Generowanie wysokoprzepustowych trójwymiarowych sferoid nowotworowych do badań przesiewowych leków
5 września 2018
W szerokim zakresie wskazań chorobowych, bardziej fizjologicznie istotne modele są opracowywane i wdrażane do programów odkrywania leków. Opisany tutaj nowy system modelowy pokazuje, w jaki sposób trójwymiarowe sferoidy nowotworowe mogą być hodowane i badane przesiewowo w wysokowydajnym systemie opartym na płytkach 1536-dołkowych w celu poszukiwania nowych leków onkologicznych.
Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie odkrywania leków, takie jak, jakie jest najodpowiedniejsze ustawienie hodowli tkankowej dla identyfikacji trafienia do odprowadzenia. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona hodowlę komórek w trzech wymiarach, w sposób wysokoprzepustowy, przy użyciu płytek 1536-dołkowych. Zademonstruje ten protokół Kalyani Gampa, starszy naukowiec z mojego laboratorium.
Aby skonfigurować hodowlę sferoidalną guza 3D, odłącz interesujące nas linie komórek rakowych za pomocą trzech płukań BBS. Następnie dodaje się jeden mililitr trypsyny na pięć centymetrów kwadratowych powierzchni kolby hodowlanej. Po pięciu minutach zneutralizować trypsynę pięciokrotnością objętości pożywki uzupełnionej surowicą w każdej kolbie i policzyć komórki.
Użyj wysterylizowanej, małej kasety ze stali nierdzewnej z systemem opartym na pompie perystaltycznej, aby wysiać łącznie 500 komórek w ośmiu mikrolitrach sferoidalnego podłoża do każdej studzienki na płytce poddanej działaniu 1 536 dołków poddanych kulturze tkankowej. Następnie użyj oddychającej uszczelki samoprzylepnej, aby zakryć płytę. I umieść płytkę w wirującym inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 10 obr./min z 5% dwutlenkiem węgla i 95% wilgotnością względną na trzy dni.
Najważniejszym krokiem jest upewnienie się, że płytki są dobrze uszczelnione przed umieszczeniem ich w inkubatorze. Sferoidy będą potrzebowały trzech dni, aby się uformować, a ten krok zapobiega parowaniu medium. Pod koniec inkubacji szybko obróć płytki hodowlane wyłożone rakiem pod kątem 100-krotności grawitacji, aby zebrać kondensację i usunąć uszczelki adhezyjne.
Umieść każdą płytkę, która ma być poddana obróbce, na dozowniku akustycznym ustawionym tak, aby dostarczyć łącznie osiem nanolitrów każdego związku. Rozcieńczenie do końcowego stężenia 0,1% DMSO na studzienkę i górna dawka związku 10 mikromolowych. Po dodaniu związku do odpowiednich płytek należy umieścić na każdej płytce specjalnie wykonaną pokrywę do hodowli komórkowych ze stali nierdzewnej, aby zapobiec parowaniu, i umieścić płytki z powrotem w wirującym inkubatorze na kolejne pięć dni.
Pod koniec inkubacji dodać trzy mikrolitry wstępnie podgrzanego odczynnika do lizy komórek, uzupełnionego lucyferyną, do każdego dołka każdej płytki do hodowli komórkowej. I inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut. Następnie uchwyć luminescencję ATP na luminometrze płytkowym.
Po przeanalizowaniu wszystkich płytek, należy wyodrębnić surowe dane z przyrządu i znormalizować wszystkie pola zawierające badane związki do średniej ze wszystkich studzienek zawierających sam DMSO jako neutralną kontrolę. Procentowe zahamowanie wzrostu każdego związku można następnie obliczyć zgodnie ze wzorem i krzywymi odpowiedzi na dawkę, a następnie można wygenerować hamujące IC50. Różne znane komórki rakowe, o których wiadomo, że dobrze rosną w warunkach hodowli 2D, również tworzyły struktury 3D podczas hodowli, jak właśnie wykazano, pomimo różnic morfologicznych.
