Name: Prosty, szybki i ilościowy test do pomiaru naprawy wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidach transfekowanych do komórek ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Poznaj metodę ilościowej oceny naprawy wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidach w komórkach ssaków przy użyciu specyficznej dla nici ekstensji starterów i qPCR. Technika ta pozwala mierzyć kinetykę naprawy już po dwóch godzinach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez National Institutes of Health (ES023350). Lisa Chesner jest wspierana przez Training Grant 5T32HL007741. Dziękujemy Natalii Tretyakovej (University of Minnesota) i Ashis Basu (University of Connecticut) oraz członkom ich laboratorium za wsparcie i porady techniczne na wczesnych i pośrednich etapach tych prac.

1. Generowanie plazmidu zawierającego DPC
<ol>
	<li>Połączyć 80 pmol oligonukleotydu zawierającego resztę 8-oksoguaniny (20 µL) z 10 jednostkami kinazy polinukleotydowej T4 (1 µL) w 10-krotnym buforze ligazy (5 µL). Dodać wodę do osiągnięcia całkowitej objętości 50 µL i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min w łaźni wodnej.
	<ol>
		<li>Połączyć fosforylowany oligonukleotyd (50 µL), 80 pmol jednoniciowego DNA (80 μL), 100 jednostek polimerazy Taq (20 µL) w 10-krotnym buforze reakcyjnym Taq (25 µL), 100 mM ATP (20 µL), 10 mM dNTP (20 µL), bufor NEB 2 (25 µL) oraz 8 µg BSA (20 µL) do całkowitej objętości 260 µL. Inkubować próbkę w termocyklerze w temperaturze 75 °C przez 15 min, a następnie w 37 °C przez 5 min. Następnie dodać 60 U polimerazy T4 (20 µL), 8 000 U ligazy T4 (20 µL), 100 mM ATP (20 µL), 10 mM dNTP (20 µL), bufor NEB 2 (15 µL) oraz 8 µg BSA (20 µL) do całkowitej objętości 375 µL. Reakcję inkubować przez noc w temperaturze 37 °C (Rycina 1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować mieszaninę fenolu i chloroformu nasyconą buforem w stosunku 50:50. Dodać równe objętości każdego składnika, wymieszać i wirować w wirówce laboratoryjnej przy 21 130 x g przez 5 min. Chloroform wypiera wodę z fenolu nasyconego buforem, tworząc dwie warstwy: górną warstwę wodną oraz dolną warstwę organiczną. Dodać 375 µL dolnej warstwy organicznej do reakcji przedłużania primera, wymieszać i wirować w wirówce laboratoryjnej przy 21 130 x g przez 5 min. 
	UWAGA: Fenol i chloroform są substancjami niebezpiecznymi; należy zachować ostrożność, aby uniknąć kontaktu z oczami lub skórą.
	<ol>
		<li>Po wirowaniu ostrożnie pobrać górną warstwę i wymieszać z octanem amonu dodanym do stężenia końcowego 0,3 M, a następnie dodać 2 objętości 100% etanolu. Roztwór przechowywać w temperaturze -20 °C przez minimum 30 min lub przez noc.</li>
		<li>Wirować próbkę w wirówce laboratoryjnej przy 15 000 x rpm w temperaturze 4 °C przez 10 min. Usunąć nadsącz i przemyć osad w 1 mL 70% etanolu. Wirować próbkę w wirówce laboratoryjnej przy 15 000 x rpm w temperaturze 4 °C przez 5 min. Usunąć nadsącz i resuspenderować osad w 100 µL wody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Połączyć 50 µL DNA z poprzedniego kroku z 16 µL 6-krotnego barwnika do ładowania na żel oraz 34 µL wody i poddać elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia zawierającym 0,5 µg/mL bromku etydyny. Prowadzić elektroforezę przy 2 V/cm na żelu o długości 10 cm przez 6 h w 1-krotnym buforze TAE. Wyciąć prążek superzwinięty za pomocą żyletki i zważyć wycinek żelu (Rycina 1A). Przeprowadzić kontrolę pozytywną, aby służyła jako marker migracji kowalencyjnie zamkniętego, superzwiniętego DNA. 
	UWAGA: Bromek etydyny jest mutagenem; należy zachować ostrożność, aby uniknąć kontaktu ze skórą. Ważne jest również zminimalizowanie czasu ekspozycji próbki plazmidu na promieniowanie UV, aby ograniczyć powstawanie fotoproduktów UV.
	<ol>
		<li>Przetrawić wycinek żelu, dodając 10% buforu reakcyjnego β-agarazy na każdy mg masy żelu. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 10 min i schłodzić do 42 °C. Dodać 10 U β-agarazy i inkubować w temperaturze 42 °C przez 1 h.</li>
		<li>Po inkubacji zmierzyć objętość, dodać octan amonu do stężenia końcowego 0,3 M i schłodzić na lodzie przez 15 min. Wirować przy 15 000 x g przez 15 min w temperaturze pokojowej, zebrać nadsącz i dodać 2 objętości izopropanolu. Schłodzić w temperaturze -20 °C przez noc.</li>
		<li>Wyczyścić superzwinięte DNA, wirując przez 10 min przy 15 000 x rpm w wirówce laboratoryjnej w temperaturze 4 °C, a następnie resuspenderować osad w 40 µL wody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić sieciowanie 12 pmol (15 µL) DNA z 36 pmol oksoguaninyzylazy (1 µL) w buforze zawierającym 100 mM NaCl (3 µL), 1 mM MgCl2 (3 µL), 20 mM Tris-HCl pH 7,0 (6 µL) oraz 10 mM cyjanoborowodorku sodu (2 µL) do osiągnięcia objętości końcowej 30 µL w temperaturze 37 °C przez 30 min26. Pobrać 1 µL sieciowanej próbki i rozcieńczyć w 500 µL wody, aby służyła jako punkt pomiarowy dla 0 h, i przeanalizować metodą PCR w kroku 3.</li>
</ol>
2. Wytrącanie KCl/SDS
<ol>
	<li>Aby zwizualizować wydajność sieciowania, przeprowadź trawienie restrykcyjne 1 µg sieciowanego plazmidu przy użyciu 1 μL BspDI w buforze 10x w temperaturze 37 °C przez 1 h w celu uzyskania dwóch fragmentów DNA o różnych rozmiarach. 
	UWAGA: Jeden fragment będzie sieciowany z białkiem (4,4 kb), a drugi nie (2,8 kB) (Rysunek 1B).
	<ol>
		<li>Podziel próbki na pół, dodaj do obu SDS do stężenia końcowego 0,5% i inkubuj w temperaturze 65 °C przez 10 min.</li>
		<li>Do jednej z próbek dodaj KCl (stężenie końcowe 100 mM) i inkubuj na lodzie przez 5 min.</li>
		<li>Odwiruj obie próbki z prędkością 12 000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C, a następnie nałóż nadsączone ciecze na żel agarozowy, aby oszacować procent koniugacji białka z DNA12. 
		UWAGA: Wytrącanie KCl/SDS służy do kontroli jakości, a nie do przygotowania substratu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Transfekcja komórek ssaków
<ol>
	<li>Na 1 dzień przed transfekcją wysiać 0,5 x 106 komórek/dołek w płytce 6-dołkowej. Następnego dnia zmieszać 1,5 µg (30 µL) plazmidu zawierającego DPC (z kroku 1.6) z 300 µL bezsurowiczego medium hodowlanego. W drugiej probówce zmieszać 12 µL odczynnika do transfekcji i 300 µL bezsurowiczego medium hodowlanego. Połączyć 300 µL rozcieńczonego DNA z 300 µL rozcieńczonego odczynnika do transfekcji i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej. Do każdej z dwóch dołek dodać 250 µL kompleksów i inkubować przez minimum 1 h w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po inkubacji usunąć medium, dodać 1 mL 0,6% SDS/0,01 M EDTA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10–15 min. Zebrać komórki za pomocą gumowego skrobaka (policemana) i przenieść do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Dodać 200 µL 5 M NaCl (stężenie końcowe 1 M), delikatnie odwrócić probówkę 5 razy i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C27.</li>
	<li>Próbki wirować przy 21 130 x g w wirówce stołowej w temperaturze 4 °C przez 30 min, zebrać nadsącz, przeprowadzić wytrącanie etanolem zgodnie z powyższym opisem i resuspender w 50 µL wody.</li>
</ol>
4. SSPE-qPCR
<ol>
	<li>Wymieszać 1 µL odzyskanego DNA z każdego punktu czasowego (w tym 0 h), 2x SYBR green PCR master mix (30 µL), 27 µL wody oraz 1 µL (100 pMol) startera komplementarnego do uszkodzonej nici plazmidu (Primer R, Rysunek 2). Przeprowadzić reakcję PCR zgodnie z następującymi warunkami: wstępna denaturacja przez 10 min w 90 °C, a następnie 8 cykli: 90 °C przez 15 s, 65 °C przez 1 min. Po zakończeniu 8. cyklu dodać 1 µL (100 pMol) drugiego startera do końcowej objętości 60 µL (Primer L, Rysunek 2)28 (szczegóły dotyczące odczynników znajdują się w Tabeli materiałów).</li>
	<li>Wymieszać 1 µL nieamplifikowanego odzyskanego DNA z każdego punktu czasowego (w tym 0 h), 2x master mix (30 µL), 27 µL wody oraz 1 µL każdego startera (100 pMol) do końcowej objętości 60 µL.</li>
	<li>Nanieść na 96-dołkową płytkę PCR próbki z kroków 4.1 i 4.2 (20 µL/dołek, w trzech powtórzeniach) i przeprowadzić qPCR przez 30 cykli, stosując warunki opisane powyżej.</li>
	<li>Obliczyć średnie wartości CT dla każdego zestawu trzech powtórzeń. Od wartości CT uzyskanych w kroku 4.2 odjąć wartości CT z kroku 4.1, aby otrzymać wartość delta CT dla każdej próbki. Od wartości delta CT odjąć wartość dla punktu czasowego 0 h w celu usunięcia tła (szczegółowy opis znajduje się w sekcji Reprezentatywne wyniki).</li>
	<li>Przeliczyć wartość delta CT na procent naprawy, korzystając ze wzoru: 
	<img alt="wzór na procent naprawy, 2^ΔCT/2^3 × 100, równanie do obliczania wydajności naprawy DNA" src="/files/ftp_upload/57413/57413eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"></li>
</ol>

