Name: Identyfikacja receptora dopaminowego D1-alfa w jądrze półleżącym gryzoni za pomocą innowacyjnej technologii wykrywania RNA in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Poznaj nową technikę hybrydyzacji in situ RNA do wizualizacji pojedynczych cząsteczek RNA w mózgu szczura. Metoda umożliwia badanie ekspresji receptora dopaminowego D1-alfa w jądrze półleżącym i analizę różnic między płciami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Obecne prace były wspierane przez granty National Institutes of Health (NIH) HD043680, MH106392, DA013137 i NS100624. Częściowe finansowanie pochodziło z grantu szkoleniowego NIH T32 w zakresie nauk biomedyczno-behawioralnych.

Protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) na Uniwersytecie Południowej Karoliny (numer federalny: A3049-01).
1. Przygotowanie świeżo zamrożonych sekcji mózgu
<ol>
	<li>Użyj szczepu szczurów F344/N: trzy szczury każdej płci, w wieku 13 miesięcy, masa ciała około 320 g.</li>
	<li>Dostosować stężenie sewofluranu do 5% (przedawkowanie sewofluranu). Ekspozycję na sewofluran należy kontynuować po zatrzymaniu oddechu na dodatkową minutę.</li>
	<li>Odetnij głowę szczurowi i usuń mózg.</li>
	<li>Zanurz mózg szczura w ciekłym azocie na 15 s w ciągu 5 minut od pobrania tkanek.</li>
	<li>Wyrównać temperaturę mózgu do -20 °C w kriosacie przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wyciąć odcinki 30 μm i przenieść na szkiełka (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Wybierz sekcje z obszaru jądra półleżącego, około 2,76 mm do 2,28 mm przed Bregma14.</li>
	<li>Nieprzerwanie przecinaj mózg szczura od opuszki węchowej przez obszar jądra półleżącego zgodnie ze stereotaktyczną strukturą mózgu szczura.</li>
	<li>Zamontuj próbki na szkiełkach. Przechowywać sekcje w temperaturze -20 °C przez 10 minut do wyschnięcia.</li>
	<li>Preparaty należy natychmiast zanurzyć we wstępnie schłodzonym 4% paraformaldehydzie na 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umieść szkiełka w rosnącym gradiencie etanolu w temperaturze pokojowej (RT): 50% EtOH przez 5 min; 70% EtOH przez 5 min; i 100% EtOH przez 5 min.</li>
	<li>Powtórz ze świeżym 100% EtOH.</li>
	<li>Umieść szkiełka na chłonnym papierze i wysusz na powietrzu.</li>
	<li>Narysuj barierę wokół każdej sekcji za pomocą pisaka barierowego (patrz Tabela materiałów). Pozostaw barierę do całkowitego wyschnięcia na 1 minutę.</li>
</ol>
2. Wstępne leczenie wycinków mózgu
<ol>
	<li>Włącz piekarnik i ustaw temperaturę na 40 °C.</li>
	<li>Dodać 3 krople (90 μl) odczynnika Pretreatment 4 (patrz tabela materiałów) na każdą sekcję mózgu (po jednej sekcji na szkiełku).</li>
	<li>Inkubować sekcje przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zanurz szkiełka w 1x PBS na 1 minutę przy RT. Powtórz ze świeżymi 1x PBS. 
	UWAGA: Slajdy nie powinny pozostawać w 1x PBS dłużej niż 15 minut.</li>
</ol>
3. Test multipleksowy fluorescencyjny RNA in situ
<ol>
	<li>Podgrzewać sondę docelową przez 10 minut w temperaturze 40 °C w łaźni wodnej, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Umieść odczynnik RNA (np. Amp 1-4 FL) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń nadmiar płynu z szkiełek za pomocą chłonnego papieru i umieść z powrotem na stojaku na szkiełka (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Dodać 3 krople (90 μl) sondy Drd1α (C1) na wycinek próbki. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 40 °C.</li>
	<li>Zanurz szkiełka w 1x buforze do płukania na 2 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórz ze świeżym 1x buforem do płukania.</li>
	<li>Usuń nadmiar płynu ze szkiełek za pomocą chłonnego papieru i umieść z powrotem na stojaku na szkiełka (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Dodać 3 krople (90 μl) Amp 1-FL na wycinek próbki. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 40 °C.</li>
	<li>Zanurz szkiełka w 1 buforze do płukania na 2 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórz ze świeżym buforem 1wash.</li>
	<li>Usuń nadmiar płynu ze szkiełek za pomocą chłonnego papieru i umieść z powrotem na stojaku na szkiełka (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Dodać 3 krople (90 μl) Amp 2-FL na wycinek próbki. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 40 °C.</li>
