Name: Analiza minerałów wytwarzanych przez ogniwa hFOB 1.19 i Saos-2 przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej z mikroanalizą rentgenowską z dyspersją energii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Poznaj analizę mineralizacji w pęcherzykach komórek kostnych hFOB 1.19 i Saos-2 przy użyciu TEM z mikroanalizą EDX. Ta metoda pozwala badać nukleację apatytów in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MK i ASK wykonali ręczne operacje, a LB przygotował rysunki i nakręcił film. ASK napisał rękopis, LB napisał scenariusz, a MK przygotował tabelę. SM, RB i SP krytycznie czytają tabelę, scenariusz i rękopis. Autorzy pragną podziękować Hannie Chomontowskiej za doskonałą pomoc przy ultramikrotomii oraz Szymonowi Suskiemu i Henrykowi Bilskiemu za doskonałą pomoc przy analizie TEM-EDX. Autorzy dziękują dr Patrickowi Grovesowi za profesjonalną korektę języka angielskiego oraz Barbarze Sobiak za nagranie instrukcji.
Ta praca była wspierana przez grant N N401 140639 Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego dla ASK, przez granty z Narodowego Centrum Nauki, Polska 2016/23/N/NZ4/03313 dla LB i 2016/23/N/NZ1/02449 dla MK, Projekt EU 7PR BIOIMAGINE: BIO-IMAGing in research INnovation and Education, GA nr 264173, oraz przez fundusze statutowe Instytutu Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego, Polskiej Akademii Nauk.

