Kwantyfikacja przestrzenna leków w zmianach gruźlicy płuc za pomocą mikrodysekcji laserowej Chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LCM-LC/MS)
18 kwietnia 2018
Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący mikrodysekcję laserową w połączeniu z analizą LC/MS do przestrzennego ilościowego określania dystrybucji leków w ziarniniakach gruźlicy płuc. Podejście to ma szerokie zastosowanie w ilościowym określaniu stężeń leków w tkankach przy dużej szczegółowości przestrzennej.
Ogólnym celem tej techniki analitycznej jest ilościowe określenie leku przeciwgruźliczego etambutolu w przedziałach tkankowych zmian w płucach gruźlicy w celu określenia, czy osiągane są stężenia leku bakteriobójczego. Metoda ta może odpowiedzieć na pytania w dziedzinie odkrywania i opracowywania leków na gruźlicę poprzez określenie, czy podawane leki docierają do populacji bakterii w stężeniach sterylizujących we wszystkich przedziałach tkankowych ziarniniaka. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia pełną kwantyfikację stężeń leków przy dużej szczegółowości przestrzennej w określonych strukturach tkankowych i populacjach komórek.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy cięcia i montażu tkanek są trudne do nauczenia się ze względu na możliwość zanieczyszczenia tkanek i delikatną naturę szkiełek membranowych. Rozpocznij tę procedurę od pobrania tkanki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby wykonać cięcie tkanek, najpierw ustaw kriostat na żądaną temperaturę cięcia.
Przenieś napromieniowaną promieniami gamma biopsję płuc z magazynu o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do kriostatu i pozostaw na 30 minut, aby wyrównać temperaturę tkanki. Za pomocą pęsety przymocuj biopsję do uchwytu kriostatu, używając niewielkiej ilości kleju o optymalnej temperaturze cięcia, aby przykleić podstawę tkanki do uchwytu. Ustaw tkankę tak, aby płaska powierzchnia była odsłoniętą powierzchnią do cięcia.
Upewnij się, że OCT nie zanieczyszcza powierzchni tkanki, ponieważ może to zakłócić późniejszą analizę spektrometrii mas. Wytnij trzy odcinki tkanki o grubości 25 mikronów i zamontuj na szkiełkach z membrany PET. Delikatnie przyłóż membranę do sekcji tkanki i usuń sekcję.
Jeśli zostanie przyłożony zbyt duży nacisk, cienka membrana może się rozerwać . Unikaj nadmiernego obchodzenia się ze szkiełkiem przed montażem, aby nie obciążyć membrany PET i nie zmniejszyć przyczepności części tkanki. Utrzymuj szkiełko membranowe w temperaturze pokojowej, aby umożliwić montaż na rozmrożeniu i pomyślne przyleganie tkanki do membrany.
Wyjmij szkiełko z kriostatu i pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu przez trzy minuty. Jeśli LCM-LC-MS/MS nie zostanie wykonany natychmiast, zamknij szkiełko w małej, hermetycznie zamykanej torbie i przenieś do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie to wymagane do sekcji. Wytnij sąsiednią sekcję na głębokość od 10 do 12 mikronów i zamontuj na rozmrożeniu na standardowym szkiełku do barwienia hematoksyliną i eozyną.
W tym czasie można wyciąć dodatkowe skrawki dla innych pożądanych plam histochemicznych. Wyjmij szczelnie zamkniętą torbę zawierającą szkiełko z miejsca do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i pozostaw do osiągnięcia temperatury pokojowej na pięć minut. Jeśli zimny szkiełko zostanie natychmiast wystawiony na działanie atmosfery laboratoryjnej, tkanka zostanie pokryta kondensacją, a integralność przestrzenna leku może być zagrożona.
Włącz mikroskop i laser. Laser potrzebuje od pięciu do 10 minut na rozgrzanie się przed rozpoczęciem cięcia. Załaduj płaskie probówki PCR o pojemności 0,20 mililitra do uchwytu.
