Identyfikacja receptora dopaminowego D1-alfa w jądrze półleżącym gryzoni za pomocą innowacyjnej technologii wykrywania RNA in situ
27 marca 2018
Identyfikacja receptora D1-alfa dopaminy w jądrze półleżącym jest kluczowa dla wyjaśnienia dysfunkcji receptora D1 podczas choroby ośrodkowego układu nerwowego. Przeprowadziliśmy nowatorski test hybrydyzacji RNA in situ, aby uwidocznić pojedyncze cząsteczki RNA w określonym obszarze mózgu.
Ogólnym celem tego nowatorskiego testu hybrydyzacji RNA in situ jest wizualizacja pojedynczych cząsteczek RNA w określonym obszarze mózgu, które mają kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia dysfunkcji dopaminergicznej podczas choroby ośrodkowego układu nerwowego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak nieprawidłowości dopaminergiczne pośredniczące w reakcjach behawioralnych i modulujące funkcję pamięci roboczej. Główną zaletą tej metody jest to, że zapewnia ona nowatorską technikę hybrydyzacji in-situ w celu zbadania dysfunkcji układu dopaminowego podczas progresji chorób ośrodkowego układu nerwowego.
Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w ogólne poziomy ekspresji docelowego mRNA w danym regionie mózgu, można ją również zastosować do określenia, w jaki sposób transkrypty mRNA są rozmieszczone w komórkach danego regionu. Aby rozpocząć tę procedurę, w ciągu pięciu minut po pobraniu mózgu dorosłego szczura, zanurz go w ciekłym azocie na 15 sekund. Następnie utrzymuj równowagę mózgu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w kriosacie przez godzinę.
Po godzinie wytnij 30-mikronowe odcinki zawierające jądro półleżące od 2,76 milimetra do 2,28 milimetra przed bregmą i zamontuj je na szkiełkach. Następnie susz skrawki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie zanurz szkiełka we wstępnie schłodzonym 4% paraformaldehydzie na godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnie umieść szkiełka w rosnącym gradiencie etanolu w temperaturze pokojowej, a następnie przenieś szkiełka do świeżego 100% etanolu na kolejne pięć minut. Następnie umieść szkiełka na bilecie chłonnym, aby umożliwić wyschnięcie na powietrzu. Narysuj barierę wokół każdej sekcji za pomocą pisaka barierowego.
Pozostaw barierę do całkowitego wyschnięcia na jedną minutę. Aby wstępnie potraktować sekcje mózgu, włącz piekarnik i ustaw temperaturę na 40 stopni Celsjusza. Dodaj trzy krople odczynnika przed leczeniem na każdą sekcję mózgu.
Następnie inkubuj skrawki przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zanurz szkiełka w 1X PBS na jedną minutę w temperaturze pokojowej i przenieś szkiełka do świeżego 1X PBS na kolejną minutę. Slajdy nie powinny pozostawać w 1X PBS dłużej niż 15 minut.
Aby uruchomić test multipleksowy, ogrzej sondę docelową przez 10 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza w łaźni wodnej, a następnie ostudź do temperatury pokojowej. Umieść odczynnik RNA w temperaturze pokojowej. Usuń nadmiar płynu z szkiełek za pomocą chłonnego papieru i umieść je z powrotem na stojaku na szkiełka.
Następnie dodaj trzy krople Drd1alpha jako sondę na każdy wycinek próbki i inkubuj próbki przez dwie godziny w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Następnie umyj szkiełka w buforze do mycia 1X przez dwie minuty w temperaturze pokojowej dwukrotnie. Następnie usuń nadmiar płynu z szkiełek za pomocą chłonnego papieru i umieść je z powrotem na stojaku na szkiełka.
Nie pozwól, aby sekcje mózgu wyschły między etapami inkubacji. Dodaj trzy krople AMP 1FL na każdy plasterek próbki i inkubuj próbki przez 30 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Następnie umyj szkiełka dwukrotnie w buforze do mycia 1X przez dwie minuty za każdym razem w temperaturze pokojowej.
Następnie usuń nadmiar płynu z szkiełek za pomocą chłonnego papieru i umieść je z powrotem na stojaku na szkiełka. Następnie dodaj trzy krople AMP 2FL na każdy plasterek próbki. Próbki należy inkubować przez 15 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza.