	<li>Zanurz szkiełka w 1x buforze do płukania na 2 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórz ze świeżym 1x buforem do płukania.</li>
	<li>Usuń nadmiar płynu ze szkiełek za pomocą chłonnego papieru i umieść z powrotem na stojaku na szkiełka (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Dodać 3 krople (90 μl) Amp 3-FL na próbkę. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 40 °C.</li>
	<li>Zanurz szkiełka w 1x buforze do płukania na 2 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórz ze świeżym 1x buforem do mycia.</li>
	<li>Usuń nadmiar płynu ze szkiełek za pomocą chłonnego papieru i umieść z powrotem na stojaku na szkiełka (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Dodaj 3 krople (90 μl) Amp 4-FL-Alt A na wycinek próbki. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 40 °C.</li>
	<li>Zanurz szkiełka w 1x buforze do płukania na 2 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórz ze świeżym 1x buforem do płukania.</li>
	<li>Usuń nadmiar płynu z szkiełek i natychmiast umieść 2 krople odczynnika montażowego (patrz Tabela materiałów) na każdą sekcję.</li>
	<li>Umieścić szkiełko nakrywkowe o grubości 22 mm i średnicy 22 mm (patrz Tabela materiałów) na każdym fragmencie mózgu.</li>
	<li>Szkiełka należy przechowywać w ciemności w temperaturze 2-8 °C do czasu wyschnięcia.</li>
	<li>Włącz mikroskop konfokalny i przełącz się na obiektyw 60X.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy stosu Z za pomocą mikroskopu konfokalnego. Zobacz film dodatkowy, aby zapoznać się ze szczegółową procedurą obrazowania konfokalnego.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy komórek znakowanych Drd1α w regionie jądra półleżącego (wzbudzenie: 488 nm; Emisja: 515/30 nm). 
	UWAGA: Nie pozwól, aby sekcje mózgu wyschły między etapami inkubacji.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Półilościowo przeanalizuj wzór barwienia: "dyskretne kropki".
	<ol>
		<li>Aby zidentyfikować pojedynczą komórkę na obrazie, wykonaj barwienie DAPI jako marker jądrowy. Jednak nadal trudno jest analizować niektóre części tkanki mózgowej, ponieważ ma ona wiele typów komórek o nieregularnym kształcie jąder i / lub komórek. Tutaj dwóch doświadczonych badaczy osobno przypisuje każdą komórkę z obrazów, aby zdefiniować region komórki.</li>
		<li>Wizualnie oceń każdą komórkę w reprezentatywnych obrazach konfokalnych na podstawie liczby punktów na komórkę, korzystając z określonych kryteriów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Określ całkowitą liczbę komórek w każdej kategorii i podziel przez całkowitą liczbę komórek x100, aby utworzyć względne wykresy częstości, które wyświetlają procentową częstość komórek w każdej kategorii dla wszystkich sekcji tkanek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A) oraz osobno dla mężczyzn i kobiet (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2E).</li>
		<li>Podziel sumę komórek we wszystkich poprzednich kategoriach przez całkowitą liczbę komórek x100, aby określić skumulowaną częstość komórek dla wszystkich odcinków tkanki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B) oraz osobno dla mężczyzn i kobiet (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2F).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizuj statystycznie wzór barwienia "dyskretne kropki" (opcjonalnie).
	<ol>
		<li>Zbadaj liczbę kropek na komórkę, aby uzyskać zmienną jakościową, która ma charakter porządkowy (tj. liczbę komórek, które mieszczą się w każdej kategorii rangi od najniższego wyrażenia komórki (1) do najwyższej ekspresji komórki (9)) w celu dalszych analiz statystycznych.</li>
		<li>Po zapoznaniu się ze statystykami opisowymi zastosuj trzy główne podejścia: statystykę Mantela-Haenszela, test U Manna-Whitneya i test Kruskala-Wallisa. Chociaż dokładne podejście statystyczne będzie zależało od projektu eksperymentu i interesującego nas pytania badawczego, statystyczne drzewo decyzyjne (<silna klasa="xfig">Rysunek 4) może pomóc w podejmowaniu decyzji dotyczących podejścia analitycznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ ilościowo intensywność sygnału w obszarze zainteresowania (ROI) dla wzoru barwienia: "klastry".
