Ocena mikroarchitektury zależnej od ciśnienia kolagenu i elastyny w żywych, ludzkich tętnicach oporowych za pomocą bezznacznikowej mikroskopii fluorescencyjnej
9 kwietnia 2018
Opisujemy równoczesne testy mechaniczne i obrazowanie 3D ściany tętniczej izolowanych, żywych tętnic oporowych człowieka, a także analizy obrazów Fiji i Ilastik w celu ilościowego określenia organizacji przestrzennej elastyny i kolagenu oraz gęstości objętościowej. Omówiono wykorzystanie tych danych w modelach matematycznych mechaniki ścian tętnic.
Ogólnym celem tej metodologii jest zapewnienie ustandaryzowanej procedury uzyskiwania obrazów żywych tętnic oporowych człowieka w celu analizy związku między mikroarchitekturą macierzy zewnątrzkomórkowej a mechaniką ściany tętnicy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii i mechaniki naczyń krwionośnych, takie jak to, w jaki sposób ciśnienie indukuje zmiany w ogólnej geometrii, a także mikroarchitekturę ściany naczynia. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie trzeba oznaczać próbki do obrazowania.
Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w mechanikę tętnic oporowych, zmodyfikowaną wersję protokołu można zastosować do innych narządów przypominających rurki, takich jak oskrzela lub do pasków z ludzkiego pęcherza moczowego lub ściany jelita. Na początek należy pobrać interesujące nas próbki tkanek natychmiast po ich wycięciu podczas operacji i przygotować naczynia zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Zwiększ ciśnienie w tętnicy kaniulowanej do pięciu milimetrów słupa rtęci.
Następnie ustaw ścieżkę optyczną do obrazowania, aktywując laser dwufotonowy i ustawiając długość fali wzbudzenia na 820 nanometrów. Włóż zwierciadło dichroiczne o długości 460 nanometrów, aby rozdzielić światło emisyjne między powielacze zdjęć i zebrać emisję jednocześnie w dwóch kanałach. Użyj filtrów pasmowo-przepustowych o szerokości od 30 do 60 nanometrów wyśrodkowanych na 520 nanometrach, aby zebrać autofluorescencję elastyny, a drugiego wyśrodkowanego na 410 nanometrach, aby zebrać sygnał generowania drugiej harmonicznej kolagenu.
Teraz ustaw czas przebywania lasera i piksel na 10 mikrosekund. Ustaw rozdzielczość na 512 na 512 pikseli, aby uzyskać 100%pole widzenia. Włącz ciągłe skanowanie i używaj jak najniższej mocy światła wzbudzenia i czasu przebywania pikseli, aby uniknąć uszkodzenia tętnicy pod napięciem przez zdjęcie.
Następnie ręcznie przeskanuj tętnicę, aby znaleźć płaszczyznę o maksymalnej średnicy. Następnie wybierz prostokątny wycinek zakrywający najszerszą średnicę tętnicy i zeskanuj pojedynczą klatkę o rozmiarze piksela 300 nanometrów na piksel lub mniejszym. Zapisz ten obraz do analizy w późniejszym czasie.
Aby określić średnicę światła i grubość ściany przy maksymalnej średnicy tętnicy, najpierw załaduj obraz w języku Fidżi. Ustaw skalę, klikając menu główne, a następnie przejdź do analizy, a następnie ustaw skalę. Tutaj wprowadź mikrometr na piksel i stosunek pikseli.
Następnie wybierz narzędzie Linia Fidżi i narysuj linię między dwiema wewnętrznymi elastyczną blaszką po obu stronach światła tętnicy. Następnie kliknij Control M, aby zgłosić długość w tabeli wyników. Kontynuuj rysowanie kolejnych linii, aby zmierzyć grubość każdej ściany i zapisać ostateczny pomiar.
Zmień obiektyw na 60-krotny z aperturą numeryczną jedną lub większą. Wyobraź sobie mikroarchitekturę kolagenu i elastyny na poziomie pięciu milimetrów słupa rtęci, skanując całą grubość ściany tętnicy. Następnie zdefiniuj głębokość początkową i końcową stosu Z oraz odstępy między krokami Z i gęstość pikseli.
Projektując stosy Z, upewnij się, że obszar zainteresowania jest wystarczająco mały, aby uniknąć wnioskowania o krzywiźnie podczas późniejszej analizy. Po zakończeniu ustaw każdy kanał tak, aby był zapisywany osobno. Na koniec znajdź od jednego do trzech różnych obszarów zainteresowania i uzyskaj stosy obrazów 3D o dobrej jakości.
