Immunofenotypowanie homograftu ortotopowego (syngenecznego) mysiego pierwotnego gruczolakoraka przewodowego trzustki KPC za pomocą cytometrii przepływowej

Ta wiadomość może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące immunofenotypowania w modelach mysich, takich jak markery używane do identyfikacji różnych linii odpornościowych i strategii starzenia. Główną zaletą tej techniki jest to, że marker i stany starzenia, podczas immunofenotypowania, można zastosować do różnych modeli mysich. Monitoruj masę ciała myszy C57 Black 6 za pomocą wagi.

Monitoruj również objętość guza myszy dawców o różnym guzie za pomocą pomiaru kalibru. Po eutanazji zwierzęcia w kapturze stanowiącym zagrożenie biologiczne zgodnie z protokołem, wysterylizuj skórę wokół guza za pomocą wacików jodoforowych. Po chirurgicznym usunięciu guza, jak opisano w protokole tekstowym, umieść guz na szalce Petriego zawierającej 20 mililitrów PBS, która została wstępnie schłodzona do 4 stopni Celsjusza.

Jeśli krew jest zanieczyszczająca, przenieś guz na inną szalkę Petriego i umyj guz PBS. Przetnij guz na pół. Usuń nadmiar skóry, naczyń, zwapnienia i martwicę.

Wybierz tylko nienaruszone kawałki guza i umieść je w sterylnej 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Dodaj 20 mililitrów PBS przed przetransportowaniem probówki do oddzielnego pomieszczenia dla zwierząt w celu badań farmakologicznych. Aby przygotować się do implantacji ortotopowej, zamocuj w pełni znieczuloną mysz na tablicy eksperymentalnej w odpowiedniej pozycji bocznej.

Zdezynfekuj skórę wokół śledziony idodą, a następnie odjoduj 75% alkoholem etylowym. Znajdź środkowy punkt śledziony i wykonaj 1-centymetrowe pionowe nacięcie na brzuchu, aby odsłonić śledzionę. Delikatnie wyciągnij część tkanki trzustki pod śledzioną za pomocą pęsety z płaską końcówką.

I fragment guza homoprzeszczepu myszy sutro z myszy C na trzustkę myszy biorcy za pomocą 9-O absorbowalnego szwu chirurgicznego. Zamknij brzuch jedwabnym szwem 6-O podwójnym szwem. Osiągnij homeostazę przez kompresję.

Po zakończeniu implantacji guza trzymaj zwierzę w ciepłej klatce, o ile nie wystąpi krwawienie lub wyciek tkanki nowotworowej. Monitorować zwierzę, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Zwróć zwierzę do pomieszczenia dla zwierząt po pełnym wyzdrowieniu ze znieczulenia.

Monitoruj myszy różniące się guzem, badając palpacyjnie brzuch w pobliżu śledziony i wybierz myszy z guzami ortotopowymi. Dla każdego guza przygotuj jedną rurkę C z buforem do trawienia guza. Użyj 3 mililitrów buforu wytrawiającego dla fragmentów guza mniejszych niż 0,8 grama, aby upewnić się, że guz jest w pełni strawiony.

Oznacz guz kodem badania, guzem, identyfikatorem myszy, grupą leczoną i masą guza. Zbierz guz z myszy. Umyj guz w zimnym PBS i oczyść tkankę przyczepioną do guza.

Umieść guz w pożywce trawiennej w jednym dołku sterylnej 6-dołkowej płytki. Przytrzymaj guz na miejscu za pomocą sterylnej pęsety lub kleszczy i pokrój skalpelem. Pokrój guz na tyle dobrze, aby rozbić się na mniejsze kawałki.

Teraz umieść kawałki guza z powrotem w rurce C i użyj pozostałego buforu do wytrawiania, aby umyć płytkę. Przenieś płyn do rurki C i umieść go na lodzie do czasu strawienia. Następnie włącz dysocjator z grzałkami.

