Name: Montaż i oczyszczanie prototypowych pienistych intasomów wirusowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Naucz się montażu i oczyszczania prototypowych pienistych intasomów wirusowych do badań biochemicznych i strukturalnych w retrowirologii. Ta metoda umożliwia izolację kompleksów integracyjnych z wysoką wydajnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez NIH AI099854 i AI126742 do KEY.

1. Wyżarzanie vDNA
<ol>
	<li>Połącz 1X bufor TEN (10X TEN stock: 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl, 10 mM EDTA), 10 μM Oligo 1 (5' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3', 100 μM stock) i 10 μM Oligo 2 (5' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAAATTCCATGACA 3', 100 μM stock) w końcowej objętości 1,5 ml. Porcję 25 μl do sześćdziesięciu probówek reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) o pojemności 0,2 ml. 
	UWAGA: W zależności od zastosowania, oligomery mogą być modyfikowane fluoroforami lub znacznikami na końcu 5' Oligo 2 lub jako wewnętrzny amino-T o podstawie 13 od końca 5' Oligo 1. Zmodyfikowane oligomery powinny być oczyszczone metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) przed wyżarzaniem. Odkryliśmy, że znakowanie fluoroforem Cy3 lub Cy5 końca 5' Oligo 2 zmniejsza 10-krotnie wydajność montażu intasomu. Wewnętrzne znakowanie fluoroforem nie zmniejsza wydajności montażu.</li>
	<li>Wyżarzanie przy użyciu termocyklera w następujących czasach i temperaturach: 1 cykl w temperaturze 94,0 °C 3 min, 99 cykli w temperaturze (94,0 °C 1 min, 93,6 °C 1 min) obniżając obie temperatury o 0,8 °C na cykl (ostatni cykl to 14,8 °C 1 min, 14,4 °C 1 min) i przechowywać w temperaturze 4,0 °C.</li>
	<li>Połącz reakcje wyżarzania ze wszystkich sześćdziesięciu probówek. Załaduj 500 μl do dwóch 0,5 ml 3 kDa jednostek stężenia filtra ultraodśrodkowego o masie cząsteczkowej (MWCO). Zagęścić wyżarzone vDNA przez odwirowanie w mikrowirówce przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). 
	UWAGA: Objętość retentatu powinna wynosić ~50 μL w każdej jednostce stężenia.</li>
	<li>Odrzuć przepływ. Dodać 250 μl pozostałego wyżarzonego vDNA do każdej jednostki filtrującej. Powtórz wirowanie i wyrzuć przepływ. Wymiana buforu na bufor TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) poprzez trzykrotne przemycie 450 μL TE.</li>
	<li>Odwróć jednostkę filtrującą i wiruj z prędkością 1 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Ostateczna objętość retentatu dla każdej jednostki filtrującej powinna wynosić ~50 μL. Połączyć retentaty i przenieść do probówki z nakrętką o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Zmierz absorbancję vDNA w ultrafiolecie (UV) o długości fali 260 nm. Użyj tej wartości, aby obliczyć końcowe stężenie molowego DNA. Współczynnik ekstynkcji (ε260) tego vDNA wynosi 622,803 cm-1 M-1, a jego masa cząsteczkowa wynosi 23,972 Da. Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Zestaw Intasome
<ol>
	<li>Jeśli to możliwe, wykonaj montaż intasome w małym pomieszczeniu ze zmiennym termostatem. Ustaw termostat na około 18-22 °C. 
	UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że montaż w temperaturze 4 °C jest nieefektywny.</li>
	<li>Przygotować 1 l buforu do dializy (20 mM bis-tris propan, pH 7,5, 200 mM NaCl, 2 mM ditiotreitol (DTT), 25 μM ZnCl2) w 2 l zlewce z mieszadłem na płytce do mieszania. Równoważyć bufor w pomieszczeniu o temperaturze 18–22 °C przez co najmniej 6 godzin.</li>