Jeśli twoja autofluorescencja elastyny wybiela, używasz zbyt dużej mocy światła wzbudzającego. Należy tego unikać. Aby zakończyć trwający eksperyment, możesz dodać rozcieńczone stężenie eozyny, aby wzmocnić autofluorescencję elastyny.
Po zakończeniu powtórz cały proces przy ciśnieniu zmiennym do 100 milimetrów słupa rtęci, zastępując bufor w komorze miografu świeżym HBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza po każdym kroku ciśnienia. Aby rozpocząć analizę obrazu, otwórz stos obrazów elastyny na Fidżi. Następnie przejdź do obrazu, kliknij stosy i wybierz projekt Z, aby wybrać obrazy do pracy i wybierz maksymalną intensywność jako typ projekcji.
Zapisz projekcję o maksymalnej intensywności jako obraz TIFF. Następnie wybierz jak najwięcej wewnętrznych punktów rozgałęzień włókien blaszki elastycznej i zmierz je za pomocą narzędzia kątowego. Systematycznie przeglądaj każdy obraz, a po zakończeniu zapisz arkusz wyników Fidżi.
Aby zmierzyć falistość kolagenu przybyszowego, otwórz stos obrazów kolagenu na Fidżi. Następnie przejdź do obrazu w dół do stosów i wybierz projekt Z, aby wybrać obrazy do pracy i ustawić projekcję maksymalnej intensywności. Teraz zmień typ obrazu na ośmiobitowy obraz TIFF, klikając obraz, tekst, a następnie ośmiobitowy.
Zapisz projekcję o maksymalnej intensywności jako obraz TIFF. Otwórz wtyczkę Neuron J, klikając Fidżi i wybierając Neuron J w sekcji wtyczki. Następnie otwórz ośmiobitowy plik TIFF w Neuron J. Po otwarciu kliknij dodaj ślady i wybierz włókna do analizy, klikając początek i koniec każdego włókna.
Następnie przejdź do sekcji Pomiary i wybierz opcję Wyświetl śledzenie i pomiary wierzchołków w oknie dialogowym. Aby obliczyć prostoliniowość włókien kolażu, najpierw skopiuj wartości w oknie śledzenia Fidżi do programu Excel. Wartości długości w oknie śledzenia są miarami pełnych długości analizowanych włókien kolagenowych Lf. Po drugie, skopiuj dla każdej wiązki włókien kolagenowych przeanalizowane pierwsze i ostatnie współrzędne XY okna wierzchołków Fidżi do programu Excel.
Następnie oblicz długość linii prostej łączącej każdy koniec analizowanego włókna kolagenowego L0 za pomocą twierdzenia Pitagorasa. Prostoliniowość włókien kolagenowych jest ostatecznie obliczana jako L0/Lf. Zgodnie z przedstawionym właśnie protokołem, zidentyfikowano najszerszą część tętnicy i w tym momencie tętnicę zeskanowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej bez znaczników w celu zmierzenia maksymalnej średnicy naczynia i grubości ściany naczynia.
Wykorzystując większe powiększenie do obiektywu o dużej aperturze numerycznej, można nie tylko zmierzyć średnicę naczynia i grubość ścianki, ale także mikroarchitekturę kolagenu i elastyny. Mikroarchitektury kątów rozgałęzień włókien elastyny i prostoliniowości kolagenu można określić w kolejnych wycinkach obrazu za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu. Pozwala to na bezpośrednią analizę związku między zmianami w mikroarchitekturze kolagenu i elastyny wywołanymi ciśnieniem a przyrostowym modułem sprężystości przy różnych ciśnieniach.
Zgodnie z tą procedurą można również wyodrębnić inne informacje z obrazów. Może to być orientacja aniołów kolagenu przybyszowego wzdłuż osi podłużnej naczynia lub może to być mikroarchitektura macierzy zewnątrzkomórkowej w osłonce pośrodkowej. Miary ilościowe wyodrębnione z obrazów za pomocą tej metody mogą być wprowadzone do modeli matematycznych w celu wyjaśnienia, w jaki sposób zdrowy i zmarły ludzki krążenie reaguje na różne warunki.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dogłębną wiedzę na temat tego, jak projektować eksperymenty obrazowania i późniejszą analizę obrazu, aby uzyskać informacje o tym, jak ciśnienie indukuje zmiany w mikroarchitekturze ściany tętnicy oporowej. Pamiętaj, że podczas pracy z mikroskopią fluorescencyjną wzbudzenia dwufotonowego należy unikać ekspozycji na światło widzialne i niewidzialne.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia zestandaryzowaną metodologię obrazowania żywych ludzkich tętnic oporowych w celu analizy związku między mikroarchitekturą macierzy zewnątrzkomórkowej a mechaniką ściany tętnicy. Technika ta umożliwia ocenę wpływu ciśnienia na geometrię i mikroarchitekturę ściany naczyniowej bez konieczności znakowania próbek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia naczyniowa
- Biomechanika
- Analiza macierzy zewnątrzkomórkowej
Wstęp
- Zrozumienie mechaniki ścian tętnic jest kluczowe dla zdrowia układu naczyniowego.
