Protokół doświadczalny wykorzystania Drosophila jako modelowego systemu bezkręgowców do badań toksyczności w laboratorium

Protokół ten może być wykorzystany do zrozumienia wpływu substancji toksycznych na sprawność fizyczną na różnych etapach rozwoju i zbadania wpływu narażenia na zanieczyszczenia z pokolenia na pokolenie. Procedurę zademonstrują dwaj studenci studiów licencjackich z mojego laboratorium badawczego, którzy są częścią społeczności budujących aktywne zaangażowanie w badania naukowe na Uniwersytecie Stanowym Kolorado w Pueblo, Hugh Long i Tyler Harvey. Aby rozpocząć pracę z interesującym Cię zanieczyszczeniem środowiska, najpierw określ 50% śmiertelną dawkę związku Drosophilia.

Należy użyć ustalonych metod w celu stworzenia krzywej dawka-odpowiedź. Następnie przygotuj pożywkę wzrostową ze związkiem o pożądanym stężeniu. Na przykład dodaj związek do podwielokrotności wody podczas przygotowywania pożywki instant.

Równolegle przygotuj pożywkę kontrolną bez dodatku związku. Aby stworzyć kulturę, z której zbierasz zwierzęta doświadczalne, przenieś dorosłe osobniki reprodukcyjne na pożywkę wzrostową przy użyciu standardowych metod. Ujednolicić liczbę much w fiolce i unikać przepełnienia dorosłych.

Następnie wysiaduj muchy w standardowych warunkach przez jeden do czterech dni. Po inkubacji wyrzuć dorosłe osobniki, pozostawiając zapłodnione jaja, aby dojrzały do testów. Następnie należy umieścić fiolki z powrotem w inkubatorze.

Ekspozycję można ustawić w dowolnym etapie rozwoju. Ponadto obiekty eksperymentalne mogą być zbierane na dowolnym etapie rozwoju, w zależności od celów eksperymentu. Codziennie sprawdzaj rozwijające się zwierzęta, aby zidentyfikować pierwsze oznaki etapu zainteresowania, takie jak wędrujące larwy trzeciego stadium rozwojowego.

Aby przetestować wpływ ekspozycji na wędrujące stadium larwy w trzecim stadium rozwojowym, należy zebrać larwy w ciągu godziny od zapalenia światła, kiedy zaczną wyłaniać się z podłoża pokarmowego. Następnie wylej wodę i przenieś larwy do tkanki laboratoryjnej, aby delikatnie usunąć nadmiar wody. Po wysuszeniu przenieś larwy do odpowiednich probówek w celu zebrania.

Aby przetestować wpływ narażenia na osoby dorosłe, należy zebrać nowo zamknięte osoby dorosłe; Znieczulenie dwutlenkiem węgla jest w porządku. Pamiętaj, aby zebrać muchy, zanim osiągną dojrzałość reprodukcyjną i rozpoczną krycie. Podziel muszki na grupy specyficzne dla płci i przenieś je do fiolek wypełnionych kontrolną lub eksperymentalnie zanieczyszczoną pożywką, aby dopasować ją do wcześniej istniejącej ekspozycji.

Później, 24 godziny przed pomiarem zanieczyszczeń u dorosłych muszek, przenieś dorosłe osobniki zarówno w pożywce kontrolnej, jak i zanieczyszczonej do fiolki wypełnionej pożywką kontrolną, aby umożliwić dorosłym osobnikom oczyszczenie organizmu z nadmiaru pożywki. Po 24 godzinach pielęgnacji muchy można przetestować przy użyciu odpowiedniej metody. Na przykład zmiany w zachowaniu można przetestować za pomocą testu wyboru krycia.

Dzięki tym metodom badania międzypokoleniowych skutków narażenia na zanieczyszczenia są bardzo łatwe. Wystarczy skonfigurować krzyżówki między narażonymi dorosłymi osobnikami na pożywce kontrolnej i zbadać wpływ ekspozycji na Fnot na ich potomstwo. Protokół ten został wykorzystany do oceny akumulacji, eliminacji i sekwestracji ołowiu w tym samym pokoleniu potomstwa.

Drosophila łatwo gromadziła ołów w różnych dawkach, etapach rozwoju i skalach ewolucyjnych. Stosując ekspozycję wielopokoleniową, stwierdzono, że narażenie rodziców nie jest przenoszone na pierwsze pokolenie dorosłego potomstwa. W związku z tym, korzystając z tego protokołu, możliwe jest testowanie odpowiedzi adaptacyjnych w różnych skalach ewolucyjnych, a także efektów międzypokoleniowych Fnot ekspozycji.

Następnie muchy były hodowane od fazy jaj do dorosłości na pożywce kontrolnej lub ołowiowej i testowane po 24 godzinach od oczyszczenia, testowano preferencje partnera. Samice hodowane na podłożu ołowiowym, preferencyjnie kojarzone samcami narażonymi na ołów w stosunku do samców narażonych na kontakt z grupą kontrolną. Z drugiej strony, mężczyźni nie wykazywali takich samych uprzedzeń.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować i zbierać Drosophila, aby odpowiedzieć na różne pytania i toksykologię. Po opanowaniu tego protokołu można go wykonać w ciągu jednego do dwóch miesięcy, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Próbując wykonać ten zabieg, należy pamiętać o delikatnym obchodzeniu się z muchami, aby nie wywoływać niepotrzebnego stresu.

Po tej procedurze można przetestować inne pytania, takie jak pytania behawioralne, genetyczne i neurologiczne. Nie zapominaj, że praca z zanieczyszczeniami może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej i przygotowywanie zanieczyszczeń w kapturze.