziego przeciwciała antyludzkiego rozcieńczonego rozcieńczalnikiem przeciwciał.
	<ol>
		<li>Zoptymalizuj rozcieńczenie przeciwciała drugorzędowego zgodnie z badaną immunoglobuliną, jak opisano w tabeli 2. Przykryj szkiełka i inkubuj je delikatnie potrząsając przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyć szkiełka 5 x 3 minuty każde w 120 μl PBST na studzienkę, wstrząsając.</li>
	<li>Dodać 100 μl streptawidyny Cy5 do każdego bloku rozcieńczonego w stosunku 1:2000 w 5% BSA. Przykryj szkiełka folią, aby chronić je przed światłem, potrząsając przez 15 minut z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Przemyć szkiełka 5 razy po 1 minutę w 120 μl PBST na studzienkę z wytrząsaniem, a następnie 2 płukania po 1 minutę każde w PBS tylko z wstrząsaniem.</li>
	<li>Wiruj szkiełka przez 5 minut w temperaturze 300 x g, aby je wysuszyć.</li>
	<li>Szkiełka należy przechowywać w ciemnym pudełku do transportu i przechowywania w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Natychmiast przystąp do skanowania macierzy, aby zapewnić spójność sygnału po sondowaniu. 
	UWAGA: Jednak szkiełka z sondą mogą być przechowywane w ciemności i skanowane w ciągu tygodnia od sondowania.</li>
</ol>
5. Skanowanie tablic
<ol>
	<li>Włącz skaner laserowy (patrz tabela materiałów) 30 minut przed skanowaniem, aby rozgrzać laser. Prześlij oprogramowanie skanera i podłącz komputer do skanera.</li>
	<li>Umieść slajd zadrukowaną stroną do góry w skanerze, aż kontrolka odtwarzania zaświeci się na zielono.</li>
	<li>Naciśnij przycisk Ustawienia i dostosuj następujące ustawienia podczas skanowania slajdów w następujący sposób: Tryb skanowania, Mediana; nabycie, tylko 635; Tryb akwizycji, ręczny; Zysk, 20; moc, niska; Typ slajdu, slajd bez etykiety; Ostrość, autofokus. Wyłącz automatyczne przewijanie i ustaw Odczyt kodów kreskowych na Rozmiar piksela 10 i Skanuj 35.</li>
	<li>Wynikowe obrazy można zapisać w 16-bitowym formacie TIFF z wieloma obrazami w skali szarości. Naciśnij przycisk Importuj siatkę i wybierz odpowiednią listę tablic. 
	UWAGA: Lista tablic opisuje rozmiar i położenie podtablic oraz nazwy drukowanych substancji powiązanych z każdym wskaźnikiem funkcji.
	<ol>
		<li>Dopasuj siatkę do miejsc na slajdzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizuj obrazy, naciskając przycisk procesu kwantyfikacji, aby zmierzyć intensywność sygnału fluorescencji każdego punktu i zapisać wyniki w formacie tekstowym o nazwie GenePix Results (GPR). 
	UWAGA: Plik georadarowy zawiera zmienne lokalizacyjne i identyfikacyjne celów antygenowych na tablicy, a także medianę intensywności fluorescencji i lokalne tło, które reprezentuje wartości sygnału wiązania przeciwciał w każdym punkcie.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Oblicz medianę dla powtórzeń każdego antygenu po odjęciu tła za pomocą bezpłatnego oprogramowania do analizy mikromacierzy o nazwie analizator macierzy białek z odwróconą fazą (RPPA), modułu w języku statystycznym R w CRAN36.</li>
	<li>Wykreślić krzywą wzorcową i interpolować sygnały każdego antygenu w stosunku do krzywej wzorcowej immunoglobuliny za pomocą komercyjnego oprogramowania do tworzenia wykresów naukowych i statystyk (patrz tabela materiałów) w celu obliczenia poziomów przeciwciał.</li>
</ol>

