Name: Protokół doświadczalny wykorzystania Drosophila jako modelowego systemu bezkręgowców do badań toksyczności w laboratorium (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Poznaj protokół badania toksyczności zanieczyszczeń na Drosophila w różnych stadiach rozwoju i pokoleniach. Metoda umożliwia analizę wpływu toksykantów na fenotyp oraz przystosowanie ewolucyjne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta publikacja została wsparta grantem z Departamentu Edukacji (PR Award #P031C160025-17, tytuł projektu: 84.031C) dla społeczności Colorado State University-Pueblo (CSU-Pueblo) na rzecz budowania aktywnego zaangażowania STEM (C-BASE). Dziękujemy wydawnictwom Current Zoology i Elsevier za udostępnienie praw do wykorzystania reprezentatywnych wyników opublikowanych w poprzednich artykułach, a także redakcji JoVE za umożliwienie nam opublikowania tego protokołu. Chcielibyśmy również podziękować programowi C-BASE, dr Brianowi Vanden Heuvelowi (C-BASE i Wydział Biologii, CSU-Pueblo), wydziałowi biologii CSU-Pueblo, Thomasowi Graziano, dr Bernardowi Possidente (Wydział Biologii, Skidmore College) i dr Claire Varian Ramos (Wydział Biologii, Colorado State University-Pueblo) za ich wsparcie i pomoc.