Po wyjęciu szkiełka z worka należy wykonać obraz optyczny wycinka tkanki na szkiełku PET za pomocą skanera płaskiego. Umieść szkiełko w uchwycie szkiełka, stroną z chusteczką skierowaną w dół. Przypisz oddzielne probówki zbiorcze do określonych obszarów ziarniniaka za pomocą oprogramowania mikroskopowego.
Zazwyczaj będą to niezajęte płuca, ziarniniak komórkowy i kazeum, ale mogą się różnić w zależności od konkretnej patologii biopsji ziarniniaka. Skoncentruj się na tkance za pomocą obiektywu mikroskopowego 5X. To powiększenie powinno zapewnić dobry przegląd tkanki zawierającej zarówno obszary ziarniniaka, jak i martwicze.
W oprogramowaniu wybierz rurkę oznaczoną kazeum, aby przesunąć ją na miejsce pod tkanką. Wprowadź żądane parametry rozwarstwienia. Typowe ustawienia dla sekcji płuc o grubości 25 mikronów to moc lasera 30, prędkość 15 i przysłona 35.
Będą się one jednak różnić w zależności od używanego mikroskopu i potencjalnego spadku mocy ze względu na wiek lasera. Wybierz narzędzie Rysowanie swobodne i za pomocą myszy lub pióra na ekranie dotykowym obrysuj żądany obszar do sekcji. Powierzchnia regionu zostanie wyświetlona w oprogramowaniu.
Utrzymuj wybrane obszary poniżej 500 000 mikronów kwadratowych, aby ułatwić preparację. Powtarzaj preparację, aż w sumie trzy miliony mikronów kwadratowych zostaną zebrane w nasadce probówki. Czasami wycięty obszar może pozostać przyklejony do otaczającej membrany i nie wpaść do nasadki zbierającej.
Usuń te obszary z łącznej całkowitej powierzchni, ręcznie wybierając i usuwając je w oprogramowaniu. Następnie wybierz czapeczkę do zmiany komórkowej i zbierz trzy miliony mikronów kwadratowych tkanki przy użyciu tego samego procesu. Wybierz nasadkę dla niezajętego płuca i zbierz trzy miliony mikronów kwadratowych tkanki przy użyciu tego samego procesu.
Należy pamiętać, że niezaangażowana tkanka płucna zawiera wiele oskrzelików i przestrzeni pęcherzykowych. Zwróć szczególną uwagę, aby wykluczyć je ze zdefiniowanych obszarów tkanek do rozwarstwienia. Zdejmij uchwyt nasadki i ostrożnie odepnij, uszczelnij i oznacz każdą tubę.
Chroń wypreparowane tkanki przed zakłóceniami otaczającego powietrza. Wypreparowane tkanki należy natychmiast przeanalizować lub przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i rozmrozić przed przetworzeniem i analizą LC/MS. Zakładając gęstość tkanki wynoszącą jeden gram na mililitr, przygotować homogenat przez zważenie 50 miligramów tkanki kontrolnej i dodanie buforu PBS w celu rozcieńczenia.
Homogenizować tkankę przez ubijanie kulki w tkankę płucną i bufor PBS przez pięć minut przy 1750 obr./min na homogenizatorze kulkowym. Następnie rozcieńczyć jeden miligram na mililitr zapasów leków w acetonitrylu / wodzie jeden do jednego, aby utworzyć roztwory do zwiększania krzywej standardowej. Określ standardowe stężenia skokowe na podstawie objętości kolca i objętości tkanki docelowej.
Ilustrowany przykład dotyczy wzorca 100 nanogramów na mililitr przy użyciu objętości skoku 10 mikrolitrów. Wyjmij probówki zawierające wyciętą tkankę z miejsca przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i pozostaw do osiągnięcia temperatury pokojowej na pięć minut. Dodać 10 mikrolitrów roztworu acetonitrylu / wody jeden do jednego i dwa mikrolitry buforu PBS do probówek zawierających mikrowyciętą tkankę.
W przypadku probówek o standardowej krzywej i kontroli jakości dodać 10 mikrolitrów roztworu do dwóch mikrolitrów kontrolnego homogenatu płucnego. Do każdej probówki dodać 50 mikrolitrów roztworu ekstrakcyjnego. Wiruj każdą rurkę przez pięć minut.
