Izolacja ludzkich komórek śródbłonka z normalnego raka jelita grubego i raka jelita grubego - ulepszony protokół

Ogólnym celem tego protokołu izolacji komórek jest uzyskanie czystych i żywotnych komórek śródbłonka od pacjentów cierpiących na raka jelita grubego, zarówno z guza, jak i odpowiadającej mu normalnej okrężnicy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii nowotworów i angiogenezy, takie jak oszacowanie i analiza wpływu układu naczyń krwionośnych na nowotworzenie jelita grubego. Główną zaletą tej techniki jest to, że można uzyskać stosunkowo wysoki wskaźnik sukcesu w uzyskaniu czystych i żywotnych ludzkich komórek śródbłonka od pacjentów z rakiem jelita grubego.

Aby uzyskać próbkę tkanki od pacjentów z rakiem jelita grubego, użyj świeżego skalpela, aby uzyskać kawałki tkanki o wadze około grama. Następnie za pomocą sterylnych kleszczy przenieś świeże kawałki tkanki w 40 mililitrach lodowatego buforu HBSS z antybiotykami w 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Następnie użyj oddzielnych sterylnych kleszczy, aby przenieść raka i normalną tkankę sekwencyjnie z jednej probówki wirówkowej do drugiej, aby czterokrotnie przemyć 40 mililitrów lodowatego buforu HBSS antybiotykami.

Aby usunąć cały tłuszcz, tkankę nienowotworową lub potencjalnie martwicze części tkanki, użyj sterylnych kleszczy i przenieś fragmenty tkanki na sterylną szalkę Petriego do hodowli komórek. Następnie dodaj trzy do pięciu mililitrów buforu HBSS uzupełnionego antybiotykiem, aby pozostawić zwilżone kawałki tkanki. Następnie użyj świeżego skalpela, aby przyciąć kawałki tkanki.

Następnie za pomocą skalpela z zakrzywionym ostrzem zmielić pozostałą tkankę na małe kawałki. Przenieś zmielone kawałki tkanki do probówki dysocjacyjnej wypełnionej wstępnie podgrzaną pożywką do hodowli komórkowych. Oddziel zmielone kawałki tkanki za pomocą dysocjatora tkanek wraz z zestawem do dysocjacji guza dla tkanki ludzkiej zgodnie z instrukcjami producenta.

Pierwszym krytycznym krokiem jest prawidłowe przetworzenie i mikrodysekcja próbki chirurgicznej w celu uzyskania fragmentów tkanek o odpowiednim rozmiarze i typie tkanki. Po dysocjacji kawałków tkanki odwiruj ją w temperaturze pokojowej przy 300-krotności grawitacji przez jedną minutę. Następnie za pomocą pipety serologicznej dodaj 10 mililitrów wstępnie podgrzanego podłoża DMEM Low do probówki MACS.

Następnie wlej zawiesinę komórek z probówki na sitko do komórek o wielkości porów 100 mikrometrów ustawione na 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Odpipetować dodatkowe 10 mililitrów pożywki DMEM Low do probówki MACS, aby przepłukać dodatkowe komórki z probówki przez sitko w probówce wirówkowej. Po przefiltrowaniu całej zawiesiny komórkowej umyj sitko komórkowe dodatkowymi 10 mililitrami pożywki DMEM Low.

Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze pokojowej 300-krotności grawitacji przez siedem minut. Następnie, po zakończeniu wirowania, należy wyrzucić supernatant. Następnie rozpuść osad komórkowy w pięciu mililitrach uzupełnionych antybiotykami, wstępnie podgrzanym podłożu EBM-2-MV w tej samej 50-mililitrowej probówce wirówkowej.

Usunąć roztwór powlekający z kolby hodowlanej i przenieść zawiesinę komórek bezpośrednio do kolby hodowlanej T-25 utrzymywanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Gdy zbieg osiągnie około 80 do 90%, dodaj jeden mililitr Accutase, aby odłączyć komórki w kolbie. Następnie pozostaw komórki z Accutase na 10 minut.

Następnie dodaj do komórek cztery mililitry pożywki EBM-2-MV utrzymywanej w temperaturze 37 stopni. Następnie użyj automatycznego urządzenia do liczenia komórek o zakresie od 10 do 25 mikrometrów, aby policzyć komórki. Drugim najbardziej krytycznym krokiem są wszystkie kroki, w których komórki muszą zostać podzielone.

Oszacowanie prawidłowego punktu czasowego wymaga doświadczenia. Jeśli podział jest zbyt wczesny, komórki umrą. Jeśli podział jest zbyt późny, komórki śródbłonka osiągną starzenie się lub problemem będzie przerost fibroblastów.