Umieść rurkę C dysocjacji guza do góry nogami w tulei wolnego miejsca. Dostosuj stan pozycji rury od Swobodnej do Wybranej. Wybierz program do dysocjacji, a następnie wybierz żądany folder, w którym wyświetlana jest lista programów.

Po zakończeniu programu zdjąć rurkę C z dysocjatora i krótko obrócić, aby umieścić próbkę na paletze. Teraz ponownie zawiesić próbki i umieścić je w sitku do komórek nad 50-mililitrową probówką. Przemyj komórkę przez sitko komórkowe z 10 mililitrami buforu do płukania, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.

Po odwirowaniu probówki o stężeniu 300 G przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki z 5 mililitrami buforu do przemywania wody. Policz żywe komórki i dostosuj stężenie komórek do 1 miliona komórek na probówkę lub próbkę. Wykonaj projekt panelu immunologicznego, barwienie immunologiczne i fluorescencję minus jedna kontrola jako szczegół w protokole tekstowym.

Przygotuj kulki UltraComp podczas rozgrzewania się przyrządów przepływowych, dokładnie je wirując przed użyciem. Oznaczyć oddzielną probówkę z próbką o wymiarach 12 x 75 milimetrów dla każdego przeciwciała sprzężonego z fluorochromami. Dodaj 100 mikrolitrów buforu barwiącego do każdej probówki, a następnie jedną pełną kroplę kulek.

Dodać przeciwciała i przeprowadzić procedurę barwienia zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie dodaj 0,5 mililitra buforu barwiącego do każdej granulki kulki i całkowicie ponownie zawiesić przez wir. Teraz ustaw napięcie PMT cytometrii przepływowej na tkankę docelową dla danego eksperymentu.

Przepuść próbkę przez próbkę przez cytometrię przepływową w celu uzyskania danych, uzyskując populację kulek singletowych na odczyty rozproszenia do przodu i rozrzutu bocznego. Ustaw natężenie przepływu wokół 200 do 300 zdarzeń na sekundę. Ustaw odpowiednią kompensację dla danego przeciwciała koniugacji fluoresceiny FITC za pomocą wykresu kropkowego FL1 w porównaniu z FL1.

Umieść bramkę kwadrantową tak, aby koraliki ujemne znajdowały się w lewym dolnym kwadrancie, a koraliki dodatnie w prawym górnym lub dolnym kwadrancie. Dostosuj wartości kompensacji, aż mediana intensywności fluoresceiny w każdej populacji będzie w przybliżeniu równa. Powtórz te kroki dla wszystkich probówek.

Teraz przejdź do pobierania rzeczywistych próbek plam. Uruchom kreatora wynagrodzeń i zapisz ustawienie z formatem:data, eksperyment i swoje inicjały. Ortotopowa implantacja gruczolakoraka przewodowego trzustki spowodowała szybki wzrost guza podobny do obserwowanego w przypadku implantacji podskórnej.

Przedstawiono reprezentatywne obrazy barwienia hematoksyliną i eozyną, które wykazują podobny wzrost implantów podskórnych i ortotopowych. Dość wysoką wydajność żywotnych komórek uzyskano z próbki guza w obu typach implantacji. Reprezentatywny rozprysk FACS pokazuje żywotne komórki z guza oddzielone od martwych komórek i szczątków komórkowych.

Pokazany tutaj jest guz naciekający porównanie profilu immunologicznego populacji komórek głównych i licznikowych kilku kluczowych podzbiorów komórek odpornościowych nowotworu. Pokazano podskórny i ortotopowy homograft raka trzustki. Dane wyraźnie pokazują, że guz ma znacznie zwiększoną infiltrację komórek odpornościowych w porównaniu z trzustką zdrowych myszy.

Ponadto stwierdzono różne odsetki podzbiorów komórek odpornościowych naciekających nowotwór w homoprzeszczepach ortotopowych i podskórnych. Na przykład w ortotopie jest znacznie więcej limfocytów B niż w podskórnym. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o wcześniejszym przygotowaniu wszystkich związanych z nią materiałów i odczynników.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić analizę FACS dla modeli mysich.