- Macierz pozakomórkowa odgrywa istotną rolę w strukturze i funkcji naczyń.
- Techniki obrazowania na żywo mogą dostarczyć cennych informacji na temat dynamicznych procesów biologicznych.
- Zmiany w geometrii naczyń indukowane ciśnieniem są istotne dla zrozumienia chorób układu sercowo-naczyniowego.
Cel badania
- Opracowanie metody obrazowania tętnic oporowych bez konieczności znakowania.
- Zbadanie związku między mikroarchitekturą a mechaniką ściany tętnicy.
- Dostarczenie protokołu możliwego do zastosowania w przypadku innych narządów o budowie rurkowej.
Zastosowane metody
- Pobranie próbek tkanek bezpośrednio po wycięciu chirurgicznym.
- Przygotowanie naczyń zgodnie ze szczegółowym protokołem.
- Utrzymanie ciśnienia w kaniulowanych tętnicach na poziomie pięciu mmHg.
- Wykorzystanie programów Fiji i Ilastik do analizy obrazowej elastyny i kolagenu.
Główne wyniki
- Osiągnięto pomyślne obrazowanie żywych ludzkich tętnic oporowych.
- Przeprowadzono kwantyfikację organizacji przestrzennej elastyny i kolagenu.
- Uzyskane dane mogą zostać zintegrowane z matematycznymi modelami mechaniki tętnic.
- Metoda ta wykazuje potencjał do zastosowania w innych układach narządowych.
Wnioski
- Opracowana metodologia pogłębia zrozumienie mechaniki naczyniowej.
- Zapewnia ona nieinwazyjne podejście do badania właściwości ściany tętniczej.
- Technikę tę można dostosować do różnych tkanek biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Zrozumienie indukowanych ciśnieniem zmian mikroarchitektonicznych w tętnicach oporowych wspiera walidację celów w poszukiwaniu leków sercowo-naczyniowych poprzez powiązanie przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej ze stresem hemodynamicznym. To podejście obrazowania bezznakowego umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów naczyniowych dzięki ilościowej ocenie reorganizacji kolagenu i elastyny pod wpływem ciśnień istotnych fizjologicznie. Metoda ta zapewnia pewność prognostyczną dla modeli przedklinicznych, dostarczając powtarzalnych, niezależnych od znakowania danych strukturalnych, które mogą służyć jako podstawa dla matematycznych modeli mechaniki tętnic.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez kwantyfikację zależnych od ciśnienia zmian w kątach rozgałęzień włókien elastyny oraz prostoliniowości kolagenu jako bezpośrednich wskaźników przebudowy ściany naczyniowej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia obrazowanie żywej tkanki bez użycia znaczników, co pozwala uniknąć markerów egzogennych i zachować natywną mikroarchitekturę dla dokładnej oceny mechanistycznej.
- Wartość prognostyczna: Wspiera walidację modeli przedklinicznych poprzez generowanie ilościowych parametrów mikroarchitektonicznych (np. prostoliniowości kolagenu, uporządkowania elastyny), które korelują ze sztywnością mechaniczną i progresją choroby.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Pozwala na uzyskanie standaryzowanych, powtarzalnych stosów obrazów 3D mikroarchitektury elastyny i kolagenu, które mogą służyć do ustalenia bazowych fenotypów naczyniowych w kampaniach przesiewowych związków chemicznych.