<ol><li>Negm, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+humoral+immune+responses+to+Clostridium+difficile.-specific+antigens+by+protein+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).</li>
<li>Monaghan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+subclass-specific+binding+and+neutralizing+antibodies+against+Clostridium+difficile.+toxins+in+adult+cystic+fibrosis+sera%3A+possible+mode+of+immunoprotection+against+symptomatic+C.+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">High prevalence of subclass-specific binding and neutralizing antibodies against Clostridium difficile. toxins in adult cystic fibrosis sera: possible mode of immunoprotection against symptomatic C. difficile infection.</a> Clinical and Experimental Gastroenterology. 10, 169-175 (2017).</li>
<li>Negm, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+antibodies+against+Clostridium+difficile.+are+present+in+intravenous+immunoglobulin+and+are+retained+in+humans+following+its+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective antibodies against Clostridium difficile. are present in intravenous immunoglobulin and are retained in humans following its administration.</a> Clinical & Experimental Immunology. 188 (3), 437-443 (2017).</li>
<li>Monaghan, T., et al. <a target="_blank" href="http://gut.bmj.com/content/66/Suppl_2/A31.1">OC-058 A protein microarray assay for predicting severe outcomes in Clostridium difficile infection.</a> Gut. 66, Suppl. 2 31(2017).</li>
<li>Bacon, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+G+directed+against+toxins+A+and+B+of+Clostridium+difficile+in+the+general+population+and+patients+with+antibiotic-associated+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin G directed against toxins A and B of Clostridium difficile in the general population and patients with antibiotic-associated diarrhea.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 18 (4), 205-209 (1994).</li>
<li>Viscidi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+antibody+response+to+toxins+A+and+B+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Serum antibody response to toxins A and B of Clostridium difficile.</a> The Journal of Infectious Diseases. 148 (1), 93-100 (1983).</li>
<li>Salcedo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+immunoglobulin+therapy+for+severe+Clostridium+difficile+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Intravenous immunoglobulin therapy for severe Clostridium difficile colitis.</a> Gut. 41 (3), 366-370 (1997).</li>
<li>Abougergi, M. S., Kwon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+immunoglobulin+for+the+treatment+of+Clostridium+difficile+infection%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Intravenous immunoglobulin for the treatment of Clostridium difficile infection: a review.</a> Digestive Diseases and Sciences. 56 (1), 19-26 (2011).</li>
<li>Shah, N., Shaaban, H., Spira, R., Slim, J., Boghossian, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24926170">Intravenous immunoglobulin in the treatment of severe Clostridium difficile colitis.</a> Journal of Global Infectious Diseases. 6 (2), 82-85 (2014).</li>
<li>Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymptomatic+carriage+of+Clostridium+difficile+and+serum+levels+of+IgG+antibody+against+toxin+A%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A.</a> The New England Journal of Medicine. 342 (6), 390-397 (2000).</li>
<li>Solomon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+in+patients+with+Clostridium+difficile+infection+correlates+with+host+pro-inflammatory+and+humoral+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mortality in patients with Clostridium difficile infection correlates with host pro-inflammatory and humoral immune responses.</a> Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 9 1453-1460 (2013).</li>
<li>Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+antibody+response+to+toxin+A+and+protection+against+recurrent+Clostridium+difficile+diarrhoea%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Association between antibody response to toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile diarrhoea.</a> Lancet. 357 (9251), 189-193 (2001).</li>
<li>Leav, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+anti-toxin+B+antibody+correlates+with+protection+from+recurrent+Clostridium+difficile+infection+%28CDI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Serum anti-toxin B antibody correlates with protection from recurrent Clostridium difficile infection (CDI).</a> Vaccine. 28 (4), 965-969 (2010).</li>
<li>Drudy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody+response+to+surface+layer+proteins+in+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Human antibody response to surface layer proteins in Clostridium difficile infection.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 41 (3), 237-242 (2004).</li>
<li>Bauer, M. P., Nibbering, P. H., Poxton, I. R., Kuijper, E. J., van Dissel, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+immune+response+as+predictor+of+recurrence+in+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Humoral immune response as predictor of recurrence in Clostridium difficile infection.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 (12), 1323-1328 (2014).</li>
<li>Wilcox, M. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28121498">Bezlotoxumab for prevention of recurrent Clostridium difficile infection.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (4), 305-317 (2017).</li>
<li>Leuzzi, R., Adamo, R., Scarselli, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24637887">Vaccines against Clostridium difficile.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 10 (6), 1466-1477 (2014).</li>
<li>Ghose, C., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prospect+for+vaccines+to+prevent+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infectious+Disease+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">The prospect for vaccines to prevent Clostridium difficile infection.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 29 (1), 145-162 (2015).</li>