Poniższy protokół jest protokołem eksperymentalnym stosowanym do hodowli gatunków z rodzaju Drosophila na zanieczyszczonym podłożu w przypadkach, gdy odpowiednią drogą podania toksyny jest spożycie doustne; w modelu Drosophila możliwe są również inne formy ekspozycji11,15,16,26. Metody opisane w niniejszym protokole zostały wcześniej przedstawione przez Hirsch et al.19 oraz Peterson et al.23,24,25.
1. Zakładanie populacji wyjściowych Drosophila w laboratorium badawczym
<ol>
	<li>Przygotuj inkubator z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi (lub małe pomieszczenie) do utrzymywania populacji stokowych Muszka owocówka poprzez ustawienie w inkubatorach stałej temperatury, cyklu światło:ciemność oraz wilgotności, w zależności od preferencji badanych gatunków. 
	UWAGA: Preferowane warunki środowiskowe będą się różnić w zależności od naturalnej ekologii gatunku wybranego do badania. Na przykład, D. melanogaster pochodzi z Afryki subsaharyjskiej27 i zazwyczaj utrzymuje się na poziomie 25 °C, cykl światła i ciemności 12:12 oraz wilgotność powietrza na poziomie około 60%16,18,19,20,21,22,23,24,25,28,29,30Z drugiej strony, *D. montana* zasięg obejmuje większość Kanady oraz środkową część USA, co stanowi znacznie chłodniejszy region; w związku z tym, *D. montana* zwykle utrzymuje się na poziomie 19–20 °C a niekiedy 24-godzinny reżim świetlny w celu symulacji warunków panujących w okresie godowym31. Bardziej szczegółowy opis zasięgów geograficznych poszczególnych gatunków Muszka owocówka, zobacz Muszka owocówka Strona internetowa Speciation Patterns32.</li>
	<li>Uzyskać preferowany Muszka owocówka gatunki i/lub linie inbredowe z centrum zasobów (patrz Tabela materiałów), z innego laboratorium badawczego na prośbę lub zebrane z terenu dzikie, zmienne genetycznie populacje. 
	UWAGA: Poniższe kroki wyjaśniają metody pobierania dzikich, zmiennych genetycznie populacji Muszka owocowa do utrzymania w laboratorium badawczym. Metody te zostały zmodyfikowane na podstawie prac Markowa i O'Grady33 oraz Werner i Jaenike34 aby zebrać jednocześnie jak najszerszą różnorodność gatunków, zamiast kierować się ku konkretnym gatunkom za pomocą jednego źródła przynęty.
	<ol>
		<li>Zamrozić sześć dojrzałych bananów w zamrażarce przez noc i rozmrozić przed ustawieniem pułapek z przynętą.</li>
		<li>Przygotuj kilka plastikowych butelek o pojemności 1–2 l, wycinając w przedniej części każdej z nich nacięcie w kształcie litery U, aby muchy mogły dostać się do butelki z przynętą i nie mogły z niej uciec. Zakręć butelki plastikowymi nakrętkami, aby zapobiec ucieczce much przez górną część.</li>
		<li>Dodaj rozmrożonego banana na dno butelek w taki sposób, aby na dnie każdej z nich znalazła się warstwa banana o grubości około jednej uncji. Włóż do butelki plaster dojrzałego pomidora. Dodaj zawiesinę drożdżową (pozostałość drożdży z procesu warzenia piwa) do banana na dnie butelki, tak aby banan był zanurzony w zawiesinie drożdżowej.</li>
		<li>Do butelki należy włożyć drewniane patyczki (w pozycji pionowej), aby muchy miały czyste podłoże do chodzenia, oddzielone od zawiesiny drożdżowej i banana. 
		Rysunek 1 przedstawia produkt końcowy tych metod.</li>
		<li>Zawieś butelki z przynętą na drzewach na noc i sprawdzaj je co 24 godziny. Odessać muchy z butelek za pomocą aspiratora ustnego, a następnie umieścić pojedynczo samice w fiolkach z pożywką w celu stworzenia linii izofemale. 
		UWAGA: Można tworzyć linie wielosamicowe, jednak tylko wtedy, gdy samice każdego gatunku można wyraźnie zidentyfikować. Ponadto muchy z rodzaju Muszka owocówka zajmują różne nisze ekologiczne i będą mieć różne wymagania pokarmowe w zależności od tych nisz (Werner i Jaenike34); patrz Werner i Jaenike34 do zaleceń dietetycznych i przepisów kulinarnych.</li>
		<li>Zbadaj dorosłą samicę1 potomstwo pod mikroskopem stereowym w celu zidentyfikowania gatunku zebranego Muszka owocówka (patrz Markow i O'Grady)33 oraz Werner i Jaenike34 w celu uzyskania pomocy w identyfikacji różnych gatunków).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Układ eksperymentu dotyczącego równowagi statycznej na gałęzi drzewa z wahadłem z plastikowej butelki, badanie środowiskowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przedstawienie graficzne pułapek i przynęty użytych do zbierania dzikich populacji Drosophila w terenie. (A) Pułapki na muchy rozmieszczone na lokalnym obszarze badań w Kolorado. (B) Zbliżenie na pułapki na muchy rozmieszczone na tym obszarze badań. <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="3">
	<li>Utrzymuj linie izofemalne lub wielofemalne w inkubatorze lub pomieszczeniu o kontrolowanych warunkach środowiskowych, ze stałą temperaturą, cyklem światło:ciemność i wilgotnością. W tym celu hoduj muchy w fiolkach lub butelkach z preferowanym podłożem, pozwalając zapłodnionym samicom składać jaja w podłożu. Monitoruj fiolki pod kątem obecności larw i pociorek. 
	UWAGA: Muchy z rodzaju Drosophila zajmują różne nisze ekologiczne i będą miały różne wymagania dietetyczne oraz preferencje abiotyczne w zależności od tych nisz33,34. Preferencje środowiskowe i zalecenia dietetyczne (oraz dalsze instrukcje dotyczące hodowli much) można znaleźć u Elgin i Millera28, Shaffera et al.29, Stockera i Gallanta30, Markowa i O'Grady33 oraz Wernera i Jaenike34. W przypadku stosowania gatunków odłowionych z natury, w inkubatorach można symulować lokalne warunki środowiskowe do momentu zidentyfikowania gatunku.</li>
	<li>Często przenoś populacje na świeże podłoże, utylizując stare fiolki, aby utrzymać zdrowe linie i uniknąć infekcji roztoczami. 
	UWAGA: Częstotliwość przenoszenia zależy od cyklu życiowego gatunku. Na przykład Drosophila melanogaster przenosi się na świeże podłoże co 2 tygodnie. W celu uzyskania dalszych informacji na temat utrzymywania linii w laboratorium patrz Rand et al.16, Elgin i Miller28, Shaffer et al.29, Stocker i Gallant30, Greenspan35 oraz Science Education Database36.</li>
</ol>
2. Hodowla Drosophila w zanieczyszczonym podłożu
UWAGA: Jeśli po raz pierwszy testujesz Drosophila w laboratorium lub używasz nowego zanieczyszczenia/zanieczyszczeń, najpierw określ dawkę letalną (metody opisano u Castaneda et al.37 oraz Massie et al.38) oraz LD50 (metody opisano u Castaneda et al.37 oraz Akins et al.39). Następnie wyznacz krzywą zależności dawka-odpowiedź, aby określić biologicznie istotne stężenia dla pożądanego efektu fenotypowego; metody opisano u Hirsch et al.19 oraz Zhou et al.40.
<ol>
	<li>Przygotować roztwory zapasowe zanieczyszczonego medium o pożądanych stężeniach, w zależności od charakterystyki chemicznej zanieczyszczenia. 
	UWAGA: Na przykład, aby przygotować roztwory zapasowe PbAc: przygotować roztwory zapasowe octanu ołowiu (PbAc) poprzez dodanie zanieczyszczenia do wody destylowanej (dH2O)20) aż pożywka sporządzona z zanieczyszczonej wody osiągnie pożądane stężenie. Na przykład roztwór stokowy 1,000 µM PbAc można przygotować poprzez dodanie PbAc do dH2O20 aż do osiągnięcia 1,000 µM PbAc. Następnie rozcieńczyć roztwór zapasowy (np. the 1,000 µM roztwór PbAc) do pożądanego stężenia (takiego jak 500 µM PbAc) i przechowywać te roztwory również jako roztwory zapasowe.</li>
	<li>Przygotować pożywkę zgodnie z wytycznymi producenta, która będzie służyć jako pożywka kontrolna. Przygotować dodatkową pożywkę zgodnie z wytycznymi producenta, jednak uzupełnić ją przygotowanym roztworem zanieczyszczeń dla dH.20. 
	UWAGA: Na przykład w przypadku zastosowania natychmiastowego Muszka owocówka pożywka, dodać około jednej łyżeczki pożywki liofilizowanej do plastikowej probówki. Dodać około 5–5,5 ml dH20 do medium. Posypać kilkoma ziarnami żywych drożdży piekarskich, aby przygotować medium kontrolne. W celu przygotowania medium eksperymentalnego, uzupełnić roztwór zapasowy (taki jak 500 µM PbAc) dla dH20.</li>