Następnie odwiruj komórki w temperaturze pokojowej 250-krotności grawitacji przez cztery minuty i wyrzuć supernatant na końcu przebiegu. Następnie rozpuść osad komórkowy we wstępnie podgrzanym buforze FACS. Następnie dodaj przeciwciała barwiące FACS do komórek.

Wymieszaj, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez łącznie 15 minut. Po połowie tego okresu inkubacji przesuń rurkę raz. Użyj pipety serologicznej, aby dodać dwa mililitry buforu FACS do znakowanej zawiesiny komórek.

Następnie odwirować zawiesinę komórek w temperaturze pokojowej przy 250-krotności grawitacji przez cztery minuty i zdekantować supernatant po zakończeniu wirowania. Następnie dodaj dwa mililitry buforu FACS, aby rozpuścić osad komórkowy i odwiruj zawiesinę komórkową w temperaturze pokojowej przez cztery minuty przy 250-krotności grawitacji. Następnie ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach pożywki EBM-2-MV uzupełnionej antybiotykiem.

Następnie przenieś komórki do przyrządu sortującego FACS. Zidentyfikuj potrójnie dodatnie komórki i pozwól im wysiać się w 24-dołkowym naczyniu hodowlanym wypełnionym świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką EBM-2-MV. Hoduj komórki przez następne 48 godzin, a następnie odnów pożywkę.

Kontynuuj zmianę podłoża co dwa dni, aż zbieg osiągnie 90 do 100% w ciągu pięciu do 10 dni. Następnie rozszerz populację komórek zgodnie z pożądanym naczyniem hodowlanym. Następnie zbierz plony po osiągnięciu konfluencji i przejdź do charakterystyki.

Najpierw uzyskana próbka guza jest dysocjowana i wysiewana w naczyniu do hodowli komórkowej. Nieprzylegające komórki są zmywane, a przylegające komórki są hodowane do 80 do 90% konfluencji przed sortowaniem FACS. Następnie przeprowadza się analizę FACS w celu zidentyfikowania populacji znakowanego immunologicznie żywotnego guza i normalnych komórek śródbłonka.

Aby to zrobić, wykonuje się potrójne znakowanie komórek śródbłonka normalnych i nowotworowych swoistych dla przeciwciał fluorochromowych, które należy posortować przez FACS. Średnio 3,6 i 5,6% całej populacji komórek to odpowiednio komórki nowotworowe i normalne komórki śródbłonka. Następnie, aby zidentyfikować ekspresję markerów komórek śródbłonka, uzyskane normalne i nowotworowe komórki śródbłonka poddaje się immunocytochemii.

Zdjęcia tutaj pokazują CD31-dodatnie normalne i nowotworowe komórki śródbłonka. Następnie RNA jest izolowane z populacji komórek śródbłonka CD31-dodatnich i poddawane RT-qPCR w celu identyfikacji innych markerów specyficznych dla komórek śródbłonka. Na wykresie wykrywa się również ekspresję markerów komórek śródbłonka, takich jak CD105, kadheryna VE i czynnik von Willebranda, ale brakuje ekspresji markerów z potencjalnie zanieczyszczających populacji komórek, co wskazuje na czystość izolowanych kultur komórek śródbłonka.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około trzy tygodnie, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ wymaga ona doświadczenia z pierwotnymi hodowlami komórek śródbłonka, aby oszacować, kiedy i w jakich proporcjach komórki mogą zostać podzielone lub dalej przetwarzane do analizy sortowania FACS. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię raka jelita grubego, ponieważ hodowle komórkowe mogą być wykorzystane do identyfikacji mechanizmów odpowiedzi na leczenie nowotworami lub oporności w raku jelita grubego.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy przeczytaliśmy wiele doniesień w literaturze wskazujących na problemy z ustaleniem naprawdę czystych i żywotnych komórek śródbłonka z ludzkich guzów litych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy mikrodysekcji lub przetwarzania tkanek do analizy sortowania FACS lub dalszego podziału komórek śródbłonka wymagają doświadczenia w celu oszacowania prawidłowego punktu czasowego. Próbując tej procedury, ważne jest, aby najpierw ustanowić funkcjonalną sieć współpracy z chirurgią, patologią i rejestrem nowotworów.

Ponadto powinieneś zostać przeszkolony w zakresie ćwiczeń fizycznych do pracy z pierwotnymi hodowlami komórek śródbłonka, ponieważ komórki te są delikatne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować komórki śródbłonka z ludzkiego raka jelita grubego i odpowiadającego mu normalnego jelita grubego.