	<ol>
		<li>Oblicz intensywność sygnału każdego obrazu, korzystając z następującego równania: 
		Intensywność sygnału = Całkowita intensywność obrazu ROI - (Średnia intensywność tła × Całkowita powierzchnia obrazu)</li>
		<li>Policz całkowitą liczbę komórek na obrazie ROI, aby obliczyć przybliżone wyrażenie sygnału na komórkę. Różnice grupowe w intensywności sygnału/obrazie, a także liczbie komórek/obrazu mogą być interesujące w celu rozważenia mechanizmów, które mogą przyczyniać się do różnic grupowych obserwowanych w ekspresji sygnału/komórce (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3B-3D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizuj statystycznie wzór barwienia "klastrów" (opcjonalnie).
	<ol>
		<li>Zbadaj wyrażenie/komórkę sygnału, aby zapewnić zmienną ciągłą do dalszej analizy statystycznej. Zastosuj dwa podejścia, w tym test t dla niezależnej próby i analizę wariancji (ANOVA), w oparciu o liczbę czynników międzyobiektowych uwzględnionych w projekcie. Statystyczne drzewo decyzyjne (<silna klasa="xfig">Rysunek 4) może pomóc w podejmowaniu decyzji dotyczących najbardziej odpowiedniego podejścia statystycznego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+dopamine+D1+receptor+in+schizophrenia%3A+insights+for+cognitive+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction.</a> Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).</li>
<li>Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology%2C+signaling%2C+and+pharmacology+of+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors.</a> Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).</li>
<li>Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supranormal+stimulation+of+D1+dopamine+receptors+in+the+rodent+prefrontal+cortex+impairs+spatial+working+memory+performance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance.</a> J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).</li>
<li>Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dopamine+receptor+subtypes+in+the+medial+prefrontal+cortex+of+the+rat+regulate+set-shifting%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting.</a> Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).</li>
<li>Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dopamine+therapeutics+for+cognitive+deficits+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia.</a> Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).</li>
<li>Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prepulse+inhibition+and+latent+inhibition%3A+the+role+of+dopamine+in+the+medial+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex.</a> Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).</li>
<li>Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+D1+dopamine+signaling+is+necessary+for+temporal+expectation+during+reaction+time+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance.</a> Neuroscience. 255, 246-254 (2013).</li>
<li>Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+Neurotransmission+in+the+Nucleus+Accumbens+Modulates+Social+Play+Behavior+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).</li>
<li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).</li>
<li>Abi-Dargham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+dopamine+D1+receptors+and+working+memory+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia.</a> J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).</li>
<li>Shinohara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D1+receptor+subtype+mediates+acute+stress-induced+dendritic+growth+in+excitatory+neurons+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+contributes+to+suppression+of+stress+susceptibility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice.</a> Mol Psychiatry. 19, (2017).</li>
<li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385, 634-636 (1997).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , 7th ed, Elsevier Academic Press. Burlington. (2014).</li>
</ol>