	<li>Przenieś do medium kontrolnego oraz eksperymentalnego dojrzałe, zdolne do reprodukcji osobniki męskie i żeńskie z populacji wyjściowych. 
	UWAGA: Czas od momentu wyklucia do osiągnięcia dojrzałości rozrodczej jest różny pomiędzy Muszka owocówka gatunki41.
	<ol>
		<li>Delikatnie opukaj fiolkę z populacją wyjściową much dominującą ręką. Upewnij się, że muchy przemieściły się na dno fiolki. Drugą ręką zdejmij korek z fiolki, jednocześnie ją opukując, a następnie nałóż na nią świeżą fiolkę z podłożem kontrolnym lub zanieczyszczonym. Trzymając obie fiolki razem, odwróć je i delikatnie opukuj, aby muchy automatycznie przeniosły się do świeżej fiolki z podłożem kontrolnym lub zanieczyszczonym. Zakręć fiolkę z muchami, wciąż ją opukując.</li>
		<li>Powtórz procedurę z większą liczbą probówek, dbając o ustandaryzowanie liczby much w każdej z nich. 
		UWAGA: całkowita liczba przeniesionych osobników dorosłych poprzez Pojedynczy transfer lub znieczulenie będą zależeć od rozmiaru użytych fiolek, aby uniknąć zbyt dużego zagęszczenia.</li>
		<li>Inkubować osobniki dorosłe w standardowych warunkach środowiskowych (t.j. (inkubator) i pozostawić osobniki dorosłe w celu kopulacji i złożenia jaj w podłożu przez 24–96 h.</li>
		<li>Po 24–96 h osobniki dorosłe należy przenieść do pułapki (kolby wypełnionej olejem mineralnym i zamkniętej szczelnym lejkiem), pozostawiając zapłodnione jaja (które w późniejszym etapie będą stanowić grupę badawczą) do dojrzewania przed testami. Probówki należy umieścić w inkubatorze, aby umożliwić rozwój jaj.</li>
		<li>Monitoruj fiolki pod kątem obecności larw w stadium wędrownym, szukając osobników wynurzających się z podłoża.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pobieranie obiektów doświadczalnych na różnych etapach rozwoju
UWAGA: Obiekty doświadczalne można pobierać na dowolnym etapie rozwoju, umieszczać w zakodowanych probówkach stożkowych o pojemności 15 mL i badać pod kątem akumulacji. Metody badania akumulacji zanieczyszczeń będą zależeć od badanego związku. Na przykład akumulację PbAc można badać przy użyciu spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS)42. Ponadto obiekty doświadczalne można pobierać na dowolnym etapie rozwoju, aby zbadać różnorodne efekty fenotypowe zanieczyszczeń. Rysunek 2 przedstawia cykl życiowy Drosophila43. Rysunek 3 przedstawia protokół doświadczalny ekspozycji oraz poszczególne etapy rozwoju przeznaczone do poboru próbek.
<img alt="Schemat cyklu życiowego muszki owocówki; stadia: jajo, larwa, poczwarka, osobnik dorosły. Przedstawiono odstępy czasu pobierania próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Koncepcyjny przegląd cyklu życiowego D. melanogaster (najczęściej stosowanego systemu modelowego Drosophila). Stadia cyklu życiowego Drosophila to: 1) jajo, 2) larwa pierwszego stadium, 3) larwa drugiego stadium, 4) larwa trzeciego stadium, 5) wędrująca larwa trzeciego stadium, 6) poczwarka z białymi oczami, 7) poczwarka z czerwonymi oczami, 8) nowo wykluty osobnik dorosły oraz 9) dojrzały osobnik dorosły. <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procesu reprodukcji i ekspozycji na toksynę; przepływ etapów cyklu życia eksperymentalnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Koncepcyjny przegląd metod doustnej ekspozycji Drosophila na zanieczyszczoną pożywkę w pokoleniu rodzicielskim (F0) oraz w kolejnych pokoleniach (F1 i następnych). (A) Metody ekspozycji doustnej podczas rozwoju w pokoleniu eksponowanym. (B) Metody badania przenoszenia zanieczyszczeń na potomstwo (od F1 do pożądanej generacji). Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Peterson et al.24 <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol>
	<li>Zbiór larw trzeciego stadium w fazie wędrówki
	<ol>
		<li>Rozpocznij monitorowanie probówek w momencie zapalenia się świateł w inkubatorze, ponieważ larwy opuszczą pożywkę i zaczną przemieszczać się w górę ścianek probówki w ciągu godziny od włączenia światła. W ciągu tej godziny ostrożnie usuń larwy trzeciego stadium w fazie wędrówki ze ścianek probówki, używając drewnianego patyczka lub pęsety. 
		UWAGA: Liczba larw dostępnych do zbioru zależy od liczby jaj złożonych w punkcie „2.3.4”).</li>
		<li>Aby usunąć nadmiar pożywki z larw, umieść je w małym zlewce z dH2O. Odlej dH2O ze zlewki i przenieś larwy na chłonny papier do precyzyjnych prac (delicate task wiper). Używając takiego papieru, delikatnie usuń nadmiar dH2O z larw.</li>
		<li>Utrzymuj populacje doświadczalne w inkubatorze z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbiór nowo wyklutych osobników dorosłych
	<ol>
		<li>Monitoruj proces wykluwania w probówkach, obserwując barwę poczwarek znajdujących się przy ściankach probówek. 
		UWAGA: Poczwarki ciemnieją w trakcie rozwoju. Czas rozwoju, szczególnie przed wykluciem, zależy od badanego gatunku.</li>
		<li>Gdy pierwsze osobniki dorosłe zaczną się wykluwać, usuń je i wyrzuć do pojemnika z olejem mineralnym.</li>
		<li>Następnego ranka, po zapaleniu świateł w inkubatorze, usuń i wyrzuć wszystkie osobniki dorosłe o nieznanym wieku (lub stanie dziewictwa), które mogły się wykluć w nocy lub rano przed włączeniem światła.</li>
		<li>Około 4 h później znieczul wszystkie osobniki, które wykluły się jako nowo wyklute, za pomocą pistoletu z CO2 bezpośrednio w probówkach. Umieść osobniki dorosłe na płytce z CO2 pod mikroskopem stereoskopowym. Określ płeć osobników, szukając grzebieni płciowych na przednich odnóżach samców oraz pokładaczy u samic. 
		UWAGA: D. melanogaster muszą zostać zebrane w ciągu 6 h od wyklucia, aby uniknąć kopulacji, jednak inne gatunki mogą mieć dłuższy czas rozwoju (a zatem nie muszą być zbierane w tym przedziale czasowym).</li>
		<li>Rozdziel osobniki dorosłe na płytce z CO2 za pomocą drewnianego patyczka. Delikatnie przenieś osobniki w grupach podzielonych według płci, używając drewnianego patyczka, na pożywkę zgodną z wcześniejszą historią ekspozycji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbiór dojrzałych osobników dorosłych po wykluciu
	<ol>
		<li>Pozostaw osobniki dorosłe na pożywce odpowiadającej ekspozycji przed wykluciem (od stadium jaja) do osiągnięcia pożąganego wieku po wykluciu w inkubatorze z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi.</li>
		<li>Przenieś pojedynczo osobniki dorosłe na pożywkę kontrolną na 24 h przed badaniem, aby umożliwić im oczyszczenie ciała z nadmiaru zanieczyszczonej pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przebudowa grup badawczych w celu przetestowania efektów ekspozycji wielopokoleniowej lub transgeneracyjnej.
<ol>
	<li>Aby wyhodować pokolenie rodzicielskie (znane również jako pokolenia P0 lub F0 ), przenieś osobniki dorosłe z populacji wyjściowych do medium kontrolnego oraz eksperymentalnego, postępując zgodnie z krokami od „2.1” do „2.3” oraz od „3.1” do „3.3”.</li>
	<li>Gdy osobniki dorosłe osiągną dojrzałość rozrodczą (patrz Pitnick et al.41), przenieś pojedynczo (zgodnie z opisem w punkcie 2.3.1) jedną fiolkę samców do nowej fiolki z medium kontrolnym lub eksperymentalnym. Przenieś pojedynczo jedną fiolkę samic do nowej fiolki, w której znajdują się już samce. Pozostaw osobniki dorosłe w celu kopulacji i zniesienia jaj do medium na 24-96 h. Usuń osobniki dorosłe do naczynia z olejem mineralnym i ponownie inkubuj fiolki, aby umożliwić rozwój potomstwa.</li>
	<li>Powtarzaj kroki od 4.1 do 4.2 w zależności od pożądanej liczby pokoleń.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Drosophila melanogaster została uznana za potężny model dla szeregu procesów biologicznych ze względu na rozległą ochronę genów i szlaków między D. melanogaster a ludźmi13,14. Z tych samych powodów, dla których jest to potężny model dla nauk medycznych, Drosophila pojawiła się jako odpowiedni system modelowy do badania wpływu zanieczyszczeń antropogenicznych na szereg toksykologicznych punktów końcowych. Kilka laboratoriów z powodzeniem...