<ol><li>Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Protein+Cross-links%3A+Formation%2C+Structural+Identities%2C+and+Biological+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+chemical+research%22%5BJournal%5D)">DNA-Protein Cross-links: Formation, Structural Identities, and Biological Outcomes.</a> Accounts of chemical research. 48 (6), 1631-1644 (2015).</li>
<li>Barker, S., Weinfeld, M., Murray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-protein+crosslinks%3A+their+induction%2C+repair%2C+and+biological+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">DNA-protein crosslinks: their induction, repair, and biological consequences.</a> Mutat Res. 589 (2), 111-135 (2005).</li>
<li>At Groehler, A. t, Degner, A., Tretyakova, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-Based+Tools+to+Characterize+DNA-Protein+Cross-Linking+by+Bis-Electrophiles%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Clin+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-Based Tools to Characterize DNA-Protein Cross-Linking by Bis-Electrophiles.</a> Basic Clin Pharmacol Toxicol. 121, 63-77 (2016).</li>
<li>Barker, S., Weinfeld, M., Zheng, J., Li, L., Murray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mammalian+proteins+cross-linked+to+DNA+by+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of mammalian proteins cross-linked to DNA by ionizing radiation.</a> J Biol Chem. 280 (40), 33826-33838 (2005).</li>
<li>Dizdaroglu, M., Gajewski, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+hydroxyl+radical-induced+formation+of+a+DNA-protein+cross-link+involving+thymine+and+lysine+in+nucleohistone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of hydroxyl radical-induced formation of a DNA-protein cross-link involving thymine and lysine in nucleohistone.</a> Cancer Res. 49 (13), 3463-3467 (1989).</li>
<li>Chvalova, K., Brabec, V., Kasparkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+formation+of+DNA-protein+cross-links+by+antitumor+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the formation of DNA-protein cross-links by antitumor cisplatin.</a> Nucleic Acids Res. 35 (6), 1812-1821 (2007).</li>
<li>Speit, G., Schutz, P., Merk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+repair+of+formaldehyde-induced+DNA-protein+crosslinks+in+repair-deficient+human+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Induction and repair of formaldehyde-induced DNA-protein crosslinks in repair-deficient human cell lines.</a> Mutagenesis. 15 (1), 85-90 (2000).</li>
<li>Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA-protein+crosslink+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA-protein crosslink repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Kohn, K. W., Erickson, L. C., Ewig, R. A., Friedman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+DNA+from+mammalian+cells+by+alkaline+elution%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fractionation of DNA from mammalian cells by alkaline elution.</a> Biochemistry. 19 (15), 4629-4637 (1976).</li>
<li>Ewig, R. A., Kohn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+repair+in+mouse+leukemia+L1210+cells+treated+with+nitrogen+mustard%2C+1%2C3-bis%282-chloroethyl%29-1-nitrosourea%2C+and+other+nitrosoureas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">DNA damage and repair in mouse leukemia L1210 cells treated with nitrogen mustard, 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea, and other nitrosoureas.</a> Cancer Res. 37, 2114-2122 (1977).</li>
<li>Ewig, R. A., Kohn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-protein+cross-linking+and+DNA+interstrand+cross-linking+by+haloethylnitrosoureas+in+L1210+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">DNA-protein cross-linking and DNA interstrand cross-linking by haloethylnitrosoureas in L1210 cells.</a> Cancer Res. 38, 3197-3203 (1978).</li>
<li>Zhitkovich, A., Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+sensitive+assay+to+detect+DNA-protein+crosslinks+in+intact+cells+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">A simple, sensitive assay to detect DNA-protein crosslinks in intact cells and in vivo.</a> Carcinogenesis. 13 (8), 1485-1489 (1992).</li>
<li>Chiu, S. M., Sokany, N. M., Friedman, L. R., Oleinick, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+processing+of+ultraviolet+or+ionizing+radiation-induced+DNA-protein+cross-links+in+Chinese+hamster+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol+Relat+Stud+Phys+Chem+Med%22%5BJournal%5D)">Differential processing of ultraviolet or ionizing radiation-induced DNA-protein cross-links in Chinese hamster cells.</a> Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med. 46 (6), 681-690 (1984).</li>
<li>Merk, O., Reiser, K., Speit, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+chromate-induced+DNA-protein+crosslinks+with+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of chromate-induced DNA-protein crosslinks with the comet assay.</a> Mutat Res. 471 (1-2), 71-80 (2000).</li>
<li>Loeber, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+DNA-protein+cross-linking+by+antitumor+nitrogen+mustards%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Res+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of DNA-protein cross-linking by antitumor nitrogen mustards.</a> Chem Res Toxicol. 22 (6), 1151-1162 (2009).</li>
<li>Gherezghiher, T. B., Ming, X., Villalta, P. W., Campbell, C., Tretyakova, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1%2C2%2C3%2C4-Diepoxybutane-induced+DNA-protein+cross-linking+in+human+fibrosarcoma+%28HT1080%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">1,2,3,4-Diepoxybutane-induced DNA-protein cross-linking in human fibrosarcoma (HT1080) cells.</a> J Proteome Res. 12 (5), 2151-2164 (2013).</li>
<li>Groehler, A. t, Villalta, P. W., Campbell, C., Tretyakova, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+DNA-Protein+Cross-Linking+by+Phosphoramide+Mustard+and+Nornitrogen+Mustard+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Res+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Covalent DNA-Protein Cross-Linking by Phosphoramide Mustard and Nornitrogen Mustard in Human Cells.</a> Chem Res Toxicol. 29 (2), 190-202 (2016).</li>
<li>Kiianitsa, K., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+assay+for+DNA-protein+covalent+complexes+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 41 (9), e104(2013).</li>
<li>Kiianitsa, K., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+isolation%2C+identification+and+quantification+of+DNA-protein+adducts+by+ELISA-based+RADAR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive isolation, identification and quantification of DNA-protein adducts by ELISA-based RADAR assay.</a> Nucleic Acids Research. 42 (13), e108(2014).</li>
<li>Stingele, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+Regulation+of+DNA-Protein+Crosslink+Repair+by+the+DNA-Dependent+Metalloprotease+SPRTN%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism and Regulation of DNA-Protein Crosslink Repair by the DNA-Dependent Metalloprotease SPRTN.</a> Molecular Cell. 64 (4), 688-703 (2016).</li>
<li>Vaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metalloprotease+SPRTN%2FDVC1+Orchestrates+Replication-Coupled+DNA-Protein+Crosslink+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Metalloprotease SPRTN/DVC1 Orchestrates Replication-Coupled DNA-Protein Crosslink Repair.</a> Mol Cell. 64, 704-719 (2016).</li>
<li>Maskey, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spartan+deficiency+causes+accumulation+of+Topoisomerase+1+cleavage+complexes+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Spartan deficiency causes accumulation of Topoisomerase 1 cleavage complexes and tumorigenesis.</a> Nucleic Acids Res. 45 (8), 4564-4576 (2017).</li>
<li>Lessel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+SPRTN+cause+early+onset+hepatocellular+carcinoma%2C+genomic+instability+and+progeroid+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in SPRTN cause early onset hepatocellular carcinoma, genomic instability and progeroid features.</a> Nature Genetics. 46 (11), 1239-1244 (2014).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+excision+repair+eliminates+unique+DNA-protein+cross-links+from+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nucleotide excision repair eliminates unique DNA-protein cross-links from mammalian cells.</a> J Biol Chem. 282 (31), 22592-22604 (2007).</li>
<li>Ahn, B., Kang, D., Kim, H., Wei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+mitomycin+C+cross-linked+DNA+in+mammalian+cells+measured+by+a+host+cell+reactivation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cells%22%5BJournal%5D)">Repair of mitomycin C cross-linked DNA in mammalian cells measured by a host cell reactivation assay.</a> Mol Cells. 18 (2), 249-255 (2004).</li>
<li>Fromme, J. C., Bruner, S. D., Yang, W., Karplus, M., Verdine, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product-assisted+catalysis+in+base-excision+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Product-assisted catalysis in base-excision DNA repair.</a> Nat Struct Biol. 10 (3), 204-211 (2003).</li>
<li>Hirt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+extraction+of+polyoma+DNA+from+infected+mouse+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures.</a> J Mol Biol. 26 (2), 365-369 (1967).</li>
<li>Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+repair+of+DNA+damage+in+cell+lines+and+human+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Monitoring repair of DNA damage in cell lines and human peripheral blood mononuclear cells.</a> Anal Biochem. 365 (2), 246-259 (2007).</li>
<li>Sikorsky, J. A., Primerano, D. A., Fenger, T. W., Denvir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+reduces+Taq+DNA+polymerase+fidelity+and+PCR+amplification+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">DNA damage reduces Taq DNA polymerase fidelity and PCR amplification efficiency.</a> Biochemical and biophysical research communications. 355 (2), 431-437 (2007).</li>
<li>Wickramaratne, S., Mukherjee, S., Villalta, P. W., Scharer, O. D., Tretyakova, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+sequence-specific+DNA-protein+conjugates+via+a+reductive+amination+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of sequence-specific DNA-protein conjugates via a reductive amination strategy.</a> Bioconjug Chem. 24 (9), 1496-1506 (2013).</li>
<li>George, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+nucleotide+excision+repair+in+a+helicase-deficient+XPD+mutant+from+intragenic+suppression+by+a+trichothiodystrophy+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Restoration of nucleotide excision repair in a helicase-deficient XPD mutant from intragenic suppression by a trichothiodystrophy mutation.</a> Mol Cell Biol. 21 (21), 7355-7365 (2001).</li>
<li>Minko, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+Repair+of+DNA-Polypeptide+Cross-Links+by+the+UvrABC+Nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Initiation of Repair of DNA-Polypeptide Cross-Links by the UvrABC Nuclease.</a> Biochemistry. 44 (8), 3000-3009 (2005).</li>
<li>Minko, I. G., Zou, Y., Lloyd, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incision+of+DNA-protein+crosslinks+by+UvrABC+nuclease+suggests+a+potential+repair+pathway+involving+nucleotide+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Incision of DNA-protein crosslinks by UvrABC nuclease suggests a potential repair pathway involving nucleotide excision repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (2002).</li>
<li>Reardon, J. T., Sancar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+DNA-polypeptide+crosslinks+by+human+excision+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Repair of DNA-polypeptide crosslinks by human excision nuclease.</a> PNAS. 103, 4056-4061 (2006).</li>
<li>Lopez-Mosqueda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPRTN+is+a+mammalian+DNA-binding+metalloprotease+that+resolves+DNA-protein+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">SPRTN is a mammalian DNA-binding metalloprotease that resolves DNA-protein crosslinks.</a> eLife. 5, e21491(2016).</li>
<li>Stingele, J., Schwarz, M. S., Bloemeke, N., Wolf, P. G., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA-dependent+protease+involved+in+DNA-protein+crosslink+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A DNA-dependent protease involved in DNA-protein crosslink repair.</a> Cell. 158 (2), 327-338 (2014).</li>
<li>Duxin, J. P., Dewar, J. M., Yardimci, H., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+a+DNA-Protein+Crosslink+by+Replication-Coupled+Proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repair of a DNA-Protein Crosslink by Replication-Coupled Proteolysis.</a> Cell. 159 (2), 346-357 (2014).</li>
<li>Stingele, J., Habermann, B., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-protein+crosslink+repair%3A+proteases+as+DNA+repair+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">DNA-protein crosslink repair: proteases as DNA repair enzymes.</a> Trends in Biochemical Sciences. 40 (2), 67-71 (2015).</li>
<li>Potter, H., Heller, R., et al. Transfection by Electroporation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPotter%2C+H+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22">Current protocols in molecular biology</a>. Ausubel, F. M., et al. , CHAPTER Unit-9.3 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda SSPE-qPCR ma wiele zalet w porównaniu z innymi podejściami poprzez badanie naprawy jednorodnej populacji zawierającej jedną, zdefiniowaną zmianę DPC. Warto zauważyć, że oprócz kontrolowania tożsamości białka i rodzaju chemicznego wiązania krzyżowego używanego do łączenia białka z DNA, możliwe jest łatwe manipulowanie kontekstem sekwencji, do której wprowadzana jest zmiana DPC. Zbadaliśmy wpływ na naprawę DPC wprowadzenia zmiany na matrycę lub nić kodującą plazmidu za aktywnym locus promotora. Podobnie, jesteśmy w trakcie badania wpływu replikacji na naprawę DPC przy użyciu plazmidu M13 zawierającego pochodzenie SV40 replikacji transfekowanej do komórek HEK293T. Opisany tutaj test bezpośrednio mierzy naprawę DPC, w przeciwieństwie do innych strategii, takich jak reaktywacja komórek gospodarza, które pośrednio szacują aktywność naprawczą24,25. Ponadto system jest solidny, czuły i ilościowy. W przeciwieństwie do innych systemów, które mierzą usunięcie DPC, test ten wykrywa tylko pełne zdarzenia naprawcze, tj. wymaga nie tylko usunięcia zmiany DPC, ale także pełnego przywrócenia integralności dupleksowego DNA17. Dzieje się tak, ponieważ apodstawowe miejsca i nacięcia lub pęknięcia w szkielecie fosfodiestrowym blokują test tak skutecznie, jak oryginalna zmiana DPC29.
Chociaż niniejszy raport koncentruje się na szczególnym typie DPC, który został utworzony przez uwięzienie borowodorku w pośredniej reakcji enzymatycznej, obecnie opracowujemy podejścia do badania naprawy DPC obejmujących inne białka i zmiany chorobowe, w których powiązanie białka z DNA zachodzi poprzez zasadę nukleozydową, a nie pozycję rybozy. Za pomocą aminacji redukcyjnej stworzyliśmy wiązania krzyżowe białek i peptydów przyłączone do zasady guaniny lub cytozyny startera DNA30. Te oligonukleotydy oczyszczono do jednorodności i wykorzystano do wytworzenia superskręconych plazmidów zawierających wiązania krzyżowe DNA-białko i DNA-peptyd. Chociaż skuteczność tych reakcji jest nieco zmniejszona w porównaniu z podejściem sieciowania glikozylazy oksoguaninowej opisanym szczegółowo powyżej, były one jednak udane i pozwalają na badanie naprawy tych substratów w liniach komórkowych ssaków z niedoborem naprawy przez wycinanie typu dzikiego i nukleotydów. Wykorzystaliśmy również test SSPE-qPCR do zbadania naprawy zmian oksmoguaninowych i syntetycznego koniugatu rybozy i cholesterolu, który, jak wykazano wcześniej, jest naprawiany przez maszynerię naprawy przez wycinanie nukleotydów komórkowych31. Jak przedstawiono graficznie na rysunku 2 , naprawa każdej zmiany, która blokuje wydłużanie startera przez polimerazę Taq, można w zasadzie zmierzyć za pomocą testu SSPE-qPCR.
Obecne modele naprawy DPC sugerują, że większe DPC (>10 kDa) są poddawane przetwarzaniu proteolitycznemu w celu zmniejszenia uszkodzenia peptydowego przed usunięciem 32,33,34. Najbardziej prawdopodobnymi kandydatami odpowiedzialnymi za tę proteolizę są proteasom lub specyficzna proteaza w komórkach ludzkich o nazwie Spartan 20,21,35,36,37,38. Dalsze badania nad rolą tych proteaz można przeprowadzić za pomocą testu SSPE-qPCR. Inhibitory proteasomów mogą być stosowane do wstępnej obróbki komórek przed transfekcją substratami zawierającymi DPC. Alternatywnie, spartańskie linie komórkowe knockdown mogą być transfekowane uszkodzonymi plazmidami, aby wyjaśnić ich rolę w proteolizie większych DPC.
Niezależnie od metody użytej do wytworzenia sieciowania lub charakteru zmiany DNA, warto podkreślić, że metodologia SSPE-qPCR jest krytycznie uzależniona od zdolności do generowania znacznych ilości jednorodnego substratu plazmidu DPC. Etapy niezbędne do tej analizy obejmują oczyszczanie kowalencyjnego, zamkniętego kolistego plazmidu po rozszerzeniu startera w celu wyeliminowania wszelkich naciętych lub liniowych cząsteczek plazmidu. Zanieczyszczenia te muszą zostać wyeliminowane, aby zapewnić, że jakakolwiek późniejsza zaobserwowana naprawa DPC nie jest spowodowana procesami naprawy skierowanymi w kierunku nacięć lub dwuniciowych. Niepowodzenie w uzyskaniu wystarczających ilości superskręconego DNA w wyniku reakcji wydłużania startera można przezwyciężyć poprzez zmianę stosunku oligonukleotydu do jednoniciowego DNA. Kolejnym ważnym krokiem dla metody SSPE-qPCR jest skuteczność sieciowania białka z plazmidem. W tym badaniu zastosowano wydajną, enzymatyczną reakcję w celu usieciowania białka glikozylazy oksoguaninowej ze zmianą 8-okso-guaniny. Nieoptymalne sieciowanie można poprawić, zmieniając ilość białka dodawanego do reakcji.
Chociaż wyniki opisane w tym raporcie opierały się na lipofekcji w celu wprowadzenia substratów naprawczych DPC do komórek biorcy, nie ma powodu, a priori, dla których nie można by zastosować innych metod transfekcji. Przeprowadziliśmy wstępne badania i zaobserwowaliśmy, że można również zastosować elektroporację39 . Warto jednak zauważyć, że z naszego doświadczenia wynika, że wydajność transfekcji elektroporacyjnej jest zmniejszona w porównaniu z lipofekcją i stwierdziliśmy, że konieczne jest użycie nośnika DNA (do 5 μg) oprócz 1,5 μg substratu DPC w celu uzyskania danych naprawczych. Ogólnie rzecz biorąc, opisana powyżej metoda SSPE-qPCR zapewnia innowacyjny sposób badania wyłącznie naprawy DPC na plazmidowym DNA i generowania nowych informacji na temat odpowiedzi na uszkodzenie DNA.

