Zautomatyzowane skanowanie i segmentacja szkiełek w tkankach znakowanych fluorescencyjnie przy użyciu szerokokątnego systemu analizy o wysokiej zawartości
3 maja 2018
Tutaj opisujemy protokół automatycznej segmentacji fluorescencyjnie znakowanych tkanek na szkiełkach przy użyciu systemu analizy o wysokiej zawartości (WHCAS) o szerokim polu. Protokół ten ma szerokie zastosowanie we wszystkich dziedzinach, które obejmują ilościowe oznaczanie markerów fluorescencyjnych w tkankach biologicznych, w tym w naukach biologicznych, inżynierii medycznej i naukach o zdrowiu.
Ogólnym celem tej metody obrazowania i analizy jest wygenerowanie łatwego do skonfigurowania przepływu pracy dla automatycznej segmentacji dowolnej znakowanej fluorescencyjnie próbki tkanki zamontowanej na szkiełku. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nauk biologicznych dotyczące tego, ile danego białka znajduje się w określonym obszarze próbki tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Główną zaletą tej techniki jest to, że można zaoszczędzić protokoły optymalizacji czasu dla automatycznej segmentacji, co pozwala na zastosowanie tej metody do kolejnych znakowanych fluorescencyjnie próbek tkanek montowanych na szkiełku.
Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy musieliśmy określić ilościowo nowe komórki w tkance mózgowej w dużym powiększeniu. Po zaimportowaniu kropek otwórz okno dialogowe Ustawienia pobierania płyty, a następnie otwórz kartę Cel i kamera. Ustaw powiększenie na cztery razy, kamerę na jeden, a wzmocnienie na dwa.
Otwórz zakładkę Skanowanie szkiełek i wprowadź odpowiednie ustawienia eksperymentalne. Na karcie Miejsca do odwiedzenia wypełnij studzienki równomiernie z miejscami i otwórz kartę Edytuj ustawienia dna płyty, aby wprowadzić odpowiednie wartości eksperymentalne. Po zapisaniu tych ustawień jako Ustawienie A otwórz kartę Obiektyw i kamera i ustaw Powiększenie na 40 razy, Kamera w binning na jeden, a Wzmocnienie na dwa.
Upewnij się, że wszystkie ustawienia na kartach Skanowanie szkiełek płytowych i edycja ustawień dna płyty są takie same, jak wprowadzone w ustawieniu A. I otwórz kartę Pętla akwizycji. Wprowadź liczbę długości fal obecnych w próbce i zaznacz opcje Włącz ogniskowanie laserowe i Włącz ogniskowanie na podstawie obrazu. Następnie zapisz te ustawienia jako Ustawienie B. Następnie umieść do trzech szkiełek nakrywkowych, szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w dół z etykietą z boku wycięcia w adapterze do prowadnic.
I naciśnij F4, aby otworzyć menu główne. Wybierz opcję Slide Scanning (Skanowanie slajdów) i kliknij przycisk Open Door Eject Slide (Wysuwanie suwaka otwierania drzwi), aby włożyć adapter suwaka do systemu analizy wysokiej zawartości w szerokim polu. Następnie kliknij przycisk Zamknij suwak załadunku drzwi.
Aby rozpocząć, upewnij się, że wybrano odpowiednią długość fali. Przechodź do różnych witryn w obrębie obrazu obiektu na żywo, aż zostanie zlokalizowany obszar zainteresowania. Skup się na regionie.
Jeśli nie jest ostry, użyj przycisku Autofokus lub dostosuj rozmiar kroku, aż stanie się ostry. Użyj opcji Przyciągaj, aby przechwycić obraz, jeśli ręcznie dostosowujesz ostrość, zmieniając rozmiar kroku. Aby skonfigurować poprzednie skanowanie, najpierw załaduj ustawienie A i wybierz opcję Podgląd slajdów.
Wskaż liczbę slajdów i wybierz przycisk OK. Wybierz cztery razy jako powiększenie. Następnie wybierz opcję Szkiełko nakrywkowe w dół i kontynuuj wybieranie ustawień podstawowych dla poprzedniego skanowania. Upewnij się, że zarówno ustawienie akwizycji, jak i kalibracje są zaznaczone przed wybraniem opcji Anuluj i naciśnięciem przycisku Kontynuuj.