Następnie zanurz szkiełka w buforze myjącym 1X na dwie minuty dwukrotnie w temperaturze pokojowej. Usuń nadmiar płynu z szkiełek za pomocą chłonnego papieru i umieść je z powrotem na stojaku na szkiełka. Dodaj trzy krople AMP 3FL na każdy plasterek próbki i inkubuj próbki przez 30 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza.
Następnie umyj szkiełka w buforze do mycia 1X przez dwie minuty w temperaturze pokojowej dwukrotnie. Usuń nadmiar płynu z szkiełek za pomocą chłonnego papieru i umieść je z powrotem na stojaku na szkiełka. Następnie dodaj trzy krople AMP 4FL ALT A na każdy plasterek próbki i inkubuj próbki przez 15 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza.
Umyj szkiełko w buforze do mycia 1X przez dwie minuty w temperaturze pokojowej dwa razy. Usuń nadmiar płynu ze szkiełek i natychmiast umieść dwie krople odczynnika montażowego na każdej sekcji. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 milimetry na 22 milimetry na każdej sekcji mózgu.
Następnie przechowuj szkiełka w ciemności w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza, aż wyschną. Aby uzyskać obrazowanie, włącz mikroskop konfokalny i przełącz się na obiektyw 60X. Uzyskaj obrazy stosu Z i uzyskaj obrazy komórek znakowanych Drd1alpha w regionie jądra półleżącego.
W przypadku obrazów z jądra półleżącego, które wykazywały dyskretny wzór barwienia kropek, dynamiczny zakres ekspresji oceniono za pomocą analizy półilościowej. Każda komórka została oceniona od zera do dziewięciu na podstawie liczby kropek na komórkę. Ta hybrydowa metoda oceny sygnału może zatem ocenić zakres i zmienność ekspresji Drd1alpha w poszczególnych komórkach.
Oto reprezentatywne obrazy konfokalne ekspresji Drd1alpha u samców i samic szczurów, które mają dyskretny wzór barwienia kropkami. Aby uwzględnić zagnieżdżoną strukturę danych, średnie wartości zliczania zostały obliczone dla każdej kategorii i wykorzystane do analizy statystycznej. Przeprowadzono test U Manna-Whitneya w celu oceny różnic w medianie liczby komórek u samców i samic szczurów.
Częstość komórek w każdej kategorii jest analizowana przy użyciu częstotliwości względnej i częstotliwości skumulowanej. Samice wykazywały znaczącą zmianę w rozmieszczeniu z większą częstością komórek w niższych kategoriach rzędu w porównaniu z samcami. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki sugerują wyraźne różnice płci w ekspresji Drd1alpha w jądrze półleżącym.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu siedmiu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkiej pracy, ponieważ zmiany temperatury lub wysychanie tkanki mogą uszkodzić mRNA i utrudnić nam uzyskanie wiarygodnego sygnału. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać technikę hybrydyzacji in-situ w tkankach korowych, fluorescencyjnie obrazować transkrypty mRNA sygnału w wybranych regionach mózgu i scharakteryzować rozkład transkryptów mRNA do analizy statystycznej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie identyfikuje receptor dopaminergiczny D1-alpha w jądrze półleżącym z wykorzystaniem nowatorskiego testu hybrydyzacji RNA in situ, który umożliwia wizualizację pojedynczych cząsteczek RNA. Celem badań jest wyjaśnienie dysfunkcji dopaminergicznych związanych z chorobami ośrodkowego układu nerwowego oraz zbadanie, w jaki sposób nieprawidłowości te wpływają na zachowanie i pamięć roboczą.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Neurofarmakologia
- Biologia molekularna
Wprowadzenie
- Receptory dopaminy odgrywają kluczową rolę w modulowaniu funkcji neuronalnych.
- Dysfunkcja receptorów D1 jest powiązana z różnymi zaburzeniami ośrodkowego układu nerwowego.
- Zrozumienie rozmieszczenia receptorów może pomóc w wyjaśnieniu deficytów behawioralnych i poznawczych.
- Techniki hybrydyzacji in situ są niezbędne do badania ekspresji mRNA w konkretnych obszarach mózgu.
Cel badania
- W celu wizualizacji rozkładu RNA w jądrze półleżącym.
- W celu zidentyfikowania nieprawidłowości w ekspresji receptorów dopaminy.
- W celu przyczynienia się do zrozumienia reakcji behawioralnych i funkcji pamięci operacyjnej.
