Name: Kwantyfikacja przestrzenna leków w zmianach gruźlicy płuc za pomocą mikrodysekcji laserowej Chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LCM-LC/MS) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji przestrzennej leków przeciwgruźliczych w zmianach płucnych za pomocą mikrodysekcji laserowej i chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas. Technika ta umożliwia precyzyjne oznaczanie stężeń etambutolu w poszczególnych kompartmentach granulomów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Paulowi O'Brienowi, Marizel Mina i Isabelli Freedman za eksperymenty na zwierzętach, Jacquie Gonzalez i Danielle Weiner z NIH/NIAID za pomoc w napromienianiu promieniami gamma tkanek królika przed mikrodysekcją laserową oraz Jansy Sarathy za przemyślenia i rady dotyczące rękopisu. Prace te były wspierane przez fundusze z Fundacji Billa i Melindy Gatesów (OPP1174780) oraz grantu NIH na wspólne oprzyrządowanie 1S10OD018072. Dziękujemy Eliseo A. Eugeninowi za udostępnienie mikroskopu Leica LMD 6500 oraz podzielenie się wiedzą i poradami. Zakup i bieżące wsparcie LMD 6500 zostało sfinansowane z grantu Narodowego Instytutu Zdrowia Psychicznego MH096625, Narodowego Instytutu Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu, NS105584, finansowania PHRI (na rzecz E.A.E) i składek GSK (na rzecz E.A.E.).