Opisany tutaj jest test oparty na PCR, określany jako SSPE-qPCR. Celem tej metody jest ilościowe określenie naprawy DPC na plazmidowym DNA transfekowanym do komórek ssaków z niedoborem naprawy i biegłości. Ten test jest szybki, ilościowy, niezwykle elastyczny i bezpośrednio mierzy aktywność naprawczą. Chociaż niniejszy raport koncentruje się na zastosowaniu tej metodologii do badania naprawy DPC, wyniki przedstawione poniżej ilustrują, że naprawa każdej zmiany blokującej polimerazę Taq może być badana przy użyciu tej metodologii.
Uzasadnieniem rozwoju tej metody jest uzyskanie wglądu w mechanizmy, za pomocą których komórki ssaków naprawiają DPC. W przeciwieństwie do innych rodzajów uszkodzeń DNA, DPC są bardzo zróżnicowane1,2. Badania wykazały, że setki białek komórkowych mogą zostać usieciowane z DNA i że dla każdego białka istnieje w zasadzie wiele łańcuchów bocznych aminokwasów, które mogą zostać kowalencyjnie przyłączone do DNA komórkowego3. Ponadto istnieje wiele chemicznych punktów przyłączania białek do szkieletu DNA, w tym kilka pozycji na zasadach nukleotydowych, a także na cukrze rybozy4,5. Ta różnorodność chemiczna stwarza perspektywę, że różne szlaki biochemiczne mogą być wykorzystywane do naprawy różnych typów DPC. Mając na uwadze tę kwestię, opracowano test SSPE-qPCR.
Opracowano kilka technik, aby uzyskać wgląd w biologię molekularną naprawy komórkowego DPC. Poniżej znajduje się przegląd głównych podejść, które zostały opracowane, wraz z podsumowaniem głównych mocnych i słabych stron każdego z nich. Warto podkreślić, że chociaż niniejsze podsumowanie koncentruje się na badaniach naprawy DPC w systemach hodowli komórek ssaków, znaczący wkład w obecny model naprawy DPC został wniesiony przy użyciu systemów mikrobiologicznych i bezkomórkowych, które nie są omawiane w tym manuskrypcie.
Być może najłatwiejszą strategią, którą można podjąć, aby uzyskać wgląd w genetykę naprawy DPC, jest ocena odpowiedniej wrażliwości na śmierć komórkową obserwowaną w komórkach typu dzikiego i zmutowanych, wystawionych na działanie czynników wywołujących DPCs6,7. Strategia ta jest stosunkowo szybka, niedroga i nie wymaga specjalistycznej wiedzy poza umiejętnością wykonywania podstawowych technik hodowli komórkowych. Przeciwwagą dla tych zalet są liczne ograniczenia tego podejścia, w tym następujące. Po pierwsze, test nie mierzy bezpośrednio naprawy DNA. Roboczym założeniem leżącym u podstaw tej strategii jest to, że inaktywacja mutacji w genach kodujących odpowiednie białka naprawy DNA powoduje akumulację uszkodzeń DNA, które wyzwalają zaprogramowaną śmierć komórki. Jednak mutacje w genach kodujących białka nienaprawiające DNA mogą, w zasadzie, zwiększyć (lub zmniejszyć) wrażliwość komórkową na śmierć komórkową wywołaną ksenobiotykami. Po drugie, czynniki tworzące DPC niezmiennie indukują inne rodzaje uszkodzeń DNA (jednym z wyjątków jest 5-aza-2'-deoksycytadyna, ale ten czynnik również wyczerpuje poziomy metylotransferazy komórkowej8). W związku z tym nie można wykluczyć, że zwiększona nadwrażliwość komórkowa na omawiany czynnik może odzwierciedlać defekty w naprawie wiązań międzyniciowych lub inne zmiany chorobowe. Po trzecie, jak wspomniano powyżej, DPC reprezentują bardzo niejednorodną klasę składającą się z różnych typów chemicznych wiązań krzyżowych, obejmujących różnych partnerów białkowych. Możliwe jest, że podczas gdy naprawa jednego lub więcej podtypów tych zmian może być zmieniona w określonym tle genetycznym, różnica ta może nie być wystarczająca do znaczącej zmiany nadwrażliwości komórkowej na śmierć wywołanej przez ten czynnik. Podsumowując, chociaż strategia ta stanowi atrakcyjny punkt wyjścia, ograniczenia przedstawione powyżej podkreślają znaczenie poszukiwania innych, bardziej bezpośrednich metod badania kinetyki naprawy DPC.
Aby osiągnąć ten cel, opracowano wiele powiązanych podejść. Na przykład badacze opracowali metody rozróżniania między "wolnym" DNA a "związanym z białkiem" DNA9,10,11. Korzystając z tych podejść, możliwe jest porównanie poziomów DPC w stanie stacjonarnym lub po ekspozycji na czynnik wytwarzający DPC w różnych tłach genetycznych. Dwie strategie, które były najczęściej stosowane, polegają na oddzieleniu DNA zawierającego DPC od wolnego DNA przy użyciu strategii wiązania błony nitrocelulozowej lub wytrącania KCl/SDS12,13. W pierwszym podejściu komórki są poddawane lizie i przepuszczane przez filtr nitrocelulozowy. Ponieważ nitroceluloza wiąże białko, filtr zachowuje DNA połączone z białkiem, umożliwiając przejście wolnego DNA. W tej ostatniej strategii DNA związane z białkiem jest oddzielane od wolnego DNA w oparciu o fakt, że SDS wiąże się z białkiem, ale nie z DNA, i może być wytrącony przez dodanie KCl. W konsekwencji DNA sprzężone z białkiem staje się nierozpuszczalne, podczas gdy niezwiązane DNA pozostaje w roztworze. DNA zawierające DPC można następnie określić ilościowo za pomocą znakowanej radioaktywnie tymidyny (jeśli komórki były początkowo znakowane metabolicznie) lub za pomocą selektywnego barwnika fluorescencyjnego DNA, takiego jak Hoechst 33258. Metody te są powtarzalne i wymagają niewielkiej liczby kroków. Nie dostarczają jednak informacji na temat charakteru chemicznego wiązania krzyżowego, za pomocą którego białko jest przyłączone do DNA. Ponadto ważne jest, aby zauważyć, że testy te mogą przeszacowywać naprawę DPC poprzez fałszywą ocenę niekompletnej naprawy, tj. przetwarzania proteolitycznego do mniejszych wiązań krzyżowych DNA-peptyd, które mogą nie być tak łatwe do uwięzienia lub wytrącenia, jak naprawa DNA w dobrej wierze.
Testy komety mogą być używane do wizualizacji powstawania DPC w komórkach14. W tych eksperymentach obecność DPC zmniejsza migrację DNA, którą można następnie odwrócić poprzez wstępne traktowanie proteinazą K. W związku z tym długość ogona może być wykorzystana do oszacowania powstawania DPC. Jednak, jak wspomniano powyżej, leki tworzące DPC powodują inne rodzaje uszkodzeń DNA, które mogą zmieniać długość ogona. Protokół ten jest również wysoce techniczny i wymaga specjalistycznej wiedzy oraz szkolenia w zakresie obrazowania konfokalnego.
Spektrometria mas może być używana do badania kinetyki naprawy DPC po leczeniu środkami sieciującymi15,16,17. Eksperymenty te traktują komórki środkami tworzącymi DPC i izolują DPC poprzez wychwytywanie biotyny lub ekstrakcję fenolu:chloroformu (1:1). Spektrometria mas może być następnie wykorzystana do identyfikacji usieciowanych białek lub ilościowego określenia ilości DPC powstających w czasie. Główną zaletą tego podejścia jest charakter tworzonych danych. Możliwe jest precyzyjne skatalogowanie rodzajów białek, które stają się usieciowane po ekspozycji na ksenobiotyk, jednak protokół ten jest kosztowny, czasochłonny i ograniczony rodzajem usieciowania, które można wykryć.
Maizels et al. opracowali czuły test 'RADAR' (szybkie podejście do odzyskiwania adduktów DNA) do ilościowego oznaczania immunodetekcji adduktów DNA-białka, a także test RADAR oparty na ELISA18,19. Testy te są szczególnie przydatne do wychwytywania produktów pośrednich DNA-białko, które przejściowo tworzą się w komórkach i generowania próbek odpowiednich do spektroskopii mas w celu identyfikacji nowych adduktów białkowych. Ten test immunodetekcji opiera się na dostępności przeciwciał w celu wychwycenia wiązania krzyżowego DNA-białko, a zatem może nie być w stanie wykryć zdegradowanych adduktów peptydów DNA, które tworzą się podczas naprawy. Niedawno odkryto specyficzny szlak naprawy DPC związany z replikacją DNA i zależnym od DNA metaloproteazą Spartan, w której DPC są proteolizowane do mniejszych peptydów podczas naprawy20,21. Dziedziczne mutacje w tym genie są związane z zespołem Ruijsa-Aalfsa u ludzi, chorobą charakteryzującą się niestabilnością genomu, przedwczesnym starzeniem się i rakiem wątroby22. Myszy z genetycznie zmodyfikowanymi defektami genu spartańskiego wykazują podobne fenotypy23.
Reaktywacja aktywności transkrypcyjnej komórek gospodarza została wykorzystana do badania naprawy zdefiniowanych zmian obecnych na transfekowanych substratach plazmidowego DNA24,25. W tych eksperymentach plazmid zawierający DPC (lub inne rodzaje uszkodzeń DNA), które blokują transkrypcję reportera, taki jak lucyferaza, są transfekowane do komórek. Pomiary luminescencji wykonane 24 - 72 godziny później są następnie skorelowane z naprawą DPC. Jednak te pośrednie testy naprawy nie są w stanie wykryć zdarzeń naprawczych wcześniej niż 24 godziny po transfekcji i nie są w stanie odróżnić obejścia polimerazy RNA częściowo naprawionych substratów od całkowitej naprawy.
Każda z opisanych powyżej metod ma zalety i przyczyniła się do obecnego modelu naprawy DPC. Jednak test SSPE-qPCR omija kilka ograniczeń związanych z tymi innymi podejściami i w konsekwencji może dostarczyć bardziej szczegółowych informacji na temat mechanizmów naprawy DPC. Na przykład test SSPE-qPCR może bezpośrednio mierzyć naprawę specyficznych dla miejsca DPC na DNA w nienaruszonych komórkach ssaków. Metoda ta jest wszechstronna i została wykorzystana do uzyskania wyników naprawy po transfekcji w liniach komórkowych chomików i ludzi. Transfekcję plazmidu można przeprowadzić za pomocą lipofekcji lub elektroporacji w hodowanych liniach komórkowych ssaków. Zapewnia również, że mierzona jest tylko naprawa zdefiniowanych DPC, a nie inne rodzaje uszkodzeń DNA wywołanych przez większość czynników tworzących DPC. SSPE-qPCR jest łatwy do wykonania, niedrogi i szybki. Wyniki uzyskane za pomocą tego testu wykryły zdarzenia naprawcze już 2 godziny po transfekcji. Za pomocą tej metody zmienne, które mogą wpływać na wyniki naprawy DPC, mogą być badane w sposób, który jest czuły i skuteczny. Na przykład rola transkrypcji w naprawie DPC nie została jeszcze rygorystycznie oceniona. Ze względu na elastyczność testu SSPE-qPCR, miejscem sieciowania DPC można manipulować w celu rozwiązania tego problemu. Ponadto wprowadzenie początku replikacji do plazmidu zawierającego DPC może być wykorzystane do zbadania wpływu replikacji na naprawę DPC. Dodatkowo na plazmidzie można utworzyć wiele wiązań krzyżowych w celu zbadania różnic w naprawie pojedynczego DPC w porównaniu z wieloma sieciami krzyżowymi. Są to pytania, na które trudno byłoby odpowiedzieć za pomocą chromosomalnego DNA, ale można je łatwo rozwiązać za pomocą testu SSPE-qPCR. Ogólnie rzecz biorąc, test SSPE-qPCR wymaga oczyszczonego, plazmidowego DNA w ilościach mikrogramowych zawierających zmianę o znanej lokalizacji. W tym teście można zastosować addukty oprócz DPC, jednak zmiana musi być zdolna do blokowania rozszerzenia przez polimerazę Taq.