1. Hodowla komórkowa i leczenie
<ol>
	<li>Umieść wszystkie niezbędne materiały pod okapem z przepływem laminarnym i wysterylizuj je w świetle UV. Pożywkami hodowlanymi są: mieszanina 1:1 pożywki F12 i DMEM Hama z 2,5 mM L-glutaminą uzupełnioną 100 U/ml penicyliny, 100 U/ml streptomycyny, 0,3 mg/ml G418 i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (v/v) dla ludzkich płodów hFOB 1,19 SV40 transfekowanych antygenem T transfekowanym antygenem T oraz pożywki McCoy's 5A z 1,5 mM L-glutaminą uzupełnioną 100 U/ml penicyliny, 100 U/ml streptomycyny i 15% FBS (v/v) dla komórek ludzkiego kostniakomięsaka Saos-2.</li>
	<li>Hodować komórki hFOB 1,19 w temperaturze 34 °C w atmosferze 5% CO2 i komórki Saos-2 w temperaturze 37 °C w atmosferze 5 % CO2 . Przenieść hodowle komórkowe, komórki hFOB 1.19 lub Saos-2, z inkubatora do okapu z przepływem laminarnym i zmienić pożywkę na 10 ml świeżej pożywki hodowlanej z FBS.</li>
	<li>Inkubuj komórki bez stymulatorów (komórki w stanie spoczynku) lub stymuluj je za pomocą kwasu askorbinowego (AA) o stężeniu 50 μg/mL, a następnie 7,5 mM β-glicerofosforanu (β-GP), przygotowanego wcześniej w ultraczystej wodzie i przefiltrowanego przez filtry strzykawkowe 0,22 μm. Dodać stymulatory z plastikowych probówek do mikrowirówek na powierzchnię pożywki hodowlanej. Delikatnie wymieszaj naczynie hodowlane i inkubuj przez 7 dni.</li>
</ol>
2. Wykrywanie minerałów wapnia
<ol>
	<li>Przemyć kultury komórkowe roztworem soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS: 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, pH 7,0).</li>
	<li>Dodaj 5 ml 2% (g: 100 ml) AR-S w PBS, pH 5,0 i inkubuj płytki przez 30 minut, aby zabarwić minerały.</li>
	<li>Umyj 3 razy PBS. Ostrożnie dodaj PBS do ścianki naczynia, staraj się nie niszczyć minerałów.</li>
	<li>Obserwuj minerały wapnia pod mikroskopem odwróconego światła i rób zdjęcia.</li>
</ol>
3. Wizualizacja sond w świetle UV
<ol>
	<li>W przypadku lizatów komórkowych należy traktować hodowle komórkowe, w stanie spoczynku lub stymulowane przez 7 dni, zgodnie z protokołem trawienia kolagenazy24.</li>
	<li>Zebrać pożywkę z kultur komórkowych i przemyć komórki PBS.</li>
	<li>Trawić komórki za pomocą 3 ml kolagenazy o stężeniu 500 U/ml w roztworze 0,25 M sacharozy, 0,12 M NaCl, 0,01 M KCl i 0,02 M buforu Tris-HCl, pH 7,45, w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.</li>
	<li>Mechanicznie zeskrobać komórki, przenieść je do plastikowych probówek do mikrowirówek i przepuścić 10 razy przez strzykawkę 1 ml 40 U z igłą 0,5 × 16.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 500 × g przez 5 minut.</li>
	<li>Odrzuć supernatant i zawieś osad komórkowy w 500 μl syntetycznej chrząstki limfatycznej (SCL, 100 mM NaCl, 12,7 mM KCl, 0,57 mM MgCl2, 1,83 mM NaHCO3, 0,57 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-glukozy, 63 mM sacharozy, 16,5 mM Hepes, pH 7,4).</li>
	<li>Przenieś proszki hydroksyapatytu (HA), fluorapatytu (FA) i chlorapatytu (CA) z butelek na transiluminatorze UV za pomocą szpatułki i użyj jako kontroli.</li>
	<li>Przenieś lizaty komórkowe z plastikowych probówek za pomocą plastikowych końcówek i ostrożnie umieść na transiluminatorze UV.</li>
	<li>Rób zdjęcia w świetle widzialnym i UV.</li>
</ol>
4. Przygotowanie sond dla TEM-EDX
<ol>
	<li>Przygotowanie minerałów do barwienia ujemnego
	<ol>
		<li>Zawiesić 2,5 mg syntetycznie wytwarzanych minerałów HA, CA i FA25 w 500 μl wody dejonizowanej i inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 1 godzinę.</li>
		<li>Wyjmij siatki Formvar/Carbon 300 Mesh Ni z pudełka z kleszczami antystatycznymi, umieść na porcelanowej płytce wielodołkowej i upuść 10 μl zawiesin HA, CA i FA na kratki.</li>
		<li>Suszyć próbki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komórek spoczynkowych i stymulowanych do osadzania 26
	<ol>
		<li>Zebrać pożywkę z kultur komórkowych i przemyć komórki pożywką do odczulania fizjologicznego (PD) (125 mM NaCl, 5 mM KCL, 10 mM NaHCO3, 1 mM KH2PO4, 10 mM glukozy, 20 mM HEPES, pH 7,4).</li>
		<li>Utrwalić komórki za pomocą 5 ml mieszaniny 3% (g: 100 ml) paraformaldehydu/1% (g: 100 ml) aldehydu glutarowego w 100 mM buforze fosforanu sodu o pH 7,2 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej pod wyciągiem.</li>
		<li>Umyj komórki 5 ml 100 mM buforu fosforanu sodu i delikatnie usuń bufor po umyciu.</li>
		<li>W ciemnym pomieszczeniu utrwalić próbki 2 ml 1% (g: 100 ml) tetratlenku osmu w 100 mM buforze fosforanu sodu o pH 7,2 przez 20 minut w temperaturze pokojowej pod wyciągiem.</li>
		<li>Usuń tetratlenek osmu i wykorzystaj go.</li>
		<li>Przemyć komórki 5 ml 100 mM buforu fosforanu sodu.</li>
		<li>Następnie odwodnić próbki w 5 ml porcji sortowanego roztworu etanolu w temperaturze pokojowej: 25% (obj.) przez 5 min, 50% (obj.) przez 10 min, 75% (obj.) przez 15 min, 90% (obj.) przez 20 min. Na koniec dwukrotnie użyj etanolu absolutnego i inkubuj przez 30 minut i 12 godzin.</li>
		<li>Mechanicznie zeskrobać komórki z plastikowych szalek do hodowli Petriego, zebrać do plastikowych probówek do mikrowirówek i odwirować próbki o masie 130 x g przez 1 minutę.</li>
		<li>Usunąć supernatanty i zawiesić komórki w 1 ml mieszaniny żywicy LR White i absolutnego etanolu w stosunku objętościowym 1:2.</li>
		<li>Przed użyciem dobrze wymieszać zawartość szklanych probówek i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 130 g przez 1 minutę.</li>
		<li>Usunąć sklarowane osady i powtórzyć poprzedni krok, używając 1 ml mieszaniny żywicy LR White i etanolu w stosunku 1:1.</li>
		<li>Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 130 g przez 1 minutę.</li>
		<li>Usunąć supernatanty.</li>
		<li>Na koniec dwukrotnie dodać 1 ml czystej żywicy LR White do próbek i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w plastikowych probówkach.</li>
		<li>Umieścić 500 μl każdej próbki w kapsułkach żelatynowych. 
		UWAGA: Próbki są oznaczane za pomocą małego arkusza papieru i ołówka, aby żywica nie zniszczyła etykiet.</li>
		<li>Zamknąć kapsułki żelatynowe, umieścić je w plastikowych probówkach do mikrowirówek i wirować przy 130 x g przez 1 minutę w odchylanym wirniku.</li>
		<li>Wyjmij kapsułki z plastikowych tubek za pomocą pompy próżniowej.</li>
		<li>Przenieść próbki do pieca i polimeryzować w temperaturze 56 °C przez 48 godzin.</li>
		<li>Przygotuj klocki, montując je w uchwycie i przycinając do piramidy.</li>
		<li>Włóż uchwyt do ultramikrotomu, przymocuj diamentowy nóż Ultra 45° i napełnij go wodą dejonizowaną; pamiętaj o oczyszczeniu ostrza z przypadkowych pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Następnie wyciąć odcinki (700 A) za pomocą noża diamentowego na dejonizowaną łaźnię wodną.</li>
		<li>Ustaw skrawki za pomocą rzęs bydlęcych i umieść je na błyszczącej stronie siatki Ni Formvar/Carbon 300 mesh i wysusz</li>.
		<li>Przygotować octan uranylu o stężeniu 2,5% (obj.) w absolutnym etanolu w ciemności pod wyciągiem wyciągowym. Przechowuj octan uranylu w ołowianym pojemniku i pamiętaj, aby nie zbierać osadu.</li>
		<li>W ciemnym pomieszczeniu należy przebarwić siatki syntetycznych apatytów i próbek komórkowych 2,5% (obj.) octanem uranylu w etanolu przez 20 minut w temperaturze pokojowej pod wyciągiem.</li>
		<li>Kratki umyć w 50% etanolu (obj.), następnie w wodzie dejonizowanej i suszyć w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Na koniec włóż kratki do pudełka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza TEM-EDX
<ol>
	<li>Obrazowanie TEM za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) wyposażonego w pełnozakresowy system mikroanalizy rentgenowskiej z dyspersją energii (EDX) i 11-megapikselową kamerę
	<ol>
		<li>Przygotuj uchwyt na beryl do obserwacji minerałów i komórek. Używaj narzędzi antystatycznych.</li>
		<li>Wykręć parę i podnieś płytkę berylową i podkładkę berylową z reszty ustalacza.</li>
		<li>Zamontuj siatkę, błyszczącą stroną do góry, na uchwycie.</li>
		<li>Ostrożnie umieść podkładkę berylową i płytkę berylową i mocno dokręć mocujące.</li>
		<li>Włóż uchwyt do komory próżniowej i włącz pompę próżniową.</li>
		<li>Po uzyskaniu podciśnienia delikatnie włóż uchwyt do komory obrazowania i włącz wiązkę.</li>
		<li>Na monitorze fluorescencyjnym ustaw parametry przysłony mikroskopu. Wykonaj korekcję astygmatyzmu obrazu; Ustawianie powiększenia, ostrości i ramki; i rób zdjęcia TEM w powiększeniu 50 000X.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie STEM i mikroanaliza rentgenowska do analizy spektralnej i składu
	<ol>
		<li>Włóż detektor promieniowania rentgenowskiego z dyspersją energii (EDX) do komory obrazowania skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM).</li>
		<li>Dostosuj ostrość obrazu w trybie ostrości.</li>
		<li>Wykonuj zdjęcia STEM w powiększeniu 15 000x.</li>
		<li>Wybierz punkt w próbce do mikroanalizy rentgenowskiej i zbierz widma.</li>
		<li>Uzyskaj dane poprzez zsumowanie wszystkich mas atomowych wszystkich pierwiastków układu okresowego pierwiastków w próbce (jako 100%) i oznaczenie zawartości wybranych pierwiastków: Ca, F, Cl i P (jako atomowe%). Następnie oblicz stosunki Ca, F lub Cl do P dla każdej próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mapowanie jonów
	<ol>
		<li>Wybierz pierwiastki, takie jak wapń, fluor, chlor i fosfor, aby wykonać mapowanie jonów i wykonać mapy EDX wybranych pierwiastków w próbkach.</li>
		<li>Uzyskaj dane, wskazując lokalizację analizowanych pierwiastków: Ca, F, Cl i P (jako % atomowy) i oblicz kolokalizację (w %) Ca, F lub Cl z P dla każdej próbki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Buckwalter, J. A., Cooper, R. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3325555">Bone structure and function.</a> Instr. Course Lect. 36, 27-28 (1987).</li>
<li>Anderson, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+matrix+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of matrix vesicles.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 314, 266-280 (1995).</li>
<li>Anderson, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+vesicles+and+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Matrix vesicles and calcification.</a> Curr Rheumatol. 5 (3), 222-226 (2003).</li>
<li>Bolean, M., Simão, A. M. S., Barioni, M. B., Favarin, B. Z., Sebinelli, H. G., Veschi, E. A., Janku, T. A. B., Bottini, M., Hoylaerts, M. F., Itri, R., Millán, J. L., Ciancaglini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+aspects+of+biomineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">Biophysical aspects of biomineralization.</a> Biophys Rev. 9 (5), 747-760 (2017).</li>
<li>Bottini, M., Mebarek, S., Anderson, K. L., Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Simão, A. M. S., Bolean, M., Ciancaglini, P., Bandorowicz Pikula, J., Pikula, S., Magne, D., Volkmann, N., Hanein, D., Millán, J. L., Buchet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+vesicles+from+chondrocytes+and+osteoblasts%3A+Their+biogenesis%2C+properties%2C+functions+and+biomimetic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Matrix vesicles from chondrocytes and osteoblasts: Their biogenesis, properties, functions and biomimetic models.</a> Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 532-546 (2018).</li>
<li>Hessle, L., Johnson, K. A., Anderson, H. C., Narisawa, S., Sali, A., Goding, J. W., Terkeltaub, R., Millan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-nonspecific+alkaline+phosphatase+and+plasma+cell+membrane+glycoprotein-1+are+central+antagonistic+regulators+of+bone+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Tissue-nonspecific alkaline phosphatase and plasma cell membrane glycoprotein-1 are central antagonistic regulators of bone mineralization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (14), 9445-9449 (2002).</li>