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Guide for the Care and Use of Laboratory Animals Narodowych Instytutów Zdrowia (National Institutes of Health) za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) NIAID (NIH) w Bethesda, MD.
1. Eksperymenty na zwierzętach i pobieranie tkanek
Ta sekcja protokołu opisuje procedury dotyczące zwierząt oraz pobieranie próbek w warunkach 3. poziomu biosafety (BSL3). Szczegółowe protokoły procedury infekcji aerozolowej Mycobacterium tuberculosis oraz protokoły podawania leków królikom zostały opisane wcześniej1,12.
<ol>
	<li>Zakaź króliki nowozelandzkie białe (samce i samice w wieku 4-5 miesięcy) szczepem M. tuberculosis HN878 przy użyciu systemu aerozolu wyłącznie przez nos, zgodnie z wcześniejszym opisem11.</li>
	<li>Podaj wybrane leki (w przedstawionym tutaj przykładzie etambutol) preferowaną drogą podania i uśmierć zwierzęta w 2., 6. i 24. godzinie po podaniu. Najpierw znieczul królika poprzez domięśniowy zastrzyk ketaminy w dawce 35 mg/kg oraz ksylazyny w dawce 5 mg/kg. Odczekaj dziesięć minut i potwierdź prawidłowe znieczulenie, uszczypując ogon i delikatnie dotykając oka. W przypadku braku reakcji uśmierć zwierzę poprzez dożylne podanie pentobarbitalu i fenytoiny (patrz Tabela materiałów) w dawce 1 mL/4,5 kg w 2 mL sterylnego roztworu soli fizjologicznej. 
	UWAGA: Te punkty czasowe są optymalne dla profilu farmakokinetycznego etambutolu i mogą wymagać dostosowania lub optymalizacji w przypadku innych badanych leków.</li>
	<li>Za pomocą pęsety, nożyczek i/lub skalpela wyjmij płuca z jamy klatki piersiowej i wykonaj biopsje płuc zawierające duże nekrotyczne ziarniniaki osadzone w otaczającej, niezajętej tkance płucnej (jak opisano wcześniej3). Ziarniniaki nekrotyczne mają beżowy kolor i zazwyczaj lekko wystają ponad otaczającą czerwoną lub różową tkankę płuca. Aby ułatwić kriosekcjonowanie, upewnij się, że biopsje nie są większe niż 2 x 1,5 x 1,5 cm.</li>
	<li>Za pomocą pęsety umieść biopsję na wcześniej oznakowanej tacy do formowania krioprzekrojów, tak aby pożądana powierzchnia cięcia była w bezpośrednim kontakcie z dnem tacy. Po zamrożeniu zapewni to płaską powierzchnię, z której będą pobierane krioprzekroje.</li>
	<li>Zamroź biopsję w oparach ciekłego azotu. Napełnij styropianowy pojemnik ciekłym azotem do głębokości 2 cali i umieść w nim metalowy stojak z drutu. Stojak powinien wystawać ponad powierzchnię ciekłego azotu, tworząc płaską powierzchnię, na której zostaną umieszczone tacki z tkanką. Załóż pokrywkę na pojemnik styropianowy i pozostaw tkanki na 10 minut do całkowitego zamrożenia.</li>
	<li>Wyjmij tacki z tkanką, szybko owiń je folią aluminiową, umieść w oddzielnie oznakowanych, zamykanych plastikowych woreczkach i szczelnie zamknij. Przenieś do zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu przechowywania. 
	UWAGA: Kroki 1.1 – 1.6 są wykonywane w warunkach BSL3 (w tym wszystkie prace ze zwierzętami oraz manipulacje zakażonymi organami i tkankami). Biopsje płuc poddaj irradiacji gamma dawką 3 Megarads, aby umożliwić manipulację poza obszarem BSL3. Mikrosekcja laserowa (LCM) niesterylizowanej tkanki może być przeprowadzona w obiekcie BSL3, jeśli obowiązują zatwierdzone protokoły bezpieczeństwa. Pozostała część niniejszego protokołu opisuje dalsze przetwarzanie w obiekcie BSL-2.</li>
</ol>
2. Przygotowanie skrawków tkankowych
<ol>
	<li>Ustaw kriostat na pożądaną temperaturę cięcia. Przenieś biopsjat płuca naświetlony promieniami gamma z przechowywania w -80 °C do kriostatu i pozostaw na 30 minut w celu wyrównania temperatury tkanki. Uwaga: dla biopsji zmian gruźliczych optymalna temperatura to -20 do -2 °C.</li>
	<li>Za pomocą pęsety przymocuj biopsjat do uchwytu kriostatu, używając niewielkiej ilości kleju OCT (Optimal Cutting Temperature), aby przykleić podstawę tkanki do uchwytu. Zorientuj tkankę tak, aby płaska powierzchnia (która stykała się z podstawą formy do mrożenia) była powierzchnią wystawioną na cięcie. Upewnij się, że OCT nie zanieczyści powierzchni tkanki, ponieważ może to zakłócić późniejszą analizę spektrometrią mas.</li>
	<li>Wykonaj trzy skrawki tkanki o grubości 25 µm i zamocuj je na szkiełkach z membraną PET. Delikatnie dotknij membraną skrawka tkanki, a następnie ją zdejmij. W przypadku zastosowania zbyt dużego nacisku cienka membrana może ulec rozerwaniu.
	<ol>
		<li>Unikaj nadmiernego manipulowania szkiełkami przed montażem, ponieważ spowoduje to naładowanie membrany PET i słabą adhezję skrawków tkanki. Upewnij się, że szkiełko z membraną jest utrzymywane w temperaturze pokojowej, aby umożliwić montaż w procesie rozmrażania i skuteczne przytwierdzenie tkanki do membrany.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjmij szkiełko z kriostatu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 3 minuty. Jeśli analiza LCM-LC/MS/MS nie zostanie przeprowadzona natychmiast, szczelnie zamknij szkiełko w małej, szczelnej torebce i przenieś do przechowywania w -80 °C aż do czasu mikrodissekcji.</li>
	<li>Wykonaj sąsiedni skrawka o grubości 10 - 12 µm i zamontuj go w procesie rozmrażania na standardowym szkiełku szklanym do barwienia hematoksyliną i eozyną (H&amp;E) oraz do celów referencyjnych. W tym czasie można wykonać dodatkowe skrawki do innych pożądanych barwień histochemicznych (takich jak metoda Ziehl-Niellsen do wizualizacji Mycobacterium tuberculosis (MTB)).</li>
</ol>
3. Mikrodysekcja
<ol>
	<li>Wyjąć szczelną torebkę zawierającą preparat z przechowywania w -80 °C i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej przez 5 minut. 
	UWAGA: Jeśli zimny preparat zostanie natychmiast wystawiony na atmosferę laboratoryjną, tkanka zostanie pokryta kondensatem, co może naruszyć integralność przestrzenną leku.</li>
	<li>Włączyć mikroskop i laser (laser wymaga 5 - 10 minut rozgrzewania przed rozpoczęciem cięcia). Załadować probówki PCR 0,20 mL z płaskim dnem do uchwytu.</li>
	<li>Wyjąć preparat z torebki i wykonać obraz optyczny przekroju tkanki na szkiełku PET za pomocą skanera płaskiego.</li>
	<li>Umieścić preparat w uchwycie (stroną z tkanką skierowaną w dół) i przypisać oddzielne probówki do pobierania próbek do konkretnych obszarów ziarniaka budzących zainteresowanie, korzystając z oprogramowania mikroskopu. Zazwyczaj będą to „płuca niezajęte”, „ziarniak komórkowy” i „caseum” (centrum nekrotyczne), ale mogą one różnić się w zależności od specyficznej patologii ziarniaka/biopsji.</li>
	<li>Ustawić ostrość na tkance, używając obiektywu mikroskopowego 5X. Takie powiększenie powinno zapewnić dobry przegląd tkanki zawierającej zarówno komórkowe, jak i nekrotyczne obszary ziarniaka. W oprogramowaniu wybrać probówkę oznaczoną jako „caseum”, aby przesunąć ją w pozycję pod tkankę.</li>
	<li>Wprowadzić żądane parametry dyssekcji. Typowe ustawienia dla przekroju płuc o grubości 25 µm to moc lasera 30, prędkość 15 i przysłona 35 (jednostki arbitralne). Wartości te będą się jednak różnić w zależności od użytego mikroskopu oraz potencjalnego spadku mocy wynikającego z wieku lasera.</li>
	<li>Wybrać narzędzie „free-draw” (rysunek swobodny) i, używając myszy lub pisaka ekranowego, obrysować żądany obszar do dyssekcji. Powierzchnia obszaru zostanie wyświetlona w oprogramowaniu. Wybrane obszary powinny być mniejsze niż 50 0 µm2 (0,5 mm2), aby ułatwić dyssekcję. Powtarzać dyssekcję, aż w nakrętce probówki zostanie zebranych łącznie 3 miliony µm2 (3 mm2).
	<ol>
		<li>Okazyjnie wycięty obszar może pozostać przyklejony do otaczającej błony (np. z powodu przyciągania elektrostatycznego) i nie wpaść do nakrętki zbiorczej. Takie obszary należy odjąć od całkowitej sumarycznej powierzchni, zaznaczając i usuwając je ręcznie w oprogramowaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybrać nakrętkę dla „zmiany komórkowej” i zebrać 3 miliony µm2 tkanki, stosując ten sam proces, który opisano w kroku 3.7.</li>