<table><tbody><tr><td>Modyfikowany oligo modyfikowany 8-oksoguaniną</td><td>Midland Certified Reagent Company</td><td>NA</td><td>Sekwencja: 5' AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3'</td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Jednoniciowy M13</td><td>NEB</td><td>N4040S</td><td></td></tr><tr><td>Taq polimeraza</td><td>NEB</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>ATP, 100mM</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0441</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix, 10mM każdy</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>T4 polimeraza</td><td>NEB</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>T4 ligaza</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-agaraza</td><td>NEB</td><td>M0392S</td><td></td></tr><tr><td>Glikozylaza oksoguaninowa 1</td><td>NEB</td><td>M0241S</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4309155</td><td>zielona mieszanka wzorcowa PCR</td></tr><tr><td>Primer R</td><td>Centrum Genomiczne UMN</td><td>NA</td><td>5' CGGCTCGTATGTTGTGTG 3'</td></tr><tr><td>Primer L</td><td>UMN Centrum Genomiczne</td><td>NA</td><td>5' GCTGCAAGGCGATTAAGT 3'</td></tr><tr>Odczynnik do transfekcji <td>lipofekcjony</td><td>Invitrogen</td><td>18324-012</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BspD1</td><td>NEB</td><td>R0557S</td><td></td></tr><tr><td>Bufor NEB 2</td><td>NEB</td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>System PCR w czasie rzeczywistym StepOnePlus</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Nasycony buforem fenol</td><td>Invitrogen</td><td>15513-047</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform, odczynnik ACS, klasa spektrometryczna</td><td>ACROS</td><td>40463-5000</td><td></td></tr></tbody></table>

