Prosty, szybki i ilościowy test do pomiaru naprawy wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidach transfekowanych do komórek ssaków

Celem tego protokołu jest ilościowe określenie naprawy zdefiniowanych wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidowym DNA. Uszkodzone plazmidy są transfekowane do linii komórkowych ssaków biorcy i zbierane o niskiej masie cząsteczkowej w wielu punktach czasowych po transfekcji. Kinetykę naprawy DNA określa się ilościowo za pomocą specyficznego dla nici wydłużania startera, a następnie qPCR.

Ogólnym celem tego transpacyficznego eseju QPCR dotyczącego rozszerzenia startera jest ilościowa ocena naprawy adduktów, usieciowanych z plazmidowym DNA, po transfekcji do komórek ssaków. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie naprawy DNA. Na przykład, jakie szlaki są zaangażowane w naprawę wiązań krzyżowych białek DNA.

Technika ta może zapewnić lepsze zrozumienie odpowiedzi na uszkodzenie DNA. Ponieważ pozwala na selektywne badanie naprawy wiązań krzyżowych białek DNA i braku innych rodzajów uszkodzeń DNA. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w naprawę wiązań krzyżowych białek DNA, może być również stosowana do innych rodzajów uszkodzeń DNA.

Takich jak miejsca zasadowe i inne addukty blokujące polimerazę. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona wykryć naprawę plazmidów zawierających addukty już po dwóch godzinach. Początkowo zamierzaliśmy wykorzystać reaktywację komórek domowych do badania naprawy, jednak te testy nie mierzą bezpośrednio naprawy lub mogą zawyżać skuteczność naprawy.

Zwłaszcza, jeśli polimeraza RNA może odczytywać niekompletne produkty naprawcze. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy oczyszczania i wydłużania podkładu specyficznego dla pasma są trudne do wizualizacji w inny sposób. Zmieszać 20 mikrolitrów roztworu zawierającego 80 pikomoli ośmiu oksogonuaniny zawierającej oligonukleotydy z pięcioma mikrolitrami 10-krotnego buforu ligazy.

I dodaj jeden mikrolitr roztworu zawierającego 10 jednostek kinazy polinukleotydowej T4. Dostosuj końcową objętość do 50 mikrolitrów i inkubuj probówkę w łaźni wodnej przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie należy przeprowadzić reakcję rozciągnięcia startera na lodzie.

Ustaw program na termocyklerze i rozpocznij bieg. Po inkubacji dostosuj całkowitą objętość do 375 mikrolitrów, dodając różne odczynniki, enzymy i bufor. Następnie inkubuj reakcję w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Aby przygotować mieszaninę fenylu i chloroformu w stosunku 50:50, dodaj równe objętości fenolu i chloroformu. Następnie wymieszaj oba składniki i wiruj w wirówce stołowej o masie 21, 130 G przez pięć minut. Po zakończeniu wirowania dodaj 375 mikrolitrów warstwy organicznej do reakcji starter-przedłużanie. Mieszać.

I ponownie odwirować przy 21, 130 G przez pięć minut. Po odwirowaniu ostrożnie odpipetować górną warstwę. I wymieszać z octanem amonu do końcowego stężenia 0,3 mola.

A następnie dodaj do niego dwie objętości 100% etanolu. Przechowuj mieszaninę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej 30 minut do nocy. Po zakończeniu okresu inkubacji odwirować próbkę z prędkością 15 000 obr./min w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.

Następnie wyrzuć sklarowany osad i umyj osad w 70% etanolu. Ponownie odwirować próbkę w wirówce stołowej z prędkością 15 000 obr./min przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant i rozpuścić osad w 100 mikrolitrach wody.

Połącz 50 mikrolitrów DNA z 34 mikrolitrami wody i 16 mikrolitrami 6-krotnego barwnika ładującego żel. Uruchom próbkę na 10-centymetrowym, 0,8% niskotopliwym żelu agarozowym zawierającym 0,5 mikrograma na mililitr bromku etydyny o napięciu dwóch woltów na centymetr przez sześć godzin w buforze 1x TAE. Następnie użyj żyletki, aby wyciąć superskręcone DNA.

I zważ plasterek żelu. Następnie dodaj jeden mikrolitr buforu reakcyjnego beta-agarazy do strawienia co 10 miligramów plastra żelu. Następnie inkubuj plasterek w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie schładzaj w temperaturze 42 stopni Celsjusza w termocyklerze.