Każdego roku, około 1,000 nowych substancji chemicznych jest wprowadzanych przez przemysł chemiczny1,2; jednak wpływ na środowisko tylko niewielkiego procentu tych chemikaliów jest testowany przed dystrybucją2,3. Chociaż katastrofy na dużą skalę są rzadkie, subletalne i przewlekłe narażenie na wiele różnych zanieczyszczeń jest powszechne zarówno wśród ludzi, jak i dzikich zwierząt4,5. Historyczny nacisk ekotoksykologii i toksykologii środowiskowej polegał na testowaniu śmiertelności, narażenia na pojedynczą substancję chemiczną, ostrego narażenia i fizjologicznych skutków narażenia, jako sposobu pomiaru wpływu zanieczyszczeń na przeżycie6,7,8,9,10. Chociaż obserwuje się zwrot w kierunku etycznych i nieinwazyjnych podejść do testów na zwierzętach, obecne podejścia są ograniczone ze względu na rolę, jaką rozwój, właściwości emergentne i czynniki zewnętrzne (takie jak interakcje na poziomie populacji i ekosystemu) odgrywają w pośredniczeniu w ważnych ekologicznie punktach końcowych8. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na metody, które uwzględniają bardziej holistyczne podejście bez poświęcania dzikiej przyrody i/lub kręgowców w laboratorium.
Systemy modelowe bezkręgowców, takie jak Drosophila melanogaster, są atrakcyjną alternatywą, która zaspokaja potrzebę bardziej holistycznego podejścia do badań toksyczności. D. melanogaster, został pierwotnie opracowany jako system modelowy bezkręgowców do badań genetycznych związanych z człowiekiem około sto lat temu11. D. melanogaster jest obecnie powszechnie stosowany jako alternatywa dla modelu kręgowców z kilku powodów: 1) zachowanie genów i szlaków między D. melanogaster a ludźmi; 2) krótki czas generacji w porównaniu z modelami kręgowców; 3) niedrogie koszty utrzymania; 4) łatwość w generowaniu dużych rozmiarów próby; oraz 5) mnóstwo istotnych pod względem fenotypowym i ekologicznym punktów końcowych dostępnych do testowania11,12,13,14,15,16,17.
Kilka laboratoriów11,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 używają teraz D. melanogaster jako alternatywy dla modelu kręgowców do testowania toksyczności, aby zrozumieć wpływ zanieczyszczeń na ludzi. Lokalne dzikie gatunki Drosophila mogą być również wykorzystywane jako modele toksyczności dla dzikiej przyrody (i ludzi), aby odpowiedzieć na pytania istotne ekologicznie, behawioralnie i ewolucyjnie na wielu biologicznych poziomach organizacji. Korzystając z gatunków z rodzaju Drosophila jako modelu, możliwych jest kilka mierzalnych punktów końcowych11,15,16,18,19,20,21,22,23,24,25. Ponadto, korzystając z modelu Drosophila, toksykolodzy mogą: 1) etycznie łączyć efekty na wielu poziomach biologicznych organizacji; 2) uwzględnianie roli czynników emergentnych i rozwoju; 3) badanie punktów końcowych ważnych z punktu widzenia środowiska (oprócz punktów końcowych ważnych z medycznego punktu widzenia); 4) testuj wiele stresorów jednocześnie; 5) i testować długoterminowe, wielopokoleniowe (np. ewolucyjne i międzypokoleniowe) implikacje stresorów. Dlatego wykorzystanie Drosophila jako systemu modelowego umożliwia wiele podejść, nie ograniczając się do badania podejść mechanistycznych z wsobnymi szczepami D. melanogaster w laboratorium.
W tym artykule prezentujemy metody hodowli i zbierania Drosophila, aby odpowiedzieć na różne pytania toksykologiczne. Dokładniej rzecz ujmując, opisujemy metodologię 1) hodowli Drosophila w podłożu z jednym lub kilkoma zanieczyszczeniami; 2) zbieranie Drosophila przez cały okres rozwoju (np. wędrujące larwy w trzecim stadium rozwojowym, przypadki poczwarek, nowo zamknięte dorosłe osobniki i dojrzałe osobniki dorosłe); oraz 3) hodowla Drosophila w skażonym podłożu w celu zbadania transmisji międzypokoleniowej i międzypokoleniowej, a także ewolucyjnych implikacji długotrwałego narażenia na toksyny. Korzystając z tego protokołu, poprzedni autorzy18,19,20,21,22,23,24,25 zgłosili różne fizjologiczne, genetyczne i behawioralne skutki rozwojowego ołowiu (Pb2+) ekspozycji. Protokół ten umożliwia toksykologom stosowanie bardziej holistycznego podejścia toksykologicznego, które jest niezbędne do zrozumienia, w jaki sposób zanieczyszczenia są czynnikami ryzyka zarówno dla ludzi, jak i dzikich zwierząt w coraz bardziej zanieczyszczonym środowisku.