prosty, szybki i ilościowy test do pomiaru naprawy wiązań krzyżowych dna-białko na plazmidach transfekowanych do komórek ssaków

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

Celem tej metody jest dostarczenie elastycznej, szybkiej i ilościowej techniki do badania kinetyki naprawy sieciowania DNA-białko (DPC) w liniach komórkowych ssaków. Zamiast globalnego testu usuwania indukowanego ksenobiotykami lub spontanicznego usuwania chromosomów DPC, test ten bada naprawę jednorodnej, chemicznie zdefiniowanej zmiany specyficznie wprowadzonej w jednym miejscu w substracie plazmidowego DNA. Co ważne, takie podejście pozwala uniknąć stosowania materiałów radioaktywnych i nie jest zależne od drogiej lub wysoce wyspecjalizowanej technologii. Zamiast tego opiera się na standardowych procedurach rekombinacji DNA i szeroko dostępnych, ilościowych instrumentach reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) w czasie rzeczywistym. Biorąc pod uwagę nieodłączną elastyczność zastosowanej strategii, wielkość usieciowanego białka, a także charakter wiązania chemicznego i dokładny kontekst sekwencji DNA w miejscu przyłączenia mogą być zróżnicowane, aby uwzględnić odpowiedni wkład tych parametrów w ogólną skuteczność naprawy DPC. Korzystając z tej metody, plazmidy zawierające specyficzny dla miejsca DPC transfekowano do komórek, a DNA o niskiej masie cząsteczkowej odzyskano w różnych momentach po transfekcji. Odzyskane DNA jest następnie poddawane wydłużaniu startera specyficznego dla nici (SSPE) przy użyciu startera komplementarnego do uszkodzonej nici plazmidu. Ponieważ zmiana DPC blokuje polimerazę DNA Taq, stosunek DNA naprawionego do nienaprawionego można ocenić ilościowo za pomocą qPCR. Wartości progu cyklu (CT) są używane do obliczania procentu naprawy w różnych punktach czasowych w odpowiednich liniach komórkowych. Ta metoda SSPE-qPCR może być również stosowana do ilościowej oceny kinetyki naprawy dowolnego adduktu DNA, który blokuje polimerazę Taq.