	<li>Aby złożyć intasomy, połącz 50 mM propanu Bis-tris, pH 7,5, 500 mM NaCl, 120 μM PFV IN i 50 μM vDNA w całkowitej objętości 150 μL. 
	UWAGA: PFV IN powinien być wolny od zanieczyszczającej aktywności nukleazy7,8. Jeśli stężenie PFV IN jest zbyt rozcieńczone, aby pomieścić 120 μM IN w objętości 150 μl, możliwe jest zwiększenie końcowej objętości do 200 μL. Krytycznymi czynnikami tego etapu są utrzymanie stosunku molowego IN do vDNA (2,4:1) i posiadanie wystarczającej ilości kompleksu do wizualizacji podczas chromatografii.</li>
	<li>Wyczyść ~10-centymetrowy kawałek rurki dializacyjnej MWCO o średnicy 10 mm 6-8 kDa i klipsów wodą podwójnie destylowaną (ddH2O) lub wodą o najwyższej dostępnej czystości. Przypnij jeden koniec rurki. 
	UWAGA: Z rurkami do dializy należy obchodzić się ostrożnie, aby zapobiec ewentualnemu zanieczyszczeniu przestrzeni laboratoryjnej.</li>
	<li>Przygotować 15 ml buforu do płukania rurki dializacyjnej (50 mM bis-tris propan, pH 7,5, 500 mM NaCl). Przepłukać wnętrze rurki dializacyjnej trzykrotnie za pomocą 1-2 ml buforu do płukania. Usuń jak najwięcej buforu do płukania za pomocą pipety i cienkiej końcówki do napełniania żelem.</li>
	<li>W razie potrzeby użyj czystej żyletki lub skalpela, aby przeciąć rurkę dializacyjną tak, aby cienka końcówka do napełniania żelem mogła dotrzeć do końca rurki.</li>
	<li>Przenieś zestaw intasomu z kroku 2.3 do rurki dializacyjnej za pomocą pipety i cienkiej końcówki do nakładania żelu. Zatrzasnąć otwarty koniec rurki do dializy, minimalizując ilość powietrza wprowadzanego do rurki. Umieścić rurkę w buforze do dializy.</li>
	<li>Dializować przez noc (16-20 godzin) delikatnym mieszaniem, aby rurka obracała się, ale nie znajdowała się w zawirowaniu. Upewnij się, że rurka do dializy jest zanurzona i ruchoma. Po około godzinie należy zaobserwować widoczny osad wewnątrz rurki. 
	UWAGA: W przypadku Cy3 lub Cy5 znakowanego fluorescencyjnie vDNA osad jest bardziej oczywisty. Dotyczy to zarówno znakowanego końcowo, jak i wewnętrznie znakowanego fluorescencyjnego vDNA.</li>
</ol>
3. Rozpuszczalność w intasomie
<ol>
	<li>Przygotuj dwie końcówki do pipet o szerokim otworze, usuwając 2-4 mm z końca końcówki o pojemności 200 μl za pomocą nowej żyletki lub ostrza skalpela na czystej powierzchni. 
	UWAGA: Wskazówki zostaną użyte w krokach 3.3 i 3.5.</li>
	<li>Wyjąć rurkę dializacyjną z buforu do dializy. Aby zapobiec rozcieńczeniu próbki intasomu buforem do dializy, który może pozostać na końcu rurki w pobliżu zacisku, należy użyć mikropipety z małą końcówką pipety w celu usunięcia nadmiaru buforu do dializy. Zdejmij zacisk z jednego końca rurki do dializy.</li>
	<li>Za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze z kroku 3.1 przenieść próbkę wraz z osadem z rurki do dializy do probówki o pojemności 1,5 ml na lodzie. Proszę zanotować całkowitą objętość odzyskanego materiału; całkowita objętość wynosi zwykle ~140 μL.</li>
	<li>Próbka z osadem ma temperaturę 200 mM NaCl; zwiększyć sól do końcowego stężenia 320 mM NaCl poprzez dodanie odpowiedniej objętości podstawowego roztworu 5 M NaCl. Na przykład do próbki o objętości 150 μl należy dodać 3,9 μl 5 M NaCl i 1,1 μl ddH2O, aby uzyskać końcową objętość 155 μl. Przenieść wiadro na lód z próbką do chłodni o temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Użyj końcówki do pipet o szerokim otworze z kroku 3.1, aby ponownie zawiesić i rozpuścić osad przez pipetowanie. Powtarzaj co 20 minut przez co najmniej 1 godzinę. Zwróć uwagę, że większość osadu powinna przejść do roztworu. 
