Name: Ocena mikroarchitektury zależnej od ciśnienia kolagenu i elastyny w żywych, ludzkich tętnicach oporowych za pomocą bezznacznikowej mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Poznaj metodę bezznacznikowej mikroskopii fluorescencyjnej do analizy mikroarchitektury kolagenu i elastyny w żywych ludzkich tętnicach oporowych pod wpływem ciśnienia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Duńskiemu Centrum Obrazowania Biomedycznego na Wydziale Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu Południowej Danii za korzystanie z laboratoriów i mikroskopów. Kristoffer Rosenstand i Ulla Melchior są znani z doskonałej pomocy technicznej w zakresie miografii ciśnieniowej i obrazowania.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Praca ta stanowi naszą sugestię dotyczącą znormalizowanego, połączonego podejścia do obrazowania i miografii ciśnieniowej, cennego dla jednoczesnej oceny właściwości mechanicznych tętnic oporowych i związanych z ciśnieniem zmian w strukturze ściany tętnicy w zakresie ciśnienia od 0 do 100 mmHg. Przedstawione podejście zostało opracowane przy użyciu specjalnie skonstruowanego sprzętu, jednak można użyć dowolnego miografu ciśnieniowego, który pasuje do mikroskopu fluorescencyjnego wzbudzenia dwufotonowego, gdy konstrukcja ...