Następnie poddawaj je sonikacji przez pięć minut. Następnie odwiruj probówki z prędkością 5 000 obr./min przez pięć minut, aby w każdej probówce uformować osad z folii i tkanki. Po odwirowaniu przenieść 50 mikrolitrów supernatantu na 96-dołkową płytkę głębinową i rozcieńczyć dodatkowymi 50 mikrolitrami wody dejonizowanej w każdym dołku.
Na koniec przeprowadź analizę LC-MS/MS i walidację metody zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Metoda LCM-LC/MS została po raz pierwszy zwalidowana poprzez analizę mikrowypreparowanych laserowo obszarów z homogenatu tkankowego wzbogaconego etambutolem. Jak pokazano tutaj, metoda była wysoce powtarzalna i wykazała doskonałe odzyskiwanie leków.
Stężenia etambutolu mierzone za pomocą LCM-LC/MS w wielu tkankach płuc zostały następnie zweryfikowane przez bezpośrednie porównanie ze stężeniami oznaczonymi za pomocą ustalonego podejścia LC/MS. Równoważne stężenia wykryto za pomocą obu technik. Bezwzględne stężenia etambutolu w niezajętym miąższu płuc, brzegu zmiany komórkowej i martwiczej kazei oznaczono za pomocą LCM-LC/MS.
Poziomy sterylizacji prątków gruźlicy osiągnięto we wszystkich przedziałach zmianowych. Wskazano minimalne stężenia wymagane do zabicia 99% zewnątrzkomórkowych replikujących się pałeczek i 99% prątków wewnątrzkomórkowych w makrofagach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mikropreparować tkanki i określać ilościowo poziomy leków w określonych strukturach ziarniniaka płucnego.
Technika ta umożliwia naukowcom zajmującym się badaniami nad lekami przeciwdrobnoustrojowymi dokładną i ilościową ocenę, czy podawane leki docierają do docelowych populacji patogenów w stężeniach sterylizujących. Podejście to ma szerokie zastosowanie w wielu różnych tkankach i stanach chorobowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół ilościowego oznaczania rozkładu leków w ziarniniakach gruźlicy płuc z wykorzystaniem laserowej mikrodysekcji oraz analizy LC/MS. Metoda ta umożliwia uzyskanie wysokiej rozdzielczości przestrzennej przy pomiarze stężeń leków w konkretnych strukturach tkankowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Farmakologia
- Mikrobiologia
Wstęp
- Zrozumienie dystrybucji leków w zmianach gruźliczych jest kluczowe dla skutecznego leczenia.
- Etambutol jest lekiem przeciwgruźliczym, który musi osiągnąć stężenia sterylizujące.
- ziarniniaki są złożonymi strukturami, w których bakterie mogą przetrwać.
- Obecne metody nie posiadają rozdzielczości przestrzennej niezbędnej do szczegółowej analizy.
Cel badania
- Ilościowe oznaczenie stężenia etambutolu w tkankach zmian gruźliczych.
- Ocena, czy stężenia leku osiągają poziomy skuteczne we wszystkich przedziałach ziarniniaka.
- Przedstawienie wizualnej demonstracji metody w celu lepszego zrozumienia.
Zastosowane metody
- Laserowa mikrodysekcja do izolowania specyficznych obszarów tkanki.
- Analiza LC/MS w celu oznaczenia stężeń leku.
- Krojenie tkanek przy użyciu kriostatu w kontrolowanej temperaturze.
- Staranne montowanie próbek tkankowych w celu uniknięcia kontaminacji.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na skuteczne oznaczanie ilościowe poziomu leku w różnych przedziałach ziarniniaka.
- Wykazano możliwość wizualizacji rozkładu leku z wysoką rozdzielczością przestrzenną.
- Uzyskano informacje na temat skuteczności etambutolu w docieraniu do populacji bakterii.
- Zwrócono uwagę na trudności związane z obchodzeniem się z tkanką i jej przygotowaniem.
Wnioski
- Technika ta jest cenna w procesie odkrywania i opracowywania leków przeciwprątkowych.
