Wykrywanie aktywacji inflamasomu i śmierci komórek piroptotycznych w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Ogólnym celem tego protokołu jest zbadanie aktywacji inflamasomu na poziomie pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz pomiar lizy podczas piroptozy za pomocą dehydrogenazy mleczanowej lub testu uwalniania LDH. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inflamasomów, takie jak to, w jaki sposób regulowana jest aktywacja kaspazy-1. Główną zaletą tych technik jest to, że pozwalają użytkownikowi badać wiele etapów szlaków aktywacji inflamasomu i piroptozy.

Procedurę zademonstruje Andreas den Hartigh, naukowiec z mojego laboratorium. Zacznij od zastąpienia pożywki z makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego zagruntowanych LPS wysianych na szklanych szkiełkach nakrywkowych 290 mikrolitrami pożywki DMEM 5, uzupełnionej pięcioma mikromolowymi nigerycynami i pięcioma milimolowymi glicynami na studzienkę. Umieść 24-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, dodając 10 mikrolitrów 30X FAM-YVAD-FMK po pierwszych 15 minutach.

Pod koniec inkubacji przemyć komórki jednym mililitrem zimnego PBS na studzienkę, trzy razy przez pięć minut na przemycie i utrwalić komórki 250 mikrolitrami 2% paraformaldehydu na studzienkę przez 30 minut na lodzie chronionym przed światłem, znakując komórki odpowiednim fluorescencyjnym barwnikiem jądrowym w ciągu ostatnich pięciu minut. Pod koniec inkubacji przemyj komórki trzykrotnie zimnym PBS, jak właśnie pokazano, i załaduj każde szkiełko siedmioma mikrolitrami pożywki mocującej zapobiegającej blaknięciu. Umieść szkiełko nakrywkowe na każdym szkiełku podstawowym i poczekaj, aż medium montażowe stwardnieje przez noc, zanim uszczelnisz szkiełka nakryte lakierem do paznokci.

Aby zobrazować komórki za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej, umieść nieleczone szkiełko kontrolne na stoliku mikroskopu i ręcznie ustaw ostrość na komórkach. Korzystając z ustawień tabeli przeglądowej mikroskopu, dostosuj przesunięcie, aż w nieleczonych komórkach nie będzie można zaobserwować dodatniego barwienia sondą. Następnie, używając próbki potraktowanej nigeryną, zlokalizuj pole zawierające komórki, które są zarówno dodatnie, jak i ujemne dla barwienia sondy i dostosuj płaszczyznę obrazowania kanału sondy do płaszczyzny o największej intensywności barwienia dodatniego.

Następnie dostosuj wzmocnienie, aż ogniska będą widoczne w komórkach ze skondensowanymi jądrami i uzyskaj obrazy pięciu losowo wybranych pól na szkiełko przy 100-krotnym powiększeniu całkowitym. W celu analizy immunofluorochemicznej komórek traktowanych nigerycyną, umyj komórki znakowane rekwizytem, jak właśnie pokazano, i inkubuj komórki w 250 mikrolitrach roztworu utrwalającego i przepuszczalnego na studzienkę przez 30 minut na lodzie, chroniony przed światłem. Przemyj makrofagi jeszcze trzy razy świeżym buforem do płukania i oznacz komórki 250 mikrolitrami pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko białemu plamkowemu związanemu z opadaniem powieki, zawierającemu C-końcową domenę rekrutacji kaspazy lub ASC, na studzienkę, przez jedną godzinę na lodzie.

Umyć komórki pod koniec inkubacji i oznaczyć próbki 250 mikrolitrami odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z barwnikiem fluorescencyjnym przez kolejną godzinę na lodzie, dodając cztery mikrolitry odpowiedniego fluorescencyjnego barwnika barwiącego jądra w ciągu ostatnich pięciu minut. Po trzykrotnym umyciu komórek w buforze do płukania na zimno, zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach z siedmioma mikrolitrami pożywki mocującej zapobiegającej blaknięciu, jak pokazano, i zobrazuj makrofagi za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej. Aby przeprowadzić test uwalniania LDH, dodaj 50 mikrolitrów pożywki DMEM 5 uzupełnionej 10 mikromolową nigerycyną do każdej studzienki doświadczalnej i 50 mikrolitrów DMEM 5 do dołków spontanicznych i 100% kontrolnych lizy przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Po 30 minutach dodaj 10 mikrolitrów 10-krotnego buforu do lizy do studzienek kontrolnych 100% lizy i dodaj 10 mikrolitrów pożywki do pozostałych studzienek. Pod koniec inkubacji odwirować płytkę i przenieść 50 mikrolitrów supernatantu z każdej studzienki na klarowną płytkę o płaskim dnie. Następnie dodaj 50 mikrolitrów świeżo rozmrożonego i przygotowanego substratu do każdej studzienki na 30-minutową inkubację w ciemności, sprawdzając płytkę po 15 minutach, aby potwierdzić, że sygnał nie przekroczy granicy wykrywalności czytnika płytek.

Pod koniec inkubacji dodać 50 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki i zmierzyć OD490 na odpowiednim czytniku płytek, aby umożliwić obliczenie procentowej lizy komórek na studzienkę. Podczas gdy makrofagi typu wystawione na działanie nigerycyny wykazują tworzenie ogniska ASC w regionie okołojądrowym, które zawiera również aktywną kaspazę-1, co wskazuje, że komórki te przechodzą piroptozę. Podczas gdy makrofagi myszy z niedoborem kaspazy-111 również generują ognisko ASC, komórki te nie mają żadnej aktywnej kaspazy-1 związanej z tym ogniskiem, na co wskazuje brak barwienia FAM-YVAD-FMK.

Jądra tych komórek nie są również skondensowane, co wskazuje na brak pyroptotycznej śmierci komórki. Co więcej, duży odsetek makrofagów typu dzikiego ulega śmierci komórkowej po ekspozycji na nigerycynę, mierzoną za pomocą analizy uwalniania LDH ich supernatantów hodowlanych, podczas gdy makrofagi z niedoborem kaspazy-1 nie uwalniają LDH do supernatantu, co wskazuje, że komórki są nadal nienaruszone. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować tworzenie się inflamasomu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i określać poziom lizy komórek poprzez pomiar uwalniania LDH.

Procedura ta może być zmodyfikowana w celu zastosowania innych bodźców inflamasomowych lub interwencji, które zmieniają aktywację inflamasomu lub piroptozę.