- Wynik ilościowy: Dostarcza mierzalnych punktów końcowych, takich jak kąty rozgałęzienia wewnętrznej błony elastycznej oraz stopień prostoliniowości włókien kolagenowych (L0/Lf), odpowiednich do analizy wysokotreściowej (high-content analysis) i modelowania zależności dawka-odpowiedź.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Adaptacyjność protokołu do innych narządów o budowie rurkowatej (np. oskrzeli, ściany jelita) wspiera walidację celów w różnych tkankach oraz przenaszalność testu pomiędzy programami badawczymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie kliniczne: Bezpośrednio odnosi się do mechanizmów patogennych w nadciśnieniu tętniczym, cukrzycy i zespole metabolicznym, w których przebudowa tętnic oporowych jest znanym czynnikiem przyczyniającym się do rozwoju choroby.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z etapami przedklinicznymi, dostarczając danych mikroarchitektonicznych pochodzenia ludzkiego, które mogą zostać zintegrowane z modelami obliczeniowymi w celu przewidywania odpowiedzi in vivo na interwencje farmakologiczne.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) na podstawie tego, czy testowane związki normalizują zmiany mikroarchitektoniczne wywołane ciśnieniem, co redukuje ryzyko niepowodzeń w późnych fazach badań wynikających z nieprzewidzianej toksyczności naczyniowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkrywania leków, od walidacji celu po ocenę przedkliniczną, oferując platformę odpowiadającą warunkom ludzkim do oceny wpływu związków kandydujących na dynamikę zewnątrzkomórkowej macierzy naczyniowej w warunkach fizjologicznego ciśnienia.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez umożliwienie bezpośredniej obserwacji wpływu ciśnienia na mikroarchitekturę elastyny i kolagenu, co wyjaśnia mechanizmy sztywnienia i przebudowy naczyń krwionośnych.
- Screening: Generuje zestandaryzowane, ilościowe wyniki oparte na obrazowaniu (np. prostoliniowość włókien, kąty rozgałęzień), które nadają się do automatyzacji i analizy wieloparametrycznej w kaskadach przesiewowych.
- Analityka: Dostarcza wskaźników strukturalnych wykorzystywanych w modelach matematycznych mechaniki ścian tętnic, co pozwala zespołom badawczym korelować zmiany mikroarchitektoniczne z wynikami funkcjonalnymi, takimi jak przyrostowy moduł sprężystości.
- Badania translacyjne: Wykorzystują żywe ludzkie tętnice oporowe, aby zapewnić istotność w kontekście chorób oraz zwiększyć moc prognostyczną przy ekstrapolacji wyników na kliniczne reakcje naczyniowe.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny schemat obrazowania i analizy, który można zastosować w programach badawczych nad chorobami sercowo-naczyniowymi, metabolicznymi i włóknistymi w zakresie przebudowy naczyń.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność w odniesieniu do celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności w sposobie, w jaki naczyniowa macierz zewnątrzkomórkowa reaguje na stres hemodynamiczny, będący kluczowym czynnikiem w patogenezie sercowo-naczyniowej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki zestandaryzowanym etapom zmian ciśnienia, parametrom obrazowania oraz zwalidowanym potokom analizy z wykorzystaniem programów Fiji i Ilastik.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne wykrywanie wad naczyniowych, co zmniejsza odsetek niepowodzeń w późniejszych etapach przedklinicznych lub klinicznych.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ich zdolność do łagodzenia indukowanego ciśnieniem nieadaptacyjnego przebudowywania w ludzkich tętnicach oporowych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu manipulacji tkankami naczyniowymi, mikroskopii dwufotonowej oraz myografii ciśnieniowej w celu utrzymania żywotności tętnicy i jakości obrazu podczas etapów ciśnieniowych.
- Metoda jest zależna od specjalistycznej aparatury, w tym regulowanego lasera dwufotonowego, obiektywów o wysokiej aperturze numerycznej (60X, NA ≥1.0), luster dichroicznych oraz filtrów pasmowych do jednoczesnej detekcji sygnałów elastyny i kolagenu.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie biologii, obrazowania i analizy w celu zapewnienia spójnej akwizycji stosów Z (Z-stack), wyboru obszarów zainteresowania (ROI) oraz zastosowania narzędzi Neuron J i Fiji do śledzenia włókien i pomiaru kątów.
- Adaptacja do tkanek niehumanoidalnych lub zmienionych chorobowo może wymagać optymalizacji mocy wzbudzenia w celu zapobiegania fotobleachingowi, szczególnie w przypadku autofluorescencji elastyny, oraz walidacji wskaźników strukturalnych w różnych gatunkach lub stanach patologicznych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują techniczne trudności w utrzymaniu perfuzji żywej tętnicy podczas długich sesji obrazowania oraz konieczność starannego sekwencjonowania kroków ciśnieniowych, aby uniknąć uszkodzeń mechanicznych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
1:02
Imaging of the Artery Using TPEM
2:47
Diameter and Wall Thickness Measurement
3:33
Imaging the Collagen and Elastin Microarchitecture
5:10
Image Analysis Internal Elastic Lamina Branching Angles
5:51
Image Analysis - Collagen Fiber Straightness
7:46
Results: Measurement of the Microstructural Changes in Adventitial Collagen and the Internal Elastic Lamina in Response to Vessel Pressure
8:48
Conclusion
