Name: Generowanie wysokoprzepustowych trójwymiarowych sferoid nowotworowych do badań przesiewowych leków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Poznaj metodę hodowli trójwymiarowych sferoid nowotworowych w formacie 1536-well do badań przesiewowych leków onkologicznych. Technika umożliwia szybkie testowanie związków chemicznych w warunkach wysokoprzepustowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Marcowi Ferrerowi z National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health za jego wsparcie i wskazówki dotyczące początkowego rozwoju tych testów. Ponadto chcielibyśmy podziękować Alyson Freeman, Marieli Jaskelioff, Michaelowi Ackerowi, Jacobowi Halingowi i Vesselini Cooke za ich wkład naukowy i dyskusję jako członków zespołu projektowego.

1. Hodowla 1536-dołkowych sferoid guzów 3D
<ol>
	<li>Przygotować świeżą pożywkę sferoidalną 3D guza (pożywka komórkowa + zamiennik surowicy nokautującej + insulina-transferyna-selen), dodając następujące odczynniki do 500 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM/F12): 1x penicylina/streptomycyna, 10 ng/ml ludzkiego podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF), 20 ng/ml ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), 0,4% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (frakcja V), 1x insulina-transferyna-selen i 1% nokautująca (KO) surowica (nie zamrażać-rozmrażać).</li>
	<li>Przefiltruj i wysterylizuj całe podłoże z suplementami przez system filtrów butelkowych 0,4 μm.</li>
	<li>Odłącz linie komórek rakowych, które rosły zgodnie z zalecanymi rutynowymi warunkami hodowli, od tradycyjnych kolb do hodowli komórkowych, przemłukując je 3x solą fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem (PBS) i dodając odpowiednią ilość 0,25% trypsyny (1 ml na 5 cm2) przez 5 minut, aby utworzyć cienką warstwę na komórkach. Zneutralizuj trypsynę 5-krotnością ilości pożywki zawierającej surowicę i przystąp do liczenia komórek. Na przykład użyj 25 ml pożywki na 5 ml trypsyny.</li>
	<li>Dostosuj stężenie roztworu komórkowego do 62,5 x 104 komórek/ml, aby wysiać łącznie 500 komórek na studzienkę w 8 μl podłoża sferoidalnego do płytek poddanych działaniu 1536-dołkowej hodowli tkankowej.</li>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego wysiewaj komórki za pomocą wysterylizowanej, małej kasety z końcówką ze stali nierdzewnej z systemem opartym na pompie perystaltycznej. Pomiędzy różnymi liniami komórkowymi przepłucz rurki kasety 1x PBS i 70% etanolem przez 10 sekund.</li>
	<li>Alternatywnie, wysiewaj komórki za pomocą płynu znajdującego się w pomieszczeniu filtrowanym przez HEPA za pomocą wysterylizowanej, małej kasety ze stalą nierdzewną i pompy perystaltycznej lub dołączonej pompy strzykawkowej, w zależności od liczby płytek na potrzebną linię komórkową.</li>
	<li>Uszczelnij płytki za pomocą oddychającej samoprzylepnej uszczelki do płyt, ręcznie lub za pomocą uszczelniacza do płyt.</li>
	<li>Umieścić płytki w inkubatorze wirującym ustawionym na 10 obr./min i 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla (CO2 ) i 95% wilgotnością względną. Pozwól sferoidom uformować się przez 3 dni.</li>
</ol>
2. Hodowla 1536-dołkowych linii raka 2D
UWAGA: 1536-dołkowe linie raka 2D powinny być hodowane 24 godziny przed dodaniem związku do płytek 3D.
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę 2D z komórek rakowych, dodając następujące odczynniki do 500 ml odpowiedniej pożywki wzrostowej dla wybranych linii: 1x penicylina/streptomycyna i 10% płodowa surowica bydlęca (FBS).</li>
	<li>Przefiltruj i wysterylizuj całe podłoże z suplementami przez system filtrów butelkowych 0,4 μm.</li>
	<li>Odłącz linie komórek rakowych, które rosły zgodnie z zalecanymi rutynowymi warunkami hodowli, od tradycyjnych kolb do hodowli komórkowych, myjąc je 3x 1x PBS i dodając odpowiednią ilość 0,25% trypsyny (1 ml na 5 cm2) przez 5 minut, aby utworzyć cienką warstwę na komórkach. Zneutralizuj trypsynę 5-krotnością ilości pożywki zawierającej surowicę i przystąp do liczenia komórek. Na przykład użyj 25 ml pożywki na 5 ml trypsyny.</li>
	<li>Dostosuj stężenie roztworu komórkowego do 62,5 x 104 komórek/ml, aby wysiać łącznie 500 komórek na studzienkę w 8 μl kompletnego podłoża na 1536-dołkowe płytki poddane działaniu kultur tkankowych.</li>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego wysiewaj komórki za pomocą wysterylizowanej, małej kasety z końcówką ze stali nierdzewnej z systemem opartym na pompie perystaltycznej. Pomiędzy różnymi liniami komórkowymi przepłucz rurkę kasety 1x sterylnym PBS i 70% etanolem przez 10 sekund.</li>
	<li>Alternatywnie, wysiewa się komórki za pomocą urządzenia do obsługi cieczy umieszczonego w pomieszczeniu robotyki z filtrem HEPA przy użyciu wysterylizowanej, małej kasety ze stalą nierdzewną i pompy perystaltycznej lub dołączonej pompy strzykawkowej, w zależności od wymaganej objętości płytek na linię komórkową.</li>
	<li>Uszczelnij płytki za pomocą oddychającej samoprzylepnej uszczelki do płyt, ręcznie lub za pomocą uszczelniacza do płyt.</li>
	<li>Umieścić płytki w inkubatorze wirującym ustawionym na 10 obr./min i 37 °C na 24 godziny przed dodaniem mieszanki, przy 5% CO2 i wilgotności względnej 95%.</li>
</ol>
3. Dodawanie złożone
<ol>
	<li>Przygotować 8-punktowe, 3-krotne seryjne rozcieńczenia inhibitorów MAPK w 100% dimetylosulfotlenku (DMSO) na robocie do obsługi cieczy o maksymalnym stężeniu 10 mM. Inhibitor proteasomu Bortezomib jest stosowany jako kontrola pozytywna do całkowitego zabicia komórki w celu określenia zakresu dynamicznego testu.</li>
	<li>Szybko odwiruj wszystkie płytki testowe i płytki złożone przy 100 x g, aby zebrać kondensację. Usuń uszczelkę adhezyjną z każdej płytki i umieść płytkę na dozowniku akustycznym, aby dodać łącznie 8 nL każdego związku/rozcieńczenia, co stanowi końcowe stężenie 0,1% DMSO na studzienkę i górną dawkę związku 10 μM.</li>