<li>Garimella, R., Bi, X., Anderson, H. C., Camacho, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+of+phosphate+substrate+as+a+major+determinant+of+mineral+type+formed+in+matrix+vesicle-mediated+in+vitro+mineralization%3A+An+FTIR+imaging+study%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Nature of phosphate substrate as a major determinant of mineral type formed in matrix vesicle-mediated in vitro mineralization: An FTIR imaging study.</a> Bone. 38 (6), 811-817 (2006).</li>
<li>Thouverey, C., Bechkoff, G., Pikula, S., Buchet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+pyrophosphate+as+a+regulator+of+hydroxyapatite+or+calcium+pyrophosphate+dihydrate+mineral+deposition+by+matrix+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr.+Cartil%22%5BJournal%5D)">Inorganic pyrophosphate as a regulator of hydroxyapatite or calcium pyrophosphate dihydrate mineral deposition by matrix vesicles.</a> Osteoarthr. Cartil. 17, 64-72 (2009).</li>
<li>Terkeltaub, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+pyrophosphate+generation+and+disposition+in+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Phys%22%5BJournal%5D)">Inorganic pyrophosphate generation and disposition in pathophysiology.</a> Am. J. Phys. 281 (1), 1-11 (2001).</li>
<li>Guicheux, J., Palmer, G., Shukunami, C., Hiraki, Y., Bonjour, J. P., Caverzasio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+culture+system+for+analysis+of+functional+role+of+phosphate+transport+in+endochondral+ossification%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro culture system for analysis of functional role of phosphate transport in endochondral ossification.</a> Bone. 27 (1), 69-74 (2000).</li>
<li>Yadav, M. C., Bottini, M., Cory, E., Bhattacharya, K., Kuss, P., Narisawa, S., Sah, R. L., Beck, L., Fadeel, B., Farquharson, C., Millán, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+mineralization+deficits+and+impaired+biogenesis+and+function+of+chondrocyte-derived+matrix+vesicles+in+Phospho1%28-%2F-%29+and+Phospho1%2FPi+t1+double-knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner.+Res%22%5BJournal%5D)">Skeletal mineralization deficits and impaired biogenesis and function of chondrocyte-derived matrix vesicles in Phospho1(-/-) and Phospho1/Pi t1 double-knockout mice.</a> J. Bone Miner. Res. 31 (6), 1275-1286 (2016).</li>
<li>Thouverey, C., Malinowska, A., Balcerzak, M., Strzelecka-Kiliszek, A., Buchet, R., Dadlez, M., Pikula, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+biogenesis+and+functions+of+matrix+vesicles+released+from+mineralizing+human+osteoblast-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of biogenesis and functions of matrix vesicles released from mineralizing human osteoblast-like cells.</a> J. Proteome. 74 (7), 1123-1134 (2011).</li>
<li>Wang, W., Xu, J., Kirsch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin-mediated+Ca2%2B+influx+regulates+growth+plate+chondrocyte+maturation+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Annexin-mediated Ca2+ influx regulates growth plate chondrocyte maturation and apoptosis.</a> J. Biol. Chem. 278 (6), 3762-3769 (2003).</li>
<li>Nollet, M., Santucci-Darmanin, S., Breuil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+osteoblasts+is+involved+in+mineralization+and+bone+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy in osteoblasts is involved in mineralization and bone homeostasis.</a> Autophagy. 10 (11), 1965-1977 (2014).</li>
<li>Boonrungsiman, S., Gentleman, E., Carzaniga, R., Evans, N. D., McComb, D. W., Porter, A. E., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+intracellular+calcium+phosphate+in+osteoblast-mediated+bone+apatite+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">The role of intracellular calcium phosphate in osteoblast-mediated bone apatite formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 14170-14175 (2012).</li>
<li>Genge, B. R., Wu, L. N., Wuthier, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+matrix+vesicle+nucleation%3A+synergistic+stimulation+of+mineral+formation+by+annexin+A5+and+phosphatidylserine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of matrix vesicle nucleation: synergistic stimulation of mineral formation by annexin A5 and phosphatidylserine.</a> J. Biol. Chem. 282 (36), 26035-26045 (2007).</li>
<li>Jahnen-Dechent, W., Schäfer, B., Ketteler, M., McKee, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mineral+chaperones%3A+a+role+for+fetuin-A+and+osteopontin+in+the+inhibition+and+regression+of+pathologic+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Mineral chaperones: a role for fetuin-A and osteopontin in the inhibition and regression of pathologic calcification.</a> J. Mol. Med. (Berl). 86 (4), 379-389 (2008).</li>
<li>Suchanek, W., Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://adsabs.harvard.edu/abs/1998JMatR..13...94S">Processing and properties of hydroxyapatite-based biomaterials for use as hard tissue replacement implants.</a> J. Miner. Res. 13 (1), 94-117 (1998).</li>
<li>Pautke, C., Schieker, M., Tischer, T., Kolk, A., Neth, P., Mutschler, W., Milz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+osteosarcoma+cell+lines+MG-63%2C+Saos-2+and+U-2+OS+in+comparison+to+human+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of osteosarcoma cell lines MG-63, Saos-2 and U-2 OS in comparison to human osteoblasts.</a> Anticancer Res. 24 (6), 3743-3748 (2004).</li>
<li>Yen, M. -L., Chien, C. -C., Chiu, I. -M., Huang, H. -I., Chen, Y. -C., Hu, H. -I., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+differentiation+and+characterization+of+the+human+fetal+osteoblastic+1.19+cell+line%3A+a+possible+in+vitro+model+of+human+mesenchymal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Multilineage differentiation and characterization of the human fetal osteoblastic 1.19 cell line: a possible in vitro model of human mesenchymal progenitors.</a> Stem Cells. 25 (1), 125-131 (2007).</li>
<li>Brittle, S. W., Foose, D. P., O'Neil, K. A., Sikon, J. M., Johnson, J. K., Stahler, A. C., Ryan, J. D., Higgins, S. R., Sizemore, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+raman-based+imaging+method+for+characterizing+the+molecular+adsorption+and+spatial+distribution+of+silver+nanoparticles+to+hydrated+mineral+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">A raman-based imaging method for characterizing the molecular adsorption and spatial distribution of silver nanoparticles to hydrated mineral surfaces.</a> Environ Sci Technol. , (2018).</li>
<li>Liu, N., Wang, Y., Ge, F., Liu, S., Xiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+effect+of+nano-ZnO+and+cetyltrimethyl+ammonium+chloride+on+the+growth+of+Chlorella+vulgaris%3A+Dissolution+and+accumulation+of+nano-ZnO%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Antagonistic effect of nano-ZnO and cetyltrimethyl ammonium chloride on the growth of Chlorella vulgaris: Dissolution and accumulation of nano-ZnO.</a> Chemosphere. 196, 566-574 (2018).</li>
<li>Tasbihi, M., Kočì, K., Troppová, I., Edelmannová, M., Reli, M., Čapek, L., Schomäcker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocatalytic+reduction+of+carbon+dioxide+over+Cu%2FTiO2+photocatalysts%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Pollut+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Photocatalytic reduction of carbon dioxide over Cu/TiO2 photocatalysts.</a> Environ Sci Pollut Res Int. , (2017).</li>
<li>Chen, N. X., O'Neill, K. D., Chen, X., Moe, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin-Mediated+Matrix+Vesicle+Calcification+in+Vascular+Smooth+Muscle+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner.+Res%22%5BJournal%5D)">Annexin-Mediated Matrix Vesicle Calcification in Vascular Smooth Muscle Cells.</a> J. Bone Miner. Res. 23 (11), 1798-1805 (2008).</li>
<li>Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+minerals+in+vesicles+produced+by+human+osteoblasts+hFOB+1.19+and+osteosarcoma+Saos-2+cells+stimulated+for+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inorg.+Bioch%22%5BJournal%5D)">Characteristics of minerals in vesicles produced by human osteoblasts hFOB 1.19 and osteosarcoma Saos-2 cells stimulated for mineralization.</a> J. Inorg. Bioch. 171, 100-107 (2017).</li>
<li>Thouverey, C., Strzelecka-Kiliszek, A., Balcerzak, M., Buchet, R., Pikula, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+vesicles+originate+from+apical+membran%C4%99+microvilli+of+mineralizing+osteoblast-like+Saos-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Matrix vesicles originate from apical membranę microvilli of mineralizing osteoblast-like Saos-2 cells.</a> J. Cell. Biochem. 106 (1), 127-138 (2009).</li>
<li>Cazalbou, S., Eichert, D., Ranz, X., Drouet, C., Combes, C., Harmand, M. F., Rey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+exchanges+in+apatites+for+biomedical+application%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci.+Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Ion exchanges in apatites for biomedical application.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 16 (5), 405-409 (2005).</li>
<li>Kraus, D. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1179/2047480613Z.000000000181?journalCode=ymew20">Consolidated data analysis and presentation using an open-source add-in for the Microsoft Excel® spreadsheet software.</a> Med. Writ. 23 (1), 25-28 (2014).</li>
<li>Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomineralization+in+humans%3A+making+the+hard+choices+in+life%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Biomineralization in humans: making the hard choices in life.</a> Annu. Rev. Genet. 43, 119-142 (2009).</li>
<li>Bonucci, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22201735">Bone mineralization.</a> Front. Biosci. 17, 100-128 (2012).</li>
<li>Veis, A., Dorvee, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomineralization+mechanisms%3A+A+new+paradigm+for+crystal+nucleation+in+organic+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif.+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">Biomineralization mechanisms: A new paradigm for crystal nucleation in organic matrices.</a> Calcif. Tissue Int. 93 (4), 307-315 (2013).</li>
<li>Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A., Sone, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+collagen+biomineralization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro models of collagen biomineralization.</a> J. Struct. Biol. 183 (2), 258-269 (2013).</li>
<li>Alliston, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4134366/">Biological regulation of bone quality.</a> Curr. Osteoporos. Rep. 12 (3), 366-375 (2014).</li>
<li>Wang, W., Kirsch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+stimulates+annexin-mediated+growth+plate+chondrocyte+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid stimulates annexin-mediated growth plate chondrocyte mineralization.</a> J. Cell Biol. 157 (6), 1061-1069 (2002).</li>
<li>Wang, W., Xu, J., Kirsh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+V+and+terminal+differentiation+of+growth+plate+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Annexin V and terminal differentiation of growth plate chondrocytes.</a> Exp. Cell Res. 305 (1), 156-165 (2005).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