<table><tbody><tr><td>Carolina Biological Instant Drosophila Medium Formula 4-24</td><td>Fiolki Carolina Biological</td><td>173204</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila, wąskie (PS), polistyren, Superbulk, 1000 fiolek / jednostkę</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-116SB</td><td>Służy do przechowywania much</td></tr><tr><td>Flugs Zamknięcia do fiolek i butelek, Wąskie plastikowe fiolki</td><td>Genessee Scientific</td><td>49-102</td><td>Służy do przechowywania much</td></tr><tr><td>Tacki tekturowe, tacki tylko, wąski</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-124</td><td>Służy do organizowania populacji much</td></tr><tr><td>Tacki kartonowe, tylko przegrody, wąskie</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-126</td><td>Służy do organizowania populacji much</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; Nalgene Kwadratowe butelki HDPE z szerokim otworem z zamknięciem</td><td>Fischer Scientific</td><td>03-312D</td><td>Przydatne do przechowywania zanieczyszczeń</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; Nalgene Oznaczone kolorami butelki do mycia LDPE</td><td>Fischer Scientific</td><td>03-409-17C</td><td>Przydatne do przechowywania zanieczyszczeń</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Repeater M4 Ręczny ręczny dozownik do pipet</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-287-150</td><td>Służy do przygotowania średnich</td></tr><tr><td>końcówek Combitips Zaawansowane końcówki do pipet - standardowe, Eppendorf Quality Tips</td><td>Fischer Scientific</td><td>13-683-708</td><td>Służy do przygotowania średniego</td></tr><tr><td>Flypad, standardowy rozmiar (8,1 x 11,6 cm)</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-114</td><td>Służy do znieczulania much</td></tr><tr><td>Zawór stopowy Flystuff</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-121</td><td>Służy do znieczulania much</td></tr><tr><td>Rurka, zielona (1 stopa warunkowa/jednostka)</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-124G</td><td>Służy do znieczulania much</td></tr><tr><td>Olej mineralny, lekki, biały, o wysokiej czystości, 500 ml Butelka HDPE</td><td>VWR</td><td>97064-130</td><td>Używany do produkcji kostnicy</td></tr><tr><td>Zestaw szklanych kolb Erlenmeyera - 3 rozmiary - 50, 150 i 250 ml, Karter Scientific 214U2</td><td>Walmart</td><td>Nie dotyczy</td><td>Używany do budowy kostnicy</td></tr><tr><td>BGSET5 Szklana zlewka Zestaw 5 sztuk</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linia wsobna lub dzika Drosophila</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center na Uniwersytecie</td><td></td> Indiana <td>https://bdsc.indiana.edu</td></tr><tr><td>Dzikie populacje Drosophila</td><td>UC San Diego Drosophila Stock Center</td><td></td><td>https://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php</td></tr></tbody></table>