W przypadku stosowania do badań przesiewowych na dużą skalę można zaobserwować różnicową wrażliwość związków między kulturami uprawianymi w 2D w porównaniu z kulturami uprawianymi w 3D. Każda kropka reprezentuje stężenie hamujące pojedynczego związku, dla którego obserwuje się 50% odpowiedź zabijania komórek w obu warunkach hodowli. W tym reprezentatywnym eksperymencie oba testowane związki hamujące kinazę RAF były silniejsze w warunkach 3D w hodowli linii niedrobnokomórkowego raka płuca zawierającej mutację aktywującą białko KRAS.
Jednak związki te wykazują podobną siłę działania zarówno w hodowlach linii feroidów 3D, jak i 2D raka jelita grubego, które zawierają mutację aktywującą G13D w KRAS. Test 3D pozwala również na obserwację paradoksalnego zjawiska aktywacji wzrostu, które występuje, gdy dochodzi do niepełnego zahamowania dimerów RAF w wysoce aktywowanych liniach mutantów RAF, o czym świadczy wzrost komórek przy niskich stężeniach leku, który jest tłumiony przy wysokich stężeniach. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się odkrywaniem leków przeciwnowotworowych do zbadania alternatywnych warunków hodowli w celu identyfikacji nowej, skutecznej materii chemicznej przeciwko znanym celom.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia nowatorską metodę poszukiwania leków z wykorzystaniem trójwymiarowych sferoidów nowotworowych hodowanych w wysokoprzepustowym systemie płytek 1536-dołkowych. Podejście to ma na celu zwiększenie relewantności warunków hodowli tkankowych w procesie identyfikacji potencjalnych leków onkologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Onkologia
- Odkrywanie leków
- Techniki hodowli komórkowych
Wstęp
- Tradycyjne dwuwymiarowe hodowle komórkowe często nie oddają charakterystyki mikrośrodowiska guza.
- Hodowle trójwymiarowe stanowią model bardziej istotny fizjologicznie do badania nowotworów.
- Przesiewanie wysokoprzepustowe jest niezbędne do efektywnego odkrywania leków.
- Niniejsze badanie koncentruje się na optymalizacji hodowli sferoidów nowotworowych.
Cel badania
- Opracowanie wysokoprzepustowej metody hodowli sferoidów nowotworowych.
- Ocena przydatności tego modelu w procesie odkrywania leków.
- Ułatwienie identyfikacji nowych leków onkologicznych.
Zastosowane metody
- Odrywanie linii komórek nowotworowych za pomocą przemywania w roztworze BBS.
- Wykorzystanie trypsyny do odrywania komórek i neutralizacja za pomocą pożywki z dodatkiem surowicy.
- Hodowla komórek w formacie płytki 1536-dołkowej.
- Przesiewanie potencjalnych kandydatów na leki metodą wysokoprzepustową.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na efektywną hodowlę trójwymiarowych sferoidów nowotworowych.
- Możliwości wysokoprzepustowe umożliwiają szybki screening kandydatów na leki.
- Wykazano istotność modelu hodowli 3D w procesie odkrywania leków.
- Potencjał do usprawnienia procesu identyfikacji związków hit-to-lead.
Wnioski
- Ta metoda hodowli trójwymiarowych sferoidów nowotworowych usprawnia procesy odkrywania nowych leków.
- Zapewnia ona dokładniejsze odwzorowanie biologii nowotworu.
- Podejście to może prowadzić do zidentyfikowania nowych terapii onkologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Metoda ta niweluje lukę translacyjną w poszukiwaniu leków onkologicznych, umożliwiając wysokoprzepustowe przesiewanie w fizjologicznie istotnym 3D modelu sferoidów nowotworowych. Wspiera ona pewność prognostyczną w walidacji celu, ujawniając zróżnicowane odpowiedzi na leki pomiędzy warunkami hodowli 2D a 3D. Podejście to usprawnia identyfikację związków wiodących (hit-to-lead) dla inhibitorów szlaku MAPK w genetycznie zdefiniowanych modelach nowotworowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w systemie istotnym dla danej jednostki chorobowej, który odwzorowuje trójwymiarowe interakcje komórkowe oraz organizację przestrzenną.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez porównanie skuteczności związków w hodowlach 2D i 3D w celu zidentyfikowania aktywności zależnej od kontekstu.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia identyfikację związków wiodących poprzez wykrywanie zróżnicowanej wrażliwości w modelach niedrobnokomórkowego raka płuca z mutacją KRAS w warunkach 3D.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia zestandaryzowany, powtarzalny system hodowli 3D kompatybilny z formatami 1536-dołkowymi, przeznaczony do wysokoprzepustowego przesiewania związków.