	UWAGA: Pipetowanie w celu ponownego zawieszenia osadu można przerwać, gdy widać, że osad nie jest już zauważalnie zmniejszony między punktami czasowymi. Gdy vDNA nie jest znakowane lub jest znakowane wewnętrznie, osad zmniejsza się o ~90% na podstawie oględzin. W przypadku vDNA znakowanego końcem Cy5 osad jest redukowany tylko o ~20%; większość osadu z końcówką fluoroforową znakowaną vDNA nie ulega solucjonizacji. Ilość osadu, który jest skutecznie rozpuszczony, jest zmienna i powinna być określona empirycznie.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie Intasome
<ol>
	<li>Przygotować 250 ml buforu do chromatografii wykluczającej (SEC) (20 mM bis-tris propan, pH 7,5, 320 mM NaCl, 10% glicerol). Sterylnie przefiltrować bufor za pomocą jednostki filtrującej 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Wszystkie etapy oczyszczania przeprowadza się w chłodni o temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zrównoważyć usieciowaną kolumnę SEC z agarozy (średnica = 10 mm; długość = 300 mm; objętość złoża = 24 ml; objętość próbki = 25 - 500 μL; maksymalne ciśnienie = 1,5 MPa; granica wykluczenia = 4 x 107 Da; rozdziela masy cząsteczkowe między 5 a 5 000 kDa, patrz tabela materiałów) z buforem SEC pracującym przy natężeniu przepływu 0,4 ml/min. 
UWAGA: To oczyszczanie można dostosować do kolumn wykluczających o różnych rozmiarach, jeśli są one w stanie skutecznie oddzielić 300 kDa od 44 kDa, takich jak Superose 12 10/300 GL lub Superose 6 Increase. Superose 12 10/300 GL ma niższą rozdzielczość, co prowadzi do większego nakładania się szczytów. I odwrotnie, Superose 6 Increase ma wyższą rozdzielczość i oferuje lepszą separację.</li>
	<li>Odwirować próbkę intasomu w mikrodymie o sile 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia pozostałego osadu. Ostrożnie usunąć supernatant. Załadować supernatant do pętli iniekcyjnej o pojemności 200 μl (rurka o pojemności ~200 μl). Zastosuj próbkę do kolumny SEC. 
	UWAGA: Mniejsze objętości ładunku pozwalają na większą rozdzielczość przez SEC.</li>
	<li>Eluować za pomocą 25 ml buforu SEC i zebrać 95 frakcji po 270 μl. Zauważyć, że chromatogram SEC wyświetla trzy piki A280/A260 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: Pierwszym powinien być agregat (~9,0 - 11,5 ml elucji), następnie pik intasomu tetrameru PFV (~12,0 - 14,75 ml elucji) i monomer PFV IN z wolnym pikiem vDNA (~15,0 - 18,0 mL).</li>
</ol>
5. Test transferu nici integracji, wybór frakcji i przechowywanie
<ol>
	<li>Połączyć 2 μl każdej frakcji pikowej intasomu i 50 ng 3 kb superskręconego plazmidowego DNA (stężenie podstawowe wynosi 50 ng/μl) w buforze reakcyjnym (10 mM bis-tris propan, pH 7,5, 110 mM NaCl, 5 mMMgSO4, 4 μM ZnCl2, 10 mM DTT) w końcowej objętości reakcyjnej 15 μL. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 min.</li>
	<li>Uwzględnij kontrolę ujemną bez dodatku intasomu PFV. Zatrzymaj reakcję za pomocą 0,75 μl proteinazy K (20 mg/ml roztworu podstawowego) i 0,75 μl SDS (10% roztwór podstawowy). Inkubować w temperaturze 55 °C przez 1 godzinę. W razie potrzeby próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszych analiz. 
	UWAGA: Ten test jest jakościową oceną działań integracyjnych. Stężenie molowe każdej frakcji nie jest określane przed tym testem. Frakcje zawarte w teście przenoszenia nici integracyjnej mogą być przechowywane na lodzie (w tym przechowywanie przez noc) do czasu potwierdzenia aktywności integracji i poddzielenia wybranych frakcji. Tutaj używamy pMP2, pochodnej pUC19 klasy 9. Z powodzeniem zastosowaliśmy również plazmid pcDNA 3.1 o wielkości 5,4 kb. Każdy plazmid, który może być rozdzielony na formy zrelaksowanego koła, liniowe i superskręcone, może być użyty jako cel do integracji.</li>
