Ocena mikroarchitektury zależnej od ciśnienia kolagenu i elastyny w żywych, ludzkich tętnicach oporowych za pomocą bezznacznikowej mikroskopii fluorescencyjnej
April 9th, 2018
Opisujemy równoczesne testy mechaniczne i obrazowanie 3D ściany tętniczej izolowanych, żywych tętnic oporowych człowieka, a także analizy obrazów Fiji i Ilastik w celu ilościowego określenia organizacji przestrzennej elastyny i kolagenu oraz gęstości objętościowej. Omówiono wykorzystanie tych danych w modelach matematycznych mechaniki ścian tętnic.
Ogólnym celem tej metodologii jest zapewnienie ustandaryzowanej procedury uzyskiwania obrazów żywych tętnic oporowych człowieka w celu analizy związku między mikroarchitekturą macierzy zewnątrzkomórkowej a mechaniką ściany tętnicy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii i mechaniki naczyń krwionośnych, takie jak to, w jaki sposób ciśnienie indukuje zmiany w ogólnej geometrii, a także mikroarchitekturę ściany naczynia. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie trzeba oznaczać próbki do obrazowania.
Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w mechanikę tętnic oporowych, zmodyfikowaną wersję protokołu można zastosować do innych narządów przypominających rurki, takich jak oskrzela lub do pasków z ludzkiego pęcherza moczowego lub ściany jelita. Na początek należy pobrać interesujące nas próbki tkanek natychmiast po ich wycięciu podczas operacji i przygotować naczynia zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Zwiększ ciśnienie w tętnicy kaniulowanej do pięciu milimetrów słupa rtęci.
Następnie ustaw ścieżkę optyczną do obrazowania, aktywując laser dwufotonowy i ustawiając długość fali wzbudzenia na 820 nanometrów. Włóż zwierciadło dichroiczne o długości 460 nanometrów, aby rozdzielić światło emisyjne między powielacze zdjęć i zebrać emisję jednocześnie w dwóch kanałach. Użyj filtrów pasmowo-przepustowych o szerokości od 30 do 60 nanometrów wyśrodkowanych na 520 nanometrach, aby zebrać autofluorescencję elastyny, a drugiego wyśrodkowanego na 410 nanometrach, aby zebrać sygnał generowania drugiej harmonicznej kolagenu.
Teraz ustaw czas przebywania lasera i piksel na 10 mikrosekund. Ustaw rozdzielczość na 512 na 512 pikseli, aby uzyskać 100%pole widzenia. Włącz ciągłe skanowanie i używaj jak najniższej mocy światła wzbudzenia i czasu przebywania pikseli, aby uniknąć uszkodzenia tętnicy pod napięciem przez zdjęcie.
Następnie ręcznie przeskanuj tętnicę, aby znaleźć płaszczyznę o maksymalnej średnicy. Następnie wybierz prostokątny wycinek zakrywający najszerszą średnicę tętnicy i zeskanuj pojedynczą klatkę o rozmiarze piksela 300 nanometrów na piksel lub mniejszym. Zapisz ten obraz do analizy w późniejszym czasie.
Aby określić średnicę światła i grubość ściany przy maksymalnej średnicy tętnicy, najpierw załaduj obraz w języku Fidżi. Ustaw skalę, klikając menu główne, a następnie przejdź do analizy, a następnie ustaw skalę. Tutaj wprowadź mikrometr na piksel i stosunek pikseli.
Następnie wybierz narzędzie Linia Fidżi i narysuj linię między dwiema wewnętrznymi elastyczną blaszką po obu stronach światła tętnicy. Następnie kliknij Control M, aby zgłosić długość w tabeli wyników. Kontynuuj rysowanie kolejnych linii, aby zmierzyć grubość każdej ściany i zapisać ostateczny pomiar.
Zmień obiektyw na 60-krotny z aperturą numeryczną jedną lub większą. Wyobraź sobie mikroarchitekturę kolagenu i elastyny na poziomie pięciu milimetrów słupa rtęci, skanując całą grubość ściany tętnicy. Następnie zdefiniuj głębokość początkową i końcową stosu Z oraz odstępy między krokami Z i gęstość pikseli.
Projektując stosy Z, upewnij się, że obszar zainteresowania jest wystarczająco mały, aby uniknąć wnioskowania o krzywiźnie podczas późniejszej analizy. Po zakończeniu ustaw każdy kanał tak, aby był zapisywany osobno. Na koniec znajdź od jednego do trzech różnych obszarów zainteresowania i uzyskaj stosy obrazów 3D o dobrej jakości.
Jeśli twoja autofluorescencja elastyny wybiela, używasz zbyt dużej mocy światła wzbudzającego. Należy tego unikać. Aby zakończyć trwający eksperyment, możesz dodać rozcieńczone stężenie eozyny, aby wzmocnić autofluorescencję elastyny.
Po zakończeniu powtórz cały proces przy ciśnieniu zmiennym do 100 milimetrów słupa rtęci, zastępując bufor w komorze miografu świeżym HBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza po każdym kroku ciśnienia. Aby rozpocząć analizę obrazu, otwórz stos obrazów elastyny na Fidżi. Następnie przejdź do obrazu, kliknij stosy i wybierz projekt Z, aby wybrać obrazy do pracy i wybierz maksymalną intensywność jako typ projekcji.
Zapisz projekcję o maksymalnej intensywności jako obraz TIFF. Następnie wybierz jak najwięcej wewnętrznych punktów rozgałęzień włókien blaszki elastycznej i zmierz je za pomocą narzędzia kątowego. Systematycznie przeglądaj każdy obraz, a po zakończeniu zapisz arkusz wyników Fidżi.
Aby zmierzyć falistość kolagenu przybyszowego, otwórz stos obrazów kolagenu na Fidżi. Następnie przejdź do obrazu w dół do stosów i wybierz projekt Z, aby wybrać obrazy do pracy i ustawić projekcję maksymalnej intensywności. Teraz zmień typ obrazu na ośmiobitowy obraz TIFF, klikając obraz, tekst, a następnie ośmiobitowy.
Zapisz projekcję o maksymalnej intensywności jako obraz TIFF. Otwórz wtyczkę Neuron J, klikając Fidżi i wybierając Neuron J w sekcji wtyczki. Następnie otwórz ośmiobitowy plik TIFF w Neuron J. Po otwarciu kliknij dodaj ślady i wybierz włókna do analizy, klikając początek i koniec każdego włókna.
Następnie przejdź do sekcji Pomiary i wybierz opcję Wyświetl śledzenie i pomiary wierzchołków w oknie dialogowym. Aby obliczyć prostoliniowość włókien kolażu, najpierw skopiuj wartości w oknie śledzenia Fidżi do programu Excel. Wartości długości w oknie śledzenia są miarami pełnych długości analizowanych włókien kolagenowych Lf. Po drugie, skopiuj dla każdej wiązki włókien kolagenowych przeanalizowane pierwsze i ostatnie współrzędne XY okna wierzchołków Fidżi do programu Excel.
Następnie oblicz długość linii prostej łączącej każdy koniec analizowanego włókna kolagenowego L0 za pomocą twierdzenia Pitagorasa. Prostoliniowość włókien kolagenowych jest ostatecznie obliczana jako L0/Lf. Zgodnie z przedstawionym właśnie protokołem, zidentyfikowano najszerszą część tętnicy i w tym momencie tętnicę zeskanowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej bez znaczników w celu zmierzenia maksymalnej średnicy naczynia i grubości ściany naczynia.
Wykorzystując większe powiększenie do obiektywu o dużej aperturze numerycznej, można nie tylko zmierzyć średnicę naczynia i grubość ścianki, ale także mikroarchitekturę kolagenu i elastyny. Mikroarchitektury kątów rozgałęzień włókien elastyny i prostoliniowości kolagenu można określić w kolejnych wycinkach obrazu za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu. Pozwala to na bezpośrednią analizę związku między zmianami w mikroarchitekturze kolagenu i elastyny wywołanymi ciśnieniem a przyrostowym modułem sprężystości przy różnych ciśnieniach.
Zgodnie z tą procedurą można również wyodrębnić inne informacje z obrazów. Może to być orientacja aniołów kolagenu przybyszowego wzdłuż osi podłużnej naczynia lub może to być mikroarchitektura macierzy zewnątrzkomórkowej w osłonce pośrodkowej. Miary ilościowe wyodrębnione z obrazów za pomocą tej metody mogą być wprowadzone do modeli matematycznych w celu wyjaśnienia, w jaki sposób zdrowy i zmarły ludzki krążenie reaguje na różne warunki.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dogłębną wiedzę na temat tego, jak projektować eksperymenty obrazowania i późniejszą analizę obrazu, aby uzyskać informacje o tym, jak ciśnienie indukuje zmiany w mikroarchitekturze ściany tętnicy oporowej. Pamiętaj, że podczas pracy z mikroskopią fluorescencyjną wzbudzenia dwufotonowego należy unikać ekspozycji na światło widzialne i niewidzialne.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia standaryzowaną metodologię obrazowania żywych ludzkich tętniczek rezystancji w celu analizy związku między mikroarchitekturą macierzy zewnątrzkomórkowej a mechaniką ściany tętniczej. Technika ta umożliwia ocenę, w jaki sposób ciśnienie wpływa na geometrię i mikroarchitekturę ściany naczyniowej bez konieczności oznaczania próbki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia naczyniowa
- Biomechanika
- Analiza macierzy zewnątrzkomórkowej
Tło
- Rozumienie mechaniki ściany tętniczej jest kluczowe dla zdrowia naczyń.
- Macierz zewnątrzkomórkowa odgrywa znaczącą rolę w strukturze i funkcji naczyń.
- Techniki obrazowania na żywo mogą dostarczyć informacji o dynamicznych procesach biologicznych.
- Zmiany wywołane ciśnieniem w geometrii naczyń są ważne dla zrozumienia chorób układu krążenia.
Cel badania
- Opracowanie metody obrazowania tętniczek rezystancji bez oznaczania.
- Zbadanie związku między mikroarchitekturą a mechaniką ściany tętniczej.
- Dostarczenie protokołu nadającego się do zastosowania w innych rurkowatych narządach.
Stosowane metody
- Zbieranie próbek tkankowych natychmiast po wycięciu chirurgicznym.
- Przygotowanie naczyń zgodnie z szczegółowym protokołem.
- Nadawanie ciśnienia zakannolizowanym tętnikom do pięciu milimetrów rtęci.
- Wykorzystanie Fiji i Ilastik do analizy obrazów elastyny i kolagenu.
Główne wyniki
- Udało się uzyskać udane obrazy żywych ludzkich tętniczek rezystancji.
- Przeprowadzono ilościową analizę przestrzennej organizacji elastyny i kolagenu.
- Uzyskane dane mogą być zintegrowane z matematycznymi modelami mechaniki tętniczej.
- Metoda ta wykazuje potencjał do zastosowania w innych układach narządowych.
Wnioski
- Opracowany metodologia poprawia rozumienie mechaniki naczyniowej.
- Dostawia nieinwazyjne podejście do badania właściwości ściany tętniczej.
- Ta technika może być dostosowana do różnych tkanek biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding pressure-induced microarchitectural changes in resistance arteries supports target validation in cardiovascular drug discovery by linking extracellular matrix remodeling to hemodynamic stress. This label-free imaging approach enables mechanistic de-risking of vascular targets through quantitative assessment of collagen and elastin reorganization under physiologically relevant pressures. The method provides predictive confidence for preclinical models by delivering reproducible, label-independent structural data that can inform mathematical models of arterial mechanics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying pressure-dependent changes in elastin fiber branching angles and collagen straightness as direct readouts of vascular wall remodeling.
- Operational Value: Provides label-free, live-tissue imaging that avoids exogenous markers, preserving native microarchitecture for accurate mechanistic assessment.
- Predictive Value: Supports preclinical model validation by generating quantitative microarchitectural parameters (e.g., collagen straightness, elastin alignment) that correlate with mechanical stiffness and disease progression.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, reproducible 3D image stacks of elastin and collagen microarchitecture that can be used to establish baseline vascular phenotypes for compound screening campaigns.
- Quantitative Output: Delivers measurable endpoints such as internal elastic lamina branching angles and collagen fiber straightness (L0/Lf) suitable for high-content analysis and dose-response modeling.
- Platform Reuse: The protocol’s adaptability to other tube-like organs (e.g., bronchi, intestinal wall) supports cross-tissue target validation and assay portability across discovery programs.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly addresses pathogenic mechanisms in hypertension, diabetes, and metabolic syndrome where resistance artery remodeling is a known contributor.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by providing human-derived microarchitectural data that can be integrated into computational models to predict in vivo responses to pharmacological interventions.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on whether test compounds normalize pressure-induced microarchitectratic changes, reducing late-stage failure due to unanticipated vascular toxicity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical assessment, offering a human-relevant platform to evaluate how candidate compounds affect vascular extracellular matrix dynamics under physiological pressure conditions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling direct observation of how pressure alters elastin and collagen microarchitecture, clarifying mechanisms of vascular stiffening and remodeling.
- Screening: Generates standardized, quantitative image-based readouts (e.g., fiber straightness, branching angles) that are amenable to automation and multi-parametric analysis in screening cascades.
- Analytics: Outputs structural metrics that feed into mathematical models of arterial wall mechanics, allowing teams to correlate microarchitectural changes with functional outcomes like incremental elastic modulus.
- Translational Research: Uses live human resistance arteries to ensure disease relevance and improve predictive power when extrapolating findings to clinical vascular responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis workflow applicable across cardiovascular, metabolic, and fibrotic disease programs studying vascular remodeling.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by reducing ambiguity in how vascular extracellular matrix responds to hemodynamic stress, a key factor in cardiovascular pathogenesis.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized pressure steps, imaging parameters, and validated analysis pipelines using Fiji and Ilastik.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of vascular liabilities, thereby reducing attrition in later preclinical or clinical stages.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to mitigate pressure-induced maladaptive remodeling in human resistance arteries.
Implementation Considerations
- Requires expertise in vascular tissue handling, two-photon microscopy, and pressure myography to maintain artery viability and image quality during pressurization steps.
- Dependent on specialized instrumentation including tunable two-photon laser, high-NA objectives (60X, NA ≥1.0), dichroic mirrors, and bandpass filters for simultaneous elastin and collagen signal detection.
- Necessitates cross-team standardization between biology, imaging, and analysis teams to ensure consistent Z-stack acquisition, region-of-interest selection, and application of Neuron J and Fiji tools for fiber tracing and angle measurement.
- Adaptation to non-human or diseased tissues may require optimization of excitation power to prevent photobleaching, particularly for elastin autofluorescence, and validation of structural metrics across species or pathology states.
- Practical limitations include the technical challenge of maintaining live artery perfusion during extended imaging sessions and the need for careful pressure-step sequencing to avoid mechanical damage.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:02
Imaging of the Artery Using TPEM
2:47
Diameter and Wall Thickness Measurement
3:33
Imaging the Collagen and Elastin Microarchitecture
5:10
Image Analysis Internal Elastic Lamina Branching Angles
5:51
Image Analysis - Collagen Fiber Straightness
7:46
Results: Measurement of the Microstructural Changes in Adventitial Collagen and the Internal Elastic Lamina in Response to Vessel Pressure
8:48
Conclusion