	<li>Wybrać nakrętkę dla „płuc niezajętych” i zebrać 3 miliony µm2 tkanki, stosując ten sam proces, który opisano w kroku 3.7. Należy pamiętać, że niezajęta tkanka płucna zawiera wiele oskrzelików i przestrzeni pęcherzykowych. Należy zwrócić szczególną uwagę, aby wykluczyć je z określonych obszarów tkanki do dyssekcji.</li>
	<li>Wyjąć uchwyt nakrętek i ostrożnie odpiąć, zamknąć i opisać każdą probówkę. Chronić wycięte tkanki przed zakłóceniami powietrznymi z otoczenia (np. prądami powietrza wywołanymi otwarciem drzwi). Przeanalizować wycięte tkanki natychmiast lub przechowywać w -80 °C i rozmrozić przed przetwarzaniem i analizą LCMS.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja i analiza LCMS
<ol>
	<li>Przygotować roztwór do ekstrakcji z acetonitrylu i metanolu w stosunku 1:1, zawierający standard wewnętrzny etambutol d-10. Przy wyborze standardu wewnętrznego należy zastosować stabilną, znakowaną formę leku będącego analitem (taką jak etambutol znakowany deuterem, użyty w niniejszym pokazie) o wystarczającym przesunięciu masy, aby uniknąć interferencji izotopowych pomiędzy lekiem a standardem (zazwyczaj minimum 4 daltony). 
	UWAGA: Tworzenie wzorców w homogenacie każdego z odpowiednich typów tkanek jest trudne ze względu na bardzo ograniczoną ilość tkanki kontrolnej, z której można przygotować wzorce w homogenacie. Jako alternatywa dla sporządzania wzorców z próbki homogenatu z dodatkiem związku (spiked homogenate), wzorzec można przygotować poprzez wspólne dodanie czystej tkanki oraz badanego związku, a następnie przeprowadzenie ekstrakcji. Objętość tkanki kontrolnej w homogenacie, odpowiadająca objętości docelowej sekcji tkanek z próbki badawczej, jest łączona bezpośrednio z ilością badanego związku, która odpowiada danej koncentracji.</li>
	<li>Oblicz objętość docelowej tkanki na podstawie powierzchni i grubości przekroju tkankowego, a następnie wyznacz niezbędny czynnik rozcieńczenia homogenatu, przyjmując objętość homogenatu, która zostanie dodana do próbek standardowych i kontrolnych (QC). Poniżej przedstawiono obliczenia dla 3 milionów µm2 (3 mm2) skierować wiązkę na wypreparowany obszar za pomocą 25 µm grubość i 2 µL objętość homogenatu. 
	<img alt="Wzór na objętość tkanki: \( \text{Objętość} = \text{Pole powierzchni} \times \text{Grubość} \). Przedstawienie równania." src="/files/ftp_upload/57402/57402eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
	<img alt="Obliczanie objętości tkanki docelowej; wzór; równanie matematyczne; proces konwersji objętości." src="/files/ftp_upload/57402/57402eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"> 
	<img alt="Równanie czynnika rozcieńczenia homogenatu: Objętość homogenatu ÷ Objętość docelowa do przygotowania roztworu." src="/files/ftp_upload/57402/57402eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3"> 
	<img alt="Wzór na czynnik rozcieńczenia homogenatu, 2 µL ÷ 0,075 µL = 26,67, proces obliczeniowy." src="/files/ftp_upload/57402/57402eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 4"></li>
	<li>Zakładając gęstość tkanki wynoszącą 1 g/ml, należy przygotować roztwór zapasowy homogenatu poprzez odważenie 50 mg tkanki kontrolnej i dodanie buforu PBS w celu rozcieńczenia (stosując współczynnik rozcieńczenia homogenatu 26,67 obliczony w kroku 4.2, objętość rozcieńczalnika wynosi 1,283 ml). Homogenizować tkankę płuc oraz bufor PBS za pomocą homogenizatora kuleczkowego przez 5 minut przy prędkości 1750 obr./min. 
	<img alt="Wzór do obliczeń rozcieńczenia: (Współczynnik rozcieńczenia homogenatu-1) × Objętość tkanki kontrolnej = Objętość rozcieńczalnika." src="/files/ftp_upload/57402/57402eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 5"> 
	<img alt="Wzór na obliczanie rozcieńczenia, przeliczanie mg na mL przy użyciu przeliczników masy i objętości." src="/files/ftp_upload/57402/57402eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 6"></li>
	<li>Rozcieńczyć roztwory zapasowe leku o stężeniu 1 mg/ml w mieszaninie acetonitrylu i wody w stosunku 1:1, aby przygotować roztwory wzorcowe do krzywej kalibracyjnej. Określić stężenia standardów dodawanych na podstawie objętości dodawanej próbki i objętości docelowej tkanki. Przedstawiony przykład dotyczy standardu o stężeniu 10 ng/ml przy użyciu 10 µL objętość dodanego standardu. 
	<img alt="Wzór do obliczania stężenia dodatku w procesie chemii analitycznej." src="/files/ftp_upload/57402/57402eq7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 7"> 
	<img alt="Wzór na obliczanie rozcieńczeń, konwersja stężeń, dzielenie jednostek, schemat do celów edukacyjnych." src="/files/ftp_upload/57402/57402eq8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 8"></li>
	<li>Wyjmij probówki zawierające mikrodissekowane tkanki z -80 °C przechowywać i pozostawić przez 5 minut do osiągnięcia temperatury pokojowej.</li>
	<li>Dodaj 10 µL roztworu acetonitrylu i wody w stosunku 1:1 oraz 2 µL buforu PBS do probówek zawierających mikrodysekcjonowaną tkankę.</li>
	<li>Do probówek krzywej standardowej i kontroli jakości dodać 10 µL roztworu wzbogacającego do 2 µL homogenatu płuc kontrolnych.</li>
	<li>Dodaj 50 µL roztworu ekstrakcyjnego do każdej probówki.</li>
	<li>Mieszać każdą probówkę na wstrząsarku wortex przez 5 minut, poddać sonikacji przez 5 minut, a następnie wirować przy 500 obr./min przez 5 minut, aby w każdej probówce utworzył się osad z błony i tkanki.</li>
	<li>Transfer 50 µL nadfiltratu do głębokiej płytki 96-dołkowej i rozcieńczyć dodatkową ilością 50 µL wody dejonizowanej do każdej studni.</li>
	<li>Przeprowadzić analizę LC/MS/MS z wykorzystaniem zoptymalizowanych parametrów instrumentu dla etambutolu oraz etambutolu-d10 jako standardu wewnętrznego (zgodnie z wcześniejszym szczegółowym opisem12).</li>
	<li>Należy zastosować czynnik rozcieńczenia, aby skorygować dokładną ilość tkanki wypreparowanej dla każdej próbki. 
	<img alt="Wzór na współczynnik rozcieńczenia: Pole docelowe ÷ Pole rzeczywiste; równanie edukacyjne do obliczeń naukowych." src="/files/ftp_upload/57402/57402eq9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 9"></li>
</ol>
5. Walidacja metody
<ol>
	<li>Przygotuj homogenat z kontrolnej tkanki płuc, łącząc 1 część tkanki płucnej, 2 części PBS oraz 3–4 stalowe kulki. Homogenizuj tkankę płucną w buforze PBS przez 5 minut przy prędkości 1750 obr./min za pomocą homogenizatora kulkowego.</li>
	<li>Wzbogać homogenat poprzez dodanie 10 µL 1 mg/mL zapasu etambutolu w DMSO do 990 µL homogenatu, aby uzyskać końcowe stężenie 10 00 ng/ml (10 mg/ml), a następnie mieszać w wytrząsarce wortex przez 1 minutę.</li>
	<li>Przygotuj zamrożony blok homogenatu, wlewając homogenat do formy kriogenicznej i szybko zamrażając go na suchem lodzie przez 5 minut.</li>
	<li>Przygotuj 25 µm grube cięcia z bloku homogenatu, zgodnie z opisem w krokach 2.1 – 2.5.</li>
	<li>Wypreparuj docelowy obszar tkanki zgodnie z instrukcjami opisanymi w krokach 3.2 – 3.10.</li>
	<li>Dodaj 10 µL mieszanina acetonitrylu i wody w stosunku 1:1 oraz 2 µL buforu PBS do probówek zawierających mikroprzestrzeń tkanek.</li>
	<li>Dodaj 50 µL roztworu ekstrakcyjnego do każdej probówki. Należy wykonać kroki 4.9–4.12 w celu stworzenia krzywej wzorcowej i oznaczenia stężenia leku w bloku homogenatu tkankowego.</li>
	<li>Oblicz wydajność ekstrakcji, korzystając z poniższego wzoru: 
	<img alt="Wzór na wydajność ekstrakcji; równanie stężenia leku; stosunek stężenia zmierzonego do stężenia dodanego." src="/files/ftp_upload/57402/57402eq10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 10"></li>
</ol>