W niniejszej pracy opisano protokoły barwienia AR-S, identyfikacji fluorapatytu światłem UV oraz obrazowania in vitro TEM-EDX MV uwalnianych przez komórki mineralizujące oraz minerałów wytwarzanych przez MV. Możliwe jest zajęcie się wszystkimi wyżej wymienionymi metodami, wykonując kilka typowych kroków rozwiązywania problemów. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy dokładnie wykonać kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, lepiej jest dodać AA (który jest kwaśny), a następnie β-GP (który jest zasadowy), ab...

Kość jest rodzajem tkanki łącznej składającej się z dwóch części: organicznej (komórek i włókien kolagenowych) oraz mineralnej (związków wapnia i fosforu). Głównymi składnikami mineralnymi kości są apatyty1. Różne typy komórek zdolnych do mineralizacji w kościach (osteoblasty), zębach (odontoblasty) i chrząstkach (chondrocyty) regulują początkowe etapy mineralizacji poprzez produkcję białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i uwalnianie pęcherzyków macierzy (MVs) (Rysunek 1). MVs to pęcherzyki o średnicy 100-300 nm, które gromadzą wapń i fosfor, co ułatwia nukleację apatytu, a następnie wiążą się z kolagenem2,3. Następnie pęcherzyki MVs ulegają rozpadowi, uwalniając apatyty do środowiska zewnątrzkomórkowego. Apatyty kontynuują wzrost w kontakcie z włóknami kolagenowymi i tworzą macierz kostną. Mineralizacja jest podtrzymywana przez stałą podaż Pi i Ca2+ w środowisku zewnątrzkomórkowym. Niektóre niedawno opublikowane dane wspierają nasz model4,5. Tkanki miękkie nie mineralizują się w warunkach fizjologicznych. Jednak w warunkach patologicznych może dojść do zwapnienia ektopowego, np. w przypadku zwapnienia naczyń3. Komórki naczyniowe, które nabywają fenotypu osteoblastów, mogą wytwarzać pęcherzyki MVs, które indukują nukleację apatytów i inicjują mineralizację w warstwie środkowej (media) i wewnętrznej (intima) ścian naczyń krwionośnych. Ponieważ zwapnienie ektopowe przypomina prawidłową mineralizację endochondralną3, zrozumienie mechanizmów molekularnych mineralizacji komórek kostnych i chondrocytów powinno dostarczyć wskazówek dotyczących powstawania zwapnień ektopowych w tkankach miękkich.
Rozwój tkanek szkieletowych jest regulowany przez różne enzymy, czynniki wzrostu oraz promotory lub inhibitory mineralizacji. Antagonistyczne działanie nieswoistej tkankowo fosfatazy alkalicznej (TNAP) (Rysunek 1) i ektonukleotydopirofosfatazy/fosfodiesterazy I (NPP1), wraz z ankiryną (ANK), kontroluje stężenie nieorganicznego pirofosforanu (PPi)6. PPi, silny inhibitor tworzenia HA, jest hydrolizowany przez TNAP; NPP1 hydrolizuje nukleotydotrifosforany do PPi, podczas gdy ANK eksportuje PPi z komórki do ECM. Stosunek Pi/PPi może regulować tworzenie apatytu7,8, co może prowadzić do konsekwencji patologicznych9.
Błona MV jest wzbogacona w białka transportu jonowego, które ułatwiają wstępne wytrącanie wapnia i fosforanu wewnątrz MV podczas procesu nukleacji (Rysunek 1). Transporter fosforanu 1 (PiT) pomaga w wbudowywaniu Pi generowanego w przestrzeni perivesikularnej do wnętrza MV10,11. Aneksyny mogą uczestniczyć w wiązaniu i transporcie Ca2+ oraz w procesie biofizycznym, który inicjuje mineralizację w świetle MV12,13. Popieramy sugerowaną wcześniej hipotezę dotyczącą mineralizacji w pęcherzykach wewnątrzcytoplazmatycznych, zakładającą wewnętrzną nukleację apatytu wewnątrz MV przed jego propagacją w ECM14,15. Modelowanie in vitro potwierdziło indukcję tworzenia kompleksów Ca2+/Pi w proteoliposomach wykonanych z PS i AnxA516. Może to wskazywać, że akumulacja kompleksów Ca2+, Pi, AnxA5 i PS w tratwach lipidowych błon przypominających mikrokosmkach stanowi jądro nukleacji (NC) apatytu wewnątrz MVs. Aneksyny i TNAP posiadają również zdolność wiązania kolagenu, co może pomagać w rozmieszczaniu MV wzdłuż włókien kolagenowych oraz w stymulowaniu propagacji mineralizacji w ECM. Fetuina A i osteopontyna (OPN)17 są znane jako inhibitory tworzenia apatytu, które mogą spowalniać propagację mineralizacji na rusztowaniu kolagenowym. Nukleacja i propagacja są odrębnymi zjawiskami, przy czym pierwsze poprzedza drugie; oba mogą mieć znaczenie dla procesu patologicznej mineralizacji.
Aby odkryć, w jaki sposób chemia kompleksów fosforanu wapnia może zmieniać mineralizację fizjologiczną i zwapnienia ektopowe, konieczne jest zidentyfikowanie minerałów wytwarzanych przez komórki. Apatyty to grupa minerałów zawierających wapń i fosfor o ogólnym wzorze komórki jednostkowej kryształu Ca10(PO4)6X2, gdzie X = Cl, F, OH. Są one klasyfikowane w następujący sposób18: fluorapatyt (FA) Ca10(PO4)6F2, chlorapatyt (CA) Ca10(PO4)6Cl2 oraz hydroksyapatyt (HA) Ca10(PO4)6(OH)2.
Wybór linii komórkowych osteoblastów do indukcji mineralizacji jest kluczowy, ponieważ każda linia wykazuje odmienny profil mineralizacji. W niniejszym raporcie porównano nukleację minerałów w dwóch wybranych ludzkich modelach mineralizacji: osteoblastycznych komórkach hFOB 1.19 oraz komórkach osteosarkomu Saos-2. Komórki pochodzące z osteosarkomu są powszechnie stosowane jako modele osteoblastyczne, a komórki Saos-2 zachowały najbardziej dojrzały charakter osteoblastyczny19, podczas gdy nieróżnicowane ludzkie płodowe komórki hFOB są szeroko wykorzystywane jako model prawidłowego różnicowania osteoblastycznego20. Ich profile mineralizacji analizowano za pomocą różnych metod: barwienia Alizarin Red-S (AR-S), wizualizacji w świetle ultrafioletowym (UV), obrazowania za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM), ilościowej mikroanalizy rentgenowskiej z detekcją energii (EDX) oraz mapowania jonowego. Przewagą metody TEM-EDX nad alternatywnymi technikami stosowanymi w poprzednich badaniach jest to, że dostarcza ona ilościowych i jakościowych wyników dotyczących podstawienia jonów w kryształach apatytu4,5,21. Ogólnym celem zastosowania TEM-EDX było znalezienie prostej metody obrazowania i ilościowego określania rozkładu jonów Ca, F i Cl w różnych minerałach pochodzących z różnych typów komórek na odrębnych etapach procesu mineralizacji. Metoda ta została z sukcesem zastosowana na przykład do monitorowania oddziaływań nanocząsteczek cynku z współistniejącymi substancjami chemicznymi oraz ich połączonych efektów na organizmy wodne22. W innym badaniu fotokatalizator miedziowy na materiałach tytanowych w roztworze wodnym został szczegółowo scharakteryzowany za pomocą spektrometrii emisyjnej z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-OES), fizysorpcji N2 (BET), XRD, UV-vis DRS, FT-IR, spektroskopii Ramana, TEM-EDX oraz pomiarów fotoelektrochemicznych23. Naszym celem było porównanie pochodzenia i właściwości pęcherzyków oraz minerałów w dwóch liniach komórkowych, aby zrozumieć mechanizm kontrolujący mineralizację podczas różnicowania kostnego.