Patogenny wkład i efekty przebudowy tętnicy opornej są udokumentowane w pierwotnym nadciśnieniu, cukrzycy i zespole metabolicznym1,2,3,4,5. Rozszyfrowanie związku między właściwościami mechanicznymi i mikroarchitektonicznymi ściany mikronaczyniowej jest niezbędne do opracowania modeli matematycznych tego związku. Takie modele przyczynią się do lepszego zrozumienia procesu przebudowy i pomogą w opracowaniu modeli in silico przydatnych do testowania strategii farmakologicznych ukierunkowanych na remodeling ściany tętnicy związany z chorobą.
Wcześniejsze badania koncentrowały się na zrozumieniu, w jaki sposób mikroarchitektura ściany tętnicy odnosi się do mechaniki ściany tętnicy poprzez włączenie środków mechanicznych, a mikroarchitektura macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) jest prawie wyłącznie wykonywana na dużych, elastycznych tętnicach przewodowych myszy lub świń6,7,8,9,10,11. Obrazowanie mikrostruktur ściany jest zwykle wykonywane przy użyciu nieliniowych technik optycznych, wykorzystujących autofluorescencję elastyny i generowanie drugiej harmonicznej przez kolagen. Umożliwia to obrazowanie czasoprzestrzenne dwóch głównych składników macierzy zewnątrzkomórkowej, elastyny i kolagenu, bez konieczności barwienia. Obrazowanie ściany tętnicy w pełnej grubości jest wyzwaniem w dużych tętnicach przewodowych ze względu na rozproszenie światła w grubej osłonce. Jednak, aby określić, w jaki sposób mikroarchitektura elementów strukturalnych ściany tętnicy odnosi się do obserwowanych właściwości mechanicznych, podczas badań mechanicznych należy uzyskać informacje trójwymiarowe. W przypadku dużych tętnic, takich jak ludzka aorta, wymaga to montażu dwuosiowego, testów mechanicznych i obrazowania obszarów zainteresowania w 1-2 cm2 kawałkach ściany tętnicy7,9,10,12. Tylko część ściany może być zobrazowana i przetestowana mechanicznie.
Dla mniejszych tętnic dowolnego gatunku (np. ludzkie okołosercowe13, pulmonary14 i podskórne15 tętnice, tętnice krezkowe szczura16,17,18,19,20, krezka, mózgowa, udowa i tętnice szyjne21,22,23,24,25,26,27) Obrazowanie całej grubości ścianki jest możliwe i może być połączone z testami mechanicznymi. Pozwala to na jednoczesną rejestrację właściwości mechanicznych i układów konstrukcyjnych w obrębie ściany. Jednakże, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, bezpośrednie modelowanie matematyczne związku między obserwowanymi zmianami w trójwymiarowej strukturze ECM a zmienionymi właściwościami mechanicznymi ściany tętnicy oporowej, zostało według naszej najlepszej wiedzy dopiero niedawno opisane w ludzkich tętnicach oporowych13,15.
W tej pracy opisana jest metoda ex vivo do pasywnych testów mechanicznych i jednoczesnego trójwymiarowego obrazowania mikroarchitektury elastyny i kolagenu w ścianie tętniczej izolowanych tętnic oporowych u ludzi. Protokół obrazowania może być stosowany do tętnic oporowych dowolnego gatunku będącego przedmiotem zainteresowania. Analizy obrazu opisano w celu uzyskania pomiarów wewnętrznych kątów rozgałęzień blaszki elastycznej i przybyszowej prostoliniowości kolagenu13 przy użyciu Fiji28. Gęstości objętościowe kolagenu i elastyny są określane za pomocą oprogramowania Ilastik29 i na koniec omówiono włączenie danych mechanicznych i obrazowych do modeli matematycznych mechaniki ściany tętnicy.
Celem opisania technik obrazowania i analizy obrazów w połączeniu z modelowaniem matematycznym jest dostarczenie badaczom systematycznego podejścia do opisu i zrozumienia obserwowanych zmian wywołanych ciśnieniem w ECM tętnic oporowych. Opisana metoda koncentruje się na ilościowym określeniu zmian ECM w naczyniu podczas zwiększania ciśnienia, poprzez porównanie struktury ECM przy 20, 40 i 100 mmHg. Ciśnienia te zostały wybrane do określenia struktury ściany tętnicy w jej bardziej podatnym (20 mmHg), sztywnym (100 mmHg) i pośrednim (40 mmHg) stanie, odpowiednio. Jednak każdy proces zachodzący w ścianie naczyniowej żywych tętnic, w tym zmiany wywołane przez składniki wazoaktywne, histerezę i przepływ, można określić ilościowo, w zależności od hipotezy badawczej kwestionowanej przez badacza.
Podkreśla się użycie mikroskopii fluorescencyjnej wzbudzenia dwufotonowego (TPEM) w połączeniu z miografem ciśnienia do badania zmian wywołanych ciśnieniem (lub innymi) zmianami w ECM tętnic pod napięciem. Po pierwsze dlatego, że pozwala to na jednoczesne uzyskanie ogólnej trójwymiarowej struktury ściany tętnicy (średnicy i grubości ścianki) wraz z trójwymiarowym pozyskiwaniem wysokiej jakości, szczegółowych obrazów mikroarchitektur kolagenu i elastyny bez użycia znaczników, zgodnie z opisem13 poprzez wykorzystanie autofluorescencji elastyny i sygnału drugiej harmonicznej generacji kolagenu (SHG)30. Po drugie, TPEM pozwala na wykorzystanie niskoenergetycznego światła wzbudzenia w bliskiej podczerwieni, minimalizując fotouszkodzenia tkanki, a tym samym dozwolone jest wielokrotne obrazowanie w dokładnie tej samej pozycji w ścianie naczynia krwionośnego, co pozwala na wielokrotne analizy obserwowanych zmian.
Omówiono użycie alternatywnego podejścia wykorzystującego obrazowanie konfokalne tętnic stałych ciśnieniowo, aby umożliwić użytkownikom bez dostępu do TPEM możliwość korzystania z opisanej metody. Informacje o strukturze ECM i gęstości objętościowej można również uzyskać z dwuwymiarowych analiz tkanek podzielonych szeregowo, np. zgodnie z opisem przez31,32. Jednak ze względu na brak możliwości uzyskania trójwymiarowych informacji strukturalnych w skalach długości tętnicy, a także podczas zmieniających się warunków przy użyciu tej metody, nie zaleca się stosowania tego podejścia do badań ciśnienia i wywołanych leczeniem zmian trójwymiarowych w ECM.
Minimalnym wymogiem dla badacza do zastosowania opisanej tutaj metody jest dostęp do zestawu do kaniulacji i zwiększania ciśnienia w tętnicach w połączeniu z konfokalnym lub dwufotonowym mikroskopem fluorescencyjnym wzbudzenia. Konfiguracja opisana w poniższym protokole to zbudowany na zamówienie miograf ciśnieniowy z przetwornikiem siły podłużnej, zbudowany tak, aby pasował do specjalnie zbudowanego mikroskopu fluorescencyjnego z odwróconym wzbudzeniem dwufotonowym.