<ol><li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+path+of+anti-tuberculosis+drugs%3A+From+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li>
<li>Roscioli, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desorption+electrospray+ionization+%28DESI%29+with+atmospheric+pressure+ion+mobility+spectrometry+for+drug+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection.</a> Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+of+levofloxacin+distribution+in+TB-infected+pulmonary+lesions+by+MALDI-MSI+and+continuous+liquid+microjunction+surface+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling.</a> Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).</li>
<li>Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raster-mode+continuous-flow+liquid+microjunction+mass+spectrometry+imaging+of+proteins+in+thin+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections.</a> Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).</li>
<li>Prideaux, B., Stoeckli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+for+drug+distribution+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging for drug distribution studies.</a> J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).</li>
<li>Dilillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging%2C+laser+capture+microdissection%2C+and+LC-MS%2FMS+of+the+same+tissue+section%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section.</a> J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).</li>
<li>Xu, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+laser+capture+microdissection+and+proteomics%3A+methodologies+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications.</a> Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).</li>
<li>Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+dissection+sampling+modes+for+direct+mass+spectral+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).</li>
<li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits%3A+A+failed+host+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 110016(2011).</li>
<li>Zimmerman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethambutol+partitioning+in+tuberculous+pulmonary+lesions+explains+its+clinical+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).</li>
<li>Kempker, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavitary+penetration+of+levofloxacin+among+patients+with+multidrug-resistant+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+drug+penetration+of+echinocandin+antifungals+at+the+site+of+infection+in+an+intra-abdominal+abscess+model%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2017).</li>
<li>Pascal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+modeling+identifies+drug-uptake+history+as+predictor+of+tumor+drug+resistance+and+nano-carrier-mediated+response%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response.</a> ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przestrzennie rozdzielona kwantyfikacja leków w obrębie zmian gruźlicy płuc jest wymagana w celu określenia, czy narażenie na lek osiąga stężenia sterylizujące dla populacji bakterii znajdujących się w różnych przedziałach zmianowych. Opisana tutaj metoda LCM-LC/MS umożliwia bezwzględne określenie ilościowe leków przeciwgruźliczych we wszystkich przedziałach zmian chorobowych, w tym w bogatej w bakterie kazeum, przy użyciu łącznie tylko 1 - 3 odcinków tkanki. Tradycyjna homogenizacja tkanek i podejścia LC/MS do oznaczani...

Zdolność do przestrzennego rozpoznawania i ilościowego określania poziomów leków jest kluczowym wymogiem dla określenia, czy leki przeciwgruźlicze docierają do subpopulacji bakteryjnych w obrębie zmian płucnych w stężeniach sterylizujących1. Szczególne znaczenie ma określenie przenikania leku do martwiczego rdzenia zmiany (zwanego kazeum), który zazwyczaj zawiera największą liczbę prątków i może być słabo dostępny dla leków ze względu na brak unaczynienia.
Tradycyjne metody oceny penetracji zmian, które polegają na homogenizacji wyciętych zmian płucnych, a następnie ekstrakcji rozpuszczalnikiem i analizie spektrometrii mas metodą chromatografii cieczowej (LC/MS), są bardzo czułe i selektywne dla interesujących leków. Jednak metody te oferują słabą informację przestrzenną, ograniczoną do rozmiaru oryginalnej homogenizowanej tkanki. Metody obrazowania oparte na spektrometrii mas, takie jak jonizacja desorpcyjna wspomagana matrycą laserową (MALDI)2,3, jonizacja elektronopryskowa desorpcyjna (DESI)4 lub ekstrakcja powierzchniowa wzmocniona cieczą5,6 oferują możliwości obrazowania o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, ale bezpośrednia kwantyfikacja może być niezwykle trudna lub niemożliwa ze względu na niejednorodny jon Efekty tłumienia i różna skuteczność ekstrakcji analitu z różnych typów komórek lub tkanek<klasa SUP="xref">7. Ponadto większość metod bezpośredniego obrazowania tkanki MS jest z natury mniej czuła niż LC/MS ze względu na brak chromatograficznej separacji endogennych gatunków konkurujących o jonizację i niższą skuteczność ekstrakcji rozpuszczalnikowej leku z tkanki.
Laserowe mikrodyparowanie (LCM) w połączeniu z analizą LC/MS było rutynowo stosowane do izolowania i charakteryzowania odrębnych obszarów tkanek do badań proteomicznych8,9 i ostatnio wykorzystywane do ilościowego oznaczania leków w dozowanej tkance zwierzęcej10. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół wykorzystujący LCM w połączeniu z analizą LC/MS (LCM-LC/MS) w celu ilościowego określenia leków anty-gruźliczych w różnych przedziałach ziarniniaka. W procesie mikrodysekcji laserowej laser UV jest ogniskowany przez obiektyw mikroskopu na wycinku tkanki, który wycina i izoluje żądany obszar tkanki, podążając ścieżką zdefiniowaną przez użytkownika. W przypadku LCM wspomaganego grawitacyjnie (technika stosowana w tych badaniach) wycinek tkanki jest montowany na cienkim szkiełku z membraną polimerową (PET lub PEN), a tkanka jest wychwytywana w nasadce probówki zbiorczej umieszczonej poniżej szkiełka. Leki są ekstrahowane z wyciętej tkanki i oznaczane ilościowo przy użyciu standardowych metod LC/MS. Ilość tkanki wymaganej do pobrania jest ostatecznie określana na podstawie oczekiwanego stężenia leku obecnego w tkance i czułości metody LC/MS. W przypadku większości analiz leków podawanych na poziomie terapeutycznym i analizowanych przy użyciu rutynowego spektrometru mas z potrójnym kwadrupolem wystarczające jest 3 miliony μm2 (3 mm2) powierzchni tkanki.
Ten protokół opisuje potężną kombinację profilowania przestrzennego i pełnej kwantyfikacji oferowaną przez LCM-LC/MS, zapewniając bezwzględne stężenia leku we wszystkich przedziałach ziarniniaków gruźlicy. Technika ta może być również stosowana do określania stężeń leków w wielu różnych chorych tkankach, dostarczając istotnych informacji na temat odkrywania i opracowywania leków.

<table><tbody><tr><td>Nowa Zelandia Białe króliki</td><td>Covance</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HN878 Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (Ketamina) 100 mg/ml C3N</td><td>Henry Schein Zdrowie zwierząt</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anazed (ksylazyna) 100 mg/ml</td><td>Henry Schein Zdrowie zwierząt</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sodu i fenytoina sodu) Rozwiązanie</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl (klasa LC-MS)</td> <td>Fisher</td><td>A955-212</td><td></td></tr><tr><td>Metanol (klasa LC-MS)</td> <td>Fisher</td><td>A456-212</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy (klasa LC-MS)</td> <td>Fisher</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Woda (klasa LC-MS)</td> <td>Fisher</td><td>W6212</td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml płaskie probówki PCR</td><td>Corning</td><td>07-200-392</td><td></td></tr><tr><td>Ramy stalowe, membrana PET</td><td></td> Szkiełka mikroskopowe <td>Leica</td> 11505151 <td></td></tr><tr><td>Premium Frosted Fisher</td><td></td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>96 Płytka głębinowa 2,0 ml PP RB</td><td>Kolumna</td><td></td> Fisher NC0363259 <td></td></tr><tr><td>Zorbax SB-C8 (4,6 na 50 mm; wielkość cząstek, 3,5 &mu; m)</td> <td>Agilent</td><td>820631-001D</td><td></td></tr> <tr><td>"Zamek błyskawiczny" Worki na próbki fok</td><td>Fisher</td><td>01-816-1B</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM1850 kriostat</td><td>Leica</td><td>wycofana z produkcji</td><td>Leica CM1860 to obecny model</td></tr><tr><td>Laserowy system mikrodysekcji 6500</td><td>Leica</td><td>wycofana z produkcji</td><td>Leica LMD 6 to obecny model</td></tr><tr><td>Spektrometr masowy Agilent 1260 Infinity II HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>API 4000 QTRAP</td><td>Sciex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja przestrzenna leków w zmianach gruźlicy płuc za pomocą mikrodysekcji laserowej chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (lcm-lc/ms)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Gruźlica jest nadal główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Pilnie potrzebne jest udoskonalenie istniejących schematów leczenia oraz opracowanie nowatorskich środków terapeutycznych. Zdolność dawkowanych leków przeciwgruźliczych do docierania i sterylizacji bakterii w słabo unaczynionych obszarach martwiczych (caseum) ziarniniaków płuc ma kluczowe znaczenie dla skutecznej interwencji terapeutycznej. Skuteczne schematy terapeutyczne muszą zatem zawierać leki o korzystnych właściwościach penetracji kazeum. Obecne metody LC/MS do ilościowego określania poziomów leków w tkankach biologicznych mają ograniczone możliwości rozdzielczości przestrzennej, co utrudnia dokładne określenie bezwzględnych stężeń leku w małych przedziałach tkankowych, takich jak te znajdujące się w ziarniniakach martwiczych. W tym miejscu przedstawiamy protokół łączący mikrodysekcję wychwytu laserowego (LCM) patologicznie odrębnych obszarów tkankowych z kwantyfikacją LC/MS. Technika ta zapewnia bezwzględną kwantyfikację leków w ziarniniaku kaziniaku, otaczających zmianach komórkowych i niezaangażowanej tkance płucnej, a tym samym dokładnie określa, czy osiągane są stężenia bakteriobójcze. Oprócz badań nad gruźlicą, technika ta ma wiele potencjalnych zastosowań w przestrzennie rozdzielczej kwantyfikacji leków w chorych tkankach.