	<li>Przygotuj 120 ml żelu agarozowego o stężeniu 1% masy na objętość (w/v) w buforze 1X TAE (40 mM tris-acetat, 1 mM EDTA) z 0,1 μg/ml bromku etydyny (EtBr, 10 mg/ml roztwór podstawowy)10. Rozpuść roztwór agarozy i wlej go do tacki do odlewania żelu o wymiarach 15 cm x 10 cm. Włóż 15-dołkowy grzebień z dołkami o szerokości 5 mm i grubości 0,75 mm. 
	UWAGA: Węższe studzienki zapewniają lepszą rozdzielczość pasma w porównaniu do studzienek o grubości 1,5 mm.</li>
	<li>Pozwól żelowi zestalić się w temperaturze otoczenia. Zanurz żel w 1X TAE z 0,1 μg/ml EtBr.</li>
	<li>Dodać 3 μl 50% glicerolu do każdej reakcji integracji z kroku 5.2. Załaduj całą objętość reakcyjną do żelu. Załadować 1 μl 10 kb markera wielkości DNA (stężenie podstawowe 150 ng/μl) na tory po obu stronach próbek; innymi słowy, znacznik wielkości DNA powinien otaczać pasy próbki.</li>
	<li>Na zewnętrznym pasie załaduj 6 μl pomarańczowego barwnika G (0,25% pomarańczowego G, 30% glicerolu). Uruchom żel przy stałym napięciu, 10 V/cm (100 V) w temperaturze otoczenia przez 1 godzinę lub do momentu, gdy czoło barwnika Orange G dotrze do końca żelu.</li>
	<li>Natychmiast zobrazuj żel agarozowy za pomocą skanera fluorescencyjnego ustawionego na wykrywanie EtBr (wzbudzenie 532 nm, filtr emisyjny 610 nm). Jeśli użyto vDNA znakowanych fluoroforem, należy również zobrazować z odpowiednimi ustawieniami fluoroforu. 
	UWAGA: Na przykład, aby wykryć DNA znakowane Cy5, zobrazuj za pomocą filtrów wzbudzenia 633 nm i emisji 670 nm. Skoordynowane produkty integracji (CI, liniowe DNA) powinny działać zgodnie z rozmiarem przy ~3 kb, nieprzereagowany superskręcony plazmid (SC) powinien działać szybciej (~2 kb), a produkty integracji półlokacyjnej (HSI, zrelaksowany okrąg DNA) powinny działać wolniej (~3,5 kb). Nieprzereagowany vDNA powinien być zgodny z rozmiarem ~40 pz.</li>
	<li>Określ ilościowo pasma na każdym pasie za pomocą oprogramowania do obrazowania7. Oblicz frakcję DNA na każdym pasie, który jest CI, HSI lub SC; vDNA nie jest uwzględniane w tych obliczeniach. 
	UWAGA: Efektywność integracji, czyli ułamek SC przekształcony w produkt liniowy, obliczono, dzieląc objętość pikseli produktów zintegrowanej integracji (CI) przez całkowitą objętość pikseli w trzech pasmach (HSI+CI+SC). Jeśli intasomy są znakowane fluoroforem, produkty HSI i CI można również oznaczać ilościowo za pomocą fluorescencji.</li>
	<li>Wybierz frakcje, które mają najbardziej skoordynowane działanie integracyjne. 
	UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że szczytowa skoordynowana aktywność integracyjna zbiega się z pikiem białka zidentyfikowanym jako tetrameryczne intasomy PFV. Zmierz A280 każdej z tych frakcji i oblicz końcowe stężenie intasomu. ε280 dla tetrameru dzikiego typu PFV IN z dwoma opisanymi tutaj vDNA wynosi 908,339 cm-1 M-1, a masa cząsteczkowa wynosi 225,5 kDa. Stężenia powinny być zgodne z tym samym wzorcem, co pik chromatogramu SEC i w teście przenoszenia nici.</li>
	<li>Rozprowadzić każdą frakcję w podwielokrotnościach o pojemności 5 μl i zamrozić w ciekłym azocie. Porcje należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Frakcje wybrane do przechowywania mają zazwyczaj wielkość od 200 do 600 nM.</li>
</ol>