<img alt="Schemat macierzy zewnątrzkomórkowej; transport fosforanów, anneksyny, wiązanie Ca²⁺, fosforan organiczny, TNAP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57423/57423fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat początkowych etapów mineralizacji w komórkach kostnych, obejmujący syntezę białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) oraz uwalnianie pęcherzyków macierzy (MV) z błony. Pęcherzyki MV gromadzą wapń dzięki działaniu białek wiążących wapń, anneksyn oraz fosforan poprzez działanie transportera fosforanu nieorganicznego (PiT), a następnie dzięki aktywności nieswoistej tkankowo fosfatazy zasadowej (TNAP), która defosforyluje PPi do Pi, ułatwiając tym samym nukleację apatytu. Następnie pęcherzyki MV ulegają rozpadowi i uwalniają apatyty do środowiska zewnątrzkomórkowego. Mineralizacja jest podtrzymywana przez stałą podaż Pi i Ca2+ w środowisku zewnątrzkomórkowym4,5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57423/57423fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td><silny>odczynnik</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>szynka" s mieszanina pożywek DMEM / F12</td><td>PAA</td><td>E15-813</td><td>1:1, dla ludzkiego płodu hFOB 1.19 SV40 transfekowane osteoblasty z dużym antygenem T (ATCC CRL-11372)</td></tr> <tr><td>McCoy' s 5A medium</td><td>PAA</td><td>E82312-0025</td><td>dla ludzkich komórek kostniakomięsaka Saos-2 (ATCC HTB-85)</td></tr> <tr><td>Mieszanina antybiotyków (penicylina / streptomycyna)</td> <td>Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td>100 U / ml każdy</td></tr><tr><td>G-418</td><td>Sigma</td><td>68168</td><td>0,3 mg / ml</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>10% dla hFOB 1,19 i 15% dla Saos-2</td></tr><tr><td>AA</td><td>Sigma</td><td>A-5960</td><td>50 i mikro; g/mL</td></tr><tr><td>&szlig;-GP</td><td>Sigma</td><td>G9422-100G</td><td>7,5 mM</td></tr><tr><td>Bio-Gel HTP Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>130-0420</td><td>dla HA</td></tr><tr><td>FA</td><td></td><td></td><td>syntetyzowany przez nas</td></tr><tr><td>CA</td><td></td><td></td><td>syntetyzowany przez nas</td></tr><tr><td>Bufor fosforanu sodu Na2HPO4/NaH2PO4 mieszanina</td><td>Sigma</td><td>S7907/S8282</td><td>0,1 M, pH 7,2</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>pH 7,0, przygotowany przez nas</td></tr><tr><td>AR-S w PBS</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td>0,5 g/100 mL, pH 5,0</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu IA</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>500 U/ml</td></tr><tr><td>bufor</td><td></td><td></td> SCL <td>przygotowany przez nas</td></tr> Woda <tr><td>dejonizowana</td><td></td><td></td><td>produkowana przez nas</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>POCh</td><td>BA6480111</td><td>absolut 99,8% i roztwory 25, 50, 75, 90%</td></tr> <tr><td>octan uranylu w 50% etanolu</td><td>Polysciences Inc.</td><td>21447-25</td><td>0,25 g/10 mL</td></tr><tr><td>PD pH</td><td></td><td></td><td>7,4, przygotowane przez nas</td></tr><tr><td>Mieszanina utrwalająca (paraformaldehyd / aldehyd glutarowy)</td> <td>Sigma</td><td>158127 / G-6257</td><td>3%: 1%</td></tr> <tr><td>Po utrwaleniu OsO4</td><td>Sigma</td><td>75633</td><td>1%</td></tr><tr><td>LR Biała żywica w etanolu</td><td>Polysciences Inc.</td><td>17411-MUNC 500g</td><td>1:2, 1:1, 100%</td></tr> <tr><td>aceton</td><td>CHEMPUR</td><td>111024800</td><td>fiolki pure</td></tr><tr><td>Tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic</td><td>Corning Inc.</td><td>430487</td><td>1,2 ml</td></tr><tr><td>Plastikowe szalki do hodowli Petriego</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>100 mm</td></tr><tr><td>Probówki plastikowe</td><td>Falcon</td><td>352096 i 352070</td> Pipety serologiczne <td>15 i 50 ml</td></tr><tr><td></td><td>Falcon i VWR</td><td>357521 i 612-3700</td><td>1 i 10 ml</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek z tworzywa sztucznego</td><td>Sigma</td><td>Z688312 i Z628034</td><td>1,5 ml czarne i przezroczyste 2 ml</td></tr><tr><td>Końcówki plastikowe</td><td>VWR</td><td>613-0364, 613-0239 i 613-1050</td><td>0,1-10 i mikro; L naturalny, 1-200 i mikro; L żółty i 200-1000 &mikro; L niebieski</td></tr><tr><td>Stojaki plastikowe</td><td>Light Labs</td><td>A-7055-Z, A-7053-C</td><td>zielony do probówek, pomarańczowy do mikroprobówek i niebieski do sond TEM</td></tr><tr><td>Laminar, Hera, Save</td><td>Thermo Scientific Co.</td>Filtr HEPA <td>KS12</td><td>(H14 zgodnie z DIN EN 1822)</td></tr><tr><td>Inkubatory Hera Cell</td><td>Thermo Scientific Co.</td><td>150</td><td>34&deg; C dla hFOB 1.19 i 37&deg; C dla Saos-2</td></tr><tr><td>Dygestorium</td><td>POLON</td><td>WCS-2</td><td>do barwień TEM</td></tr><tr><td>Butelki szklane</td><td>SIMAX</td><td>1632414501050 i 1632414501100</td><td>50 i 100 ml</td></tr><tr><td>Rurki ze szkła kwarcowego</td><td>SIMAX</td><td>638422010100</td><td>&Oslash; 10 mm, L 100 mm</td></tr><tr><td>Pompa</td><td>IBS Integra Biosciences</td><td>VACUSAFE komfort</td><td>do odkurzacza</td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>Memmert</td><td>UNE 400</td><td>56&deg; C</td></tr><tr><td>Porcelanowa płytka wielodołkowa</td><td>Rosenthal technik</td><td>229/12</td><td>12 dołków</td></tr><tr><td>Zlewki szklane</td><td>SIMAX</td><td>632417010025</td><td>25 ml</td></tr><tr><td>Butelki szklane</td><td>Pocord</td><td>DIN22</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Pudełko plastikowe</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td></td><td>na ciemność</td></tr><tr><td>Snap Fit Kapsułki żelatynowe</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td>G3741</td><td>rozmiar 1</td></tr><tr><td>Siatki Form / Carbon 300 Mesh Ni w pudełku</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td>Folia S162N3</td><td>po błyszczącej stronie</td></tr><tr><td>Skrobak do ogniw silikonowych</td><td>Sigma</td><td>SIAL0010-100EA</td><td>rozmiar 1,8/25 cm</td></tr><tr><td>Strzykawka z igłą</td> Strzykawka <td>BogMark</td><td>007</td><td>1 ml 40 U, igła 0,5 x 16</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Chirana</td><td>CH005L</td> 5 <td>mL</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>MPW Medical Instruments</td><td>MPW-350R</td><td>130 x g i 500 x g</td></tr><tr><td>Transluminator UVP</td><td></td><td>M-20</td><td>do światła widzialnego i UV</td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>LKB</td><td>NOVA</td><td>700&Aring; Sekcje</td></tr><tr><td>Uchwyt blokowy</td><td>LKB</td><td>E6711</td><td>okrągły</td></tr><tr><td>kształt Nóż diamentowy</td><td>DiATOME</td><td>Ultra 45&deg;</td><td>rozmiar 3</td></tr><tr><td>Uchwyt na</td><td></td><td></td> rzęsy <td>bydlęcy, przygotowany przez nas</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>ROTH</td><td>2855.1</td><td>antystatyczne do siatek</td></tr><tr><td>Zestaw szpatułek</td><td>ROTH</td><td>E286.1</td><td>antystatyczne do pudrów</td></tr><tr><td><mocny>Obrazowanie</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop światła odwróconego</td><td>Zeiss z Canon</td><td>AxioObserver Z1 wyposażony w PowerShot G9</td><td>Kontrast fazowy, Światło przechodzące, obiektyw 20 x, filtry RGB</td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>TEM Jeol Co. z Oxford Instruments i SiS-Olympus</td><td>JEM-1400 TEM wyposażony w pełnozakresowy system mikroanalizy rentgenowskiej INCA z dyspersją energii (EDX) i 11-megapikselowy zoom kamery MORADA G2</td><td>50 000X dla TEM i 15 000X dla STEM i EDX</td></tr><tr><td>Korpus aparatu i obiektywy</td><td>Nikon</td><td>Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D </td><td>do nagrywania filmów</td></tr><tr><td>Mikrofon</td><td>MXL Mics</td><td>Tempo</td><td>do nagrań głosowych</td></tr></tbody></table>