protokół doświadczalny wykorzystania drosophila jako modelowego systemu bezkręgowców do badań toksyczności w laboratorium

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Właściwości emergentne i czynniki zewnętrzne (w szczególności interakcje na poziomie populacji i ekosystemu) odgrywają ważną rolę w pośredniczeniu w ważnych ekologicznie punktach końcowych, choć rzadko są brane pod uwagę w badaniach toksykologicznych. D. melanogaster wyłania się jako model toksykologiczny dla behawioralnych, neurologicznych i genetycznych skutków substancji toksycznych, by wymienić tylko kilka. Co ważniejsze, gatunki z rodzaju Drosophila mogą być wykorzystane jako system modelowy dla integracyjnego podejścia ramowego w celu uwzględnienia wyłaniających się właściwości i odpowiedzi na ekologicznie istotne pytania w badaniach toksykologicznych. Celem niniejszej pracy jest opracowanie protokołu narażenia gatunków z rodzaju Drosophila na działanie zanieczyszczeń, który zostanie wykorzystany jako system modelowy dla szeregu wyników fenotypowych i pytań istotnych ekologicznie. Mówiąc dokładniej, protokół ten może być wykorzystany do: 1) powiązania wielu biologicznych poziomów organizacji i zrozumienia wpływu substancji toksycznych na przystosowanie zarówno na poziomie indywidualnym, jak i populacyjnym; 2) badanie wpływu substancji toksycznych na różnych etapach narażenia rozwojowego; 3) badanie wielopokoleniowych i ewolucyjnych skutków zanieczyszczeń; oraz 4) testuj wiele zanieczyszczeń i stresorów jednocześnie.

Poprzez doustną ekspozycję Drosophila na zanieczyszczenie(a) w trakcie rozwoju, można badać różne zagadnienia toksykologiczne, poddając Drosophila działaniu tych substancji na różnych poziomach organizacji biologicznej. W tej sekcji przedstawiono reprezentatywne wyniki uzyskane przy użyciu tego protokołu w wcześniej opublikowanych pracach23,24. W szczególności protokół ten był wcześniej stosowany do oceny akumula...

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół wystawiania gatunków z rodzaju Drosophila na zanieczyszczenia w celu zbadania wpływu ekspozycji na szereg wyników fenotypowych w różnych stadiach rozwoju i dla więcej niż jednego pokolenia.