- Pozwala ona badaczom zrozumieć dynamikę dystrybucji leków w tkankach.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w celu udoskonalenia strategii leczenia.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładna ilościowa analiza przestrzenna stężeń leków w obrębie przedziałów ziarniniaka jest kluczowa dla oceny, czy środki przeciwprątkowe osiągają poziomy bakteriobójcze w martwiczym caseum oraz w obszarach zmian komórkowych. Możliwość ta bezpośrednio wpływa na decyzje o kontynuacji lub przerwaniu prac w procesie opracowywania leków przeciwgruźliczych, umożliwiając mechanistyczne zmniejszenie ryzyka w zakresie angażowania celu oraz adekwatności farmakokinetycznej. Metoda ta zwiększa pewność predykcyjną w optymalizacji związków wiodących poprzez powiązanie ekspozycji na lek ze stężeniami sterylizującymi w heterogenicznych mikrośrodowiskach zmian chorobowych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez określenie, czy leki osiągają stężenia sterylizujące w konkretnych przedziałach ziarniniaka.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ilościowych danych z rozdzielczością przestrzenną, co pozwala zminimalizować ryzyko podczas walidacji celów terapeutycznych w złożonych systemach istotnych dla przebiegu choroby.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do późniejszej standaryzacji testów poprzez izolację patologicznie odrębnych obszarów tkanki.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie powtarzalności testów oraz ilościowych wyników odczytów, które są niezbędne do rzetelnej oceny związków w kaskadach przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zachowuje istotność kliniczną poprzez ilościowe określanie stężeń leku w strukturach ziarniniaka istotnych dla organizmu człowieka, co umożliwia dopasowanie biomarkerów translacyjnych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka dzięki danym obejmującym całe spektrum od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, dostarczając danych o stężeniu leku z rozdzielczością przestrzenną, co wspiera identyfikację związków wiodących oraz prace przedkliniczne poprzez mechanistyczną redukcję ryzyka w zakresie oddziaływania na cel w obrębie przedziałów ziarniniaka.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez ilościowe określanie rozkładu leku w obszarach martwiczych i obszarach zmian komórkowych.
- Screening: Zapewnia gotowość i powtarzalność testów dzięki precyzyjnej izolacji przedziałów tkankowych w celu spójnego testowania związków.
- Analityka: Dostarcza bezwzględne pomiary stężenia leku, które umożliwiają porównania między różnymi warunkami oraz modelowanie zależności ekspozycja-odpowiedź.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną, dostarczając istotnych danych dotyczących tkanek ludzkich na temat penetracji leku w obrębie przypadku martwicy serowatej i obrzeża ziarniniaka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę do wielokrotnego użytku w celu ilościowego określania leków z rozdzielczością przestrzenną, możliwą do zastosowania w wielu stanach chorobowych obejmujących ustrukturyzowane zmiany.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność predykcyjna w walidacji celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w interakcjach lek-zmiana chorobowa.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność przepływów pracy w zakresie ilościowego oznaczania leku z rozdzielczością przestrzenną.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa oraz zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach w programach przeciwinfekcyjnych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje o dalszym rozwoju oparte na danych o ekspozycji leku w konkretnych przedziałach tkankowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Doświadczenie w zakresie laserowej mikrodysekcji (LCM) oraz obchodzenia się z tkanką w celu zapobieżenia kontaminacji i zapewnienia integralności przestrzennej.
- Dostęp do kriostatu, aparatury LC-MS/MS oraz roztworów ekstrakcyjnych z acetonitrylu i wody do przetwarzania próbek.
- Standaryzacja międzyzespołowa pomiędzy zespołami histologii, analiz molekularnych i farmakologii w celu spójnego definiowania obszarów zainteresowania.
- Uwzględnienie adaptacji do zmiennej patologii ziarniniaków i gęstości tkanki w różnych modelach chorób.
- Ograniczenia praktyczne obejmują kruchość skrawków tkankowych oraz potencjalne zakłócenia analizy MS przez OCT, jeśli nie zostaną one starannie kontrolowane.