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by zadeklarować.

W tym protokole opisujemy nowatorską technikę hybrydyzacji in situ dla świeżo mrożonych wycinków mózgu w celu oceny ekspresji receptora Drd1α w jądrze półleżącym (NAc) i ekspresji hydroksylazy tyrozynowej (TH) w regionie istoty czarnej (SNR). Udostępniamy również metody analizy danych dla różnych wzorów barwienia: "dyskretna kropka" lub "klastry".
Uwzględniono kluczowe etapy udanego testu hybrydyzacji multipleksowego fluorescencyjnego RNA in situ . Po odcięciu głowy szczurowi...

Dysfunkcja układu dopaminowego prążkowia jest zaangażowana w postęp objawów klinicznych obserwowanych w wielu chorobach neurokognitywnych. Receptory dopaminy D1 są obecne w korze przedczołowej (PFC) i obszarach prążkowia mózgu i silnie wpływają na procesy poznawcze1, w tym pamięć roboczą, przetwarzanie czasowe i zachowanie lokomotywy2,3,4,5,6,7. Wcześniejsze badania wykazały, że zmiany receptorów dopaminy D1 były związane z postępem zespołu nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi (ADHD)8, objawy neurokognitywne w schizofrenii9,10 i podatność na stres11. W szczególności w schizofrenii badania pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) wykazały, że zdolność wiązania receptorów dopaminy D1 w korze przedczołowej była silnie związana z deficytami poznawczymi i obecnością objawów negatywnych11. Dendrytyczny wzrost neuronów pobudzających w korze przedczołowej, regulowany przez receptor dopaminy D1, zmniejsza podatność na stres. Co więcej, knockdown receptora D1 w neuronach przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC) może zwiększyć społeczną porażkę wywołaną stresem unikanie społeczne12.
Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę hybrydyzacji RNA in situ, aby uwidocznić pojedyncze cząsteczki RNA w komórce ze świeżo zamrożonymi próbkami tkanek. Obecna technika ma wiele zalet w porównaniu z metodami, które istnieją w obecnej literaturze. Po pierwsze, obecna procedura zachowuje kontekst przestrzenny i morfologiczny tkanki i została przeprowadzona na świeżo zamrożonych próbkach tkanek, dzięki czemu inne procedury wymagające świeżych, nieosadzonych tkanek mogą być łączone z obecnymi metodami. Podobne procedury w tkankach utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie pokazały, że rozdzielczość pojedynczej transkrypcji można osiągnąć przy użyciu techniki hybrydyzacji RNA in situ13. Wykrywanie RNA na poziomie pojedynczej transkrypcji zapewnia wyższą czułość na niską ekspresję liczby kopii, a także możliwość porównania ekspresji genów na poziomie pojedynczych komórek, której nie można osiągnąć za pomocą innych metod wykrywania kwasów nukleinowych, takich jak techniki reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Dodatkowo, obecna metoda utrzymuje obrazy o wysokim stosunku sygnału do szumu dzięki wysoce specyficznym sondom RNA, które są hybrydyzowane z pojedynczymi docelowymi transkryptami RNA i sekwencyjnie wiązane kaskadą cząsteczek wzmacniających sygnał w systemie detekcji. Wreszcie, obecna technologia daje możliwość oceny wielu systemów biologicznych za pomocą zastrzeżonych sond specyficznych dla celu, zamiast ograniczać nasze badania tylko do jednej klasy markerów związanych z systemem, takich jak wykrywanie białek metodami immunohistochemicznymi.
W naszym badaniu użyliśmy tej nowej hybrydyzacji RNA in situ do oceny ekspresji receptora Drd1α w jądrze półleżącym (NAc) i ekspresji hydroksylazy tyrozynowej (TH) w istocie czarnej (SNR) zarówno samca, jak i samicy szczurów F344/N. Innowacyjna hybrydyzacja RNA in situ umożliwiła nam zbadanie mechanizmów wpływających zarówno na wychwyt DA, jak i uwalnianie DA, poprawiając naszą wiedzę na temat złożoności układu DA prążkowia. Tutaj opisujemy procedurę dla świeżo mrożonych wycinków mózgu i podajemy metody analizy danych dla różnych wzorców barwienia: "dyskretna kropka" lub "klastry".