<table><tbody><tr><td>Narzędzia Fine Science</td><td>15401-12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia Fine Science</td><td>11251-23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dania.</td><td>761028</td><td>do celów preparacyjnych</td><td></td></tr><tr><td>Vitrex Medical A/S, Herlev, Dania</td><td>1.63, 2.13, 210mm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Smiths medical Intl, Wielka Brytania</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethicon</td><td>Ethilon 11-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zbudowany</td><td></td> na zamówienie <td>DK numer patentu 201200167, Uniwersytet Południowej Danii, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt</td><td></td></tr><tr><td>Mettler toledo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dania.</td><td>B3259</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dania.</td><td>A7030</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dania.</td><td>C5670</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dania.</td><td>G7021</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dania.</td><td>E3889</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Merck Millipore, Hellerup, Dania</td><td>1.00496.9010</td><td>Buforowany fosforanem (pH 6,9) 4% roztwór formaldehydu&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dania.</td><td>H3784</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dania.</td><td>P9666</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dania.</td><td>P5655</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dania.</td><td>M2643</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dania.</td><td>S2002</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dania.</td><td>S5886</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dania.</td><td>S5761</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dania.</td><td>1.06462</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>10010015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dania.</td><td>PHR1423</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Dania.</td><td>Z370525</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Tocris Bioscience, Bristol, Wielka Brytania</td><td>538944</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>Custom built</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectra Physics, Mountain View, CA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu, Ballerup, Dania</td><td>H7422P-40</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akcje AHF analysentechnik AG (T&uuml; Bingen, Niemcy).</td><td>ChromaET 460 nm długoprzepustowy dichroiczny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AHF analysentechnik AG (T&uuml; Bingen, Niemcy).</td><td>Filtr Semrock FF01-520/35-25 BrightLine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AHF analysentechnik AG (T&uuml; Bingen, Niemcy).</td><td>Chroma ET402/15X&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grubość szkiełka nakrywkowego Scotch TM powinna pasować do używanego obiektywu pod mikroskopem (#1 lub #1.5), alternatywnie ustaw kołnierz regulacyjny tak, aby pasował do szkiełka</td><td></td><td></td> nakrywkowego<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena mikroarchitektury zależnej od ciśnienia kolagenu i elastyny w żywych, ludzkich tętnicach oporowych za pomocą bezznacznikowej mikroskopii fluorescencyjnej

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

Patogenny wkład przebudowy tętnicy opornej jest udokumentowany w nadciśnieniu tętniczym, cukrzycy i zespole metabolicznym. Badania i rozwój mikrostrukturalnie motywowanych modeli matematycznych w celu zrozumienia właściwości mechanicznych tętnic oporowych człowieka w zdrowiu i chorobie mogą pomóc w zrozumieniu, w jaki sposób choroby i leczenie wpływają na mikrokrążenie u ludzi. Aby opracować te modele matematyczne, konieczne jest rozszyfrowanie związku między właściwościami mechanicznymi i mikroarchitektonicznymi ściany mikronaczyniowej. W niniejszej pracy opisano metodę ex vivo pasywnych badań mechanicznych i jednoczesnego bezznacznikowego trójwymiarowego obrazowania mikroarchitektury elastyny i kolagenu w ścianie tętniczej izolowanych tętnic oporowych człowieka. Protokół obrazowania może być stosowany do tętnic oporowych dowolnego gatunku będącego przedmiotem zainteresowania. Analizy obrazów opisano w celu ilościowego określenia i) wywołanych ciśnieniem zmian w kątach rozgałęzień wewnętrznej blaszki elastycznej i przybyszowej prostoliniowości kolagenu przy użyciu Fidżi oraz ii) gęstości objętościowych kolagenu i elastyny określonych za pomocą oprogramowania Ilastik. Preferencyjnie, aby wszystkie pomiary mechaniczne i obrazowe były wykonywane na żywych, perfuzjonych tętnicach, jednak omówiono alternatywne podejście wykorzystujące standardową wideomikroskopię miografii ciśnieniowej w połączeniu z obrazowaniem po fiksacji naczyń krwionośnych. Ta alternatywna metoda zapewnia użytkownikom różne opcje podejść do analizy. Omówiono włączenie danych mechanicznych i obrazowych do matematycznych modeli mechaniki ściany tętnicy oraz zaproponowano przyszły rozwój i uzupełnienie protokołu.

