Izolacja i ekstrakcja RNA neuronów, makrofagów i mikrogleju z mózgów larw danio pręgowanego

Ogólnym celem tego protokołu jest wyizolowanie neuronów, makrofagów i mikrogleju z mózgów larw danio pręgowanego oraz ekstrakcja wysokiej jakości RNA w celu przeprowadzenia dalszej analizy, takiej jak qPCR i transkryptomika. Transgeniczne larwy danio pręgowanego są potężnym narzędziem do obrazowania na żywo i dają nam możliwość obserwacji pojedynczych komórek, takich jak mikroglej, w ich środowisku życia w czasie. Jednak, aby uzyskać szczegółowe zrozumienie ich funkcji, musimy zrozumieć ich profil ekspresji genów, a nasz protokół izolacji i sortowania został zaprojektowany w tym celu.

Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona izolować różne typy komórek z ośrodkowego układu nerwowego przy minimalnej modyfikacji ich profilu ekspresji genów, dzięki czemu można scharakteryzować funkcje i właściwości komórek. Skuteczność tego protokołu znajduje odzwierciedlenie w jego skuteczności. Dzięki temu protokołowi można wyprodukować wystarczające ilości RNA w krótkim czasie do różnych dalszych zastosowań.

Po wyhodowaniu zarodków danio pręgowanego w pożywce E3 zawierającej PTU zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego do zbadania larw przy dwóch dpf pod kątem makrofagów GFP-dodatnich i mikrogleju w neuronach DsRED-dodatnich. Aby homogenizować zarodki w jednym punkcie, pięć ml 15 milimolowej Trikainy na 50 ml pożywki do 50 larw w celu przygotowania znieczulenia. Następnie za pomocą pipety Pasteura o pojemności trzech ml przenieś 10 larw na jednorazowo na 55-mililitrową szalkę Petriego wypełnioną lodowatą pożywką E3 z trikainą, aby ostatecznie je znieczulić.

Pod steromikroskopem ustaw 10 larw w środku szalki Petriego, a następnie za pomocą mikronożyczek chirurgicznych przeciąć główki larw powyżej woreczka żółtkowego. Za pomocą pipety Pasteura o pojemności trzech ml zebrać wszystkie głowy i przy użyciu możliwie najmniejszej ilości płynu przenieść je do szklanego homogenizatora na lodzie zawierającego jeden ml lodowatego podłoża A. Wymieniać każdą małą szalkę Petriego zawierającą lodowaty E3 i trikainę na nową co 30 minut, aby upewnić się, że przekrój jest przeprowadzany w zimnym podłożu E3 plus trikaina. Wymień lodowaty nośnik A w szklanym homogenizatorze, gdy kolor zacznie blaknąć.

Po zebraniu całej grupy głów usuń całe podłoże A ze szklanego homogenizatora i zastąp je jednym ml świeżego, lodowatego podłoża A. Gdy homogenizator nadal znajduje się na lodzie, użyj ciasno dopasowanego tłuczka, aby rozbić tkankę mózgową, wykonując 40 rund zgniatania i obrotu dla trzech do pięciu larw dpf i 50 rund dla larw z siedmioma i ośmioma dpf. Następnie dodać dwa ml pożywki A do zawiesiny komórkowej w celu rozcieńczenia komórek i zmniejszenia ich aglomeracji mieliną. Wyeliminuj aglomerację komórek, przepuszczając zawiesinę komórek przez sitko komórkowe o średnicy 40 mikronów do zimnej probówki sokoła o pojemności 50 ml na lodzie.

Powtórz ten krok trzy razy. Przenieść jedną ml porcji zawiesiny komórkowej do zimnych jednopunktowych probówek o pojemności pięciu ml i obracać je w temperaturze 300 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Następnie za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o rozmiarze 23 cali usunąć supernatant.

Za pomocą jednego ml lodowatej pożywki o 22-procentowym gradimencie gęstości delikatnie nałożonej na punkt zerowy pięciu ml lodowatego 1X dbps, delikatnie ponownie zawiesić osad komórkowy. Kręć rurki z prędkością 950 razy g bez przerwy w powolnym przyspieszaniu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Po wirowaniu wyrzuć ośrodek gradientu gęstości dbps w mielinie uwięzionej na ich interfazie.

Następnie użyj pięciu ml pożywki A z dwoma procentami NGS do przemycia komórek i wiruj probówki w temperaturze 300 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Usunąć jak najwięcej supernatantu, a następnie zebrać granulki komórek z tych samych warunków eksperymentalnych razem w jednym ml pożywki A z dwoma procentami NGS. Jeśli interesujące komórki wyrażają białko fluorescencyjne, przepuść zawiesinę komórkową przez 35-mikronową nasadkę sitową do komórek i przenieś je do zimnych probówek FACS o pojemności 5 ml na lodzie chronionym przed światłem.