<table><tbody><tr><td>System HybEZ Oven</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórek&nbsp;</td><td>310010</td><td></td></tr><tr><td>Sonda RNAscope - Zaawansowana diagnostyka komórkowa Rn-DRD1a</td><td>&nbsp;</td><td>317031</td><td>Kanał koloru 1, zielona</td></tr><tr><td>sonda RNAscope - Zaawansowana diagnostyka komórek Rn-Th-C2</td><td>&nbsp;</td><td>314651-C2</td><td>Kanał koloru 2, pomarańczowy</td></tr><tr><td>zestaw odczynników fluorescencyjnych RNAscope</td><td>Zaawansowane diagnostyki komórek&nbsp;</td><td>320850</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrofobowy długopis barierowy</td><td>Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice SuperFrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Merritt Veterinary Supply</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek pionowy stojak na 24 prowadnice Fisher</td><td>Scientific</td><td>NC9837976</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do barwienia Tissue-Tek</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0731403</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjne wanny ogólnego przeznaczenia</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TSGP28</td><td></td></tr><tr><td>Obróbka wstępna 4</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórkowa&nbsp;</td><td>320850</td><td>części zestawów</td></tr><tr><td>Odczynnik zapobiegający blaknięciu ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Amp 1-FL</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórek&nbsp;</td><td>320850</td><td>części zestawów</td></tr><tr><td>Amp 2-FL</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórek&nbsp;</td><td>320850</td><td>części zestawów</td></tr><tr><td>Amp 3-FL</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórek&nbsp;</td><td>320850</td><td>części zestawów</td></tr><tr><td>Amp 4-FL-Alt A Zaawansowana diagnostyka</td><td>komórek&nbsp;</td><td>320850</td><td>części zestawów</td></tr><tr><td>Pakiet oprogramowania EZ-C1</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>wersja 3.81b</td></tr><tr><td>SAS/STAT Software</td><td>SAS Institute, Inc.,</td><td></td> <td>wersja 9.4</td></tr></tbody></table>

identyfikacja receptora dopaminowego d1-alfa w jądrze półleżącym gryzoni za pomocą innowacyjnej technologii wykrywania rna in situ

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

W ośrodkowym układzie nerwowym, receptor podtypu D1-alfa (Drd1α) jest najliczniejszym receptorem dopaminowym (DA), który odgrywa istotną rolę w regulacji wzrostu i rozwoju neuronów. Jednak mechanizmy leżące u podstaw nieprawidłowości receptora Drd1α pośredniczącego w reakcjach behawioralnych i modulującego funkcję pamięci roboczej są nadal niejasne. Korzystając z nowego testu hybrydyzacji RNA in situ, obecne badanie zidentyfikowało ekspresję RNA receptora dopaminy Drd1α i hydroksylazy tyrozyny (TH) z obwodów związanych z DA odpowiednio w obszarze jądra półleżącego (NAc) i regionie istoty czarnej (SNR). Ekspresja Drd1α w NAc wykazuje wzór barwienia "dyskretnej kropki". Zaobserwowano wyraźne różnice płci w ekspresji Drd1α. W przeciwieństwie do tego, TH wykazuje "zgrupowany" wzór barwienia. Jeśli chodzi o ekspresję TH, samice szczurów wykazywały wyższą ekspresję sygnału na komórkę w porównaniu z samcami. Przedstawione tu metody zapewniają nowatorską technikę hybrydyzacji in situ do badania zmian w dysfunkcji układu dopaminowego podczas progresji chorób ośrodkowego układu nerwowego.

W niniejszym badaniu zaobserwowano wzór barwienia w postaci „oddzielnych kropek” dla ekspresji RNA receptorów dopaminowych D1-alfa (Drd1α) w jądrze półleżącym (NAc) szczurów F344/N (Rycina 1A). Poszczególne sygnały fluorescencyjne były łatwo identyfikowalne i widoczne jako pojedyncze „kropki”, z których każda reprezentuje pojedynczy transkrypt RNA wewnątrz komórki. W przypadku obrazów z NAc wykazujących wzór barwienia w postaci „oddzielnych kropek”, oceniono ...

Identyfikacja receptora D1-alfa dopaminy w jądrze półleżącym jest kluczowa dla wyjaśnienia dysfunkcji receptora D1 podczas choroby ośrodkowego układu nerwowego. Przeprowadziliśmy nowatorski test hybrydyzacji RNA in situ, aby uwidocznić pojedyncze cząsteczki RNA w określonym obszarze mózgu.