analiza minerałów wytwarzanych przez ogniwa hfob 1.19 i saos-2 przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej z mikroanalizą rentgenowską z dyspersją energii

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

Ten film przedstawia użycie transmisyjnej mikroskopii elektronowej z mikroanalizą rentgenowską z dyspersją energii (TEM-EDX) do porównania stanu minerałów w pęcherzykach uwalnianych przez dwie ludzkie linie komórek kostnych: hFOB 1.19 i Saos-2. Te linie komórkowe, po leczeniu kwasem askorbinowym (AA) i β-glicerofosforanem (β-GP), przechodzą całkowite różnicowanie osteogenne od proliferacji do mineralizacji i wytwarzają pęcherzyki macierzy (MV), które wywołują zarodkowanie apatytu w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM).
Na podstawie barwienia Alizarin Red-S (AR-S) i analizy składu minerałów w lizatach komórkowych za pomocą światła ultrafioletowego (UV) lub w pęcherzykach za pomocą obrazowania TEM, a następnie kwantyfikacji EDX i mapowania jonów, możemy wywnioskować, że kostniakomięsak Saos-2 i osteoblastyczne komórki hFOB 1.19 wykazują różne profile mineralizacji. Komórki Saos-2 mineralizują się wydajniej niż komórki hFOB 1.19 i wytwarzają większe złoża mineralne, które nie są widoczne w świetle UV, ale są podobne do hydroksyapatytu (HA), ponieważ mają więcej podstawień Ca i F.
Wyniki uzyskane przy użyciu tych technik pozwalają nam stwierdzić, że proces mineralizacji różni się w zależności od typu komórki. Proponujemy, aby na poziomie komórkowym pochodzenie i właściwości pęcherzyków z góry determinowały rodzaj minerałów.

TEM-EDX umożliwia obrazowanie in vitro pęcherzyków macierzy (MVs) uwalnianych przez komórki mineralizujące oraz minerałów produkowanych przez MVs. Wyniki uzyskane przy użyciu tej techniki wykazują, że proces mineralizacji może przebiegać w różny sposób w zależności od rodzaju komórek. Dwie linie komórkowe poddano tej samej procedurze transdyferencjacji osteoblastycznej, jednak stymulowane komórki Saos-2 mineralizowały wydajniej niż osteoblasty hFOB 1.19, co potwierdziło ...

Przedstawiamy protokół do porównywania stanu minerałów w pęcherzykach uwalnianych przez dwie linie ludzkich komórek kostnych: hFOB 1.19 i Saos-2. Ich profile mineralizacji analizowano za pomocą barwienia czerwienią Alizarin Red-S (AR-S), wizualizacji światła ultrafioletowego (UV), obrazowania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) oraz mikroanalizy rentgenowskiej z dyspersją energii (EDX).

Analiza minerałów wytwarzanych przez ogniwa hFOB 1.19 i Saos-2 przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej z mikroanalizą rentgenowską z dyspersją energii

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...