Protokół doświadczalny wykorzystania Drosophila jako modelowego systemu bezkręgowców do badań toksyczności w laboratorium

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Protokół ten może być wykorzystany do zrozumienia wpływu substancji toksycznych na sprawność fizyczną na różnych etapach rozwoju i zbadania wpływu narażenia na zanieczyszczenia z pokolenia na pokolenie. Procedurę zademonstrują dwaj studenci studiów licencjackich z mojego laboratorium badawczego, którzy są częścią społeczności budujących aktywne zaangażowanie w badania naukowe na Uniwersytecie Stanowym Kolorado w Pueblo, Hugh Long i Tyler Harvey. Aby rozpocząć pracę z interesującym Cię zanieczyszczeniem środowiska, najpierw określ 50% śmiertelną dawkę związku Drosophilia.Należy użyć ustalonych metod w celu stworzenia krzywej dawka-odpowiedź. Następnie przygotuj pożywkę wzrostową ze związkiem o pożądanym stężeniu. Na przykład dodaj związek do podwielokrotności wody podczas przygotowywania pożywki instant.Równolegle przygotuj pożywkę kontrolną bez dodatku związku. Aby stworzyć kulturę, z której zbierasz zwierzęta doświadczalne, przenieś dorosłe osobniki reprodukcyjne na pożywkę wzrostową przy użyciu standardowych metod. Ujednolicić liczbę much w fiolce i unikać przepełnienia dorosłych.Następnie wysiaduj muchy w standardowych warunkach przez jeden do czterech dni. Po inkubacji wyrzuć dorosłe osobniki, pozostawiając zapłodnione jaja, aby dojrzały do testów. Następnie należy umieścić fiolki z powrotem w inkubatorze.Ekspozycję można ustawić w dowolnym etapie rozwoju. Ponadto obiekty eksperymentalne mogą być zbierane na dowolnym etapie rozwoju, w zależności od celów eksperymentu. Codziennie sprawdzaj rozwijające się zwierzęta, aby zidentyfikować pierwsze oznaki etapu zainteresowania, takie jak wędrujące larwy trzeciego stadium rozwojowego.Aby przetestować wpływ ekspozycji na wędrujące stadium larwy w trzecim stadium rozwojowym, należy zebrać larwy w ciągu godziny od zapalenia światła, kiedy zaczną wyłaniać się z podłoża pokarmowego. Następnie wylej wodę i przenieś larwy do tkanki laboratoryjnej, aby delikatnie usunąć nadmiar wody. Po wysuszeniu przenieś larwy do odpowiednich probówek w celu zebrania.Aby przetestować wpływ narażenia na osoby dorosłe, należy zebrać nowo zamknięte osoby dorosłe; Znieczulenie dwutlenkiem węgla jest w porządku. Pamiętaj, aby zebrać muchy, zanim osiągną dojrzałość reprodukcyjną i rozpoczną krycie. Podziel muszki na grupy specyficzne dla płci i przenieś je do fiolek wypełnionych kontrolną lub eksperymentalnie zanieczyszczoną pożywką, aby dopasować ją do wcześniej istniejącej ekspozycji.Później, 24 godziny przed pomiarem zanieczyszczeń u dorosłych muszek, przenieś dorosłe osobniki zarówno w pożywce kontrolnej, jak i zanieczyszczonej do fiolki wypełnionej pożywką kontrolną, aby umożliwić dorosłym osobnikom oczyszczenie organizmu z nadmiaru pożywki. Po 24 godzinach pielęgnacji muchy można przetestować przy użyciu odpowiedniej metody. Na przykład zmiany w zachowaniu można przetestować za pomocą testu wyboru krycia.Dzięki tym metodom badania międzypokoleniowych skutków narażenia na zanieczyszczenia są bardzo łatwe. Wystarczy skonfigurować krzyżówki między narażonymi dorosłymi osobnikami na pożywce kontrolnej i zbadać wpływ ekspozycji na Fnot na ich potomstwo. Protokół ten został wykorzystany do oceny akumulacji, eliminacji i sekwestracji ołowiu w tym samym pokoleniu potomstwa.Drosophila łatwo gromadziła ołów w różnych dawkach, etapach rozwoju i skalach ewolucyjnych. Stosując ekspozycję wielopokoleniową, stwierdzono, że narażenie rodziców nie jest przenoszone na pierwsze pokolenie dorosłego potomstwa. W związku z tym, korzystając z tego protokołu, możliwe jest testowanie odpowiedzi adaptacyjnych w różnych skalach ewolucyjnych, a także efektów międzypokoleniowych Fnot ekspozycji.Następnie muchy były hodowane od fazy jaj do dorosłości na pożywce kontrolnej lub ołowiowej i testowane po 24 godzinach od oczyszczenia, testowano preferencje partnera. Samice hodowane na podłożu ołowiowym, preferencyjnie kojarzone samcami narażonymi na ołów w stosunku do samców narażonych na kontakt z grupą kontrolną. Z drugiej strony, mężczyźni nie wykazywali takich samych uprzedzeń.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować i zbierać Drosophila, aby odpowiedzieć na różne pytania i toksykologię. Po opanowaniu tego protokołu można go wykonać w ciągu jednego do dwóch miesięcy, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Próbując wykonać ten zabieg, należy pamiętać o delikatnym obchodzeniu się z muchami, aby nie wywoływać niepotrzebnego stresu.Po tej procedurze można przetestować inne pytania, takie jak pytania behawioralne, genetyczne i neurologiczne. Nie zapominaj, że praca z zanieczyszczeniami może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej i przygotowywanie zanieczyszczeń w kapturze.