Identyfikacja receptora dopaminowego D1-alfa w jądrze półleżącym gryzoni za pomocą innowacyjnej technologii wykrywania RNA in situ

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

Ogólnym celem tego nowatorskiego testu hybrydyzacji RNA in situ jest wizualizacja pojedynczych cząsteczek RNA w określonym obszarze mózgu, które mają kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia dysfunkcji dopaminergicznej podczas choroby ośrodkowego układu nerwowego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak nieprawidłowości dopaminergiczne pośredniczące w reakcjach behawioralnych i modulujące funkcję pamięci roboczej. Główną zaletą tej metody jest to, że zapewnia ona nowatorską technikę hybrydyzacji in-situ w celu zbadania dysfunkcji układu dopaminowego podczas progresji chorób ośrodkowego układu nerwowego.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w ogólne poziomy ekspresji docelowego mRNA w danym regionie mózgu, można ją również zastosować do określenia, w jaki sposób transkrypty mRNA są rozmieszczone w komórkach danego regionu. Aby rozpocząć tę procedurę, w ciągu pięciu minut po pobraniu mózgu dorosłego szczura, zanurz go w ciekłym azocie na 15 sekund. Następnie utrzymuj równowagę mózgu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w kriosacie przez godzinę.Po godzinie wytnij 30-mikronowe odcinki zawierające jądro półleżące od 2,76 milimetra do 2,28 milimetra przed bregmą i zamontuj je na szkiełkach. Następnie susz skrawki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie zanurz szkiełka we wstępnie schłodzonym 4% paraformaldehydzie na godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie umieść szkiełka w rosnącym gradiencie etanolu w temperaturze pokojowej, a następnie przenieś szkiełka do świeżego 100% etanolu na kolejne pięć minut. Następnie umieść szkiełka na bilecie chłonnym, aby umożliwić wyschnięcie na powietrzu. Narysuj barierę wokół każdej sekcji za pomocą pisaka barierowego.Pozostaw barierę do całkowitego wyschnięcia na jedną minutę. Aby wstępnie potraktować sekcje mózgu, włącz piekarnik i ustaw temperaturę na 40 stopni Celsjusza. Dodaj trzy krople odczynnika przed leczeniem na każdą sekcję mózgu.Następnie inkubuj skrawki przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zanurz szkiełka w 1X PBS na jedną minutę w temperaturze pokojowej i przenieś szkiełka do świeżego 1X PBS na kolejną minutę. Slajdy nie powinny pozostawać w 1X PBS dłużej niż 15 minut.Aby uruchomić test multipleksowy, ogrzej sondę docelową przez 10 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza w łaźni wodnej, a następnie ostudź do temperatury pokojowej. Umieść odczynnik RNA w temperaturze pokojowej. Usuń nadmiar płynu z szkiełek za pomocą chłonnego papieru i umieść je z powrotem na stojaku na szkiełka.Następnie dodaj trzy krople Drd1alpha jako sondę na każdy wycinek próbki i inkubuj próbki przez dwie godziny w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Następnie umyj szkiełka w buforze do mycia 1X przez dwie minuty w temperaturze pokojowej dwukrotnie. Następnie usuń nadmiar płynu z szkiełek za pomocą chłonnego papieru i umieść je z powrotem na stojaku na szkiełka.Nie pozwól, aby sekcje mózgu wyschły między etapami inkubacji. Dodaj trzy krople AMP 1FL na każdy plasterek próbki i inkubuj próbki przez 30 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Następnie umyj szkiełka dwukrotnie w buforze do mycia 1X przez dwie minuty za każdym razem w temperaturze pokojowej.Następnie usuń nadmiar płynu z szkiełek za pomocą chłonnego papieru i umieść je z powrotem na stojaku na szkiełka. Następnie dodaj trzy krople AMP 2FL na każdy plasterek próbki. Próbki należy inkubować przez 15 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza.Następnie zanurz szkiełka w buforze myjącym 1X na dwie minuty dwukrotnie w temperaturze pokojowej. Usuń nadmiar płynu z szkiełek za pomocą chłonnego papieru i umieść je z powrotem na stojaku na szkiełka. Dodaj trzy krople AMP 3FL na każdy plasterek próbki i inkubuj próbki przez 30 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza.Następnie umyj szkiełka w buforze do mycia 1X przez dwie minuty w temperaturze pokojowej dwukrotnie. Usuń nadmiar płynu z szkiełek za pomocą chłonnego papieru i umieść je z powrotem na stojaku na szkiełka. Następnie dodaj trzy krople AMP 4FL ALT A na każdy plasterek próbki i inkubuj próbki przez 15 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza.Umyj szkiełko w buforze do mycia 1X przez dwie minuty w temperaturze pokojowej dwa razy. Usuń nadmiar płynu ze szkiełek i natychmiast umieść dwie krople odczynnika montażowego na każdej sekcji. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 milimetry na 22 milimetry na każdej sekcji mózgu.Następnie przechowuj szkiełka w ciemności w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza, aż wyschną. Aby uzyskać obrazowanie, włącz mikroskop konfokalny i przełącz się na obiektyw 60X. Uzyskaj obrazy stosu Z i uzyskaj obrazy komórek znakowanych Drd1alpha w regionie jądra półleżącego.W przypadku obrazów z jądra półleżącego, które wykazywały dyskretny wzór barwienia kropek, dynamiczny zakres ekspresji oceniono za pomocą analizy półilościowej. Każda komórka została oceniona od zera do dziewięciu na podstawie liczby kropek na komórkę. Ta hybrydowa metoda oceny sygnału może zatem ocenić zakres i zmienność ekspresji Drd1alpha w poszczególnych komórkach.Oto reprezentatywne obrazy konfokalne ekspresji Drd1alpha u samców i samic szczurów, które mają dyskretny wzór barwienia kropkami. Aby uwzględnić zagnieżdżoną strukturę danych, średnie wartości zliczania zostały obliczone dla każdej kategorii i wykorzystane do analizy statystycznej. Przeprowadzono test U Manna-Whitneya w celu oceny różnic w medianie liczby komórek u samców i samic szczurów.Częstość komórek w każdej kategorii jest analizowana przy użyciu częstotliwości względnej i częstotliwości skumulowanej. Samice wykazywały znaczącą zmianę w rozmieszczeniu z większą częstością komórek w niższych kategoriach rzędu w porównaniu z samcami. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki sugerują wyraźne różnice płci w ekspresji Drd1alpha w jądrze półleżącym.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu siedmiu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkiej pracy, ponieważ zmiany temperatury lub wysychanie tkanki mogą uszkodzić mRNA i utrudnić nam uzyskanie wiarygodnego sygnału. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać technikę hybrydyzacji in-situ w tkankach korowych, fluorescencyjnie obrazować transkrypty mRNA sygnału w wybranych regionach mózgu i scharakteryzować rozkład transkryptów mRNA do analizy statystycznej.