Podczas początkowych etapów mineralizacji komórki wytwarzają białka macierzy zewnątrzkomórkowej i uwalniają pęcherzyki macierzy, które gromadzą wapń i fosforany, aby ułatwić zarodkowanie apatytu. W tym raporcie porównujemy zarodkowanie minerałów przez dwa wybrane modele komórek ludzkich, osteoblastyczne hFOB 1.19 i komórki kostniakomięsaka Saos-2. Ich profile mineralizacyjne analizowano różnymi metodami.Umieść wszystkie materiały pod laminarem i wysterylizuj je w świetle UV. Zmień pożywkę na 10 mililitrów świeżej pożywki hodowlanej z płodową surowicą bydlęcą. Komórki spoczynkowe są inkubowane bez stymulatorów, podczas gdy stymulowane komórki są traktowane zarówno kwasem askorbinowym, jak i beta-glicerofosforanem.Najpierw delikatnie upuść kwas askorbinowy do końcowego stężenia 50 mikrogramów na mililitr na powierzchnię pożywki hodowlanej, aby stymulować komórki. Następnie dodaj beta-glicerofosforan do końcowego stężenia 7,5 milimola w pożywce hodowlanej, aby stymulować komórki. Delikatnie wymieszaj naczynie hodowlane i włóż je do inkubatora na siedem dni.Po siedmiu dniach inkubacji przemyć kultury komórkowe solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, PBS. Dodaj pięć mililitrów 2% czerwieni alizarynowej i inkubuj płytkę przez 30 minut, aby zabarwić minerały. Umyj trzy razy PBS.Ostrożnie dodaj PBS do ścianki naczynia. Staraj się nie niszczyć minerałów. Obserwuj minerały pod mikroskopem z odwróconym światłem.Zebrać pożywkę z kultur komórkowych i przemyć komórki PBS. Trawić komórki spoczynkowe lub stymulowane przez siedem dni za pomocą 500 jednostek na mililitr roztworu kolagenazy w temperaturze 37 stopni przez trzy godziny. Następnie mechanicznie zeskrob komórki.Przenieś je do plastikowych probówek do mikrowirówek. Przepuść je przez strzykawkę 10 razy. Odwirować próbki o masie 500 g przez pięć minut.Wyrzuć supernatant i zawieś osad komórkowy w 500 mikrolitrach syntetycznej chrząstki chrzęstnej. Przenieś proszki hydroksyapatytu, fluorapatytu i chlorapatytu z butelek na transiluminatorze UV za pomocą szpatułki i użyj jako kontroli. Przenieś lizaty komórkowe z plastikowych probówek za pomocą plastikowych końcówek i ostrożnie umieść na transiluminatorze UV.Zawieś 2,5 miligrama proszków hydroksyapatytu, fluorapatytu i chlorapatytu w 500 mikrolitrach wody dejonizowanej. Inkubować w 37 stopniach przez godzinę. Wyjmij z pudełka kratki Formvar/niklu węglowego za pomocą kleszczyków antystatycznych i umieść je na porcelanowej płytce wielodołkowej.Upuść 10 mikrolitrów zawiesiny hydroksyapatytu na siatki. Zrób to samo dla chlorapatytu i fluorapatytu. Suszyć próbki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Przygotuj spoczynkowe i stymulowane komórki do osadzenia. Zebrać pożywkę z kultur komórkowych. Umyj komórki w fizjologicznym podłożu odczulającym.Utrwalić komórki pięcioma mililitrami mieszaniny 3% paraformaldehydu i 1% aldehydu glutarowego w 100-milimolowym buforze fosforanu sodu przez godzinę w temperaturze pokojowej pod wyciągiem. Umyj komórki pięcioma mililitrami 100-milimolowego buforu fosforanu sodu. Po umyciu delikatnie wyjmij bufor.W ciemnym pomieszczeniu utrwalić próbki dwoma mililitrami 1% tetratlenku osmu w 100-milimolowym buforze fosforanu sodu. Próbki należy inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej pod wyciągiem. Usuń tetratlenek osmu i wykorzystaj go.Umyj komórki pięcioma mililitrami 100-milimolowego buforu fosforanu sodu. Następnie odwodnić próbki w pięciu mililitrowych podwielokrotnościach serii stopniowanych roztworów etanolu w temperaturze pokojowej, 25, 50, 75 i 90% etanolu. Na koniec dwukrotnie użyj etanolu absolutnego i inkubuj przez 30 minut i 12 godzin.Mechanicznie zeskrob komórki z naczyń hodowlanych. Zbierz komórki do plastikowych probówek do mikrowirówek. Odwirować próbki o masie 130 g przez jedną minutę.Usunąć supernatanty. Zawieś ogniwa w mieszaninie żywicy LR White i absolutnego etanolu w stosunku objętościowym od jednego do dwóch. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Odwirować próbki o masie 130 g przez jedną minutę. Usunąć supernatanty. Powtórz poprzedni krok, używając mieszaniny jeden do jednego żywicy LR White i absolutnego etanolu.Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować próbki o masie 130 g przez jedną minutę. Usunąć supernatanty.Dodać czystą żywicę LR White do próbek i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej w plastikowych probówkach. Odwirować próbki o masie 130 g przez jedną minutę. Usunąć supernatanty.Dodaj ponownie czystą żywicę LR White. Umieść 500 mikrolitrów każdej próbki w kapsułkach żelatynowych. Uwaga, próbki są oznaczane za pomocą małego arkusza papieru i ołówka, aby żywica nie zniszczyła etykiet.Zamknij kapsułki żelatynowe. Umieść kapsułki w plastikowych probówkach do mikrowirówek. Wirować przy 130 g przez jedną minutę w odchylanym wirniku.Wyjmij kapsułki z plastikowych tubek za pomocą pompy próżniowej. Przenieś próbki do pieca i polimeryzuj w temperaturze 56 stopni przez 48 godzin. Przygotuj klocki, montując je w uchwycie.Umieść uchwyt w ultramikrotomie. Przymocuj nóż diamentowy. Napełnij go wodą dejonizowaną.Pamiętaj, aby oczyścić ostrze z przypadkowych pęcherzyków powietrza. Następnie wytnij sekcje za pomocą noża diamentowego na dejonizowanej kąpieli wodnej. Ustaw skrawki za pomocą rzęsy bydlęcej.Następnie umieść je po błyszczącej stronie siatki Formvar/niklu węglowego i wysusz. W ciemnym pomieszczeniu przeciwbarwić siatki syntetycznych apatytów i próbek komórkowych 2,5% octanem uranylu w etanolu przez 20 minut w temperaturze pokojowej pod wyciągiem. Umyj kratki w 50% etanolu, a następnie w wodzie dejonizowanej i susz w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.Na koniec włóż kratki do pudełka. Przygotuj uchwyt na beryl do obserwacji minerałów i komórek. Używaj narzędzi antystatycznych.Wykręć parę. Podnieś płytkę berylową i podkładkę berylową z reszty elementu ustalającego. Zamontuj siatkę, błyszczącą stroną do góry, na uchwycie.Ostrożnie umieść podkładkę berylową i płytkę berylową. Mocno przykręć mocujące. Włóż uchwyt do komory próżniowej i włącz pompę próżniową.Po uzyskaniu podciśnienia delikatnie włóż uchwyt do komory obrazowania i włącz wiązkę. Na monitorze fluorescencyjnym ustaw parametry przysłony mikroskopu. Wykonaj korekcję astygmatyzmu obrazu.Ustaw zoom, ostrość, kadr i zrób obraz z transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Przenieś detektor do komory obrazowania. Dostosuj ostrość obrazu w trybie ostrości.Wybierz punkt w próbce do mikroanalizy rentgenowskiej i zbierz widma. Wybierz pierwiastki, takie jak wapń, fluor, chlor i fosfor, aby wykonać mapowanie jonów i wykonaj mapy wybranych pierwiastków. Stymulowane komórki Saosa mineralizowały się bardziej efektywnie niż osteoblasty hFOB.Pod wpływem wzbudzenia światłem UV można zaobserwować tylko fluorapatyty. Lizaty komórkowe HFOB były bardziej fluorescencyjne niż Saos, co sugeruje, że fluorapatyty są bardziej obfite w tych komórkach. Stymulowane komórki Saos wytwarzają więcej pęcherzyków zawierających minerały w porównaniu z komórkami hFOB i spoczynkowymi komórkami Saos.Syntetyczne apatyty miały różne formy mineralne. Zastosowana powyżej procedura wykazała obecność pęcherzyków w komórkach hFOB i Saos w warunkach spoczynku i stymulacji. Czerwone punkty wskazują rozkład wapnia, zielonego fosforu i niebieskiego fluoru.W warunkach stymulowanych stwierdzono silne nakładanie się rozkładów wapnia i fosforu w pęcherzykach wytwarzanych przez komórki Saos oraz między fluorem a fosforem w pęcherzykach wytwarzanych przez komórki hFOB. Podsumowując, nasze odkrycia wskazują, że pęcherzyki są kluczowymi determinantami zarodkowania minerałów, zwłaszcza na poziomie komórkowym. Porównanie pęcherzyków uwalnianych z komórek Saos-2, które mineralizują się wydajniej, oraz pęcherzyków uwalnianych z komórek hFOB 1.19 potwierdza hipotezę, że pęcherzyki macierzyste są pęcherzykami wypełnionymi minerałami.Pozostawia to otwarte pytanie, czy obecność pęcherzyków macierzy jest wymagana do indukowania zarodkowania apatytu i jak może to zmienić mineralizację fizjologiczną na patologiczną.