- Wartość operacyjna: Umożliwia ilościowy odczyt luminescencyjny oparty na ATP w celu pomiaru hamowania wzrostu oraz generowania krzywych zależności dawka-odpowiedź i wartości IC50.
- Gotowość testu: Wykorzystuje dozowanie akustyczne do precyzyjnego dostarczania nanolitrowych ilości związków oraz inkubację w szczelnych naczyniach w celu zapobiegania parowaniu, co zapewnia integralność analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy odkrycia naukowe z procesami przedklinicznymi poprzez modelowanie oddziaływań między guzem a zrąbem oraz warunków przypominających macierz zewnątrzkomórkową w formatowalnym modelu.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia obserwację paradoksalnej aktywacji wzrostu w mutantach dimerów RAF, co pozwala na opracowanie strategii terapii skojarzonej i zmniejszenie ryzyka w przypadku kandydatów do badań klinicznych.
- Dostosowanie biomarkerów: Wspiera ocenę inhibitorów specyficznych dla danej ścieżki (np. MAPK) w zdefiniowanych genetycznie tłach w celu skorelowania genotypu z odpowiedzią na lek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, umożliwiając wczesną ocenę skuteczności związku w bardziej istotnym fizjologicznie kontekście przed inwestycjami w fazie przedklinicznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez, wykazując, w jaki sposób hodowla 3D zmienia wrażliwość na leki w modelach napędzanych onkogenami, takich jak NSCLC z mutacją KRAS.
- Screening: Zapewnia gotowość i powtarzalność testów dzięki standaryzowanemu tworzeniu sferoidów w płytkach 1536-dołkowych z kontrolowanymi protokołami inkubacji i uszczelniania.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar zmiennej zależnej poprzez normalizację luminescencji ATP względem kontroli DMSO, co ułatwia obliczanie IC50 i porównawczą analizę aktywności.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie przestrzennej architektury guza oraz interakcji klonalnych, które nie występują w systemach 2D.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do screeningu różnych linii komórek nowotworowych i bibliotek związków celujących w konserwowane szlaki, takie jak MAPK.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki bezpośredniemu porównaniu odpowiedzi leków w układach 2D i 3D.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację, powtarzalność i skalowalność dzięki kompatybilnym z robotyką procesom z wykorzystaniem płytek 1536-dołkowych oraz inkubacji w szczelnych warunkach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez identyfikację związków o aktywności specyficznej dla kontekstu, co redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków wiodących z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o różnicową skuteczność w modelach fizjologicznie relewantnych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach trójwymiarowych (3D) hodowli komórkowych, w tym w neutralizacji trypsyny, liczeniu komórek oraz sterylnym wysiewaniu.
- Zależy od aparatury, takiej jak systemy kasetowe oparte na pompach perystaltycznych, dyspensery akustyczne, inkubatory obrotowe oraz luminometry do płytek.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji protokołów uszczelniania, parametrów inkubacji (37°C, 10rpm, 5% CO2, 95% wilgotności) oraz procedur normalizacji danych.
- Obejmuje kwestie adaptacyjne dla różnych linii komórek nowotworowych, ponieważ wydajność tworzenia sferoidów może się różnić, mimo ich pomyślnego formowania w liniach uznanych.
- Uwzględnia ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność zapobiegania parowaniu podczas przedłużonej inkubacji oraz optymalizacja dawkowania związków w objętościach nanolitrowych.