Zastosowane metody
- Wykorzystano nową metodę hybrydyzacji in situ RNA.
- Wyizolowano mózgi dorosłych szczurów i przygotowano z nich preparaty na szkiełkach.
- Metoda ta umożliwia wizualizację rozmieszczenia mRNA na poziomie pojedynczych komórek.
- Do obrazowania w celu analizy wzorców ekspresji Drd1alpha zastosowano mikroskopię konfokalną.
Główne wyniki
- W jądrze półleżącym zaobserwowano istotne różnice płciowe w ekspresji Drd1alpha.
- Badanie wykazało wyraźne wzorce dystrybucji RNA, z zastosowaniem metody punktowej do oceny poziomów ekspresji.
- Wyniki sugerują istotne znaczenie dla zrozumienia dysfunkcji dopaminergicznej w kontekstach behawioralnych.
Wnioski
- Technika ta umożliwia wysokorozdzielcze badanie ekspresji receptorów i rozmieszczenia mRNA.
- Wyniki mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia różnic związanych z płcią w funkcji dopaminergicznej oraz w chorobach OUN.
- Wnioski mają istotne znaczenie zarówno dla podstawowych badań z zakresu neuronauki, jak i dla potencjalnych strategii terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta technika hybrydyzacji RNA in situ umożliwia wizualizację pojedynczych transkryptów mRNA w określonych obszarach mózgu, wspierając walidację celu w szlakach dopaminergicznych. Poprzez rozdzielenie specyficznych dla płci wzorców ekspresji Drd1alpha w jądrze półowianym, metoda ta pozwala na mechanistyczne zmniejszenie ryzyka w programach poszukiwania leków ukierunkowanych na OUN. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych poprzez powiązanie rozkładu receptorów z fenotypami behawioralnymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez mapowanie ekspresji RNA Drd1alpha w obwodach nagrody.
- Wartość operacyjna: Umożliwia biologiczną redukcję ryzyka dzięki ilościowej ocenie heterogeniczności receptorów.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację zależnego od płci zaangażowania celu.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane układy biologiczne do dalszego przesiewu modulatorów dopaminergicznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowane, powtarzalne wyniki poprzez półilościową ocenę kropek (dot scoring).
- Skalowalność: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy w modelach chorób OUN wymagających przestrzennej rozdzielczości transkrypcyjnej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Jest zgodna z systemami istotnymi dla chorób poprzez badanie dysfunkcji dopaminergicznej w ścieżkach pamięci operacyjnej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej dzięki spójnej detekcji mRNA.
- Łagodzenie ryzyka: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez wyjaśnienie zmienności ekspresji celu.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, gdzie rozdzielczość transkrypcji przestrzennej pozwala określić stopień pewności co do celu terapeutycznego przed identyfikacją związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez powiązanie dystrybucji Drd1alpha z fenotypami behawioralnymi w NAc.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie analizy dzięki ilościowym pomiarom ekspresji na poziomie komórkowym.
- Analityka: Generuje wyniki statystyczne (test U Manna-Whitneya, rozkłady częstotliwości) w celu porównania różnych warunków.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie specyficznych dla płci odpowiedzi dopaminergicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako powtarzalna metoda mapowania dowolnego mRNA celu w OUN w utrwalonej tkance.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: pewność predykcyjna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w sygnalizacji dopaminergicznej.
- Wartość operacyjna: standaryzacja, powtarzalność i skalowalność w obrębie różnych obszarów mózgu oraz gatunków.
- Wartość strategiczna: lepsze decyzje go/no-go, efektywność kapitałowa i zmniejszone ryzyko biologiczne w późnych etapach programów CNS.
- Wpływ na portfolio: priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje dotyczące rozwoju oparte na wierności ekspresji celu.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie histologii, pracy z RNA oraz obrazowania konfokalnego.
- Zależność od dostępu do kriostatu, ciekłego azotu oraz infrastruktury mikroskopii fluorescencyjnej.
- Konieczność standaryzacji międzyzespołowej w zakresie projektowania sond i kwantyfikacji sygnału.
- Rozważania dotyczące adaptacji obejmują czas fiksacji tkanki i efektywność permeabilizacji w różnych modelach.
- Ograniczenia praktyczne obejmują ryzyko degradacji RNA wskutek wahań temperatury lub wysychania podczas procesowania.