Aby wybarwić mikroglej immunologicznie, użyj punktu zerowego trzy ml pożywki A plus dwa procent NGS, aby ponownie zawiesić osad komórkowy, a następnie podziel komórki na trzy probówki o jednym przecinku i pięciu ml, jedną dla komórek niebarwionych do pomiaru autofluorescencji, jedną do pomiaru niespecyficznego wiązania przeciwciała drugorzędowego z mikroglejem i trzecią jako test. Do wszystkich probówek dodaj jeden procent wolnego od azydków endotoksyn lub liść, aby zablokować interakcje CD16, CD32 z domeną FC immunoglobulin. Następnie inkubuj komórki przez 10 minut, delikatnie mieszając co pięć minut.

Następnie do trzeciej probówki dodać przeciwciało 4C4 i inkubować je przez 30 minut z delikatnym mieszaniem co 10 minut. Następnie wiruj probówki w temperaturze 300 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Po odrzuceniu supernatantu, przemyć osad raz punktem zerowym pięcioma ml pożywki A plus dwa procent NGS przed ponownym odwirowaniem probówek.

Ponownie zawiesić osad komórkowy z punktem zerowym pięć ml pożywki A plus dwa procent NGS, następnie dodać jeden procent liścia i inkubować komórki przez 10 minut z delikatnym mieszaniem co pięć minut. Do probówek drugiej i trzeciej dodaj przeciwciała wtórne i umieść probówki w ciemności. Po odwirowaniu probówek i odrzuceniu supernatantu, użyć pięciu ml pożywki A plus dwa procent NGS do dwukrotnego przemycia próbek, a następnie ponownie zawiesić granulki komórek z jednym ml pożywki A plus dwa procent NGS.

Przepuść zawiesinę komórek przez 35-mikronową nasadkę sitową i przenieś ją do zimnych probówek FACS o pojemności pięciu ml na lodzie chronionym przed światłem. Na koniec przeprowadź sortowanie FACS i ekstrakcję RNA zgodnie z protokołem tekstowym. W tym badaniu neurony i makrofagi oraz mikroglej wyizolowano z ośmiu larw dpf mpeg1 EGFP-dodatnich NBT ds-red-dodatnich.

FACS użyto do oddzielenia komórek od szczątków w zależności od ich wielkości i ziarnistości. Pojedyncze komórki zostały następnie oddzielone od dubletów lub aglomeratów komórkowych. Z populacji pojedynczych komórek wylosowano bramę w celu wyeliminowania martwych komórek.

Odpowiedni wykres punktowy ujawnił, że ten eksperymentalny protokół zachowuje integralność błony komórkowej, ponieważ odsetek martwych komórek wynosi tylko 26,7 procent. Jak pokazano tutaj, neurony i makrofagi oraz mikroglej zostały łatwo odseparowane od bram populacji żywych komórek. W mózgu populacja neuronów wydawała się być bardziej widoczna niż populacja makrofagów i mikrogleju.

W drugim badaniu sortowanie FACS wykorzystano do wyizolowania żywego mikrogleju z mózgów larw za pomocą 4C4, przeciwciała, które specyficznie znakuje mikroglej. Jak podsumowano w tej tabeli danych dotyczących izolacji mikrogleju i ekstrakcji RNA, liczba mikrogleju w mózgach larw danio pręgowanego jest różna i jest bardzo niska przy trzech dpf. Wreszcie, wyniki ekstrakcji RNA uzyskane w jednym eksperymencie z mikrogleju pięciu larw dpf mózgów danio pręgowanego pokazano w tym śladzie elektroforezy z wyraźną wizualizacją rybosomalnego RNA.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 12 godzin, w zależności od tego, ile głów jest potrzebnych na warunek. Próbując tej procedury, należy pamiętać, aby wszystko było zimne, a powierzchnie czyste, aby uniknąć degradacji RNA. Po opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom w dziedzinie neuronauk wykorzystującym danio pręgowanego jako model do badania profili ekspresji genów różnych komórek w warunkach fizjologicznych i patologicznych.

Po obejrzeniu filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować neurony, makrofagi i mikroglej z mózgów larw danio pręgowanego oraz jak wyodrębnić wysokiej jakości RNA w celu przeprowadzenia dalszej analizy, takiej jak qPCR i transkryptomika.