Gdy plasterek żelu rozpuści się i ostygnie do 42 stopni Celsjusza, dodaj 10 jednostek beta-agarazy i pozostaw w temperaturze 42 stopni Celsjusza na godzinę w termocyklerze. Po godzinie zmierzyć objętość rozpuszczonego żelu i dodać octan amonu do końcowego stężenia 0,3 mola i inkubować na lodzie przez 15 minut. Po inkubacji odwirować mieszaninę o sile 15 000 G przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie zebrać super natant i odpipetować do niego dwie objętości izopropanolu i wymieszać. Następnie przechowuj mieszaninę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia odwiruj oczyszczone, superskręcone DNA w wirówce stołowej z prędkością 15 000 obr./min przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Usuń super natant i ponownie zawieś granulat w 40 mikrolitrach wody. Następnie połączyć 15 mikrolitrów roztworu zawierającego 12 pikomoli DNA z jednym mikrolitrem roztworu 36 pikomoli glikozylazy oksmoguaninowej w buforze i dostosować końcową objętość do 30 mikrolitrów. Następnie inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut w łaźni wodnej.

Dzień przed transfekcją wysiewaj komórki na sześciodołkowej płytce hodowlanej. Następnego dnia wymieszaj 1,5 mikrograma usieciowanego plazmidu z 300 mikrolitrami pożywki hodowlanej bez surowicy w jednej probówce, upewniając się, że zapisałeś jeden mikrolitr DNA jako punkt znaku godziny zero. W innej probówce wymieszaj 12 mikrolitrów odczynnika do transfekcji z 300 mikrolitrami pożywki bez surowicy.

Następnie połącz 300 mikrolitrów usieciowanego DNA z równą objętością rozcieńczonego odczynnika do transfekcji. I inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej w okapie z przepływem laminarnym. Po inkubacji dodaj 250 mikrolitrów kompleksu do każdej z dwóch studzienek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po upływie co najmniej jednej godziny usunąć pożywkę i dodać jeden mililitr 0,6% roztworu dodecylosiarczanu sodu z 0,1 molowym EDTA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut. Następnie odłącz ogniwa, skrobając gumowym policjantem i przenieś do 1,5 mililitrowej rurki do mikrofuge. Następnie dodaj 200 mikrolitrów 5-molowego roztworu chlorku sodu do końcowego stężenia jednego molowca i odwróć probówkę pięć razy.

Następnie inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia odwirować próbkę w temperaturze 21,130 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu zebrać super natant.

I dodaj octan amonu do końcowego stężenia 0,3 mola, wymieszaj i dodaj dwie objętości 100% etanolu, aby wytrącić DNA. Przechowuj mieszaninę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej 30 minut. Po wytrąceniu etanolu i ponownym zawieszeniu odzyskanych próbek DNA w 50 mikrolitrach wody, rozcieńczyć próbkę godziny zero w 500 mikrolitrach wody i przeprowadzić reakcje PCR przy użyciu próbek nietransfekowanych i transfekowanych.

Następnie ustaw program na termocyklerze i rozpocznij bieg. Ten etap przedłużania podkładu specyficznego dla trans jest kluczowy, ponieważ kupuje nam wzmocnienie zniszczonego pasma. Jeśli nie zostaną użyte, wartości delta CT będą mniejsze niż jeden, co utrudni wykrycie niskich poziomów naprawy DPC.

Po wykonaniu ośmiu cykli dodaj 100 pikomoli drugiego startera. Następnie wymieszaj jeden mikrolitr nieamplifikowanego DNA z próbek nietransfekowanych i transfekowanych z 2x mieszanką główną, wodą i 100 pikosolami obu starterów do końcowej objętości 60 mikrolitrów. Próbki należy załadować trzykrotnie na 96-dołkową płytkę do PCR.

Przeprowadzić ilościową reakcję PCR przez 30 cykli i uśrednić próg cyklu dla każdej z trzech próbek. W tym badaniu QPCR przeprowadza się z przedłużeniem startera specyficznego dla nici i bez niego w celu obliczenia procentu plazmidowego DNA, które zostało naprawione. Różnica w wartościach progowych cyklu między próbkami rozszerzonymi i nierozszerzonymi starterem jest określana jako CT.As delta widoczna tutaj, naprawiona próbka poddana SSPE-QPCR ma większą deltę CT niż próbka nienaprawiona.

Reprezentatywne dane procentu napraw obliczone na podstawie wartości katografii komputerowej delta pokazują, że próbki odzyskane po trzech godzinach transfekcji są naprawiane w 66%, podczas gdy próbki odzyskane po ośmiu godzinach są naprawiane w 93%. Poniżej przedstawiono procentowe wartości tła obliczone z dwóch próbek kontrolnych o odpowiednio wysokiej i niskiej skuteczności sieciowania białek. Niski procent tła obecnego w kontroli wskazuje, dlaczego do transfekcji stosuje się tylko efektywnie usieciowane podłoża.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch do trzech godzin. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby wziąć próbki w czasie zero, aby odjąć wszelkie tło z tego testu. Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak analiza sekwencji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: czy naprawa DPC jest podatna na błędy?

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować, przetransfekować i określić ilościowo naprawę plazmidów zawierających addukty w komórkach ssaków. Nie zapominaj, że praca z fenolem, chloroformem i bromkiem etydyny może być niebezpieczna. Należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawic i praca pod wyciągiem.