<li>Henderson, M., Bragg, A., Fahim, G., Shah, M., Hermes-DeSantis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+safety+and+efficacy+of+vaccines+as+prophylaxis+for+Clostridium+difficile+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">A review of the safety and efficacy of vaccines as prophylaxis for Clostridium difficile infections.</a> Vaccines. 5 (3), Basel. (2017).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li>
<li>Delehanty, J. B., Ligler, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+printing+functional+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Method for printing functional protein microarrays.</a> BioTechniques. 34 (2), 380-385 (2003).</li>
<li>Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3680110/">Overview of protein microarrays.</a> Current Protocols in Protein Science. , Chapter 27 (Unit 27) 21(2013).</li>
<li>Huang, Y., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+array-based+approaches+for+biomarker+discovery+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%2C+Proteomics+%26+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Protein array-based approaches for biomarker discovery in cancer.</a> Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 15 (2), 73-81 (2017).</li>
<li>Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+humoral+immune+response+to+infectious+agents+using+high-density+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays.</a> Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).</li>
<li>Bacarese-Hamilton, T., Mezzasoma, L., Ardizzoni, A., Bistoni, F., Crisanti, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14678154">Serodiagnosis of infectious diseases with antigen microarrays.</a> Journal of Applied Microbiology. 96 (1), 10-17 (2004).</li>
<li>Davies, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+the+humoral+immune+response+to+infection+by+using+proteome+microarrays%3A+high-throughput+vaccine+and+diagnostic+antigen+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (3), 547-552 (2005).</li>
<li>Wadia, P. P., Sahaf, B., Miklos, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+antigen+microarrays+for+serum%2Fplasma+antibody+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recombinant antigen microarrays for serum/plasma antibody detection.</a> Methods in Molecular Biology. 723, 81-104 (2011).</li>
<li>Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26599287">Applications in high-content functional protein microarrays.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 30, 21-27 (2016).</li>
<li>Crompton, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective+analysis+of+the+Ab+response+to+Plasmodium+falciparum+before+and+after+a+malaria+season+by+protein+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A prospective analysis of the Ab response to Plasmodium falciparum before and after a malaria season by protein microarray.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6958-6963 (2010).</li>
<li>Khodakov, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oligonucleotide+microarray+for+multiplex+real-time+PCR+identification+of+HIV-1%2C+HBV%2C+and+HCV%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1, HBV, and HCV.</a> BioTechniques. 44 (2), 241-246 (2008).</li>
<li>Ryabinin, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+oligonucleotide+microarray+for+sub-typing+of+Influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus.</a> PLoS One. 6 (4), 17529(2011).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+acute+respiratory+syndrome+diagnostics+using+a+coronavirus+protein+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a coronavirus protein microarray.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4011-4016 (2006).</li>
<li>Cleton, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spot+the+difference%3A+development+of+a+syndrome+based+protein+microarray+for+specific+serological+detection+of+multiple+flavivirus+infections+in+travelers%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Spot the difference: development of a syndrome based protein microarray for specific serological detection of multiple flavivirus infections in travelers.</a> PloS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003580(2015).</li>
<li>Liu, Y., Yu, F., Huang, H., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+recombinant+antigen+array+for+simultaneous+detection+of+viral+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of recombinant antigen array for simultaneous detection of viral antibodies.</a> PLoS One. 8 (9), 73842(2013).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+array+identification+of+protein+markers+for+serodiagnosis+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Protein array identification of protein markers for serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection.</a> Scientific Reports. 5, 15349(2015).</li>
<li>Mannsperger, H. A., Gade, S., Henjes, F., Beissbarth, T., Korf, U. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20634205">RPPanalyzer: analysis of reverse-phase protein array data.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2202-2203 (2010).</li>
<li>Monaghan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+antibody+and+memory+B-cell+responses+to+C.+difficile-associated+diarrhoea%2C+inflammatory+bowel+disease+and+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Circulating antibody and memory B-cell responses to C. difficile-associated diarrhoea, inflammatory bowel disease and cystic fibrosis.</a> PLoS One. 8 (9), 74452(2013).</li>
<li>Grainger, D. W., Greef, C. H., Gong, P., Lochhead, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17984513">Current microarray surface chemistries.</a> Methods in Molecular Biology. 381, 37-75 (2007).</li>
<li>Wellhausen, R., Seitz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facing+current+quantification+challenges+in+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Facing current quantification challenges in protein microarrays.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, article ID 831347 (2012).</li>
<li>Guo, A., Zhu, X. -Y. The critical role of surface chemistry in protein microarrays. <a target="_blank" href="https://www.crcpress.com/Functional-Protein-Microarrays-in-Drug-Discovery/Predki/p/book/9780849398094">Functional Protein Microarrays in Drug Discovery</a>. , CRC Press. Boca Raton. (2007).</li>
</ol>