<ol><li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoffin%2C+JM+%22Retroviruses%22">Retroviruses</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).</li>
<li>Valkov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+characterization+of+the+integrase+from+the+prototype+foamy+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).</li>
<li>Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+intasome+assembly+and+inhibition+of+DNA+strand+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer.</a> Nature. 464 (7286), 232-236 (2010).</li>
<li>Li, M., Lin, S., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+domains+of+integrase+within+retroviral+intasomes+are+dispensible+for+catalysis+of+DNA+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Outer domains of integrase within retroviral intasomes are dispensible for catalysis of DNA integration.</a> Protein Sci. 25 (2), 472-478 (2016).</li>
<li>Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+conformations+of+prototype+foamy+virus+integrase+and+its+stable+synaptic+complex+with+U5+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Solution conformations of prototype foamy virus integrase and its stable synaptic complex with U5 viral DNA.</a> Structure. 20 (11), 1918-1928 (2012).</li>
<li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nat Commun. 7, 11409(2016).</li>
<li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li>
<li>Poirier, M. G., Bussiek, M., Langowski, J., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+access+to+DNA+target+sites+in+folded+chromatin+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous access to DNA target sites in folded chromatin fibers.</a> J Mol Biol. 379 (4), 772-786 (2008).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li>Ballandras-Colas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+reveals+a+novel+octameric+integrase+structure+for+betaretroviral+intasome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM reveals a novel octameric integrase structure for betaretroviral intasome function.</a> Nature. 530 (7590), 358-361 (2016).</li>
<li>Ballandras-Colas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+supramolecular+assembly+mediates+lentiviral+DNA+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration.</a> Science. 355 (6320), 93-95 (2017).</li>
<li>Passos, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+and+atomic+model+of+the+HIV-1+strand+transfer+complex+intasome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome.</a> Science. 355 (6320), 89-92 (2017).</li>
<li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+Rous+sarcoma+virus+intasome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome.</a> Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).</li>
<li>Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+retroviral+integration+from+X-ray+structures+of+its+key+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates.</a> Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).</li>
<li>Maskell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+retroviral+integration+into+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for retroviral integration into nucleosomes.</a> Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Retrowirusowe IN tworzą multimeryczny kompleks z genomowym DNA wirusa, aby przeprowadzić integrację i kontynuować cykl życiowy wirusa. Liczba monomerów IN na intasom może wynosić tetramery, oktamery lub ewentualnie multimery wyższego rzędu 11,12,13,14. Intasomy PFV są tetramerem rekombinowanego IN z dwuniciowymi oligomerami DNA, które naśladują końcówki genomowego DNA wirusa3<...