Na karcie W1: DAPI kliknij Na żywo, a następnie Automatyczna ekspozycja, a następnie Snap. Następnie naciśnij Zamknij. Wybierz katalog i wprowadź nazwę poprzedniego skanowania.
Automatycznie pojawi się okno dialogowe Rysuj region. Użyj narzędzia Region prostokątny, aby zaznaczyć cały poprzedni region skanowania i kliknij przycisk Kontynuuj. Pod koniec poprzedniego skanowania załaduj ustawienie B i otwórz kartę Witryny do odwiedzenia.
Aby rozpocząć, upewnij się, że wybrano odpowiednią długość fali. Przechodź do różnych witryn w obrębie obrazu obiektu na żywo, aż zostanie zlokalizowany obszar zainteresowania. Skup się na regionie.
Jeśli nie jest ostry, użyj przycisku Autofokus lub dostosuj rozmiar kroku, aż stanie się ostry. Użyj opcji Przyciągaj, aby przechwycić obraz, jeśli ręcznie dostosowujesz ostrość, zmieniając rozmiar kroku. Następnie na karcie W1 DAPI kliknij opcję Auto Exposure (Automatyczna ekspozycja) i potwierdź, że obraz Plate Acquisitions Snap DAPI jest wyraźny.
W menu głównym kliknij pozycję Dziennik i wybierz opcję Uruchom dziennik z menu rozwijanego. Kliknij dwukrotnie dziennik ustawień akwizycji regionu slajdu, aby go uruchomić, a następnie kliknij przycisk Kontynuuj, gdy pojawi się okno dialogowe Konfiguracja akwizycji regionu slajdu. Po wyświetleniu instrukcji wybierz opcję DAPI Scan, aby wybrać obraz slajdu w małym powiększeniu i kliknij przycisk OK. Po wyświetleniu monitu o przyciągnięcie do akwizycji blachy podświetl przyciąganie do akwizycji blachy-DAPI i kliknij przycisk OK. Gdy pojawi się pole Utwórz lub załaduj regiony, użyj narzędzia Region prostokątny, aby wybrać obszary zainteresowania w skanowaniu DAPI, a następnie kliknij przycisk Kontynuuj.
Korzystając z narzędzia lokalizatora, zaznacz interesujący Cię region i kliknij przycisk Kontynuuj w oknie dialogowym Wybieranie regionu. Gdy pojawi się okno Potwierdź regiony, kliknij przycisk Kontynuuj i zdecyduj, czy region ma zostać zapisany, gdy pojawi się okno dialogowe Zapisz regiony. Pojawią się trzy okna dialogowe.
Kliknij przycisk Kontynuuj, aby zamknąć pole Konfiguracja zakończona. Aby wyeliminować zgadywanie podczas znajdowania przykładowej witryny, upewnij się, że na karcie Ustawienia wyświetlania jest zaznaczona opcja Wyświetlaj obrazy podczas akwizycji i otwórz kartę Podsumowanie, aby kliknąć opcję Uzyskaj płytę, aby ustawić scenę wstępnie wybranego obszaru zainteresowania. Gdy kamera przesunie się nad witrynę zawierającą interesujące Cię komórki, kliknij przycisk Anuluj, aby zatrzymać pobieranie obrazu.
Nie przejmuj się, jeśli obraz jest nieostry. Ten krok ma na celu wyłącznie ustawienie etapu pierwszej witryny w wybranym przez Ciebie regionie. Upewnij się, że stolik znajduje się nad próbką i że poprawnie wprowadzono liczbę lokalizacji.
Zoptymalizuj ustawienia długości fali, aby upewnić się, że uzyskano ostrość obrazu o wysokim zakresie dynamiki. Następnie ponownie otwórz kartę Podsumowanie i kliknij przycisk Pobierz płytę. Na końcu analizy wybierz kartę Wyświetlanie.
W menu rozwijanym Nakładka obrazu wybierz opcję Pokaż informacje o studni, aby wyświetlić numery witryn w lewym górnym rogu. Przewiń witryny i wyklucz wszelkie miejsca, które są nieostre i/lub zawierają fałdy tkankowe lub pęcherzyki i rozdarcia w tkance. Na tym reprezentatywnym obrazie pokazane są miniatury wszystkich miejsc w zdefiniowanym regionie zainteresowania w dużym powiększeniu.