W tym protokole wykazaliśmy, że mikromacierz jest odpowiednią platformą do definiowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej na antygeny białkowe C. difficile w surowicach pacjenta (ryc. 3 i 6) oraz komercyjne preparaty IVIg (ryc. 5). Wykazaliśmy również, że technika mikromacierzy działa dobrze w porównaniu z konwencjonalnym testem ELISA (rysunek 2) i wykazuje doskonałą odtwarzalność, a zmienność wewnątrz i między test...

Ten protokół opisuje rozwój i walidację nowatorskiego i dostosowanego do potrzeb testu mikromacierzy białkowej do wykrywania i półkwantyfikacji szczepu bakteryjnego i odpowiedzi przeciwciał specyficznych dla izotypu na antygeny C. difficile. Z powodzeniem wykorzystujemy nasz test mikromacierzy specyficzny dla C. difficile jako obiecujące nowe narzędzie do bioanalizy składu swoistej zawartości przeciwciał w pacjentach ssurowica1,2, preparatów IVIg3 oraz identyfikacji swoistości przeciwciał, które korelują ze słabymi wynikami w CDI4. Pokazujemy, w jaki sposób próbki surowicy z biobanków i komercyjne preparaty IVIg mogą być analizowane na szkiełkach mikromacierzowych, co pozwala na wysokiej jakości powtarzalne profilowanie odpowiedzi przeciwciał specyficznych dla patogenu C. difficile w tym teście.
Wiele zdrowych dzieci i dorosłych ma wykrywalne przeciwciała IgG i IgA w surowicy przeciwko toksynom C. difficile A i B5,6. Uważa się, że powstają one w wyniku przejściowego narażenia w okresie niemowlęcym i po narażeniu na C. difficile w wieku dorosłym. Z tego powodu poliklonalny IVIg był stosowany poza wskazaniami do leczenia zarówno nawracających, jak i piorunujących CDI7,8,9. Jednak jego ostateczna rola i sposób działania pozostają niejasne. Kilka badań wykazało, że humoralna odpowiedź immunologiczna na toksyny C. difficile odgrywa rolę w prezentacji i wyniku choroby. W szczególności pacjenci bezobjawowi wykazują zwiększone stężenie IgG antytoksyny A w surowicy w porównaniu z pacjentami, u których rozwija się objawowa choroba10. Stwierdzono wyraźny związek między medianą miana przeciwciał IgG antytoksyny A a a 30-dniową śmiertelnością z jakiejkolwiek przyczyny11. Kilka raportów ujawniło również związek z ochroną przed nawrotami i reakcjami przeciwciał na toksynę A, B i kilka antygenów niebędących toksynami (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD i białka warstwy powierzchniowej (SLPs))12,13,14,15. Obserwacje te stały się bodźcem do opracowania pierwszego biernego leku immunoterapeutycznego ukierunkowanego na toksynę B C. difficile (bezlotuxumab), który został niedawno zatwierdzony przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków oraz Europejską Agencję Leków w celu zapobiegania nawrotom CDI16. Obecnie opracowywane są również strategie szczepień z wykorzystaniem inaktywowanych toksyn lub rekombinowanych fragmentów toksyn17,18,19. Te nowe podejścia terapeutyczne bez wątpienia pobudzą potrzebę oceny humoralnej odpowiedzi immunologicznej na wiele antygenów w dużych rozmiarach próbek.
Dzisiaj zauważalny jest brak dostępnych na rynku wysokoprzepustowych testów, które mogłyby jednocześnie oceniać odpowiedzi szczepu bakteryjnego i przeciwciał specyficznych dla izotypu na antygeny C. difficile. Istnieje niezaspokojona potrzeba opracowania takich testów, aby ułatwić przyszłe wysiłki badawcze i zastosowania kliniczne. Mikromacierze białkowe to metoda immobilizacji dużej liczby indywidualnie oczyszczonych białek jako przestrzennie zorganizowanego układu plamek na mikroskopijnej powierzchni opartej na szkiełku za pomocą systemu robotycznego, który może być albo contact20, albo bezkontaktowym narzędziem do drukowania21. Plamki mogą reprezentować złożone mieszaniny, takie jak lizaty komórkowe, przeciwciała, homogenaty tkankowe, endogenne lub rekombinowane białka lub peptydy, płyny ustrojowe lub leki22,23.
Technologia mikromacierzy białkowych oferuje wyraźne przewagi nad standardowymi technikami ELISA, które tradycyjnie były używane do oceny odpowiedzi przeciwciał anty-C. difficile. Obejmują one zwiększoną zdolność do wykrywania szeregu przeciwciał specyficznych dla wielu izotypów przeciwko bardziej obszernemu panelowi celów białkowych, zmniejszone wymagania dotyczące objętości antygenów, próbek i odczynników oraz zwiększoną zdolność do włączania większej liczby kontrprób technicznych, oprócz wielu środków wewnętrznej kontroli jakości (QC)1. Mikromacierze są zatem bardziej czułe, dokładne i powtarzalne oraz mają większy zakres dynamiki. Czynniki te sprawiają, że mikromacierze są tańszą i potencjalnie korzystną alternatywą dla testów ELISA do wykrywania znanych białek na dużą skalę. Wady technologii mikromacierzy wynikają jednak głównie z dużych kosztów początkowych związanych z ustanowieniem panelu wysoce oczyszczonych antygenów i stworzeniem platformy technologicznej.
Mikromacierze białkowe były szeroko stosowane w ciągu ostatnich dwóch dekad jako narzędzie diagnostyczne i podstawowe narzędzie badawcze w zastosowaniach klinicznych. Konkretne zastosowania obejmują profilowanie ekspresji białek, badanie relacji enzym-substrat, badania przesiewowe biomarkerów, analizę interakcji gospodarz-mikroorganizm oraz profilowanie swoistości przeciwciał23,24,25,26,27,28. Stworzono wiele nowych mikromacierzy białek/antygenów patogenów, w tym malaria (Plasmodium)29, HIV-130, influenza31, zespół ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej (SARS)32, wirusowa gorączka krwotoczna33, herpesviruses34, oraz gruźlica35.
Obecny protokół odnosi się do ustanowienia łatwego w obsłudze testu mikromacierzy reaktywnego antygenu C. difficile, który umożliwia dokładne, precyzyjne i specyficzne oznaczanie ilościowe odpowiedzi przeciwciał wieloizotypowych i szczepowych na antygeny C. difficile w surowicach i poliklonalnych IVIg. W niniejszym dokumencie zamieszczamy reprezentatywne wyniki dotyczące akceptowalnej wydajności testu mikromacierzy w porównaniu z testem ELISA, a także profile precyzji i odtwarzalności testu. Test ten może być dalej rozwijany w celu profilowania innych próbek klinicznych i ustanawia nowy standard badań nad molekularnymi podstawami CDI.