identification-dopamine-d1-alpha-receptor-within-rodent-nucleus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje wszczepienie elektrod i kaniul u znieczulonego szczura w celu pomiaru uwalniania dopaminy w jądrze półleżącym za pomocą potencjostatu oraz infuzji leków w celu modulacji aktywności dopaminergicznej w brzusznej części nakrywki.

Monitorowanie uwalniania dopaminy w modelu szczurzym za pomocą manipulacji receptorem neuronów dopaminergicznych VTA

Ten film demonstruje wykrywanie syntezy RNA receptora serotoninowego za pomocą sond oligonukleotydowych w tkance mózgowej szczura dotkniętej zespołem serotoninowym. Protokół obejmuje wstępną obróbkę tkanek, hybrydyzację sondy i detekcję enzymatyczną w celu wizualizacji i ilościowego określenia ekspresji RNA receptora serotoninowego pod mikroskopem.

Hybrydyzacja in situ przy użyciu sond oligonukleotydowych do badania ekspresji RNA w skrawkach mózgu szczura

Celem tej publikacji jest wizualizacja i dyskusja na temat etapów działania protokołu Enhanced Northern Blot na RNA ekstrahowanym z zarodków, komórek i tkanek Drosophila melanogaster. Protokół ten jest szczególnie przydatny do skutecznego wykrywania małych gatunków RNA.