Każda witryna powinna zostać poddana przeglądowi w celu zidentyfikowania witryn, które powinny zostać wyłączone z analizy. Na przykład w tym eksperymencie ośrodek 149 był poza polem widzenia, ośrodek 219 miał bąbelki, a ośrodek 54 zawierał fałdę. Wszystkie trzy z tych miejsc zostały wyłączone z analizy.
W tym przypadku odpowiednie nakładki wygenerowane przez moduł punktacji komórek o wielu długościach fal pokazują wyniki automatycznej segmentacji przeprowadzonej w ośrodku 59 zgodnie ze specyfikacjami eksperymentalnymi. Po segmentacji można uzyskać dane ilościowe dotyczące odsetka komórek barwiących się dodatnio dla każdego markera, obu markerów, braku markerów, średniej barwionej powierzchni i średniej intensywności fluorescencji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować system analizy szerokiego pola o wysokiej zawartości, aby stworzyć zautomatyzowany przepływ pracy do obrazowania i segmentacji próbki tkanki zamontowanej na szkiełku.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół automatycznej segmentacji tkanek znakowanych fluorescencyjnie z wykorzystaniem systemu szerokopolowej analizy wysokoprzepustowej (WHCAS). Metoda ta usprawnia kwantyfikację markerów fluorescencyjnych w tkankach biologicznych, znajdując zastosowanie w różnych dziedzinach, w tym w naukach biologicznych i inżynierii medycznej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nauki biologiczne
- Inżynieria medyczna
- Nauki o zdrowiu
Wstęp
- Automatyczna segmentacja usprawnia analizę tkanek znakowanych fluorescencyjnie.
- Systemy analizy wysokoprzepustowej (high-content analysis) ułatwiają szczegółowe obrazowanie próbek biologicznych.
- Ilościowe oznaczanie białek w próbkach tkanek jest kluczowe dla zrozumienia procesów biologicznych.
- Metoda ta została opracowana w celu rozwiązania problemów związanych z kwantyfikacją nowych komórek w tkance mózgowej.
Cel badania
- Stworzenie wydajnego procesu automatycznej segmentacji próbek tkanek.
- Poprawa dokładności i szybkości kwantyfikacji markerów fluorescencyjnych.
- Opracowanie zestandaryzowanego protokołu możliwego do zastosowania w różnych typach tkanek.
Zastosowane metody
- Konfiguracja systemu analizy wysokotreściowej w szerokim polu do obrazowania.
- Konfiguracja ustawień eksperymentalnych w celu optymalizacji obrazowania.
- Wykorzystanie narzędzi programowych do akwizycji i analizy obrazów.
- Wdrożenie autofokusu oraz technik ustawiania ostrości na podstawie obrazu.
Główne wyniki
- Osiągnięto pomyślną segmentację tkanek znakowanych fluorescencyjnie.
- Obrazowanie przy dużym powiększeniu pozwoliło na uzyskanie szczegółowego widoku próbek tkanek.
- Obszary zainteresowania zostały precyzyjnie zidentyfikowane i przeanalizowane.
- Ustalono kryteria wykluczania obrazów nieostrych lub uszkodzonych.
Wnioski
- Zautomatyzowany protokół segmentacji znacznie skraca czas analizy.
- Metodę tę można zastosować do szerokiej gamy tkanek biologicznych.
- Przyszłe zastosowania mogą usprawnić badania w różnych dziedzinach nauki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zautomatyzowane skanowanie i segmentacja preparatów z wykorzystaniem systemu szerokopolowej analizy wysokotreściowej (WHCAS) rozwiązują problem wąskiego gardła w kwantyfikacji markerów fluorescencyjnych w dużych przekrojach tkanek, umożliwiając powtarzalną analizę wysokoprzepustową w celu walidacji celów oraz opracowywania testów. Dzięki standaryzacji procesów akwizycji obrazów i segmentacji, metoda ta ogranicza zmienność i przyspiesza przedkliniczną ocenę biomarkerów tkankowych, wspierając podejmowanie decyzji go/no-go w oparciu o dane na wczesnym etapie odkrywania.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określanie wzorców ekspresji białek w tkankach istotnych dla przebiegu choroby.