<table><tbody><tr><td>Macierz BioRobotics MicroGrid II</td><td>Digilab, Malborough, MA, USA</td><td>N/A</td><td>Macierz kontaktowa służąca do automatycznego wykrywania antygenów na szkiełkach.</td></tr><tr><td>Skaner InnoScan 710.</td><td>Innopsys</td><td>N/A</td><td>Fluorescencyjny skaner do szkiełek z mikromatrycą z czerwonym laserem (Cy5) do odczytu reakcji.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie MAPIX w wersji 7.2.0</td><td>Innopsys</td><td>N/A</td><td>Mierz natężenie sygnału plamek.</td></tr><tr><td>Krzemowy styk</td><td>Technologie syntezy równoległej</td><td>SMT-P75</td><td>Wydrukuj próbki na szkiełkach.</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Eksykator</td><td>Nalgene Thermo Scientific</td><td>41102426</td><td>Do przechowywania nowych i wydrukowanych preparatów.</td></tr><tr><td>Płytka 384-dołkowa</td><td>Genetix</td><td>X7022UN</td><td>Do przygotowania antygenów.</td></tr><tr><td>Pokrywa płyty</td><td>Sigma Aldrich, Wielka Brytania</td><td>CLS6570-100EA</td><td>Aby zmniejszyć parowanie próbek.</td></tr><tr><td>Preparaty aminozalne</td><td>Schott,&nbsp; Niemcy</td><td>1064875</td><td>Slajd z wyboru do drukowania antygenów.</td></tr><tr><td>Uchwyty do slajdów</td><td>GraceBio Labs, USA</td><td>204862</td><td>Podziel szkiełka na identyczne 16 podukładów. Uchwyty te są wielokrotnego użytku, wyjmowane, szczelne.</td></tr><tr><td>Candida albicans lizat</td><td>NIBSC</td><td>PR-BA117-S</td><td>Kontrola pozytywna</td></tr><tr><td>Tężec Toksoid&nbsp;</td><td>Badania i technologia w Atenach</td><td>04/150</td><td>Kontrola pozytywna</td></tr><tr><td>Immunoglobulina G (IgG), prawidłowe osocze ludzkie</td><td>&nbsp; Badania w Atenach i&nbsp; technologia&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090707</td><td>Oczyszczona natywna ludzka immunoglobulina G IgG, osocze ludzkie.&nbsp;</td></tr><tr><td>Immunoglobulina G1 (IgG1), prawidłowe osocze ludzkie</td><td>&nbsp; Badania w Atenach i&nbsp; technologia&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090707-1</td><td>Oczyszczona natywna ludzka immunoglobulina G1 IgG1, ludzkie osocze.</td></tr><tr><td>Immunoglobulina G2 (IgG2), prawidłowe osocze ludzkie</td><td>&nbsp; Badania w Atenach i&nbsp; technologia&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090707-2</td><td>Oczyszczona natywna ludzka immunoglobulina G2 IgG2, osocze ludzkie.&nbsp;</td></tr><tr><td>Immunoglobulina G3 (IgG3), prawidłowe osocze ludzkie</td><td>&nbsp; Badania w Atenach i&nbsp; technologia&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090707-3</td><td>Oczyszczona natywna ludzka immunoglobulina G3 IgG3, osocze ludzkie.&nbsp;</td></tr><tr><td>Immunoglobulina G4 (IgG4), prawidłowe osocze ludzkie</td><td>&nbsp; Badania w Atenach i&nbsp; technologia&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090707-4</td><td>Oczyszczona natywna ludzka immunoglobulina G4 IgG4, osocze ludzkie.&nbsp;</td></tr><tr><td>Immunoglobulina A (IgA), osocze ludzkie</td><td>&nbsp; Badania w Atenach i&nbsp; technologia&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090701</td><td>Oczyszczona natywna ludzka immunoglobulina A (IgA), ludzkie osocze.</td></tr><tr><td>Immunoglobulina A1 (IgA1), osocze szpiczaka ludzkiego</td><td>&nbsp; Badania w Atenach i&nbsp; technologia&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090701-1M</td><td>Oczyszczona natywna ludzka immunoglobulina A1 (IgA1), ludzkie osocze.</td></tr><tr><td>Immunoglobulina A2 (IgA2), osocze szpiczaka ludzkiego</td><td>&nbsp; Badania w Atenach i&nbsp; technologia&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090701-2M</td><td>Oczyszczona natywna ludzka immunoglobulina A2 (IgA2), ludzkie osocze.</td></tr><tr><td>Immunoglobulina M (IgM), osocze ludzkie</td><td>&nbsp; Badania w Atenach i&nbsp; technologia&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090713</td><td>Oczyszczona natywna ludzka immunoglobulina M (IgM), ludzkie osocze.</td></tr><tr><td>Biotynylowane kozie przeciwciało anty-ludzkie IgG, specyficzne dla łańcucha gamma</td><td>Vector Labs</td><td>BA-3080</td><td>Kozie przeciwciało anty-ludzkie IgG (&&specyficzne dla łańcucha)-biotyna kozie reaguje specyficznie z ludzką IgG, ale nie z innymi immunoglobulinami.</td></tr><tr><td>Mysi zawias anty-ludzki IgG1-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9052-08&nbsp;</td><td>Kozie przeciwciało anty-ludzkiej biotyny IgG1 reaguje specyficznie z ludzką IgG1, ale nie z innymi immunoglobulinami.</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka IgG2 Fc-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9060-08&nbsp; &nbsp;</td><td>Kozie przeciwciało anty-ludzkie IgG2-biotyna reaguje specyficznie z ludzką IgG 2ale nie z innymi immunoglobulinami.</td></tr><tr><td>Mysi zawias anty-ludzki IgG3-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9210-08&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Przeciwciało przeciwko ludzkiej biotynie IgG3-kozie reaguje specyficznie z ludzką IgG3, ale nie z innymi immunoglobulinami.</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka IgG4 pFc'-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9190-08&nbsp; &nbsp;</td><td>Przeciwciało przeciwko ludzkiej IgG-biotynie kozie reaguje specyficznie z ludzką IgG, ale nie z innymi immunoglobulinami.</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie IgA, specyficzne dla łańcucha alfa, wykonane z kozy - Biotinylated</td><td>Vector Labs</td><td>BA-3030</td><td>Kozie przeciwciało anty-ludzkie IgG-biotyny reaguje specyficznie z ludzką IgG, ale nie z innymi immunoglobulinami.</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-ludzkie IgA1-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9130-08</td><td>Kozie przeciwciało anty-ludzkie IgG-biotyny reaguje specyficznie z ludzką IgG, ale nie z innymi immunoglobulinami.</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka IgA2-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9140-08&nbsp; &nbsp;</td><td>Przeciwciało anty-ludzkiej IgG-biotyny kozy reaguje specyficznie z ludzką IgG, ale nie z innymi immunoglobulinami.</td></tr><tr><td>Mysi anty-ludzki IgM-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9020-08&nbsp;</td><td>Przeciwciało przeciwko ludzkiej IgG-biotynie kozie reaguje specyficznie z ludzką IgG, ale nie z innymi immunoglobulinami.</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy 0,2 mm</td><td>Thermo scientific</td><td>723-2520</td><td>Filtruj 5% BSA.</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma Aldrich, Wielka Brytania</td><td>A7284</td><td>Użyj 5% BSA do blokowania szkiełków.</td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik przeciwciał</td><td>Dako, UK</td><td>S3022</td><td>Do rozcieńczania surowicy i przeciwciała drugorzędowego.</td></tr><tr><td>Streptawidyna Cy5</td><td>eBioscience</td><td>SA1011</td><td>Wykrywanie reakcji immunologicznej.</td></tr><tr><td>Oczyszczone całe toksyny C. difficile A i B (toksinotyp 0, szczep VPI 10463, rybotyp 087)</td><td>Grupa ds. Toksyn, Public Health England</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczona cała toksyna C difficile B (CCUG 20309 toksyna B wyrażająca tylko szczep)</td><td>Grupa ds. Toksyn, Public Health England</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Prekursorowa forma B fragmentu toksyny binarnej, pCDTb</td><td>Uniwersytet w Bath&nbsp;</td><td>NA</td><td>Wytwarzany w E. coli z całkowicie syntetycznego rekombinowanego konstruktu genu. Sekwencja aminokwasowa oparta na opublikowanej sekwencji z rybotypu 027 (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)</td></tr><tr><td>Oczyszczone natywne białka warstwy powierzchniowej specyficzne dla całego rybotypu (001, 002, 027)</td><td>Dublin City University&nbsp;</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Vigam (przygotowanie do IVIg 1)</td><td>Szpitale Uniwersyteckie w Nottingham NHS Trust</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Privigen (przygotowanie do IVIg 2)</td><td>Szpitale Uniwersyteckie w Nottingham NHS Trust</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Intratect (przygotowanie do IVIg 3)</td><td>Szpitale Uniwersyteckie w Nottingham NHS Trust</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