Integracja genomu wirusa z genomem gospodarza jest obowiązkowym krokiem w cyklu życia wszystkich retrowirusów1. Integraza enzymu wirusowego (IN) katalizuje kowalencyjne połączenie każdego końca genomu wirusowego DNA z DNA gospodarza. Podczas infekcji komórkowej IN jest częścią kompleksu przedintegracyjnego, który pośredniczy w integracji. Rekombinowany IN skompleksowany z dwuniciowymi oligomerami DNA naśladującymi końce wirusowego DNA może również przeprowadzić integrację z docelowym DNA in vitro2. Powszechny test integracyjny in vitro wykorzystuje superskręcony plazmid jako docelowe DNA. Integracja obu oligomerów wirusowego DNA (vDNA) z plazmidem powoduje powstanie produktu liniowego i jest określana jako integracja uzgodniona (<silna klasa = "xfig" >Figura 2A). Test integracji in vitro może również dać produkty, w których tylko jeden vDNA jest kowalencyjnie połączony z docelowym plazmidem, co daje zrelaksowany krąg. Ten produkt do częściowej integracji miejsca wydaje się być artefaktem testu in vitro.
Rekombinowane IN i vDNA mogą przeprowadzać integrację in vitro, ale nie są idealnymi odczynnikami do badania dynamiki lub struktury kompleksów integracyjnych, gdy monomeryczne IN przesłaniałoby odpowiednią wizualizację. Oczyszczone kompleksy integracyjne lub "intasomy" są wymagane do dynamicznej analizy pojedynczych cząsteczek lub badań strukturalnych. PFV IN i vDNA mogą być składane przez dializę z buforu o stosunkowo wysokim stężeniu soli do niższego stężenia soli3,4. Podczas dializy tworzy się osad. Osad ten jest usuwany z dializy, a stężenie soli jest zwiększone. Wyższe stężenie soli rozpuszcza osad zawierający intasomy PFV. Intasomy są następnie oczyszczane za pomocą chromatografii wykluczania wielkości (SEC). Wykazano, że rekombinowany prototyp wirusa piankowatego (PFV) IN występuje jako monomer w roztworze w stężeniach do 225 μM5. Frakcjonowanie SEC skutecznie oddziela intasomy PFV (225,5 kDa), które zawierają tetramer PFV IN i dwa vDNA, od monomerycznego PFV IN (44,4 kDa) i wolnego vDNA (24,0 kDa). Intasomy PFV mogą być zamrożone i zachować aktywność integracyjną przez co najmniej sześć miesięcy przechowywania w temperaturze -80 °C.
Rekombinowane intasomy PFV mogą być również modyfikowane tak, aby zawierały substytucje aminokwasów IN lub mutacje skracające lub vDNA znakowane fluoroforami lub biotyną4,6. Oczyszczone intasomy PFV łatwo przeprowadzają integrację z superskręconym plazmidowym docelowym DNA in vitro. Masowe testy integracji biochemicznej z intasomami mogą testować działanie mutacji IN, inhibitorów IN lub innych dodatków chemicznych. Biotynylowane intasomy mogą być używane do badania powinowactwa do kwasów nukleinowych lub białek. Intasomy PFV działają w temperaturze otoczenia, co pozwala na analizę mikroskopową pojedynczej cząsteczki za pomocą pęsety magnetycznej w celu zmierzenia czasu między połączeniem dwóch końców vDNA lub całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia w celu wizualizacji wyszukiwania intasomu na docelowym DNA6. Ponadto intasomy PFV były pierwszymi, które zostały strukturalnie scharakteryzowane, co znacząco wpłynęło na dziedzinę integracji retrowirusowej3.