experimental-protocol-for-using-drosophila-as-an-invertebrate-model

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Naukowcy używają protokołu długości życia Drosophila do mierzenia, jak różne warunki eksperymentalne wpływają na długowieczność muszek i generowania krzywych przeżycia w tym procesie, aby określić ilościowo wyniki eksperymentu. Protokół próbki obejmuje test stosowany do badania wpływu narażenia na długowieczność substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego lub EDC, takich jak 17-α-etynyloestradiol (EE2).

Protokół długości życia dla Drosophila melanogaster: generowanie krzywych przeżycia w celu identyfikacji różnic w długości życia much

Ten film opisuje test karmienia muszek owocowych, w którym kolorowy pokarm jest używany do monitorowania karmienia oraz wpływ, jaki dodane związki mogą mieć na aktywność żywieniową. Przykładowy protokół testuje działanie kilku substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC).

Test żywieniowy: ocena preferencji żywieniowych u Drosophila melanogaster

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia unikania osób zestresowanych. Ten paradygmat jest potężny, ale przyjazny dla użytkownika i może być wykorzystany do oceny wpływu genów i środowiska na jeden rodzaj interakcji społecznych u Drosophila melanogaster.

Prosty test do ilościowego oznaczania unikania społecznego u Drosophila melanogaster

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący model uszkodzenia neuronów neuronu czuciowego Drosophila - dendrytycznej arboryzacji (da), który łączy obrazowanie na żywo in vivo, dwufotonową laserową aksotomię/dendriotomię oraz potężny zestaw narzędzi genetycznych much, jako platformę do badań przesiewowych potencjalnych promotorów i inhibitorów neuroregeneracji.

Model uszkodzeń Drosophila in vivo do badania neuroregeneracji w obwodowym i ośrodkowym układzie nerwowym

Ten protokół opisuje metodę rejestrowania malejącej aktywności elektrycznej ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster, aby umożliwić ekonomiczne i wygodne testowanie środków farmakologicznych, mutacji genetycznych białek nerwowych i/lub roli niezbadanych ścieżek fizjologicznych.

Elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym

Chemikalia zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC) stanowią poważny problem dla organizmów i środowiska naturalnego. Drosophila melanogaster stanowi idealny model do badania efektów EDC in vivo. W tym miejscu przedstawiamy metody badania zaburzeń endokrynologicznych u Drosophila, odnosząc się do wpływu EDC na płodność, płodność, czas rozwoju i długość życia muchy.

Metody badania zaburzeń endokrynologicznych u Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje efektywną i tanią metodę, która wykorzystuje płynne podłoża do oceny wpływu chemicznych substancji toksycznych na żywotność dorosłego Drosophila melanogaster.

Ocena toksyczności chemicznej u dorosłych osobników Drosophila melanogaster

Protokół przedstawia wysokoprzepustową, opłacalną metodę oceny neurotoksyczności u muszki owocowej poprzez kwantyfikację dysfunkcji lokomotorycznej jako alternatywę dla tradycyjnych modeli ssaków. Ma na celu ocenę neurotoksycznego wpływu związków farmaceutycznych, czynników środowiskowych lub modyfikacji genetycznych przy użyciu czułego, powtarzalnego i etycznie korzystnego modelu.

Analiza behawioralna dysfunkcji narządu ruchu u Drosophila melanogaster jako odczyt neurotoksyczności

W niniejszym filmie zaprezentowano test sprawdzający tolerancję na nikotynę u dwóch rodzajów mszyc: jednej, która żeruje na roślinach tytoniu w polu, oraz drugiej, która tego nie robi.

Badanie tolerancji nikotyny u mszyc z wykorzystaniem eksperymentu z dietą sztuczną

Niniejsza praca dotyczy opracowania i standaryzacji wartościowego protokołu metodycznego służącego do określania długoterminowej (14-dniowej) toksyczności letalnej substancji chemicznych, ścieków przemysłowych lub komunalnych oraz ciekłych próbek środowiskowych wobec słonawodnego skorupiaka Artemia franciscana.

Długoterminowy test toksyczności letalnej z wykorzystaniem skorupiaka Artemia franciscana

Poznaj protokół badania toksyczności zanieczyszczeń na Drosophila w różnych stadiach rozwoju i pokoleniach. Metoda umożliwia analizę wpływu toksykantów na fenotyp oraz przystosowanie ewolucyjne.

Protokół doświadczalny wykorzystania Drosophila jako modelowego systemu bezkręgowców do badań toksyczności w laboratorium

Przeglądaj więcej filmów