analysis-minerals-produced-hfob-119-saos-2-cells-using-transmission

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Tutaj prezentujemy protokół, jak określić ilość i rozkład metali w próbce za pomocą synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej. Skupiamy się na komórkach przylegających i opisujemy metodę chemicznego utrwalania w celu przygotowania tej próbki. Następnie opisujemy, jak zamontować i zobrazować próbkę za pomocą synchrotronowego promieniowania rentgenowskiego.

Przygotowanie komórek adherentnych do obrazowania fluorescencji rentgenowskiej metodą utrwalania chemicznego

Opisano zastosowanie tomografii rentgenowskiej z dyspersją energii w skaningowym transmisyjnym mikroskopie elektronowym do scharakteryzowania rozkładów pierwiastków w pojedynczych nanocząstkach w trzech wymiarach.

Tomografia rentgenowska z dyspersją energii do mapowania pierwiastkowego 3D pojedynczych nanocząstek

Ze względu na znaczenie i szerokie zastosowanie palladu, złota i kobaltu w sprzęcie high-tech, ich odzysk i recykling stanowią ważne wyzwanie przemysłowe. Opisany w niniejszym dokumencie system odzysku metali jest prostym, tanim sposobem na skuteczne wykrywanie, usuwanie i odzysk tych metali z kopalni miejskiej.

Wykrywanie i odzyskiwanie palladu, złota i metali kobaltowych z kopalni miejskiej przy użyciu nowatorskich czujników/adsorbentów oznaczonych nanoskalowymi porami w kształcie koła wagonowego

Przedstawiono protokół produkcji mikrochipa do ekstrakcji do fazy stałej wspomaganego dipolem do analizy metali śladowych.

Wytwarzanie mikrochipa do ekstrakcji do fazy stałej wspomaganego dipolem do analizy metali śladowych w próbkach wody

Opisujemy procedurę wykrywania pierwiastków chemicznych obecnych in situ w komórkach ludzkich, jak również ich kwantyfikację in vitro. Metoda ta jest odpowiednia dla każdego typu komórek i jest szczególnie przydatna do ilościowych analiz chemicznych w pojedynczych komórkach po ekspozycji na nanocząstki tlenku metalu in vitro.

In Situ Wykrywanie i kwantyfikacja pojedynczych komórek nanocząstek tlenków metali za pomocą analizy mikrosondy jądrowej

Tutaj demonstrujemy użycie oprogramowania do montażu fluorescencji rentgenowskiej, MAPS, stworzonego przez Argonne National Laboratory do ilościowego oznaczania danych z mikroskopii fluorescencyjnej. Uzyskane dane ilościowe są przydatne do zrozumienia rozkładu pierwiastków i stosunków stechiometrycznych w badanej próbie.

Kwantyfikacja danych fluorescencji rentgenowskiej za pomocą MAPS

Przedstawiamy procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym i analizy składu pierwiastkowego cząstek bemitu w wodzie dejonizowanej za pomocą płynnej skaningowej mikroskopii elektronowej in situ.

In Situ Charakterystyka cząstek bemitu w wodzie przy użyciu ciekłego SEM

Opisujemy konfigurację linii badawczej przeznaczoną do przeprowadzania szybkiej dwuwymiarowej fluorescencji rentgenowskiej i mapowania mikrodyfrakcji rentgenowskiej próbek monokryształów lub proszków za pomocą dyfrakcji Laue (promieniowanie polichromatyczne) lub proszkowej (promieniowanie monochromatyczne). Wynikowe mapy dostarczają informacji o odkształceniu, orientacji, rozkładzie fazowym i odkształceniu plastycznym.

Synchrotronowe obrazowanie mikrodyfrakcji rentgenowskiej i fluorescencji próbek minerałów i skał

Analiza morfologii, składu i rozmieszczenia blaszek rozpuszczających może dostarczyć niezbędnych informacji do zrozumienia procesów geologicznych związanych z wulkanizmem i metamorfizmem. Przedstawiamy nowatorskie zastosowanie APT do charakterystyki takich blaszek i porównujemy to podejście z konwencjonalnym zastosowaniem mikroskopii elektronowej i nanotomografii opartej na FIB.

Tomografia atomowa Analiza rozpuszczonych faz mineralnych

Prezentowany tutaj jest protokół hodowli komórek na membranach z azotku krzemu i zamrażania wgłębnego przed obrazowaniem fluorescencji rentgenowskiej za pomocą synchrotronowej kriogenicznej nanosondy rentgenowskiej. Gdy zapewniona jest tylko nanoanaliza w temperaturze pokojowej, zamrożone próbki można dalej liofilizować . Są to kluczowe kroki w celu uzyskania informacji na temat wewnątrzkomórkowego składu pierwiastków.

Hodowla komórkowa na membranach z azotku krzemu i kriopreparatyka do nanoanalizy synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej

Przedstawiamy ogólny zarys metod mikroanalizy ilościowej do szacowania zajętości zanieczyszczeń i ich stanów chemicznych, wykorzystując zjawiska kanalizacji elektronów w warunkach padającego kołysania wiązką elektronów, które niezawodnie wydobywają informacje o gatunkach mniejszościowych, pierwiastkach lekkich, wolnych miejscach tlenu i innych defektach punktowych/liniowych/płaskich.

Ilościowa analiza miejsc atomowych funkcjonalnych domieszek/defektów punktowych w materiałach krystalicznych za pomocą mikroanalizy wzmocnionej kanałem elektronowym

Poznaj analizę mineralizacji w pęcherzykach komórek kostnych hFOB 1.19 i Saos-2 przy użyciu TEM z mikroanalizą EDX. Ta metoda pozwala badać nukleację apatytów in vitro.

Analiza minerałów wytwarzanych przez ogniwa hFOB 1.19 i Saos-2 przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej z mikroanalizą rentgenowską z dyspersją energii (Wideo) | JoVE Journal

Analiza minerałów wytwarzanych przez ogniwa hFOB 1.19 i Saos-2 przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej z mikroanalizą rentgenowską z dyspersją energii

Przeglądaj więcej filmów