<table><tbody><tr><td>Oligomery DNA</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Niestandardowe Oligotyki DNA</td></tr><tr><td>Tris Ultra Pure</td><td>Gojira Fine Chemicals</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0,5 ml Filtry odśrodkowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z677094-24EA</td><td>3 kDa MWCO</td></tr><tr><td>DTT</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS propan,>=99,0% (miareczkowanie)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6755-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do ładowania żelem, 1 - 200 &mu; L</td><td>Corning</td><td>CLS4853-400EA</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka; Jednosieczny; 100/Pk.; Zestaw 100</td> sterylnych jednorazowych filtrów <td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>z membraną PES > 250 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>Klipsy do przewodów do dializy</td><td>Spectrum Labs</td><td>132734</td><td></td></tr><tr><td>6-8 kDa 10 mm</td><td>Spectrum Medical</td><td>132645</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>17517201</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Res Standard Agaroza</td><td>AGTC Bioproducts</td><td>AG500D1</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>Pomarańczowy G</td><td>Fisher Scientific</td><td>0-267</td><td></td></tr><tr><td>Hyladder 10kb, 500 pasów</td><td>Denville Scientific</td><td>CB4225-4</td><td></td></tr></tbody></table>

montaż i oczyszczanie prototypowych pienistych intasomów wirusowych

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

Cechą definiującą i niezbędnym krokiem cyklu życia retrowirusa jest integracja genomu wirusa z genomem gospodarza. Wszystkie retrowirusy kodują enzym integrazę (IN), który katalizuje kowalencyjne łączenie DNA wirusa z gospodarzem , co jest znane jako transfer nici. Integracja może być modelowana in vitro z rekombinowanymi retrowirusowymi oligomerami IN i DNA naśladującymi końce genomu wirusa. W celu dokładniejszego odtworzenia reakcji integracji, która zachodzi in vivo, kompleksy integracyjne są składane z rekombinowanego IN i syntetycznych oligomerów przez dializę w buforze o obniżonym stężeniu soli. Kompleks integracyjny, zwany intasomem, może być oczyszczony za pomocą chromatografii wykluczania wielkości. W przypadku prototypowego wirusa pienistego (PFV) intasom jest tetramerem IN i dwoma oligomerami DNA i jest łatwo oddzielany od monomerycznego IN i wolnego oligomeru DNA. Skuteczność integracji intasoomów PFV można badać w różnych warunkach eksperymentalnych, aby lepiej zrozumieć dynamikę i mechanikę integracji retrowirusowej.

Intasomy PFV są montowane z rekombinowanej integrazyny (IN) i vDNA. Po montażu intasomy są oczyszczane za pomocą SEC (Rycina 1). Aktywność integracyjną każdej frakcji bada się z użyciem superskręconego DNA docelowego oraz elektroforezy w żelu agarozowym (Rycina 2). Żel jest obrazowany za pomocą skanera fluorescencyjnego ustawionego na detekcję EtBr (oraz fluoroforu, jeśli użyto vDNA znakowanego fluoroforem). Z wykorzystaniem opro...

Rekombinowana integraza retrowirusowa i oligomery DNA naśladujące końcówki DNA wirusa mogą tworzyć enzymatycznie aktywny kompleks znany jako intasom. Intasomy mogą być wykorzystywane do badań biochemicznych, strukturalnych i kinetycznych. Protokół ten szczegółowo opisuje, jak składać i oczyszczać prototypowe pieniste intasomy wirusa.

Montaż i oczyszczanie prototypowych pienistych intasomów wirusowych

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Ogólnym celem tej procedury jest zebranie i oczyszczenie prototypowych intasomy pienistego wirusa, które mogą być następnie wykorzystane do badań biochemicznych, strukturalnych i kinetycznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie retrowirusologii, takie jak mechanika i dynamika integracji. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na izolację kompleksów integracyjnych, a nie heterogenicznej mieszaniny gatunków.Wizualna demonstracja tej metody jest korzystna, ponieważ odzyskiwanie i solubilizacja kompleksów integracyjnych mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia optymalnej wydajności intasomu. Aby rozpocząć, połącz bufor 1XTEN, 10 mikromolowy oligo-1 i 10 mikromolowy oligo-2 w końcowej objętości 1,5 mililitra. Następnie podamuluj 25 mikrolitrów mieszaniny do 60 0,2 mililitrowych probówek reakcyjnych z polimerazą.Wyżarzaj DNA za pomocą termocyklera z czasami i temperaturami podanymi w protokole tekstowym. Po reakcji połącz reakcje wyżarzania ze wszystkich 60 probówek. Następnie załaduj 500 mikrolitrów dwóch 0,5 mililitra trzykilodaltonowych jednostek odcięcia masy cząsteczkowej ultraodśrodkowego filtra o masie cząsteczkowej.Zagęścić wyżarzone DNA

assembly-and-purification-of-prototype-foamy-virus-intasomes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano prosty, wydajny i niezawodny sposób synchronizacji dostarczania wielu komponentów wirusowych do komórek roślinnych za pomocą przejściowej ekspresji pośredniczonej przez Agrobacterium. Podejście to umożliwia badanie replikacji i enkapsydacji, a następnie ponowne składanie komponentów niewirusowych in vitro w pozbawione genomu optyczne „duchy” wirusowe (viral ghosts), odpowiednie do zastosowań biomedycznych.

Prosta i niezawodna metoda in vivo oraz in vitro do badania składania wirusów

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

Źródło: Mackler, R. M., et al. Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes. J. Vis. Exp. (2018)W tym filmie przedstawiono oczyszczanie intasomów wirusa pienistego prototypowego (PFV) z mieszanej zawiesiny białkowo-DNA przy użyciu ekstrakcji solnej i chromatografii żelowej (SEC), co pozwala na uzyskanie aktywnych kompleksów do dalszych analiz.