Aby wykorzystać test SSPE-qPCR do oceny komórkowej naprawy DPC, należy przygotować wystarczającą ilość (w ilościach µg) wysokiej jakości substratu do naprawy DPC. W celu otrzymania tego produktu, oligonukleotyd zawierający resztę 8-oksoguaniny został zhybrydyzowany z komplementarnym jednoniciowym DNA, przedłużony za pomocą primera, a następnie oczyszczony w żelu, aby zapewnić, że do transfekcji wykorzystano wyłącznie kowalencyjnie zamknięty produkt kolisty (Rysunek 1A). Niniejszy raport koncentruje się na substratach, w których wykorzystano pułapkowanie borowodorkiem do stworzenia kowalencyjnego połączenia krzyżowego między rekombinowaną ludzką oksoguaninową glikozylazą a jednostką rybozy w dwuniciowej kolistej cząsteczce plazmidu, choć analogiczne podejścia mogą być stosowane w celu otrzymania chemicznie zróżnicowanych substratów DPC. Strategia pułapkowania oksoguaninowej glikozylazy/borowodorku jest szczególnie atrakcyjna ze względu na niezwykle wysoką wydajność reakcji sieciowania. Jak pokazano na Rysunku 1B, precypitacja KCl/SDS przeprowadzona na substracie DPC, który został strawiony do dwóch fragmentów, selektywnie i niemal ilościowo usunęła fragment DNA zawierający DPC. Wyniki te potwierdzają wniosek, że w zasadzie 100% cząsteczek substratu plazmidowego zawiera połączenie krzyżowe z białkiem.
Analiza SSPE-qPCR opisana w sekcji Protokół wykorzystuje wartości CT generowane przez qPCR do obliczenia procentu naprawy DPC po transfekcji w komórkach ssaków. Jak pokazano na Ryc. 2, wiązanie krzyżowe białka blokuje polimerazę Taq przed przedłużeniem primeru „R” przyłączonego do nici zawierającej DPC. Drugą kluczową cechą tej analizy jest przeprowadzenie ośmiu rund reakcji SSPE (z użyciem primeru R) przed wykonaniem analizy qPCR. Podczas gdy nieuszkodzone (lub naprawione) DNA zostanie przedłużone podczas tych reakcji SSPE, tworząc miejsce wiązania dla późniejszego primeru „L”, DNA uszkodzone (lub niepełnie naprawione) nie zostanie przedłużone. W konsekwencji SSPE zwiększa liczebność każdej nieuszkodzonej (lub naprawionej) nici ośmiokrotnie. Oznacza to, że naprawione próbki, w których etap SSPE został wykonany przed qPCR, wykażą wartość CT o trzy jednostki niższą niż wartość uzyskana dla identycznej próbki, w której SSPE nie było wykonywane przed qPCR (Ryc. 2). Różnica trzech jednostek w wartościach CT zaobserwowana dla dwóch traktowań, określana jako ΔCT, odzwierciedla fakt, że 8 = 23. Tę wartość delta CT można wykorzystać do obliczenia komórkowej aktywności naprawy DNA, stosując wzór: procent naprawy DNA = (2ΔCT/23) x 100. Eksperymenty kontrolne potwierdziły, że wartość delta CT wynosząca około 3 była konsekwentnie obserwowana, gdy nieuszkodzone plazmidy substratowe poddawano analizie SSPE-qPCR (dane nie pokazano).
Tabela 1 przedstawia przykładowe wartości CT wygenerowane z substratów plazmidowych zawierających DPC, które odzyskano z fibroblastów płuc chomika chińskiego 3 h i 8 h po transfekcji (Tabela 1A), a także z próbek z czasu zero, t.j. próbek przygotowanych zgodnie z opisem w sekcji Protokół, ale nie transfekowanych do komórek (Tabela1B). Tabela zawiera również wartości ΔCT oraz procent naprawy (obliczone według wzoru 2ΔCT/23 x 100) uzyskane z tych próbek. Jak pokazano w Tabeli 1A, procent naprawy obliczony z próbek pobranych 3 h i 8 h po transfekcji wyniósł odpowiednio 66% i 93%. Wartości te są następnie odejmowane od wartości uzyskanej z analizy próbki 0 h w celu określenia procentu naprawy. Tabela 1B przedstawia wartości CT dla dwóch różnych próbek 0 h, w których przed transfekcją uzyskano lub nie uzyskano wydajnego sieciowania. Próbka wydajnie sieciowana zaowocowała wartością delta CT wynoszącą 0,8, podczas gdy próbka słabo sieciowana zaowocowała wartością delta CT wynoszącą 2,5. Do tej pory nie udało się precyzyjnie określić źródła sygnału tła o wartości 0,8 w wydajnie sieciowanej próbce 0 h. Jest mało prawdopodobne, aby to tło odzwierciedlało niski poziom samoistnego usuwania DPC lub wynikało z niskiego poziomu syntezy „bypass” polimerazy Taq przez uszkodzenie DPC: rozległe eksperymenty przeprowadzone na wysoko oczyszczonym jednoniciowym substracie M13 konsekwentnie dawały wartość delta CT około 0,8, t.j. w zasadzie identyczną z tym „tłem” elongacji obserwowanym w substratach zawierających DPC. W konsekwencji prawdopodobne jest, że podczas SSPE dochodzi do niewielkiego stopnia błędnego przyłączania startera „R”, co skutkuje powstaniem niewielkiej ilości produktu, który może być następnie amplifikowany po dodaniu startera „L” i przeprowadzeniu qPCR. Próby wyeliminowania tego tła poprzez manipulowanie warunkami PCR do tej pory nie przyniosły poprawy tej wady. Jednak opisana powyżej strategia odejmowania pozwala na dokładną ocenę aktywności naprawy DPC. Warto zauważyć, że niewydajne sieciowanie białka na plazmidzie spowoduje podwyższenie wartości tła. Jest to przedstawione w danych próbnych zawartych w Tabeli 1B, gdzie niewydajne sieciowanie białko-DNA zaowocowało wyższą wartością delta CT dla czasu 0. Dlatego eksperymenty kontrolne są niezmiennie przeprowadzane przed rozpoczęciem transfekcji, a substraty z wartościami delta CT podwyższonymi powyżej poziomu progowego 0,8 są odrzucane. Jak wspomniano w protokole qPCR, każda próbka jest dzielona na 3 dołki w celu zapewnienia spójności pipetowania. Powtórzenia te są następnie uśredniane, aby uzyskać wartość CT dla danej próbki. Powtórzenia, które odbiegają o więcej niż ± 0,1, są usuwane ze zbioru danych. Jeśli wszystkie trzy powtórzenia odbiegają od siebie o więcej niż ± 0,1, test SSPE-qPCR jest powtarzany do momentu uzyskania spójnych wartości. Doświadczenie pokazuje, że należy przeprowadzić co najmniej 3 niezależne transfekcje, aby uzyskać wiarygodne wartości średnie, które mogą być następnie poddane analizie statystycznej w celu określenia wpływu różnych parametrów na wydajność naprawy DPC.
<img alt="Schemat edycji genów; modyfikacja plazmidu, wyniki elektroforezy, analiza DNA, układ eksperymentalny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57413/57413fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Generowanie plazmidu zawierającego DPC. (A) Oligonukleotyd zawierający resztę 8-okso-guaniny (kolor czerwony) jest hybrydyzowany z jednoniciowym DNA (grube czarne koło) i przedłużany w celu utworzenia dwuniciowego plazmidu (produkt przedłużania startera zaznaczony linią przerywaną). Po elektroforezie z bromkiem etydyny prążek odpowiadający superzwiniętemu DNA (czerwona ramka) jest wycinany z niskotopliwego żelu agarozowego i trawiony β-agarazą. Ścieżki: (1) marker masy cząsteczkowej, (2) jednoniciowe DNA, (3) dwuniciowe DNA, (4) próbka po przedłużeniu startera. (B) Oksoguaninowa glikozylaza (w skrócie hOGG1, przedstawiona jako pomarańczowe koło) zostaje sieciowana z resztą 8-okso-guaniny za pomocą cyjanoborowodorku sodu, a powstały substrat DPC jest trawiony w celu wygenerowania wolnego fragmentu DNA o długości 2 800 par zasad oraz fragmentu o długości 4 400 par zasad przyłączonego do białka. Do próbki dodaje się SDS, a następnie dzieli ją na dwie porcje, z których jedna jest traktowana KCl i wirowana w celu osadzenia DNA zawierającego DPC (przedstawionego jako pomarańczowy osad). Nadpływ z tej drugiej próbki (przedstawiony jako niebieski płyn w probówce wirówki) oraz próbka niepoddana działaniu KCl są poddawane elektroforezie żelowej. Ścieżki: (1) marker masy cząsteczkowej, (2) -KCl, (3) +KCl. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57413/57413fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu uszkadzania i naprawy DNA wraz z wykresem amplifikacji przedstawiającym analizę cyklu CT." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57413/57413fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Ilościowe oznaczenie uszkodzonego plazmidu za pomocą SSPE-qPCR. DNA plazmidowe ulega denaturacji, a następnie następuje przyłączanie i przedłużanie primera komplementarnego do uszkodzonej nici (R). Proces ten powtarza się łącznie przez 8 cykli. W przypadku uszkodzonego substratu (góra), polimeraza Taq jest blokowana przez uszkodzenie typu DPC i nie wytworzy pełnowartościowych nici produktu. Z kolei w przypadku substratu naprawionego (dół), polimeraza Taq wytworzy pełnowartościowe nici produktu zawierające miejsce wiązania dla primera L. Po 8 cyklach dodaje się primer L, a wartości progowe cyklu (CT) są określane za pomocą qPCR. Przykładowe wyniki amplifikacji dla substratów uszkodzonych i nieuszkodzonych przedstawiono po prawej stronie, gdzie linia czerwona reprezentuje DNA, które poddano przedłużaniu primera przed qPCR, a linia niebieska reprezentuje DNA, które nie zostało poddane przedłużaniu primera przed qPCR. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57413/57413fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Tabela 1A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Czas</td>
			<td rowspan="2">- Przedłużanie startera</td>
			<td rowspan="2">+ Wydłużanie startera</td>
			<td rowspan="2">Δ CT</td>
			<td>Procent naprawy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(2ΔCT/23x 100) </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 h</td>
			<td>23.5</td>
			<td>21.1</td>
			<td>2.4</td>
			<td>66</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 h</td>
			<td>29.4</td>
			<td>26.5</td>
			<td>2.9</td>
			<td>93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Tabela 1B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Czas</td>
			<td rowspan="2">- Przedłużanie startera</td>
			<td rowspan="2">+ Przedłużanie startera</td>
			<td rowspan="2">Δ CT</td>
			<td>Procent tła</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(2ΔCT/23x 100) </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 h</td>
			<td>15.4</td>
			<td>14.6</td>
			<td>0.8</td>
			<td>22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 h</td>
			<td>15.4</td>
			<td>12.9</td>
			<td>2.5</td>
			<td>71</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Obliczanie procentu naprawy przy użyciu wartości CT uzyskanych z SSPE-qPCR. (A) Naprawa substratu zawierającego DPC transfekowanego do fibroblastów płuc chomika chińskiego V79 3 h i 8 h po transfekcji. (B) SSPE-qPCR próbek z czasu 0 h, które nie zostały transfekowane do komórek. W jednej próbce wydajność reakcji sieciowania między DNA a oksoguaninową glikozylazą była wysoka (próbka ta dała niską wartość delta CT), podczas gdy w drugiej próbce wydajność sieciowania białek była niska (próbka ta dała względnie wysoką wartość delta CT). Szczegóły znajdują się w tekście sekcji Reprezentatywne Wyniki.