test mikromacierzy białkowej do serologicznego oznaczania odpowiedzi przeciwciał specyficznych dla antygenu po zakażeniu clostridium difficile

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

Przedstawiamy szczegółowy przegląd nowatorskiego, wysokoprzepustowego testu mikromacierzy białkowej do oznaczania poziomów przeciwciał anty-Clostridium difficile w surowicach ludzkich oraz w oddzielnych preparatach poliklonalnej immunoglobuliny dożylnej (IVIg). Protokół opisuje etapy metodologiczne związane z przygotowaniem próbki, drukowaniem tablic, procedurą oznaczania i analizą danych. Ponadto protokół ten może być dalej rozwijany w celu uwzględnienia różnych próbek klinicznych, w tym supernatantów z osocza i hodowli komórkowych. Pokazujemy, w jaki sposób mikromacierz białkowa może być wykorzystana do określenia kombinacji izotypu (IgG, IgA, IgM), podklasy (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2) i specyficznych dla szczepu przeciwciał przeciwko wysoce oczyszczonym całym toksynom C. difficile A i B (toxinotyp 0, szczep VPI 10463, rybotyp 087), toksyny B z szczepu eksprymującego tylko toksynę C difficile B (CCUG 20309), formy prekursorowej fragmentu B toksyny binarnej, pCDTb, białka całej warstwy powierzchniowej specyficzne dla rybotypu (SLP; 001, 002, 027) oraz białka kontrolne (toksoid tężcowy i Candida albicans). Podczas eksperymentu mikromacierze są badane surowicami od osób z zakażeniem C. difficile (CDI), osób z mukowiscydozą (CF) bez biegunki, zdrowych osób z grupy kontrolnej (HC) oraz od osób przed i po terapii IVIg w leczeniu CDI, złożonego zaburzenia niedoboru odporności i przewlekłej zapalnej poliradikulopatii demielinizacyjnej. Spotykamy się ze znaczącymi różnicami w skuteczności neutralizacji toksyn i poziomach przeciwciał specyficznych dla wielu izotypów między grupami pacjentów, komercyjnymi preparatami IVIg i surowicami przed i po podaniu IVIg. Istnieje również istotna korelacja między mikromacierzą a testem immunoenzymatycznym (ELISA) dla poziomów antytoksyn IgG w próbkach surowicy. Wyniki te sugerują, że mikromacierz może stać się obiecującym narzędziem do profilowania odpowiedzi przeciwciał na antygeny C.difficile u zaszczepionych lub zakażonych ludzi. Przewidujemy, że dzięki dalszemu udoskonalaniu paneli antygenowych i obniżeniu kosztów produkcji, technologia mikromacierzy może pomóc w optymalizacji i wyborze najbardziej użytecznych klinicznie immunoterapii zakażenia C. difficile w sposób specyficzny dla pacjenta.

Rysunek 1 przedstawia schemat blokowy opisujący główne etapy opisanego protokołu. Rysunek 2 prezentuje testy korelacji Spearmana wykazujące istotną zgodność między wynikami mikromacierzy a testem ELISA dla poziomów IgG i IgA przeciwko toksynie A i B w surowicach testowych pacjentów. Rysunek 3 przedstawia zróżnicowane odpowiedzi przeciwciał specyficznych dla klas IgG i IgA przeciwko toksynie A, toksyn...

Ten artykuł opisuje prostą metodę mikromacierzy białkowej do profilowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej na 7-pleksowy panel wysoce oczyszczonych antygenów Clostridium difficile w surowicach ludzkich. Protokół może zostać rozszerzony w celu określenia swoistych odpowiedzi przeciwciał w preparatach poliklonalnej immunoglobuliny dożylnej.

Test mikromacierzy białkowej do serologicznego oznaczania odpowiedzi przeciwciał specyficznych dla antygenu po zakażeniu Clostridium difficile

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

Metoda ta może pomóc w optymalizacji i doborze klinicznie użytecznych immunoterapii zakażenia Clostridium difficile w sposób specyficzny dla pacjenta oraz w wyjaśnieniu odpowiedzi immunologicznej człowieka na Clostridium difficile. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona dokładne i jednoczesne oznaczanie ilościowe odpowiedzi przeciwciał swoistych dla wielu izotypów i szczepów na antygeny C.difficile. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ wymagana jest wiedza specjalistyczna w tworzeniu i optymalizacji panelu wysoce oczyszczonych antygenów oraz tworzeniu platformy technologicznej.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ typy list metodologicznych związanych z przygotowaniem płytki mikrofalowej, drukowaniem tablic, bezpieczną procedurą i analizą danych wymagają zwrócenia uwagi na szczegóły. Część procedury zademonstruje Sam Greenwood, technik z mojego laboratorium. Na początek rozcieńczyć antygeny Clostridium difficile i bufor drukarski do optymalnego stężenia.Następnie przenieś 10 mikrolitrów roztworu antygenu na płytkę 384-dołkową. Przykryj płytkę uszczelką płytkową i odwiruj przy 300-krotności grawitacji przez pięć minut w temperaturze pokojowej. W przypadku drukowania z mikromacierzy użyj ręcznego palnika gazowego, aby podgrzać silikonowy kod PIN trzy razy przez dwie sekundy każdy.Następnie opłucz silikonowy PIN w czystej wodzie trzy razy przez trzy sekundy każdy. Umieść płytkę mikromacierzy w kasecie ładującej matrycy. Wysuń tackę, a następnie umieść szkiełka aminosilanowe w tacy na suwak i naciśnij przycisk OK, aby włączyć próżnię.Upewnij się, że wszystkie slajdy są zabezpieczone, a następnie kliknij przycisk OK. Umieść tacę z powrotem w punkcie początkowym i zamknij pokrywę. Następnie uruchom odpowiedni program i przejdź do Plik, następnie Parametry mikromacierzy, a następnie Otwórz. Wybierz plik Clostridium difficile, aby wydrukować wszystkie antygeny w poczwórnym powiększeniu.W tym oknie otwórz kartę Źródło, aby wskazać magazyn próbki, i kartę Cel, aby wprowadzić szczegóły mikromacierzy. Następnie otwórz kartę Opcje, aby wybrać narzędzie do mycia. Na karcie Ogólne w oknie Preferencje uruchamiania na pasku narzędzi pakietu aplikacji TAS wybierz opcję Umyj na początku uruchamiania i Umyj na końcu uruchomienia.Otwórz kartę Klimat i ustaw poziom wilgotności w zakresie od 55 do 60%Teraz rozpocznij bieg i okresowo sprawdzaj tablicę, aby zapewnić prawidłowe działanie. Po wydrukowaniu ostrożnie umieść wydrukowane szkiełka w uchwycie na szkiełka z 16 komorami wielodołkowymi. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 5% BSAT do każdego bloku.Przykryj szkiełka i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej, potrząsając. Użyj 120 mikrolitrów PBST, aby umyć każdy blok pięć razy po jednej minutę z potrząsaniem. Następnie rozmrażaj próbki surowicy uzyskane od pacjentów zakażonych C. difficile i zdrowych osób z grupy kontrolnej na lodzie przez 20 minut.Dodaj dostępny w handlu rozcieńczalnik przeciwciał do bloku głównego, a następnie dodaj próbki do bloku głównego i wymieszaj. Odrzucić bufor do przemywania i dodać 100 mikrolitrów każdej rozcieńczonej próbki do bloków doświadczalnych. Do bloku kontroli ujemnej dodać 100 mikrolitrów samego rozcieńczalnika przeciwciał.Następnie inkubuj szkiełka przez godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Następnie użyj 120 mikrolitrów PBST, aby umyć każdy blok pięć razy przez trzy minuty, każdy z potrząsaniem. Następnie do każdego bloku dodać 100 mikrolitrów biotynylowanego koziego przeciwciała anty-ludzkiego rozcieńczonego w rozcieńczalniku przeciwciał.Przykryj szkiełka i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Użyj 120 mikrolitrów PBST, aby umyć każdy blok pięć razy przez trzy minuty, każdy z potrząsaniem. Następnie dodaj 100 mikrolitrów koniugatu streptawidyny SY5 rozcieńczonego w 5% BSAT, w stosunku od jednego do dwóch tysięcy na każdy blok.Przykryj szkiełka folią i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Najpierw umyj szkiełka 120 mikrolitrami PBST pięć razy po jednej minucie każde, a następnie umyj je jeszcze dwa razy po jednej minutę za pomocą PBS. Aby wysuszyć szkiełka, obracaj je przez pięć minut przy 300-krotności grawitacji.Włącz skaner laserowy na 30 minut przed skanowaniem, aby mógł się rozgrzać. Następnie umieść szkiełko w skanerze zadrukowaną powierzchnią skierowaną do góry, aż kontrolka płytki zaświeci się na zielono. Następnie naciśnij przycisk Ustawienia.Na pierwszej karcie upewnij się, że opcje Automatyczne przewijanie i Kod kreskowy nie są zaznaczone. Następnie ustaw rozmiar piksela na 10, tryb skanowania na średni, akwizycję tylko na 635, tryb akwizycji na ręczny, wzmocnienie na 20 i moc na niską. Na drugiej karcie upewnij się, że typ slajdu nie jest oznaczony etykietą.Na trzeciej karcie ustaw Ostrość na Autofokus. Naciśnij przycisk importu siatki, aby wybrać odpowiednią listę macierzy powiązaną z zeskanowanym obrazem. Następnie naciśnij przycisk automatycznego wyszukiwania, aby wyrównać siatkę do miejsc na slajdzie.Na koniec naciśnij przycisk Proces kwantyfikacji, aby zmierzyć intensywność fluorescencji każdej plamki. Następnie zapisz wyniki w odpowiednim formacie do dalszej analizy. W tym protokole mikromacierz białkowa jest porównywana z testem ELISA w celu oceny odtwarzalności między tymi dwiema technikami.Analiza współczynnika korelacji Spearmana wykazuje istotną zgodność między mikromacierzą a testem ELISA w wykrywaniu poziomów IgG, antytoksyny A i antytoksyny B w próbkach surowicy. Odtwarzalność testu wstępnego i testu międzytestowego mikromacierzy białkowej oblicza się na podstawie próbek surowicy siedmiu pacjentów. Próbki analizowane na dwóch różnych szkiełkach macierzystych przeciwko antygenom toksyny A, toksyny B, SLP001, SLP002, SLP027, toksyny B z toksyny B wytwarzającej tylko szczep CCUG i antygenów pCDTb wykazują dobrą odtwarzalność.Mikromacierz białkowa jest wykonywana w celu wykrycia specyficznej dla izotypu odpowiedzi przeciwciał przeciwko toksynom Clostridium difficile. Próbki surowicy pacjentów i osób zdrowych służą do wykrywania poziomów IgG i IgA wobec toksyny A, toksyny B, toksyny B z toksyny C difficile wykazującej tylko ekspresję szczepu B oraz formy prekursorowej fragmentu B toksyny binarnej. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu siedmiu godzin.W eksperymencie kontroli jakości, przed uruchomieniem próbek należy ocenić różne parametry, takie jak dobór odpowiedniej chemii powierzchni, drukarskie, blokujące oraz rozcieńczenia próbek surowicy i przeciwciał drugorzędowych. Drukowanie tablicy wysokiej jakości wymaga dobrego zrozumienia macierzy lub oprogramowania w celu dostosowania drukowania parametrów zgodnie z protokołem eksperymentalnym. Kluczowe znaczenie ma utrzymanie optymalnej wydajności macierzy i środowiska wolnego od kurzu przez cały czas trwania eksperymentu.Technika ta utoruje drogę naukowcom w dziedzinie immunologii i biologii molekularnej, w zakresie charakteryzowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej na infekcję i odkrywania antygenów serodiagnostycznych. Nie zapominaj, że praca z zakażonymi próbkami krwi i toksynami bakteryjnymi może być niebezpieczna. Ogólnie rzecz biorąc, w laboratorium podczas wykonywania tej procedury należy zawsze brać pod uwagę bezpieczeństwo i standardowe środki ostrożności.

a-protein-microarray-assay-for-serological-determination-antigen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Identyfikacja mikrobiologicznych celów odporności adaptacyjnej w chorobach idiopatycznych może zostać przeprowadzona przy użyciu testu ELISpot (enzyme-linked immunospot assay).

Test immunospot z enzymatycznym sprzężeniem (ELISPOT): Ilościowe oznaczenie komórkowych odpowiedzi immunologicznych Th-1 przeciwko antygenom mikrobiologicznym

Opisaliśmy procedurę dysagregacji raka jelita grubego (CRC) w celu uzyskania żywotnych pojedynczych komórek, które następnie są wychwytywane na dostosowane mikrotablice przeciwciał rozpoznających antygeny powierzchniowe (mikrotablica DotScan CRC). Subpopulacje komórek związanych z mikrotablicą mogą być profilowane za pomocą multipleksowania fluorescencyjnego z wykorzystaniem przeciwciał monoklonalnych znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi.

Profilowanie białek powierzchniowych komórek raka jelita grubego z wykorzystaniem mikrotablicy przeciwciał i multipleksowania fluorescencyjnego

W tym filmie pokazujemy proces wykrywania izotypów przeciwciał w wielu próbkach ludzkiej surowicy za pomocą szkiełka mikromatrycowego wydrukowanego z antygenowymi podtypami szczepów wirusa grypy.

Test mikromacierzy antygenu wirusowego do wykrywania izotypów przeciwciał w surowicy przeciwko antygenowi wirusowemu

Ten film demonstruje metodę wykrywania szczepów cyjanobakterii w próbce środowiskowej za pomocą mikromatrycy przeciwciał. Próbki zawierające różne bakterie wchodzą w interakcje z wydrukowanymi przeciwciałami, a barwienie immunologiczne przeciwciałami anty-cyjanobakterii znakowanymi fluoroforem ujawnia obecność specyficznych szczepów cyjanobakterii poprzez fluorescencję w różnych miejscach.

Technika wykrywania szczepów sinic za pomocą chipa mikromacierzy przeciwciał

Obecność toksyn cyjanobakteryjnych w zbiornikach słodkiej wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi jest głównym problemem dla organów zarządzających gospodarką wodną. Aby ocenić ryzyko zanieczyszczenia wody, w artykule opisano protokół wykrywania w terenie szczepów sinic w próbkach ciekłych i stałych przy użyciu chipa mikromacierzy przeciwciał.

Eksperymentalny protokół wykrywania sinic w próbkach ciekłych i stałych za pomocą chipa mikromacierzy przeciwciał

Demonstrujemy technologię chipową do wykonywania testów immunologicznych typu sandwich bez reaktywności krzyżowej, po prostu pstrykając dwa slajdy. Aparat zatrzaskowy służy do niezawodnego przenoszenia odczynników z mikromacierzy do mikromacierzy. Chip zatrzaskowy może być stosowany do wszelkich reakcji biochemicznych wymagających kolokalizacji różnych odczynników bez zanieczyszczenia krzyżowego.

Snap Chip do multipleksowanych testów immunologicznych typu sandwich wolnych od reaktywności krzyżowej i Spotterów

Tutaj prezentujemy protokół opisujący rozwój i walidację cyfrowego testu ELISA z pojedynczą matrycą molekuł, który umożliwia ultraczułe wykrywanie wszystkich podtypów IFN-α w próbkach ludzkich.

Opracowanie i walidacja ultraczułego, cyfrowego testu immunoenzymatycznego z pojedynczą matrycą cząsteczek dla ludzkiego interferonu-α

Tutaj prezentujemy protokół do badania mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych w celu identyfikacji nowych interakcji receptor-ligand w wysokiej przepustowości. Opisujemy również metodę usprawniającą wykrywanie przejściowych interakcji białko-białko za pomocą kompleksów białko-mikrogranulki.

Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie

Przedstawiamy protokół użycia mikromatrycy białkowej zbudowanej przez drukowanie antygenów grypy na szkiełkach pokrytych nitrocelulozą do jednoczesnego sondowania surowicy pod kątem wielu izotypów przeciwciał przeciwko ponad 250 antygenom z różnych szczepów wirusa, umożliwiając w ten sposób pomiar szerokości przeciwciał w surowicy dla różnych podtypów wirusa.

Wykorzystanie mikromacierzy antygenu grypy do pomiaru szerokości przeciwciał w surowicy w różnych podtypach wirusa

Zgodnie z pilną potrzebą badań przesiewowych w kierunku cukrzycy typu 1, celiakii i choroby koronawirusowej 2019, opracowaliśmy wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 6-Plex do jednoczesnego wykrywania wszystkich czterech autoprzeciwciał wysp trzustkowych, autoprzeciwciał transglutaminazy tkankowej oraz przeciwciał przeciwko domenie wiążącej receptor koronawirusa 2 zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej.

Wysokoprzepustowe, multipleksowane badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1, celiakii i COVID-19

Poznaj metodę mikromacierzy białkowej do profilowania odpowiedzi immunologicznych przeciwko antygenom Clostridium difficile w surowicach ludzkich. Technika umożliwia jednoczesną ilościową analizę przeciwciał wielu izotypów.

Test mikromacierzy białkowej do serologicznego oznaczania odpowiedzi przeciwciał specyficznych dla antygenu po zakażeniu Clostridium difficile (Wideo) | JoVE Journal

Test mikromacierzy białkowej do serologicznego oznaczania odpowiedzi przeciwciał specyficznych dla antygenu po zakażeniu Clostridium difficile

Przeglądaj więcej filmów