Specjalnie skonstruowany myograf ciśnieniowy do obrazowania wykorzystany w tej pracy przedstawiono na Rysunku 1. Podczas projektowania myografu szczególną uwagę poświęcono: i) komorze o małej objętości (2 mL) oraz ii) możliwości rozmieszczenia kaniul blisko i równolegle do szklanego dna (Rysunek 1B). Dno komory jest dopasowane do szklanego okładki nr 1.5 o wymiarach 50 × 24 mm (wymienna). Kontroler ciśnienia został zbudowany ze s...

Opisujemy równoczesne testy mechaniczne i obrazowanie 3D ściany tętniczej izolowanych, żywych tętnic oporowych człowieka, a także analizy obrazów Fiji i Ilastik w celu ilościowego określenia organizacji przestrzennej elastyny i kolagenu oraz gęstości objętościowej. Omówiono wykorzystanie tych danych w modelach matematycznych mechaniki ścian tętnic.

Ocena mikroarchitektury zależnej od ciśnienia kolagenu i elastyny w żywych, ludzkich tętnicach oporowych za pomocą bezznacznikowej mikroskopii fluorescencyjnej

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Ogólnym celem tej metodologii jest zapewnienie ustandaryzowanej procedury uzyskiwania obrazów żywych tętnic oporowych człowieka w celu analizy związku między mikroarchitekturą macierzy zewnątrzkomórkowej a mechaniką ściany tętnicy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii i mechaniki naczyń krwionośnych, takie jak to, w jaki sposób ciśnienie indukuje zmiany w ogólnej geometrii, a także mikroarchitekturę ściany naczynia. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie trzeba oznaczać próbki do obrazowania.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w mechanikę tętnic oporowych, zmodyfikowaną wersję protokołu można zastosować do innych narządów przypominających rurki, takich jak oskrzela lub do pasków z ludzkiego pęcherza moczowego lub ściany jelita. Na początek należy pobrać interesujące nas próbki tkanek natychmiast po ich wycięciu podczas operacji i przygotować naczynia zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Zwiększ ciśnienie w tętnicy kaniulowanej do pięciu milimetrów słupa rtęci.Następnie ustaw ścieżkę optyczną do obrazowania, aktywując laser dwufotonowy i ustawiając długość fali wzbudzenia na 820 nanometrów. Włóż zwierciadło dichroiczne o długoś

assessing-collagen-elastin-pressure-dependent-microarchitectures-live

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Procesy komórkowe, takie jak migracja komórek, były tradycyjnie badane na dwuwymiarowych, sztywnych powierzchniach plastikowych. Niniejszy raport opisuje technikę bezpośredniej wizualizacji lokalizacji białek oraz analizy dynamiki białek w komórkach migrujących w bardziej fizjologicznie istotnej macierzy trójwymiarowej.

Obrazowanie żywych komórek migrujących, wykazujących ekspresję białek z fluorescencyjnym znacznikiem, w macierzy trójwymiarowej

Spektroskopia Ramana jest odpowiednią techniką do bezkontaktowej, bezetykietowej analizy żywych komórek, konstruktów inżynierii tkankowej oraz tkanek natywnych. Specyficzne dla źródła sygnatury spektralne mogą być generowane i analizowane przy użyciu analizy wielowariancyjnej.

Bezkontaktowy i bezetykietowy monitoring komórek oraz macierzy pozakomórkowej z wykorzystaniem spektroskopii Ramanowskiej

Ten artykuł przedstawia metodę fluorescencyjnego znakowania kolagenu, która może być dalej wykorzystywana zarówno do obrazowania na żywo, jak i do obrazowania na żywo kultur komórkowych 3D. Zapewniamy również zoptymalizowany protokół wizualizacji endogennych białek cytoszkieletu komórek hodowanych w środowiskach 3D.