- Wartość operacyjna: Skraca czas poświęcany na optymalizację protokołów dla poszczególnych eksperymentów, co pozwala na szybkie zastosowanie metody w odniesieniu do wielu celów znakowanych fluorescencyjnie.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki spójnym, ilościowym odczytom lokalizacji markerów i poziomów ich ekspresji.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych analiz przesiewowych poprzez generowanie zestandaryzowanych, segmentowanych obrazów tkanek odpowiednich do testów wysokoprzepustowych (high-content assays).
- Wartość operacyjna: Zwiększa standaryzację i powtarzalność testów dzięki zautomatyzowanemu wyborowi obszarów oraz wykluczaniu miejsc uszkodzonych (np. tkanek nieostrych, złożonych lub z pęcherzykami powietrza).
- Skalowalność: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy dla różnych markerów i typów tkanek dzięki gotowym modułom oprogramowania do analizy lokalizacji białek, proliferacji, żywotności, apoptozy oraz angiogenezy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: zapewnia spójność od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, dostarczając ilościowych danych na temat proporcji komórek wykazujących pozytywną reakcję z markerem, średniej powierzchni zabarwienia oraz intensywności fluorescencji.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: wspiera podejmowanie decyzji przedklinicznych poprzez dostarczanie wiarygodnych zestawów danych z filtrowaniem elementów wykluczających, które odzwierciedlają rzeczywisty sygnał biologiczny.
- System istotny dla jednostki chorobowej: wykazana przydatność w analizie tkanek guzów mózgu, z możliwością rozszerzenia na dowolny fluorescencyjnie znakowany marker jądrowy lub cytoplazmatyczny w tkankach zamontowanych na szkiełkach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesów odkrywania leków – od wczesnego etapu odkrywania, przez identyfikację związku wiodącego, aż po badania przedkliniczne – umożliwiając standaryzowaną analizę tkanek na każdym z tych etapów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez kwantyfikację ekspresji markerów w określonych, interesujących regionach tkanek.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość analizy dzięki zautomatyzowanej segmentacji i wynikom ilościowym, które umożliwiają wiarygodną ocenę związków w wielu ośrodkach.
- Analityka: Generuje mierzalne odczyty, w tym proporcję komórek pozytywnych, średnią powierzchnię zabarwienia oraz średnią intensywność fluorescencji, co umożliwia porównania między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez dostarczanie ilościowych danych tkankowych zgodnych z biomarkerami, odpowiednich do badań walidacyjnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako zasób wielokrotnego użytku w różnych projektach, wykorzystując gotowe moduły oprogramowania i zapisane ustawienia (Ustawienie A i B) w celu zapewnienia spójnego skanowania i segmentacji preparatów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: zwiększenie pewności predykcyjnej w walidacji celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w testach opartych na tkankach.
- Wartość operacyjna: standaryzacja, powtarzalność i skalowalność procesów obrazowania oraz analizy tkanek.
- Wartość strategiczna: usprawnienie decyzji typu go/no-go, efektywność kapitałowa dzięki skróceniu czasu optymalizacji protokołów oraz niższe ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje dotyczące dalszego rozwoju oparte na ilościowych danych tkankowych zwalidowanych metodą wykluczenia.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obsłudze systemu do szerokopolowej analizy wysokotreściowej oraz w nawigacji po powiązanym oprogramowaniu.
- Zależność od aparatury umożliwiającej skanowanie preparatów, akwizycję wielodługościową oraz ostrzenie oparte na laserze i obrazie.
- Konieczność międzyzespołowej standaryzacji ustawień akwizycji (np. powiększenia, binningu, wzmocnienia) oraz protokołów definiowania obszarów zainteresowania.
- Konieczność uwzględnienia adaptacji przy stosowaniu metody do różnych typów tkanek, poziomów ekspresji markerów lub grubości preparatów.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak potrzeba ręcznego wykluczania miejsc z artefaktami (np. obrazów nieostrych, zagięć tkanki, pęcherzyków powietrza) mimo zautomatyzowanej akwizycji.
