Oznaczanie swoistości proteazy w ekstraktach tkanek myszy za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF: manipulowanie PH w celu wywołania zmian swoistości

Ogólnym celem tego eksperymentu jest określenie swoistości proteazy w wielu surowych ekstraktach. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w celu określenia specyficzności proteazy. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona zidentyfikować specyficzność proteazy wielu próbek w parlay.

Chłodne próbki tkanki płucnej uzyskane od samców myszy ICR w lodzie. Homogenizować próbki w temperaturze 20 000 RMP przez 30 sekund w blenderze. Powtarzaj ten krok, aż próbki będą całkowicie jednorodne.

Nie homogenizować dłużej niż jedną minutę w sposób ciągły, aby uniknąć wzrostu temperatury. Przenieść 1 000 mikrolitrów homogenatu do probówki o pojemności 1,5 mililitra i wirować przez pięć minut w temperaturze 10 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś 500 mikrolitrów supernatantu do nowej plastikowej rurki o pojemności 1,5 mililitra.

Użyj 10 mikrolitrów próbki do oznaczenia stężenia białka. Za pomocą metod, takich jak test kwasu bicynchoninowego lub test Bradforda. Aby zapobiec zamarzaniu, dodaj 80% glicerolu do próbek, aby uzyskać końcowe stężenie 50% glicerolu.

Aby wyjaśnić różnicę w swoistości proteazy w zależności od pH, należy użyć trawiennych dostosowanych do pH trzeciego, piątego, siódmego i dziewiątego. Do 890 mikrolitrów buforu wytrawiającego dodać 10 mikrolitrów po 0,1 mikrograma na mikrolitr lub trypsynę TPCK, 0,1 mikrograma na mikrolitr proteazy Staphylococcus aureus V8 lub 10 mikrogramów na mikrolitr ekstraktów tkankowych. Przygotować kontrole ujemne przez inaktywację proteazy w ekstraktach tkankowych przez inkubację i gotowanie wody przez 10 minut.

Następnie dodaj 10 mikrolitrów substratów MNO znakowanych biotyną do próbek i inkubuj przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu strawienia. Po inkubacji przerwij trawienie substratów wrzącą wodą na 10 minut. Odwirowywać strawione substraty przez pięć minut w temperaturze 10 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj 50 mililitrów 50% kulek sefarozy streptawidyny w jednym molowym buforze tris, zawierającym 0,1% eteru polioksyetylenooktylowo-fenylowego. Użyj papieru do testowania pH, aby upewnić się, że roztwór ma pH około dziewięć.

Ważne jest, aby dostosować prawidłowe pH do dziewięciu lub więcej. Aminobiotyna nie może ugryźć koralika, chyba że ma pH dziewięć lub wyższe. Jeśli pH roztworu jest niskie, dostosuj je do około pH dziewięć, dodając więcej buforu.

Dodatkowo można dodać jeden molowy bufor tris, aby w razie potrzeby podnieść pH. Zawiesinę inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z ciągłym delikatnym mieszaniem na kole rotatora w celu związania substratów znakowanych biotyną MNO ze streptawidyną. Koraliki powinny pozostać zawieszone przez cały okres inkubacji.

Następnego dnia odwirować próbki przez jedną minutę w temperaturze 10 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu supernatantu umyć kulki, dodając 1 000 mikrolitrów buforu do mycia. Następnie inkubować przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ciągle delikatnie mieszając na rotatorze.

Wirować kulki przez jedną minutę w temperaturze 10 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant i powtórzyć to płukanie cztery razy. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 0,2% kwasu trifluorooctowego do kulek.

Użyj bibuły testowej pH, aby upewnić się, że roztwór jest poniżej pH dwóch. Jeśli pH roztworu jest wysokie, dostosuj pH poniżej dwóch, dodając 1% kwas trifluorooctowy. Inkubować zawiesinę przez 30 minut w temperaturze pokojowej z ciągłym delikatnym mieszaniem na kole rotatora.

Po odwirowaniu kulek jak poprzednio, przenieś supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Odpipetuj 20 mikrolitrów acetonitrylu na żywicę C18, aby ją aktywować. Usuń zużyty acetonitryl i powtórz ten krok aktywacji trzy razy.

Następnie zrównoważyć żywicę C18 z 20 mikrolitrami 0,1% kwasu trifluorooctowego. Usunąć eluant i powtórzyć ten etap równoważenia trzy razy. Aby załadować próbki, zwiąż je z żywicą za pomocą pipety.

Umyj żywicę 20 mikrolitrami 0,1% kwasu trifluorooctowego. Powtórz ten krok pięć razy. Eluować próbki trzema mikrolitrami 60% acetonitrylu w 0,1% kwasie trifluorooctowym.

Odpipetować eluant na płytkę docelową do spektromitrii mas MALDI-TOF. Natychmiast dodać roztwór CHCA, nasycony 50% acetonitrylem w 0,1% kwasie trifluorooctowym. Skrystalizować mieszaninę przez suszenie na powietrzu.

Uzyskaj widma masowe próbek, zgodnie z protokołem producenta urządzenia, zwracając szczególną uwagę na widma masowe od 700 do 900 daltonów dla rozszczepionej formy substratów etykiet biotyny. Widma masowe podłoży syntetycznych przedstawiono tutaj. Piki odpowiadające masie cząsteczkowej prekursora wykryto między 850 a 1 050.

Rozszczepione fragmenty wykrywane są w zakresie od 700 do 850. Pokazano tutaj widma dla substratów znakowanych biotyną MNO potraktowanych trypsyną TPCK. Szczyty 839,81 daltonów i 796,76 daltonów odpowiadają fragmentom odciętym od końca C odpowiednio lizyny i argininy.

Pokazano tutaj widma masowe substratów syntetycznych trawionych proteazą V8. Piki 769,78 daltonów i 755,62 daltonów odpowiadają fragmentom odciętym od końca C odpowiednio kwasu glutaminowego i kwasu asparaginowego. Widma dla substratów znakowanych biotyną MNO traktowanych ekstraktem z tkanki płucnej w różnych warunkach pH przedstawiono tutaj.

W stanie kwaśnym, przy pH piątym, masa cząsteczkowa rozszczepionego fragmentu wynosiła 770,13 daltonów i 826,66 daltonów, co wskazuje na rozszczepienie na końcu C kwasu glutaminowego i tryptofanu. W warunkach obojętnych i zasadowych, przy pH siódmym i dziewiątym, masa cząsteczkowa rozszczepionego fragmentu wzrosła w szczycie 767 daltonów i 840 daltonów, co wskazuje na rozszczepienie na końcu C argininy i lizyny. I odwrotnie, piki kwasu glutaminowego i tryptofanu uległy zmniejszeniu.

Ponadto ta metoda nie może wykryć rozszczepionych fragmentów z inaktywowanymi ekstraktami. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch dni, jeśli jest wykonywana prawidłowo, z wyjątkiem syntezy substratu. Dodatkowo, po zsyntetyzowaniu substratu, można go zmierzyć w kilku próbkach. Dlaczego?

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o działaniu przy pH buforu, około dziewięciu. Ogólnie rzecz biorąc, reakcja kompleksu aminobiotyny awidyny. Po tej procedurze możliwe jest ilościowe określenie aktywności enzymu poprzez wykonanie CMS.

Metoda ta pozwoli naukowcom zajmującym się proteonami utorować drogę do zbadania ekspresji proteazy w kilku warunkach.