Przegląd podejścia LCM-LC/MS przedstawiono na Rysunku 1. Po sterylizacji tkanki za pomocą promieniowania gamma wszystkie kolejne etapy (począwszy od krojenia tkanki) odbywają się poza warunkami BSL3. Rysunek 2 przedstawia przekroje biopsji zmian przed i po izolacji tkanki metodą LCM. Nekrotyczne i komórkowe obszary zmian gruźliczych można łatwo zidentyfikować i wyizolować wyłącznie na podstawie oględzin obrazów optycznych (bez ko...

Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący mikrodysekcję laserową w połączeniu z analizą LC/MS do przestrzennego ilościowego określania dystrybucji leków w ziarniniakach gruźlicy płuc. Podejście to ma szerokie zastosowanie w ilościowym określaniu stężeń leków w tkankach przy dużej szczegółowości przestrzennej.

Kwantyfikacja przestrzenna leków w zmianach gruźlicy płuc za pomocą mikrodysekcji laserowej Chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Ogólnym celem tej techniki analitycznej jest ilościowe określenie leku przeciwgruźliczego etambutolu w przedziałach tkankowych zmian w płucach gruźlicy w celu określenia, czy osiągane są stężenia leku bakteriobójczego. Metoda ta może odpowiedzieć na pytania w dziedzinie odkrywania i opracowywania leków na gruźlicę poprzez określenie, czy podawane leki docierają do populacji bakterii w stężeniach sterylizujących we wszystkich przedziałach tkankowych ziarniniaka. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia pełną kwantyfikację stężeń leków przy dużej szczegółowości przestrzennej w określonych strukturach tkankowych i populacjach komórek.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy cięcia i montażu tkanek są trudne do nauczenia się ze względu na możliwość zanieczyszczenia tkanek i delikatną naturę szkiełek membranowych. Rozpocznij tę procedurę od pobrania tkanki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby wykonać cięcie tkanek, najpierw ustaw kriostat na żądaną temperaturę cięcia.Przenieś napromieniowaną promieniami gamma biopsję płuc z magazynu o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do kriostatu i pozostaw na 30 minut, aby wyrównać temperaturę tkanki.

spatial-quantification-drugs-pulmonary-tuberculosis-lesions-laser

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Laserowa ablacja z jonizacją elektrosprayową (LAESI) jest źródłem jonów dla spektrometrii mas pracującym pod ciśnieniem atmosferycznym. W trybie obrazowania laser średniofalowy w podczerwieni bada rozkład cząsteczek w przekroju tkanki lub biofilmie. Technika ta stanowi nowe podejście do różnorodnych badań bioanalitycznych prowadzonych w natywnych warunkach doświadczalnych.

Obrazowanie molekularne tkanek biologicznych i biofilmów w ciśnieniu atmosferycznym przy użyciu spektrometrii mas LAESI

Laserowa spektroskopia rozpadu przeprowadzona na cienkich narządach i tkankach nowotworowych skutecznie wykryła naturalne pierwiastki i sztucznie wstrzyknięty gadolin (Gd), emitowany z nanocząstek opartych na Gd. Obrazy pierwiastków chemicznych osiągnęły rozdzielczość 100 μm i czułość ilościową poniżej mM. Kompatybilność zestawu ze standardową mikroskopią optyczną podkreśla jego potencjał do dostarczania wielu obrazów tej samej tkanki biologicznej.

Spektroskopia rozpadu indukowanego laserem: nowe podejście do mapowania i kwantyfikacji nanocząstek w tkance narządowej

Mikrodysekcja jest szeroko stosowana do badania DNA, RNA i białek w tkance.   Mikroskopia laserowa (LCM) jest najczęściej stosowaną metodą, ale od niedawna dostępna jest nowa technika mielenia, mezodysekcja.  Pokazujemy ekstrakcję RNA z mezorozpreparowanych szkiełek tkankowych zatopionych w parafinie w formalinie ziarniniaków Mycobacterium tuberculosis.

Nowatorskie podejście do mikrodysekcji w celu odzyskania specyficznych transkryptów Mycobacterium tuberculosis z ziarniniaków płuc zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie

Tutaj opisujemy test wysokiej wydajności chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (HPLC-MS/MS) do ilościowego oznaczania immunosupresyjnego takrolimusu w wysuszonych plamach krwi przy użyciu prostego ręcznego etapu wytrącania białka i ekstrakcji kolumnowej online.

Oznaczanie ilościowe takrolimusu działającego immunosupresyjnie na wysuszonych plamkach krwi za pomocą LC-MS/MS

Zakażenie gruźlicą u ludzi jest złożonym procesem, który jest trudny do modelowania in vitro. W tym miejscu opisujemy nowatorski model 3D ludzkiej tkanki płucnej, który podsumowuje dynamikę zachodzącą podczas infekcji, w tym migrację komórek odpornościowych i wczesne tworzenie ziarniniaka w środowisku fizjologicznym.

Model 3D ludzkiej tkanki płucnej do badań funkcjonalnych nad zakażeniem Mycobacterium tuberculosis

Tutaj opisujemy metodę szybkiej dializy równowagowej (RED) do pomiaru wiązania leku z kazeum ze zmian i jam gruźlicy płuc. Protokół jest również stosowany z pienistą matrycą pochodzącą z makrofagów, która jest skutecznym substytutem kazeum.

Test wiązania kazey in vitro, który przewiduje przenikanie leku do zmian gruźliczych

Ten protokół przedstawia zintegrowaną platformę spektroskopii Ramana i spektrometrii mas (MS), która jest w stanie osiągnąć rozdzielczość pojedynczej komórki. Spektroskopia Ramana może być stosowana do badania odpowiedzi komórkowej na leki, podczas gdy stwardnienie rozsiane może być wykorzystywane do ukierunkowanej i ilościowej analizy wychwytu i metabolizmu leków.

Zintegrowana platforma spektroskopii Ramana i spektrometrii mas do badania wychwytu, metabolizmu i efektów stosowania leków w pojedynczych komórkach

Obecne metody analizy przestrzegania przez pacjentów złożonych schematów leczenia gruźlicy opornej na leki (DR-TB) mogą być niedokładne i wymagające dużych zasobów. Nasza metoda analizuje włosy, łatwo zbieralną i przechowywaną matrycę, pod kątem stężeń 11 leków DR-TB. Dzięki LC-MS/MS możemy określić poziomy leków poniżej nanogramów, które można wykorzystać do lepszego zrozumienia przestrzegania leków.

Zweryfikowany panel LC-MS/MS do ilościowego określenia 11 leków opornych na gruźlicę w małych próbkach włosów

Przedstawiono protokół ekstrakcji całkowitej zawartości lipidów w ścianie komórkowej szerokiej gamy prątków. Ponadto przedstawiono protokoły ekstrakcji i analizy różnych rodzajów kwasów mykolowych. Dostępny jest również protokół chromatografii cienkowarstwowej do monitorowania tych związków prątków.

Analiza składu lipidowego prątków metodą chromatografii cienkowarstwowej

Ten protokół opisuje kroki do wygenerowania modelu 3D rozkładu metabolitów podczas infekcji trypanosomatydem, w tym pobieranie próbek, ekstrakcję metabolitów, przegląd akwizycji danych z chromatografii cieczowej i spektrometrii mas tandemowej, generowanie modeli 3D i wreszcie wizualizację danych.

Podejścia kartografii chemicznej do badania zakażenia trypanosomatydem

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy przepływ pracy dla sterowanej przez sztuczną inteligencję segmentacji obszarów zainteresowania potwierdzonych patologicznie na podstawie barwionych, cienkich obrazów skrawków tkanek w celu wzbogacenia populacji komórek z rozdzielczością histologiczną za pomocą mikrodysekcji laserowej. Strategia ta obejmuje nowatorski algorytm umożliwiający przenoszenie znaczników oznaczających interesujące populacje komórek bezpośrednio do mikroskopów laserowych.

Uprzemysłowiona, sterowana sztuczną inteligencją mikrodysekcja laserowa do mikroskalowej analizy proteomicznej mikrośrodowiska guza

Poznaj metodę kwantyfikacji przestrzennej leków przeciwgruźliczych w zmianach płucnych za pomocą mikrodysekcji laserowej i chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas. Technika ta umożliwia precyzyjne oznaczanie stężeń etambutolu w poszczególnych kompartmentach granulomów.

Kwantyfikacja przestrzenna leków w zmianach gruźlicy płuc za pomocą mikrodysekcji laserowej Chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LCM-LC/MS) (Wideo) | JoVE Journal

Kwantyfikacja przestrzenna leków w zmianach gruźlicy płuc za pomocą mikrodysekcji laserowej Chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LCM-LC/MS)

Przeglądaj więcej filmów