Oczyszczanie intasomów prototypowego wirusa piankowatego (PFV) metodą chromatografii wykluczania cząsteczkowego

Oczyszczanie integrazu wirusowego za pomocą chromatografii powinowactwa

Źródło: Lopez Jr., M. et al. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (2017)W niniejszym filmie zaprezentowano procedurę oczyszczania integraz wirusowej z zanieczyszczeń nukleazami bakteryjnymi przy użyciu chromatografii kolumnowej na żywicy heparin Sepharose, a następnie analizę SDS-PAGE w celu potwierdzenia czystości białka.

Oczyszczanie integraz wirusowej przy użyciu chromatografii powinowactwa do heparyny

Źródło: Gao, Y., et al. Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus. J. Vis. Exp. (2021)Film prezentuje montaż in vitro swoistych dla wirusa nukleokapsydów z oczyszczonego kompleksu nukleoproteiny i fosfoproteiny pozbawionego RNA, ich oczyszczanie za pomocą chromatografii wykluczania molekularnego oraz walidację pełnowymiarowego wirusowego RNA wewnątrz zmontowanych cząsteczek.

Rekonstytucja in vitro i oczyszczanie wirusowych cząstek przypominających nukleokapsyd

Demontaż rdzeni wirusa grypy A podczas wnikania wirusa do komórek gospodarza jest procesem wieloetapowym. Opisujemy metodę in vitro do analizy wczesnych etapów odsłaniania się wirusa. W tym podejściu wirowanie w gradionym tempie służy do biochemicznej analizy etapów, które inicjują odwarstwianie w określonych warunkach.

In vitro Demontaż kapsydów wirusa grypy A przez wirowanie gradientowe

Tutaj prezentujemy protokół syntezy cząsteczek wirusopodobnych za pomocą systemów ekspresji bakulowirusa lub ssaków oraz oczyszczania przez ultrawirowanie. To wysoce konfigurowalne podejście służy do identyfikacji antygenów wirusowych jako celów szczepionek w bezpieczny i elastyczny sposób.

Ekspresja i oczyszczanie cząstek wirusopodobnych do szczepienia

Rekombinowany prototyp pienistego białka integrazy wirusa jest często zanieczyszczony nukleazą bakteryjną podczas oczyszczania. Metoda ta identyfikuje zanieczyszczenie nukleazą i usuwa je z końcowego przygotowania enzymu.

Wykrywanie i usuwanie zanieczyszczeń nukleazami podczas oczyszczania rekombinowanej prototypowej integrazy wirusa pienistego

Tutaj opisujemy metodę mikroaspiracji pojedynczych komórek do separacji zainfekowanych ameb. W celu oddzielenia subpopulacji wirusów w Vermamoeba vermiformis zakażonych faustowirusami i nieznanymi gigantycznymi wirusami, opracowaliśmy protokół opisany poniżej i wykazaliśmy jego zdolność do oddzielania dwóch nowych wirusów gigantycznych o niskiej liczebności.

Mikroaspiracja pojedynczych komórek jako alternatywna strategia dla sortowania komórek aktywowanych fluorescencją w celu separacji gigantycznych mieszanin wirusów

Dla dogłębnej analizy mechanistycznej syntezy RNA syncytialnego wirusa oddechowego (RSV), przedstawiamy protokół wykorzystania fosfoproteiny opiekuńczej (P) do koekspresji nukleoproteiny wolnej od RNA (N0) do późniejszego składania in vitro specyficznych dla wirusa nukleokapsydów (NC).

Wytwarzanie i składanie specyficznych dla wirusa nukleokapsydów syncytialnego wirusa oddechowego

Naucz się montażu i oczyszczania prototypowych pienistych intasomów wirusowych do badań biochemicznych i strukturalnych w retrowirologii. Ta metoda umożliwia izolację kompleksów integracyjnych z wysoką wydajnością.

Montaż i oczyszczanie prototypowych pienistych intasomów wirusowych

Przeglądaj więcej filmów