Odkrywanie organizacji cytoszkieletu inwazyjnych komórek nowotworowych w 3D

Techniki mikroskopii poklatkowej i przetwarzania obrazów zostały użyte do obserwacji i analizy zagęszczenia żelu za pośrednictwem fibroblastów i wyrównania włókien fibryny w bioreaktorze kontrolowanym przez środowisko przez okres 48 godzin.

Obserwacja i ilościowe określanie zagęszczenia fibryny w żelu za pośrednictwem fibroblastów

Choroba Dupuytrena (DD) jest chorobą fibroproliferacyjną dłoni. W niniejszej pracy przedstawiono protokół resekcji wycinków z DD w trójwymiarowym (3D) systemie hodowli. Taki system hodowli krótkoterminowej pozwala na zachowanie struktury 3D i właściwości molekularnych tkanki zwłóknieniowej.

Ludzka hodowla ex vivo Dupuytrena do badania miofibroblastów i interakcji macierzy zewnątrzkomórkowej

Funkcja komórek naczyniowych zależy od aktywności przekaźników wewnątrzkomórkowych.  Opisana jest metoda obrazowania dwufotonowego ex vivo, która umożliwia pomiar wewnątrzkomórkowych poziomów wapnia i tlenku azotu w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne i farmakologiczne w poszczególnych komórkach śródbłonka i mięśni gładkich izolowanej aorty.

Obrazowanie dwufotonowe wewnątrzkomórkowego obchodzenia się z Ca2+ i produkcji tlenku azotu w komórkach śródbłonka i mięśni gładkich izolowanej aorty szczurzej

Prezentowany tutaj jest protokół do badania mikrokrążenia wieńcowego w żywej tkance serca mysiego poprzez monitorowanie ex vivo ciśnienia perfuzji tętniczej i przepływu, który utrzymuje ciśnienie, a także składników drzewa naczyniowego, w tym łożysk naczyń włosowatych i perycytów, gdy tętnica przegrody jest kaniulowana i poddawana ciśnieniu.

Dynamiczny pomiar i obrazowanie naczyń włosowatych, tętniczek i perycytów w sercu myszy

Opracowaliśmy proces mechano-obrazowania do badania heterogenicznych strukturalnych i mechanicznych właściwości blaszek miażdżycowych. Rurociąg ten umożliwia korelację lokalnego dominującego kąta i dyspersji orientacji włókien kolagenowych, zachowania podczas pękania i odcisków palców naprężeń włóknistej tkanki płytki nazębnej.

Metoda badania korelacji między lokalną strukturą kolagenu a właściwościami mechanicznymi tkanki włóknistej blaszki miażdżycowej

Przedstawiamy tutaj protokół zachowania architektury tętnic ludzkich poprzez wprowadzenie żelu stabilizującego tkanki do lumenu naczynia przed przecięciem w celu analizy molekularnej lub histologicznej.

In vitro Intraluminalna infuzja żelowa: zaawansowane podejście do mikroskopowej analizy tętnic oporowych człowieka

Celem niniejszego badania było odtworzenie naturalnej, trójwarstwowej architektury ściany tętnicy. W tym celu zastosowano elektroprzędzenie z wykorzystaniem dyszy 3-1 (wejście-wyjście) oraz mieszanin polikaprolaktonu, elastyny i kolagenu.

Trójwarstwowe elektroprzędzenie w celu naśladowania natywnej architektury tętnicy z wykorzystaniem polikaprolaktonu, elastyny i kolagenu: badanie wstępne

Poznaj metodę bezznacznikowej mikroskopii fluorescencyjnej do analizy mikroarchitektury kolagenu i elastyny w żywych ludzkich tętnicach oporowych pod wpływem ciśnienia.

Ocena mikroarchitektury zależnej od ciśnienia kolagenu i elastyny w żywych, ludzkich tętnicach oporowych za pomocą bezznacznikowej mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal

Ocena mikroarchitektury zależnej od ciśnienia kolagenu i elastyny w żywych, ludzkich tętnicach oporowych za pomocą bezznacznikowej mikroskopii fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów