Name: Wykrywanie aktywacji inflamasomu i śmierci komórek piroptotycznych w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Poznaj metody wykrywania aktywacji inflamasomu NLRP3 na poziomie pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz oznaczania lizy komórkowej w piroptozie testem LDH.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wszystkie mikroskopy zostały wykonane w Centrum Mikroskopii W. M. Keck przy wsparciu Nathaniela Petersa i przy wsparciu nagrody NIH S10OD016240. S.L.F. jest wspierane przez NIH K08AI119142 i R21AI130281. Dziękujemy dr Richardowi Flavellowi i dr Bradowi Cooksonowi za myszy z niedoborem kaspazy-1/11 oraz dr Bradowi Cooksonowi za udostępnienie urządzeń i sprzętu laboratoryjnego.

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Waszyngtońskiego.
1. Pobieranie szpiku kostnego
<ol>
	<li>W asepcie usuń kość udową i piszczel myszy i oczyść kości za pomocą sterylnych narzędzi. Umieść oczyszczone kości w Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 5 mM HEPES + 0,2 mg/ml L-glutaminy + 0,05 mM 2-merkaptoetanolu + 50 mg/ml siarczanu gentamycyny + 10 000 U/ml penicyliny/streptomycyny + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS, DMEM-10 kompletne) i inkubuj probówkę na lodzie przez 15 minut.</li>
	<li>Usuń proksymalne i dystalne przeguby kulowe za pomocą nożyczek. Wprowadzić igłę o sile 25 g dołączoną do strzykawki o pojemności 10 ml wypełnionej pożywką do zagłębienia kości. Wypłukać szpik kostny za pomocą DMEM-10 complete. Ponownie zawiesić wszelkie grudki, delikatnie pipetując pożywkę w górę i w dół.</li>
	<li>Odwirować komórki przez 10 minut przy 300 x g i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru. W tym momencie albo zamroź komórki za pomocą 90% FBS + 10% dimetylosulfotlenku (DMSO), albo umieść komórki na 15-centymetrowej szalce Petriego, aby rozróżnić makrofagi przy użyciu pożywki kondycjonowanej L929 (krok 2.1).</li>
</ol>
2. Różnicowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego
<ol>
	<li>Używając wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej (21 ml kompletnej pożywki DMEM-10 i 9 ml pożywki kondycjonowanej komórkami L929, jak opisano przez Swansona i wsp.18), umieść komórki szpiku kostnego na 15-centymetrowej szalce Petriego bez hodowli tkankowej (1,2-1,5 x 107 komórek). Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 7 dni. Dodać dodatkowe 30 ml pożywki różnicującej do płytki w dniu 3 lub 4, 
	UWAGA: Ważne jest, aby nie używać płytek poddanych działaniu kultur tkankowych, ponieważ makrofagi będą trudne do oderwania i pobrania.</li>
	<li>Aby zebrać makrofagi, przemyj płytkę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i dodaj 20 ml zimnego PBS + 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Zebrać komórki, pipetując PBS + EDTA na komórki i przemyć płytkę 10 ml PBS. Połącz oba mycia w dwóch stożkowych probówkach o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić komórki w 10 ml DMEM wolnego od czerwieni fenolowej + 5 mM HEPES + 0,2 mg / ml L-glutaminy + 0,05 mM 2-merkaptoetanolu + 5% FBS (DMEM-5) i policzyć komórki za pomocą hemocytometru lub licznika Coredler. Utrzymuj komórki na lodzie podczas liczenia.</li>
	<li>Wysiewaj makrofagi na płytkach pokrytych kulturą tkankową w ilości 2 x 105 komórek/ml. Do eksperymentów mikroskopowych wysiewa się 1 ml komórek na szkiełkach nakrywkowych w 24-dołkowych płytkach. W przypadku testów uwalniania LDH wysiewaj 100 μl komórek na 96-dołkowej płytce. W przypadku testu LDH należy wysiać 9 dołków (3 dołki niepoddane obróbce, 3 dołki ze 100% kontrolą lizy i 3 dołki dla bodźca eksperymentalnego).</li>
	<li>Wirować 96-dołkową płytkę przez 5 minut przy 300 x g, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w basenie.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C + 5% CO2 przed rozpoczęciem procesu zalewania.</li>
</ol>
3. Gruntowanie
<ol>
	<li>Zastąp pożywkę świeżą pożywką (DMEM-5) zawierającą 100 ng/ml LPS (500 μl dla płytki 24-dołkowej lub 50 μl dla płytki 96-dołkowej). 
	UWAGA: Istnieje wiele różnic strukturalnych w LPS, które wpływają na zdolność do stymulowania gruntowania za pośrednictwem TLR419. LPS firmy Salmonella minnesota R595 (Re) jest dostępny u wielu dostawców i jest zalecany.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
4. Aktywacja inflamasomu NLRP3 za pomocą nigerycyny i znakowanie za pomocą FAM-YVAD-FMK
<ol>
	<li>Usuń pożywkę i zastąp ją 290 μl DMEM-5 zawierającego 5 μM nigerycyny i 5 mM glicyny. Glicyna jest dodawana w celu zmniejszenia ilości lizy komórek, która zachodzi podczas aktywacji kaspazy-15. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Używaj zarówno makrofagów typu dzikiego, jak i makrofagów z niedoborem kaspazy-1, aby upewnić się, że obserwowane oznakowanie jest specyficzne dla kaspazy-1.</li>
	<li>W ciągu ostatnich 45 minut dodaj 10 μL 30x FAM-YVAD-FMK, przygotowanego zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	<li>Po 60 minutach usuń pożywkę i umyj komórki trzy razy po 5 minut każdy 1 ml zimnego PBS.</li>
	<li>Do każdej studzienki dodać 250 μl 2% paraformaldehydu i inkubować na lodzie pokrytym folią aluminiową przez 30 minut.</li>
	<li>W ciągu ostatnich 5 minut dodaj 4 μl 0,2 mM barwienia kwasem nukleinowym dalekiej czerwieni, aby oznaczyć jądra. 4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) lub inne barwniki mogą być również używane do znakowania DNA.</li>
	<li>Umyj komórki trzykrotnie 1 ml zimnego PBS i zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych za pomocą 7 μl środka mocującego zapobiegającego blaknięciu. Poczekaj, aż podłoże montażowe stwardnieje przez noc, a następnie uszczelnij szkiełko nakrywkowe do szkiełka mikroskopowego za pomocą lakieru do paznokci.</li>
	<li>Zobrazuj makrofagi za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ex/Em dla FAM-YVAD-FMK to 492/520nm i 642/661 dla barwienia kwasami nukleinowymi dalekiej czerwieni fluorescencyjnej. Upewnij się, że mikroskop jest ustawiony w taki sposób, aby nieleczone komórki nie wykazywały żadnych zabarwień tła w kanale 488. W przeciwnym razie zostanie wykryte barwienie w tle FAM-YVAD-FMK, a nie rzeczywista aktywna kaspaza-1. 
	UWAGA: Konfiguracja mikroskopu jest opisana w rozdziale 6.</li>
</ol>
5. Barwienie przeciwciał
UWAGA: Aby oznaczyć komórki przeciwciałami do wykrywania ASC, wysiewamy, zaszczepiamy i wystawiamy komórki na działanie nigerycyny identycznie jak w poprzedniej sekcji. Późniejsze przetwarzanie odbywa się w następujący sposób:
<ol>
	<li>Umyj komórki trzy razy przez 5 minut każde 1 ml zimnego PBS. Dodać 250 μl roztworu utrwalającego i przepuszczalnego. Inkubować komórki na lodzie i przykrywać przez 30 minut.</li>
	<li>Przemyj makrofagi trzy razy przez 5 minut każdy 1 ml buforu do mycia.</li>
	<li>Dodać 250 μl pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko ASC rozcieńczonego w stosunku 1:500 do buforu do przemywania i inkubować przez 1 godzinę na lodzie. Dołącz jedno szkiełko nakrywkowe, które nie otrzyma żadnego przeciwciała pierwszorzędowego, ale otrzyma tylko przeciwciało wtórne. Szkiełko nakrywkowe będzie używane podczas ustawiania mikroskopu w celu ustawienia prawidłowego przesunięcia.</li>
	<li>Przemyć komórki trzy razy przez 5 minut każda, za pomocą 1 ml buforu do płukania.</li>
	<li>Dodać 250 μl przeciwciała drugorzędowego (barwnik fluorescencyjny, sprzężony z kozią anty-myszą) rozcieńczonego w stosunku 1:500 w buforze do przemywania i inkubować przez 1 godzinę na lodzie. Dodać 4 μl 0,2 mM barwienia kwasem nukleinowym dalekiej czerwieni fluorescencyjnej przez ostatnie 5 minut tej inkubacji, aby znakować jądra.</li>
	<li>Przemyj komórki 3x 1 ml buforu do płukania na zimno i zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych za pomocą 7 μl środka mocującego zapobiegającego blaknięciu. Poczekaj, aż podłoże montażowe stwardnieje przez noc, zanim uszczelnisz szkiełko nakrywkowe do szkiełka mikroskopowego za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci.</li>
	<li>Obrazowanie makrofagów za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ex/Em dla przeciwciała drugorzędowego wynosi 555/580 nm i 642/661 dla barwienia kwasem nukleinowym o dalekiej czerwieni fluorescencyjnej (jak opisano poniżej). 
	UWAGA: Znakowanie za pomocą FAM-YVAD-FMK i znakowanie przeciwciałami można połączyć w celu wykazania kolokalizacji aktywnej kaspazy-1 i ASC. W tym celu należy postępować zgodnie z warunkami znakowania FAM-YVAD-FMK, a następnie przejść na protokół znakowania przeciwciał w celu dalszego przetwarzania.</li>
</ol>
6. Obrazowanie znakowanych makrofagów za pomocą mikroskopii konfokalnej
UWAGA: Poplamione komórki można oglądać po pozostawieniu szkiełek nakrywkowych do utwardzenia przez noc i przyklejeniu ich do szkiełka mikroskopowego lakierem do paznokci. Tutaj opisano obrazowanie przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Komórki można również oglądać za pomocą standardowej mikroskopii fluorescencyjnej.
<ol>
	<li>Umieść szkiełko z nieleczonymi komórkami kontrolnymi na stoliku mikroskopu i skoncentruj mikroskop na komórkach.</li>
	<li>Korzystając z ustawień tabeli przeglądowej mikroskopu (LUT), dostosuj przesunięcie tak, aby w nieleczonych komórkach nie było dodatniego barwienia FAM-YVAD-FMK. Proces ten można również przeprowadzić przy użyciu makrofagów z niedoborem kaspazy-1. 
	UWAGA: Przesunięcie musi być dostosowane dla każdego kanału użytego w eksperymencie, ale ustawienie prawidłowego przesunięcia jest najbardziej krytyczne dla kanału FAM-YVAD-FMK i kanałów przeciwciał fluorescencyjnych. Przesunięcie kanału DNA jest mniej krytyczne. Po ustawieniu przesunięcia nie dostosowuj tego ustawienia do końca eksperymentu.</li>
	<li>Przesunąć szkiełko na próbkę potraktowaną nigerycyną. Znajdź pole, które zawiera zarówno komórki, które są dodatnie, jak i ujemne dla barwienia FAM-YVAD-FMK. Dostosuj płaszczyznę obrazowania kanału FAM-YVAD-FMK do płaszczyzny o największej intensywności barwienia dodatniego. Zwykle będzie to płaszczyzna, w której obrazowany jest środek ogniska inflamasomu.</li>
	<li>Dostosuj wzmocnienie tak, aby ogniska były widoczne w komórkach, które mają skondensowane jądra. Po ustawieniu zarówno wzmocnienia, jak i przesunięcia, pozostaw te ustawienia do końca sesji obrazowania. 
	UWAGA: Jednym z łatwych sposobów określenia, czy komórka jest piroptotyczna, jest przyjrzenie się morfologii jądrowej. Komórki z aktywną kaspazą-1 mają zaokrąglone i skondensowane jądra, podczas gdy jąderka są widoczne w komórkach bez aktywacji kaspazy-1, a morfologia jądra jest podobna do morfologii komórek nieleczonych.</li>
	<li>Zbierz obrazy 5 losowo wybranych pól w 100-krotnym powiększeniu całkowitym. Zwykle daje to około 40 komórek na obraz. Powtórz ten proces dla każdej próbki.</li>
	<li>Policz liczbę komórek na każdym obrazie za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Następnie policz liczbę komórek, które mają dodatnie barwienie FAM-YVAD-FMK. Reprezentują poziom aktywacji kaspazy-1 jako procent komórek dodatnich FAM-YVAD-FMK.</li>
</ol>
7. Test uwalniania LDH
UWAGA: Do testu uwalniania LDH, zasiewaj i zagruntuj komórki zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji, z wyjątkiem użycia płytki 96-dołkowej. Nie usuwaj podłoża po zagruntowaniu.
<ol>
	<li>Dodać 50 μl DMEM-5 zawierającego 10 μM nigerycyny do dołków doświadczalnych i 50 μL DMEM-5 do dołków do spontanicznej i 100% kontrolnej lizy. Nie dodawaj glicyny w tym eksperymencie, ponieważ celem jest pomiar lizy komórek. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Po 30 minutach dodać 10 μl 10-krotnego buforu do lizy do 100% dołków kontrolnych lizy i dodać 10 μl DMEM-5 do pozostałych studzienek. Podczas tej inkubacji wyjmij 1 fiolkę mieszanki substratów (1,5 ml liofilizowanego substratu) i 1 podwielokrotność buforu do oznaczania (~12 ml) z zamrażarki i pozwól im rozmrozić się przed światłem do temperatury pokojowej. 
	UWAGA: Mieszanka substratów zawiera sól tetrazolową (fiolet jodonitro-tetrazoliowy), która jest przekształcana w czerwony produkt formazanu.</li>
	<li>Po 60 minutach całkowitej inkubacji odwirować płytkę przez 5 minut przy 500 x g w temperaturze 10 °C. Przenieść 50 μl supernatantu na przezroczystą płytkę z płaskim dnem. W tym czasie dodać 12 ml buforu do testu do fiolki z mieszanką substratów i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut przed użyciem.</li>
	<li>Dodaj 50 μl substratu do każdej studzienki i inkubuj przez 30 minut w ciemności. Uwzględnij dołki tylko w pożywkach dla wartości pustych. Sprawdź tabliczkę po 15 minutach, aby upewnić się, że sygnał nie przekroczy granicy wykrywalności czytnika tabliczek.</li>
	<li>Po 30 minutach dodać 50 μl roztworu zatrzymującego (1 M kwas octowy) i zmierzyć OD490 za pomocą czytnika płytek.</li>
	<li>Oblicz procent lizy komórek, korzystając z następującego wzoru: 
	% Cytotoksyczność = ((Eksperymentalny - Spontaniczny)/(Maksymalny - Spontaniczny))×100 
	Eksperymentalny: komórki traktowane nigerycyną; spontaniczne: nieleczone komórki; Maksimum: Komórki wystawione na działanie buforu do lizy</li>
</ol>

<ol><li>Jorgensen, I., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyroptotic+cell+death+defends+against+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens.</a> Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).</li>
<li>Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammasomes%3A+mechanism+of+action%2C+role+in+disease%2C+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics.</a> Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).</li>
<li>Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyroptosis%3A+host+cell+death+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pyroptosis: host cell death and inflammation.</a> Nat Rev Microbiol. 7 (2), 99-109 (2009).</li>
<li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasome%3A+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li>
<li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-1-dependent+pore+formation+during+pyroptosis+leads+to+osmotic+lysis+of+infected+host+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages.</a> Cell Microbiol. 8 (11), 1812-1825 (2006).</li>
<li>Bergsbaken, T., Fink, S. L., den Hartigh, A. B., Loomis, W. P., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+host+responses+during+pyroptosis%3A+caspase-1-dependent+lysosome+exocytosis+and+inflammatory+cytokine+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Coordinated host responses during pyroptosis: caspase-1-dependent lysosome exocytosis and inflammatory cytokine maturation.</a> J Immunol. 187 (5), 2748-2754 (2011).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+GSDMD+by+inflammatory+caspases+determines+pyroptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.</a> Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).</li>
<li>Sutterwala, F. S., Haasken, S., Cassel, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+NLRP3+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanism of NLRP3 inflammasome activation.</a> Ann N Y Acad Sci. 1319, 82-95 (2014).</li>
<li>Juliana, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-transcriptional+priming+and+deubiquitination+regulate+NLRP3+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation.</a> J Biol Chem. 287 (43), 36617-36622 (2012).</li>
<li>Py, B. F., Kim, M. S., Vakifahmetoglu-Norberg, H., Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deubiquitination+of+NLRP3+by+BRCC3+critically+regulates+inflammasome+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Deubiquitination of NLRP3 by BRCC3 critically regulates inflammasome activity.</a> Mol Cell. 49 (2), 331-338 (2013).</li>
<li>Song, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRP3+Phosphorylation+Is+an+Essential+Priming+Event+for+Inflammasome+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">NLRP3 Phosphorylation Is an Essential Priming Event for Inflammasome Activation.</a> Mol Cell. 68 (1), 185-197 (2017).</li>
<li>Stutz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRP3+inflammasome+assembly+is+regulated+by+phosphorylation+of+the+pyrin+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">NLRP3 inflammasome assembly is regulated by phosphorylation of the pyrin domain.</a> J Exp Med. 214 (6), 1725-1736 (2017).</li>
<li>Broz, P., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammasomes%3A+mechanism+of+assembly%2C+regulation+and+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling.</a> Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).</li>
<li>Masumoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASC%2C+a+novel+22-kDa+protein%2C+aggregates+during+apoptosis+of+human+promyelocytic+leukemia+HL-60+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells.</a> J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).</li>
<li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASC+is+essential+for+LPS-induced+activation+of+procaspase-1+independently+of+TLR-associated+signal+adaptor+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules.</a> Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).</li>
<li>Miao, E. A., Rajan, J. V., Aderem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-1-induced+pyroptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Caspase-1-induced pyroptotic cell death.</a> Immunol Rev. 243 (1), 206-214 (2011).</li>
<li>LaRock, C. N., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Yersinia+virulence+effector+YopM+binds+caspase-1+to+arrest+inflammasome+assembly+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The Yersinia virulence effector YopM binds caspase-1 to arrest inflammasome assembly and processing.</a> Cell Host Microbe. 12 (6), 799-805 (2012).</li>
<li>Swanson, M. S., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Legionella+pneumophila+with+the+macrophage+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum.</a> Infect Immun. 63 (9), 3609-3620 (1995).</li>
<li>Miller, S. I., Ernst, R. K., Bader, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS%2C+TLR4+and+infectious+disease+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">LPS, TLR4 and infectious disease diversity.</a> Nat Rev Microbiol. 3 (1), 36-46 (2005).</li>
<li>Sester, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+flow+cytometric+method+to+assess+inflammasome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A novel flow cytometric method to assess inflammasome formation.</a> J Immunol. 194 (1), 455-462 (2015).</li>
<li>Sester, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Inflammasome+Formation+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Assessment of Inflammasome Formation by Flow Cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. , (2016).</li>
<li>DiPeso, L., Ji, D. X., Vance, R. E., Price, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+and+cell+lysis+are+separable+events+during+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discov%22%5BJournal%5D)">Cell death and cell lysis are separable events during pyroptosis.</a> Cell Death Discov. , (2017).</li>
<li>Russo, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+Caspase-1+Induces+Plasma+Membrane+Pores+That+Precede+Pyroptotic+Lysis+and+Are+Blocked+by+Lanthanides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Active Caspase-1 Induces Plasma Membrane Pores That Precede Pyroptotic Lysis and Are Blocked by Lanthanides.</a> J Immunol. 197 (4), 1353-1367 (2016).</li>
<li>Evavold, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pore-Forming+Protein+Gasdermin+D+Regulates+Interleukin-1+Secretion+from+Living+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages.</a> Immunity. , (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów

W tym manuskrypcie przedstawiliśmy dwie techniki badania aktywacji inflamasomu i konsekwencji aktywacji kaspazy-1 po stymulacji NLRP3 w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Pierwsza technika pozwala badaczowi określić poziom aktywacji kaspazy-1 na bazie komórkowej za pomocą fluorescencyjnego reportera FAM-YVAD-FMK. Ten reporter jest wysoce specyficzny dla wiązania enzymów z rodziny kaspazy-1, co widać po braku barwienia w makrofagach z niedoborem kaspazy-1/11. Swoistość wykazali również LaRock i wsp</em...

Zapalenie wywołane przez inflammasomy jest kluczowym elementem obrony przed organizmami chorobotwórczymi1, ale także leży u podstaw etiologii wielu chorób2. Odpowiedź zapalna na szeroki zakres infekcji jest wywoływana przez cytozolowe wykrywanie wzorców molekularnych związanych z patogenami (PAMP) lub wzorców molekularnych związanych z uszkodzeniem (DAMP). Receptory rozpoznawania wzorców (PRR), w tym członkowie rodziny receptorów podobnych do NOD (NLR), oligomeryzują się po wykryciu tych PAMP i DAMP. Powoduje to tworzenie wielobiałkowego kompleksu zwanego inflamasomem, który zawiera PRR, białko adaptorowe podobne do plamki związane z apoptozą, zawierające C-końcową domenę rekrutacji kaspazy (CARD) (ASC) oraz pro-formę kaspazy-13,4. Kompleks ten umożliwia indukowaną bliskością automatyczną aktywację kaspazy-1. Aktywna kaspaza-1 prowadzi następnie do zestawu zdarzeń, które są charakterystyczne dla piroptozy szlaku śmierci komórki stanu zapalnego. Zdarzenia te obejmują: rozszczepienie i uwolnienie cytokin zapalnych IL-1β i IL-18, egzocytozę lizosomów z uwolnieniem zawartości lizosomalnej do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, kondensację jądrową oraz rozszczepienie gasderminy D. Uwolniona N-końcowa domena gasderminy D wstawia się do błony plazmatycznej, tworząc pory, które powodują pęknięcie błony plazmatycznej i uwolnienie treści zapalnej, a także zabierają niszę ochronną dla replikacji patogenu5,6,7.
Tutaj skupiamy się na dobrze zbadanym inflamasomie NLRP3. Aktywacja inflamasomu NLRP3 zachodzi w dwuetapowym procesie8. Pierwszy etap "torowania" następuje poprzez rozpoznanie produktu drobnoustrojowego przez receptory Toll-podobne (TLR). Jest to replikowane w warunkach laboratoryjnych za pomocą LPS do stymulacji TLR4. Ta stymulacja zwiększa poziom NLRP3 i pro-IL-1β poprzez sygnalizację NF-kB. Gruntowanie dodatkowo licencjonuje NLRP3 poprzez mechanizmy nietranskrypcyjne poprzez indukowanie jego deubikwitynacji9,10 oraz fosforylacji lub defosforylacji określonych reszt11,12.
Uważa się, że drugi sygnał aktywacji NLRP3 obejmuje czynniki mitochondrialne, reaktywne formy tlenu, wypływ potasu i sygnalizację wapnia, chociaż mechanizm jednoczący dla aktywacji NLRP3 pozostaje nieuchwytny8. Aktywowany NLRP3 oligomeryzuje poprzez interakcje między swoimi domenami NACHT i rekrutuje ASC poprzez wiązanie domen pyryny (PYD) 13. W każdej komórce te kompleksy makromolekularne tworzą pojedyncze mikroskopijnie widoczne ognisko. ASC zostało pierwotnie zidentyfikowane jako białko 22 KDa, które tworzy "plamkę" podczas apoptozy ludzkich komórek białaczkowych i nazwane białkowym białaczką związaną z apoptozą zawierającą klasę CARD14. Później ustalono, że ASC rekrutuje pro-kaspazę-1 poprzez interakcję CARD ASC z CARD pro-kaspazy-1, tworząc klasę inflammasome<sup="xref">15.
Nie wszystkie NLR-y wymagają obecności ASC do wywołania aktywacji kaspazy-1. W przeciwieństwie do NLRP3, NLRC4 i NLRP1b mają domeny CARD i mogą bezpośrednio rekrutować pro-kaspazę-1 poprzez interakcje CARD-CARD w celu wywołania aktywacji kaspazy-1. W przypadku braku ASC, aktywna kaspaza-1 pozostaje rozproszona w całym cytozolu i nie tworzy pojedynczego ogniska. Ta rozproszona aktywna kaspaza-1 jest wystarczająca do wywołania pyroptotycznej śmierci komórki, ale nie jest w stanie przetworzyć pro-IL-1β13,16.
W tym manuskrypcie omówimy dwa sposoby oceny aktywacji inflamasomu. Pierwszy z nich wykorzystuje sondę aktywności fluorescencyjnej FAM-YVAD-FMK, która wiąże rodzinę proteaz kaspazy-1. Do tej rodziny zalicza się kaspazę-1, ale także kaspazę myszą-11 oraz kaspazę ludzką-4 i kaspazę-5. Wykorzystując makrofagi od myszy z niedoborem kaspazy-1/11 we wszystkich eksperymentach, zajmiemy się specyfiką tej sondy. Metodę tę można połączyć z znakowaniem przeciwciałami składników inflamasomu, które również opiszemy. Wizualizacja mikroskopowa pozwala na identyfikację pojedynczych komórek zawierających aktywną kaspazę-1 i oligomeryzowany ASC. Korzystając z tej metody, naukowcy będą w stanie określić, w którym momencie tworzenia inflamasomu ich manipulacje komórką gospodarza lub badanym organizmem chorobotwórczym mają wpływ. Na przykład, można rozróżnić, czy dana interwencja zapobiega rekrutacji ASC do kompleksu NLRP3, czy też ma na celu późniejszą rekrutację i aktywację kaspazy-117. Badanie wyników aktywacji kaspazy-1, takich jak wydzielanie IL-1β, nie byłoby w stanie rozróżnić tych dwóch możliwości. Ponadto, wydzielanie IL-1β może być zmienione bez zmiany zdolności komórek do aktywacji kaspazy-1 i ulegania pyroptotycznej śmierci komórki16.
Druga metoda mierzy uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej (LDH) do supernatantu komórki, co następuje podczas lizy makrofagów piroptotycznych po aktywacji kaspazy-1, jak opisano powyżej. Ta druga metoda jest podejściem populacyjnym, ponieważ mierzy się uwalnianie LDH w całym dołku. To proste podejście pozwala na szybką analizę (30 minut czasu inkubacji) próbek w celu określenia, czy śmierć komórki za pośrednictwem kaspazy 1 i może być przeprowadzona w formacie 96-dołkowej płytki.
Te metody są komplementarne, każda z innymi zaletami i obie łatwo poddają się modyfikacjom. Na przykład leczenie makrofagami ukierunkowanymi związkami o małej masie cząsteczkowej przed stymulacją inflamasomu można zastosować do zbadania roli, jaką niektóre białka mogą odgrywać w kontrolowaniu odpowiedzi zapalnych.

<table><tbody><tr><td>E-MEM</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>Do hodowli komórek L929</td></tr><tr><td>Klon NCRC 929 (L929)</td> <td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do utrwalania/permeabilizacji</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>Zawiera roztwór do utrwalania i przepuszczalności oraz bufor do mycia. Zastrzeżone preparaty. Zawiera 4,2% formaldehydu</td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Biorad</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>Cytotox96 Test cytotoksyczności nieradioaktywnej</td><td>Fisher Scientific</td><td>PR-G1780</td><td>zawiera mieszaninę substratów i bufor do oznaczania; Zastrzeżone preparaty. Roztwór zatrzymujący to 1 M Kwas octowy</td></tr><tr><td>FAM-YVAD-FMK</td><td>Immunocytochemistry Technologies</td><td>98</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoki poziom glukozy, bez glutaminy</td><td>Invitrogen</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoki poziom glukozy, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowej</td><td>Invitrogen</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Invitrogen</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowany, pochodzący z USA</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td>Heat inaktywowany w temperaturze 55&deg; C przez 50 min</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Medium montażowe</td><td>Invitrogen</td><td>p36934</td><td>Zastrzeżona formuła. Utwardzanie medium montażowego. Utwardza się do wskaźnika oporności 1,46</td></tr><tr><td>Kozia ALEXA555 przeciw mysim</td><td>Invitrogen</td><td>A-21422</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Ultra Pure)</td><td>Invitrogen</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>21051024</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 Jodek</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>dalekoczerwony fluorescencyjny barwienie kwasem nukleinowym</td></tr><tr><td>Mysz C57BL/6J</td><td>Jackson Laboratoy</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>kaspaza-1/11-/- mysz</td><td>Jackson Laboratory</td><td>016621</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Leica SP8X</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure LPS od Salmonella minnesota R595 (Re)</td><td>List Biologicals</td><td>434</td><td></td></tr><tr><td>anty-ASC klon 2EI-7</td><td>Millipore-Sigma</td><td>04-417</td><td></td></tr><tr><td>beta-merkaptoetanol</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D2650-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore-Sigma</td><td>E5391</td><td></td></tr><tr><td>Spectramax M3</td><td>czytnik płytek Urządzenia molekularne</td><td>5000414</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie aktywacji inflamasomu i śmierci komórek piroptotycznych w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflamasomy są wrodzonymi platformami sygnalizacji immunologicznej, które są niezbędne do skutecznego zwalczania wielu organizmów chorobotwórczych, ale także sprzyjają chorobom zapalnym i autozapalnym. Inflamasomy są aktywowane przez receptory rozpoznawania wzorców cytozolowych, w tym członków rodziny receptorów podobnych do NOD (NLR). Receptory te oligomeryzują się po wykryciu bodźców mikrobiologicznych lub związanych z uszkodzeniem. Późniejsza rekrutacja białka adaptorowego ASC tworzy mikroskopijnie widoczny kompleks inflamasomowy, który aktywuje kaspazę-1 poprzez autoaktywację indukowaną bliskością. Po aktywacji kaspaza-1 rozszczepia pro-IL-1β i pro-IL-18, prowadząc do aktywacji i wydzielania tych cytokin prozapalnych. Kaspaza-1 pośredniczy również w zapalnej postaci śmierci komórki zwanej piroptozą, która charakteryzuje się utratą integralności błony i lizą komórek. Kaspaza-1 rozszczepia gasderminę D, uwalniając N-końcowy fragment, który tworzy pory błony plazmatycznej, prowadząc do lizy osmotycznej.
In vitro, aktywacja kaspazy-1 może być określona poprzez znakowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego za pomocą sondy aktywności kaspazy-1 FAM-YVAD-FMK i poprzez znakowanie komórek przeciwciałami przeciwko białku adaptorowemu ASC. Technika ta pozwala na identyfikację powstawania inflamasomu i aktywacji kaspazy-1 w poszczególnych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pyroptotyczną śmierć komórek można wykryć, mierząc uwalnianie cytozolowej dehydrogenazy mleczanowej do pożywki. Procedura ta jest prosta, opłacalna i wykonywana na 96-dołkowej płytce, co pozwala na adaptację do badań przesiewowych. W tym manuskrypcie pokazujemy, że aktywacja inflamasomu NLRP3 przez nigerycynę prowadzi do kolokalizacji białka adaptorowego ASC i aktywnej kaspazy-1, co prowadzi do piroptozy.

Aby wykryć aktywację kaspazy-1 po ekspozycji na nigerycynę, komórki przetwarzano zgodnie z opisem w sekcji protokołu. Połączyliśmy znakowanie FAM-YVAD-FMK oraz przeciwciałem przeciw ASC, aby wykazać, że ASC i aktywna kaspaza-1 kolokalizują po aktywacji inflamasomu zależnej od NLRP3. Rysunek 1A pokazuje, że w makrofagach typu dzikiego eksponowanych na 5 μM nigerycyny dochodzi do tworzenia się ogniska ASC w regionie okojądrowym. Ogniska te zawierają również akt...

Opisujemy wykrywanie aktywacji inflamasomu NLRP3 na bazie komórkowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i barwienia dla aktywnej kaspazy-1 i adaptera, ASC. Przedstawiono test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu wykrycia lizy piroptotycznej w skali populacji. Techniki te można dostosować do badania wielu aspektów biologii inflamasomów.

Wykrywanie aktywacji inflamasomu i śmierci komórek piroptotycznych w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Ogólnym celem tego protokołu jest zbadanie aktywacji inflamasomu na poziomie pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz pomiar lizy podczas piroptozy za pomocą dehydrogenazy mleczanowej lub testu uwalniania LDH. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inflamasomów, takie jak to, w jaki sposób regulowana jest aktywacja kaspazy-1. Główną zaletą tych technik jest to, że pozwalają użytkownikowi badać wiele etapów szlaków aktywacji inflamasomu i piroptozy.Procedurę zademonstruje Andreas den Hartigh, naukowiec z mojego laboratorium. Zacznij od zastąpienia pożywki z makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego zagruntowanych LPS wysianych na szklanych szkiełkach nakrywkowych 290 mikrolitrami pożywki DMEM 5, uzupełnionej pięcioma mikromolowymi nigerycynami i pięcioma milimolowymi glicynami na studzienkę. Umieść 24-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, dodając 10 mikrolitrów 30X FAM-YVAD-FMK po pierwszych 15 minutach.Pod koniec inkubacji przemyć komórki jednym mililitrem zimnego PBS na studzienkę, trzy razy przez pięć minut na przemycie i utrwalić komórki 250 mikrolitrami 2% paraformaldehydu na studzienkę przez 30 minut na lodzie chronionym przed światłem, znakując komórki odpowiednim fluorescencyjnym barwnikiem jądrowym w ciągu ostatnich pięciu minut. Pod koniec inkubacji przemyj komórki trzykrotnie zimnym PBS, jak właśnie pokazano, i załaduj każde szkiełko siedmioma mikrolitrami pożywki mocującej zapobiegającej blaknięciu. Umieść szkiełko nakrywkowe na każdym szkiełku podstawowym i poczekaj, aż medium montażowe stwardnieje przez noc, zanim uszczelnisz szkiełka nakryte lakierem do paznokci.Aby zobrazować komórki za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej, umieść nieleczone szkiełko kontrolne na stoliku mikroskopu i ręcznie ustaw ostrość na komórkach. Korzystając z ustawień tabeli przeglądowej mikroskopu, dostosuj przesunięcie, aż w nieleczonych komórkach nie będzie można zaobserwować dodatniego barwienia sondą. Następnie, używając próbki potraktowanej nigeryną, zlokalizuj pole zawierające komórki, które są zarówno dodatnie, jak i ujemne dla barwienia sondy i dostosuj płaszczyznę obrazowania kanału sondy do płaszczyzny o największej intensywności barwienia dodatniego.Następnie dostosuj wzmocnienie, aż ogniska będą widoczne w komórkach ze skondensowanymi jądrami i uzyskaj obrazy pięciu losowo wybranych pól na szkiełko przy 100-krotnym powiększeniu całkowitym. W celu analizy immunofluorochemicznej komórek traktowanych nigerycyną, umyj komórki znakowane rekwizytem, jak właśnie pokazano, i inkubuj komórki w 250 mikrolitrach roztworu utrwalającego i przepuszczalnego na studzienkę przez 30 minut na lodzie, chroniony przed światłem. Przemyj makrofagi jeszcze trzy razy świeżym buforem do płukania i oznacz komórki 250 mikrolitrami pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko białemu plamkowemu związanemu z opadaniem powieki, zawierającemu C-końcową domenę rekrutacji kaspazy lub ASC, na studzienkę, przez jedną godzinę na lodzie.Umyć komórki pod koniec inkubacji i oznaczyć próbki 250 mikrolitrami odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z barwnikiem fluorescencyjnym przez kolejną godzinę na lodzie, dodając cztery mikrolitry odpowiedniego fluorescencyjnego barwnika barwiącego jądra w ciągu ostatnich pięciu minut. Po trzykrotnym umyciu komórek w buforze do płukania na zimno, zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach z siedmioma mikrolitrami pożywki mocującej zapobiegającej blaknięciu, jak pokazano, i zobrazuj makrofagi za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej. Aby przeprowadzić test uwalniania LDH, dodaj 50 mikrolitrów pożywki DMEM 5 uzupełnionej 10 mikromolową nigerycyną do każdej studzienki doświadczalnej i 50 mikrolitrów DMEM 5 do dołków spontanicznych i 100% kontrolnych lizy przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Po 30 minutach dodaj 10 mikrolitrów 10-krotnego buforu do lizy do studzienek kontrolnych 100% lizy i dodaj 10 mikrolitrów pożywki do pozostałych studzienek. Pod koniec inkubacji odwirować płytkę i przenieść 50 mikrolitrów supernatantu z każdej studzienki na klarowną płytkę o płaskim dnie. Następnie dodaj 50 mikrolitrów świeżo rozmrożonego i przygotowanego substratu do każdej studzienki na 30-minutową inkubację w ciemności, sprawdzając płytkę po 15 minutach, aby potwierdzić, że sygnał nie przekroczy granicy wykrywalności czytnika płytek.Pod koniec inkubacji dodać 50 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki i zmierzyć OD490 na odpowiednim czytniku płytek, aby umożliwić obliczenie procentowej lizy komórek na studzienkę. Podczas gdy makrofagi typu wystawione na działanie nigerycyny wykazują tworzenie ogniska ASC w regionie okołojądrowym, które zawiera również aktywną kaspazę-1, co wskazuje, że komórki te przechodzą piroptozę. Podczas gdy makrofagi myszy z niedoborem kaspazy-111 również generują ognisko ASC, komórki te nie mają żadnej aktywnej kaspazy-1 związanej z tym ogniskiem, na co wskazuje brak barwienia FAM-YVAD-FMK.Jądra tych komórek nie są również skondensowane, co wskazuje na brak pyroptotycznej śmierci komórki. Co więcej, duży odsetek makrofagów typu dzikiego ulega śmierci komórkowej po ekspozycji na nigerycynę, mierzoną za pomocą analizy uwalniania LDH ich supernatantów hodowlanych, podczas gdy makrofagi z niedoborem kaspazy-1 nie uwalniają LDH do supernatantu, co wskazuje, że komórki są nadal nienaruszone. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować tworzenie się inflamasomu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i określać poziom lizy komórek poprzez pomiar uwalniania LDH.Procedura ta może być zmodyfikowana w celu zastosowania innych bodźców inflamasomowych lub interwencji, które zmieniają aktywację inflamasomu lub piroptozę.

detection-inflammasome-activation-pyroptotic-cell-death-murine-bone

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje metodę wykrywania aktywacji inflamasomu NLRP3 w makrofagach za pomocą fluorescencyjnych sond reporterowych. Komórki są traktowane jonoforami potasu i glicyną w celu indukcji składania inflamasomu i aktywacji kaspazy-1. Fluorescencyjne sondy reporterowe wizualizują aktywowaną kaspazę-1, a komórki są barwione barwnikiem fluorescencyjnym w celu wizualizacji jąder.

Wykrywanie aktywacji inflamasomu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten film demonstruje technikę badania tworzenia inflamasomu w pierwotnej makrofagach za pomocą immunofluorescencji receptorów podobnych do NOD, rodziny receptorów pirynowych, zawierających domenę 3 (NLRP3). Makrofagi są najpierw przygotowywane za pomocą bakteryjnego lipopolisacharydu (LPS) w celu zwiększenia ekspresji białka NLRP3. Wystawienie makrofagów na działanie nigerycyny - jonoforu potasu - prowadzi do aktywacji NLRP3 i powstania inflamasomów, które są wizualizowane za pomocą...

Technika in vitro do badania tworzenia kompleksów inflamasomów w makrofagach

Ten film demonstruje test dehydrogenazy mleczanowej do wykrywania śmierci makrofagów za pośrednictwem inflamasomów. Makrofagi są poddawane działaniu lipopolisacharydu w celu pobudzenia, a następnie ekspozycji na nigerycynę w celu spowodowania śmierci komórek wywołanej inflamasomem, która jest określana przez test dehydrogenazy mleczanowej.

Test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu wykrycia śmierci makrofagów po ekspozycji na nigerycynę

Ten film pokazuje ocenę wielokrotnych aktywacji kaspazy w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego poprzez stymulację wirusem grypy. Po lizie makrofagów, inaktywacji termicznej lizatu i odwirowaniu pobiera się kaspazy wewnątrzkomórkowe do późniejszej analizy immunologicznej.

Ocena aktywacji wielu kaspaz w makrofagach

Artykuł opisuje łatwy w użyciu adaptacyjny model in vitro do badania polaryzacji makrofagów. W obecności GM-CSF/M-CSF krwiotwórcze komórki macierzyste/progenitorowe ze szpiku kostnego są kierowane do różnicowania monocytowego, a następnie stymulacji M1 lub M2. Stan aktywacji można śledzić za pomocą zmian w antygenach powierzchniowych komórki, ekspresji genów i szlakach sygnalizacji komórkowej.

Badanie polaryzacji makrofagów przy użyciu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Komórki dendrytyczne (DC) wydzielają IL-1β w odpowiedzi na rozpoznanie TLR8 syntetycznej puryny, R848, a następnie aktywację inflamasomu NLRP3 nigerycyną, dlatego IL-1β może być użyty do pomiaru aktywności inflamasomu NLRP3. Barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych, immunoblotting i ELISA służą do dokładnego pomiaru pobudzania i aktywacji inflamasomu NLRP3 poprzez ekspresję IL-1β.

Aktywacja i pomiar aktywności inflamasomu NLRP3 za pomocą IL-1β w ludzkich komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów

Ten protokół przedstawia efektywną i niezawodną metodę transfekcji ludzkich makrofagów THP-1 za pomocą siRNA lub plazmidowego DNA za pomocą elektroporacji z wysoką wydajnością transfekcji, przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej żywotności komórek i pełnej zdolności makrofagów do różnicowania i polaryzacji.

Wysoce wydajna transfekcja ludzkich makrofagów THP-1 metodą nukleofekcji

Ten protokół dostarcza badaczom szybkiej, pośredniej metody pomiaru aktywności czynnika transkrypcyjnego NF-кB/AP-1 zależnego od TLR w linii komórkowej mysich makrofagów w odpowiedzi na różnorodne powierzchnie polimerowe i zaadsorbowane warstwy białek, które modelują mikrośrodowisko implantu biomateriału.

Test komórek reporterowych makrofagów do zbadania sygnalizacji NF-kB/AP-1 za pośrednictwem receptora toll-podobnego na zaadsorbowanych warstwach białek na powierzchniach polimerowych

Ten protokół opisuje proces uzyskiwania makrofagów pochodzących z monocytów (MDM) z próbek ludzkiej krwi, prostą metodę skutecznego wprowadzania reporterów dwumolekularnej komplementacji fluorescencji kaspazy (BiFC) do ludzkiego MDM bez uszczerbku dla żywotności i zachowania komórek, oraz podejście oparte na obrazowaniu do pomiaru aktywacji kaspazy zapalnej w żywych komórkach.

Wizualizacja bliskości wywołanej zapalnymi kaspazami w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Ten protokół opisuje kompleksową metodę oceny aktywacji kaspazy (kaspaza-1, kaspaza-3, kaspaza-7, kaspaza-8, kaspaza-9 i kaspaza-11) w odpowiedzi na modele infekcji zarówno in vitro, jak i in vivo (u myszy) infekcji, sterylnych zniewag i raka w celu określenia inicjacji szlaków śmierci komórki, takich jak piroptoza, apoptoza, nekroptoza i PANoptosis.

Ocena aktywacji kaspazy w celu oceny wrodzonej śmierci komórek odpornościowych

Ten protokół opiera się na indukowanej przez LPS i ATP śmierci makrofagów THP-1 zróżnicowanych PMA. Używamy cytometrii przepływowej do analizy podwójnego barwienia aneksyny V i 7-AAD w celu wykrycia śmierci komórki, wykorzystując całą komórkę i stosując skaningową mikroskopię elektronową do obserwacji morfologii błony komórkowej.

Śmierć makrofagów THP-1 różnicowanych przez PMA i ATP indukowana przez LPS i ATP i jej walidacja

Poznaj metody wykrywania aktywacji inflamasomu NLRP3 na poziomie pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz oznaczania lizy komórkowej w piroptozie testem LDH.

Wykrywanie aktywacji inflamasomu i śmierci komórek piroptotycznych w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Przeglądaj więcej filmów