Ulepszone wykrywanie małych gatunków RNA w Northern Blot u Drosophila melanogaster

Izolacja pojedynczych neuronów dopaminowych lub brzusznego obszaru nakrywki za pomocą bezpośredniej lub pośredniej immunohistochemii jest demonstrowana za pomocą mikrodysekcji laserowej. Omówiono parametry izolacji tkanki ze szkiełka podstawowego za pomocą lasera na podczerwień oraz od szkiełek membranowych z wykorzystaniem kombinacji lasera podczerwonego i ultrafioletowego.

Mikrodysekcja laserowa - demonstracja izolacji pojedynczych neuronów dopaminowych i całego brzusznego obszaru nakrywki

Hybrydyzacja in situ (ISH) RNA umożliwia wizualizację RNA w komórkach i tkankach. Tutaj pokazujemy, jak połączenie RNAscope ISH z immunohistochemią lub barwnikami histologicznymi może być z powodzeniem wykorzystane do wykrywania mRNA zlokalizowanych na aksonach w odcinkach mózgu myszy i człowieka.

Wykrywanie aksonalnie zlokalizowanych mRNA w skrawkach mózgu za pomocą hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości

W chorobie Parkinsona (PD) neurony dopaminergiczne istoty czarnej (SNc) ulegają degeneracji, co prowadzi do dysfunkcji motorycznej. W tym miejscu przedstawiamy protokół hodowli neuronów brzusznej części śródmózgowia od myszy wyrażającej eGFP napędzany sekwencją promotora hydroksylazy tyrozyny (TH), zbierania pojedynczych neuronów fluorescencyjnych z kultur i pomiaru ich transkryptomu za pomocą sekwencji RNA.

Wiarygodna identyfikacja żywych neuronów dopaminergicznych w hodowlach śródmózgowia przy użyciu sekwencjonowania RNA i ekspresji eGFP sterowanej przez promotor TH

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji, wykrywania, analizy i śledzenia endogennego transportu mRNA w żywej komorze jajowej Drosophila melanogaster za pomocą latarni molekularnych, mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem i oprogramowania do analizy open-source.

Wizualizacja i śledzenie endogennych mRNA w żywych komorach jajowych Drosophila melanogaster

Tutaj prezentujemy zautomatyzowaną metodę półilościowego określania liczby neuronów dopaminergicznych u szczurzej istoty czarnej pars compacta.

Półilościowe oznaczanie gęstości neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej modeli gryzoni przy użyciu automatycznej analizy obrazu

Multipleksowa hybrydyzacja in situ (ISH) została wykorzystana do jednoczesnej wizualizacji transkryptów dla dwóch receptorów sprzężonych z białkiem G i jednego czynnika transkrypcyjnego w całym kompleksie zwoju błędnego dorosłej myszy. Protokół ten może być wykorzystany do generowania dokładnych map profili transkrypcyjnych neuronów doprowadzających nerwy błędnego.

Wykrywanie ekspresji receptora sprzężonego z białkiem G w mysich neuronach doprowadzających nerwu błędnego za pomocą hybrydyzacji Multiplex In Situ

Badanie to przedstawia solidną metodę izolacji mRNA aksonalnych za pomocą wkładek z błony porowatej, umożliwiając całkowite rozdzielenie neuronów od neurytów oraz oczyszczanie RNA. W połączeniu z RTddPCR podejście pozwala na absolutną ilościową ilościową ilościową transkrypcję o niskiej liczbie kopii, ułatwiając badania transportu mRNA i lokalnej translacji o wysokiej czułości, powtarzalności i szerokim zastosowaniu eksperymentalnym.

Izolacja i ilościowa ilościowość mRNA aksonalnych z użyciem wkładek z błony porowatej oraz RTddPCR

Poznaj nową technikę hybrydyzacji in situ RNA do wizualizacji pojedynczych cząsteczek RNA w mózgu szczura. Metoda umożliwia badanie ekspresji receptora dopaminowego D1-alfa w jądrze półleżącym i analizę różnic między płciami.

Identyfikacja receptora dopaminowego D1-alfa w jądrze półleżącym gryzoni za pomocą innowacyjnej technologii wykrywania RNA in situ (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja receptora dopaminowego D1-alfa w jądrze półleżącym gryzoni za pomocą innowacyjnej technologii wykrywania RNA in situ

Przeglądaj więcej filmów