Celem tego protokołu jest ilościowe określenie naprawy zdefiniowanych wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidowym DNA. Uszkodzone plazmidy są transfekowane do linii komórkowych ssaków biorcy i zbierane o niskiej masie cząsteczkowej w wielu punktach czasowych po transfekcji. Kinetykę naprawy DNA określa się ilościowo za pomocą specyficznego dla nici wydłużania startera, a następnie qPCR.

Prosty, szybki i ilościowy test do pomiaru naprawy wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidach transfekowanych do komórek ssaków

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Ogólnym celem tego transpacyficznego eseju QPCR dotyczącego rozszerzenia startera jest ilościowa ocena naprawy adduktów, usieciowanych z plazmidowym DNA, po transfekcji do komórek ssaków. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie naprawy DNA. Na przykład, jakie szlaki są zaangażowane w naprawę wiązań krzyżowych białek DNA.Technika ta może zapewnić lepsze zrozumienie odpowiedzi na uszkodzenie DNA. Ponieważ pozwala na selektywne badanie naprawy wiązań krzyżowych białek DNA i braku innych rodzajów uszkodzeń DNA. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w naprawę wiązań krzyżowych białek DNA, może być również stosowana do innych rodzajów uszkodzeń DNA.Takich jak miejsca zasadowe i inne addukty blokujące polimerazę. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona wykryć naprawę plazmidów zawierających addukty już po dwóch godzinach. Początkowo zamierzaliśmy wykorzystać reaktywację komórek domowych do badania naprawy, jednak te testy nie mierzą bezpośrednio naprawy lub mogą zawyżać skuteczność naprawy.Zwłaszcza, jeśli polimeraza RNA może odczytywać niekompletne produkty naprawcze. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy oczyszczania i wydłużania podkładu specyficznego dla pasma są trudne do wizualizacji w inny sposób. Zmieszać 20 mikrolitrów roztworu zawierającego 80 pikomoli ośmiu oksogonuaniny zawierającej oligonukleotydy z pięcioma mikrolitrami 10-krotnego buforu ligazy.I dodaj jeden mikrolitr roztworu zawierającego 10 jednostek kinazy polinukleotydowej T4. Dostosuj końcową objętość do 50 mikrolitrów i inkubuj probówkę w łaźni wodnej przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie należy przeprowadzić reakcję rozciągnięcia startera na lodzie.Ustaw program na termocyklerze i rozpocznij bieg. Po inkubacji dostosuj całkowitą objętość do 375 mikrolitrów, dodając różne odczynniki, enzymy i bufor. Następnie inkubuj reakcję w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.Aby przygotować mieszaninę fenylu i chloroformu w stosunku 50:50, dodaj równe objętości fenolu i chloroformu. Następnie wymieszaj oba składniki i wiruj w wirówce stołowej o masie 21, 130 G przez pięć minut. Po zakończeniu wirowania dodaj 375 mikrolitrów warstwy organicznej do reakcji starter-przedłużanie. Mieszać.I ponownie odwirować przy 21, 130 G przez pięć minut. Po odwirowaniu ostrożnie odpipetować górną warstwę. I wymieszać z octanem amonu do końcowego stężenia 0,3 mola.A następnie dodaj do niego dwie objętości 100% etanolu. Przechowuj mieszaninę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej 30 minut do nocy. Po zakończeniu okresu inkubacji odwirować próbkę z prędkością 15 000 obr./min w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Następnie wyrzuć sklarowany osad i umyj osad w 70% etanolu. Ponownie odwirować próbkę w wirówce stołowej z prędkością 15 000 obr./min przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant i rozpuścić osad w 100 mikrolitrach wody.Połącz 50 mikrolitrów DNA z 34 mikrolitrami wody i 16 mikrolitrami 6-krotnego barwnika ładującego żel. Uruchom próbkę na 10-centymetrowym, 0,8% niskotopliwym żelu agarozowym zawierającym 0,5 mikrograma na mililitr bromku etydyny o napięciu dwóch woltów na centymetr przez sześć godzin w buforze 1x TAE. Następnie użyj żyletki, aby wyciąć superskręcone DNA.I zważ plasterek żelu. Następnie dodaj jeden mikrolitr buforu reakcyjnego beta-agarazy do strawienia co 10 miligramów plastra żelu. Następnie inkubuj plasterek w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie schładzaj w temperaturze 42 stopni Celsjusza w termocyklerze.Gdy plasterek żelu rozpuści się i ostygnie do 42 stopni Celsjusza, dodaj 10 jednostek beta-agarazy i pozostaw w temperaturze 42 stopni Celsjusza na godzinę w termocyklerze. Po godzinie zmierzyć objętość rozpuszczonego żelu i dodać octan amonu do końcowego stężenia 0,3 mola i inkubować na lodzie przez 15 minut. Po inkubacji odwirować mieszaninę o sile 15 000 G przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Następnie zebrać super natant i odpipetować do niego dwie objętości izopropanolu i wymieszać. Następnie przechowuj mieszaninę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia odwiruj oczyszczone, superskręcone DNA w wirówce stołowej z prędkością 15 000 obr./min przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Usuń super natant i ponownie zawieś granulat w 40 mikrolitrach wody. Następnie połączyć 15 mikrolitrów roztworu zawierającego 12 pikomoli DNA z jednym mikrolitrem roztworu 36 pikomoli glikozylazy oksmoguaninowej w buforze i dostosować końcową objętość do 30 mikrolitrów. Następnie inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut w łaźni wodnej.Dzień przed transfekcją wysiewaj komórki na sześciodołkowej płytce hodowlanej. Następnego dnia wymieszaj 1,5 mikrograma usieciowanego plazmidu z 300 mikrolitrami pożywki hodowlanej bez surowicy w jednej probówce, upewniając się, że zapisałeś jeden mikrolitr DNA jako punkt znaku godziny zero. W innej probówce wymieszaj 12 mikrolitrów odczynnika do transfekcji z 300 mikrolitrami pożywki bez surowicy.Następnie połącz 300 mikrolitrów usieciowanego DNA z równą objętością rozcieńczonego odczynnika do transfekcji. I inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej w okapie z przepływem laminarnym. Po inkubacji dodaj 250 mikrolitrów kompleksu do każdej z dwóch studzienek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po upływie co najmniej jednej godziny usunąć pożywkę i dodać jeden mililitr 0,6% roztworu dodecylosiarczanu sodu z 0,1 molowym EDTA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut. Następnie odłącz ogniwa, skrobając gumowym policjantem i przenieś do 1,5 mililitrowej rurki do mikrofuge. Następnie dodaj 200 mikrolitrów 5-molowego roztworu chlorku sodu do końcowego stężenia jednego molowca i odwróć probówkę pięć razy.Następnie inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia odwirować próbkę w temperaturze 21,130 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu zebrać super natant.I dodaj octan amonu do końcowego stężenia 0,3 mola, wymieszaj i dodaj dwie objętości 100% etanolu, aby wytrącić DNA. Przechowuj mieszaninę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej 30 minut. Po wytrąceniu etanolu i ponownym zawieszeniu odzyskanych próbek DNA w 50 mikrolitrach wody, rozcieńczyć próbkę godziny zero w 500 mikrolitrach wody i przeprowadzić reakcje PCR przy użyciu próbek nietransfekowanych i transfekowanych.Następnie ustaw program na termocyklerze i rozpocznij bieg. Ten etap przedłużania podkładu specyficznego dla trans jest kluczowy, ponieważ kupuje nam wzmocnienie zniszczonego pasma. Jeśli nie zostaną użyte, wartości delta CT będą mniejsze niż jeden, co utrudni wykrycie niskich poziomów naprawy DPC.Po wykonaniu ośmiu cykli dodaj 100 pikomoli drugiego startera. Następnie wymieszaj jeden mikrolitr nieamplifikowanego DNA z próbek nietransfekowanych i transfekowanych z 2x mieszanką główną, wodą i 100 pikosolami obu starterów do końcowej objętości 60 mikrolitrów. Próbki należy załadować trzykrotnie na 96-dołkową płytkę do PCR.Przeprowadzić ilościową reakcję PCR przez 30 cykli i uśrednić próg cyklu dla każdej z trzech próbek. W tym badaniu QPCR przeprowadza się z przedłużeniem startera specyficznego dla nici i bez niego w celu obliczenia procentu plazmidowego DNA, które zostało naprawione. Różnica w wartościach progowych cyklu między próbkami rozszerzonymi i nierozszerzonymi starterem jest określana jako CT.As delta widoczna tutaj, naprawiona próbka poddana SSPE-QPCR ma większą deltę CT niż próbka nienaprawiona.Reprezentatywne dane procentu napraw obliczone na podstawie wartości katografii komputerowej delta pokazują, że próbki odzyskane po trzech godzinach transfekcji są naprawiane w 66%, podczas gdy próbki odzyskane po ośmiu godzinach są naprawiane w 93%. Poniżej przedstawiono procentowe wartości tła obliczone z dwóch próbek kontrolnych o odpowiednio wysokiej i niskiej skuteczności sieciowania białek. Niski procent tła obecnego w kontroli wskazuje, dlaczego do transfekcji stosuje się tylko efektywnie usieciowane podłoża.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch do trzech godzin. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby wziąć próbki w czasie zero, aby odjąć wszelkie tło z tego testu. Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak analiza sekwencji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: czy naprawa DPC jest podatna na błędy?Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować, przetransfekować i określić ilościowo naprawę plazmidów zawierających addukty w komórkach ssaków. Nie zapominaj, że praca z fenolem, chloroformem i bromkiem etydyny może być niebezpieczna. Należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawic i praca pod wyciągiem.

a-simple-rapid-quantitative-assay-to-measure-repair-dna-protein

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Niniejszy artykuł opisuje oparte na GFP testy fluorescencyjne in vivo, które pozwalają na oddzielne ilościowe określenie rekombinacji homologicznej oraz niespecyficznego łączenia końców w komórkach ssaków.

Analiza naprawy pęknięć obu nici DNA (DSB) w komórkach ssaków

Opisujemy metodę ilościowego pomiaru aktywności glikozylazy DNA oraz endonukleazy AP w czasie rzeczywistym w lizatach jąder komórkowych. Analiza ta pozwala na wyznaczenie szybkości aktywności naprawy DNA umożliwiającej analizę kinetyczną i może być dostosowana do ilościowego oznaczania aktywności naprawy DNA w lizatach tkanek i nowotworów lub z użyciem oczyszczonych białek.

Ilościowa analiza w czasie rzeczywistym aktywności naprawy przez wycinanie zasad w lizatach komórkowych z wykorzystaniem specyficznych dla uszkodzeń sond molekularnych (molecular beacons)

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Tutaj opisujemy wysokoprzepustowy test oparty na fluorescencji, który mierzy skuteczność uszczelniania błony plazmatycznej za pomocą analiz fluorometrycznych i obrazowych w żywych komórkach. Test ten może być stosowany do badań przesiewowych leków lub genów docelowych, które regulują ponowne uszczelnianie błony plazmatycznej w komórkach ssaków.

Wysokoprzepustowy pomiar skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków

Ten artykuł przedstawia podstawowe etapy immunobarwienia i immunoprecypitacji chromatyny. Protokoły te są powszechnie stosowane do badania procesów komórkowych związanych z uszkodzeniem DNA oraz do wizualizacji i ilościowego określenia rekrutacji białek zaangażowanych w naprawę DNA.

Wizualizacja i ilościowe określanie uszkodzeń DNA specyficznych dla miejsca na podstawie endonukleazy

Obecny protokół podkreśla zmodyfikowaną metodę wykrywania i ilościowego oznaczania wiązań krzyżowych DNA-białko (DPC) oraz ich modyfikacji potranslacyjnych (PTM), w tym ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji indukowanej przez inhibitory topoizomerazy i formaldehyd, umożliwiając tym samym badanie powstawania i naprawy DPC i ich PTM.

Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

Ten protokół opisuje test pozachromosomalnego łączenia niehomologicznych końców (NHEJ) i test rekombinacji homologicznej (HR) w celu ilościowego określenia efektywności NHEJ i HR w komórkach HEK-293T.

Analiza niehomologicznego łączenia końców i skuteczności rekombinacji homologicznej w komórkach HEK-293T przy użyciu systemów reporterowych opartych na GFP

Prezentujemy protokoły oceny biegłości w naprawie szlaku pęknięć dwuniciowych w komórkach przy użyciu zestawu pozachromosomalnych substratów reporterowych opartych na luminescencji.

Ocena aktywności naprawczej pęknięć podwójnej nici DNA przy użyciu wysokoprzepustowych i ilościowych testów reporterowych opartych na luminescencji

Tutaj prezentujemy prosty i szybki protokół wykrywania oddziaływań białek w miejscach uszkodzenia DNA.

Test ligandów zbliżeniowych do lokalizacji białek w miejscach uszkodzenia DNA

Tu opisujemy metodę wizualizowania opartych na komórkach, lokalizacji subkomórkowej i analizy ilościowej ognisk wzbogaconych poli(ADP-rybozą) (PAR) w fiksowanych komórkach ssaków. Ten test umożliwia ilościową ocenę miejsc aktywacji PARP indukowanej uszkodzeniem DNA, w tym związaną z naprawą po wycinaniu zasad lub naprawą pojedynczych rozerwaniach łańcucha, w jądrach komórek narażonych na genotoksyczne substancje.

Wizualizacja i ilościowa analiza aktywacji PARP1/PARP2 indukowanej genotoksinami w komórkach z wykorzystaniem reportera opartego na białku fuzyjnym fluorescencyjnym

Poznaj metodę ilościowej oceny naprawy wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidach w komórkach ssaków przy użyciu specyficznej dla nici ekstensji starterów i qPCR. Technika ta pozwala mierzyć kinetykę naprawy już po dwóch godzinach.

Prosty, szybki i ilościowy test do pomiaru naprawy wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidach transfekowanych do komórek ssaków

Przeglądaj więcej filmów