	<li>Po zakończeniu dodawania związku należy umieścić na płytce wykonaną na zamówienie pokrywę do hodowli komórkowej ze stali nierdzewnej, która zapobiega parowaniu, a następnie umieścić płytkę w inkubatorze wirującym w temperaturze 37 °C przez 5 dni, przy 5% CO2 i wilgotności względnej 95%.</li>
</ol>
4. Wykrywanie, dodawanie odczynników i pozyskiwanie surowych danych
<ol>
	<li>Wstępnie ogrzej odpowiednią objętość odczynnika do lizy komórek zawierającego lucyferynę, aby wykryć zmiany w trifosforanie adeniny (ATP), a tym samym zmiany w proliferacji komórek w temperaturze pokojowej lub w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Dodać w sumie 3 μl odczynnika do wykrywania do każdej studzienki za pomocą pompy perystaltycznej i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut.</li>
	<li>Uchwyć luminescencję na luminometrze płytkowym.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Wyodrębnij surowe dane z przyrządu i znormalizuj wszystkie pola zawierające związki testowe do średniej ze wszystkich studzienek zawierających sam DMSO jako neutralną kontrolę. Na podstawie tej wartości oblicz procentowe zahamowanie wzrostu każdego związku. Jest to wykonywane za pomocą funkcji formuły w programie Microsoft Excel, gdzie f(x)={(wartość próbki względne jednostki światła (RLU)/(średnia wartość DMSO RLU)*100)}.</li>
	<li>Wygeneruj krzywe dawka-odpowiedź i hamujące IC50, przedstawiając na wykresie wartości znormalizowanych danych z kroku 5.1 w stosunku do stężenia związku za pomocą programu do tworzenia wykresów. 
	UWAGA: Przeanalizowaliśmy dane za pomocą Helios, wewnętrznego narzędzia programowego NIBR. Aby uzupełnić tę funkcję, wybraliśmy narzędzie do analizy krzywych nieparametrycznych.</li>
</ol>

<ol><li>Lee, M., Vasioukhin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+polarity+and+cancer--cell+and+tissue+polarity+as+a+non-canonical+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cell polarity and cancer--cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor.</a> Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).</li>
<li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research%3A+Focus+on+tumor+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).</li>
<li>Weigelt, B., Ghajar, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+complex+3D+culture+models+to+unravel+novel+pathways+and+identify+accurate+biomarkers+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 69, 42-51 (2014).</li>
<li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 332 (3), 821-828 (2010).</li>
<li>Li, L., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+a+3D+Culture+System+to+Study+the+Interaction+between+Epithelial+Breast+Cancer+and+Its+Surrounding+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optimizing a 3D Culture System to Study the Interaction between Epithelial Breast Cancer and Its Surrounding Fibroblasts.</a> Journal of Cancer. 2, 458-466 (2011).</li>
<li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li>
<li>Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumour+models%3A+novel+in+vitro+approaches+to+cancer+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies.</a> Journal of Cell Communication and Signaling. 5 (3), 239-248 (2011).</li>
<li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+%283D%29+models+in+cancer+research%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update.</a> Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).</li>
<li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+pharmacological+profiling+of+3D+tumor+models+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Large-scale pharmacological profiling of 3D tumor models of cancer cells.</a> Cell Death & Disease. 7 (12), e2492(2016).</li>
<li>Polo, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+to+PI3K+and+MEK+inhibitors+in+breast+cancer.+Use+of+a+3D+culture+system+to+study+pathways+related+to+hormone+independence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Responsiveness to PI3K and MEK inhibitors in breast cancer. Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice.</a> PLoS One. 5 (5), e10786(2010).</li>
<li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li>
<li>Bhargava, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registered+report%3A+RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Elife. 5, e09976(2016).</li>
<li>Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+CpG+promoter+methylation+in+invasive+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells.</a> Molecular Cancer. 9, 267(2010).</li>
<li>Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+gene+regulation+in+stem+cells+and+correlation+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer.</a> Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+DNA+repair+genes+in+invasive+human+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells.</a> Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+1536-well+quantitative+high-throughput+screen+to+identify+compounds+targeting+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).</li>
<li>Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+culture+of+murine+primordial+germ+cells+and+embryonic+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells.</a> Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+SOX9+by+the+NF-kappaB+signaling+pathway+in+pancreatic+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells.</a> Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+1536-well+quantitative+high-throughput+screen+to+identify+compounds+targeting+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).</li>
<li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+combinatorial+screening+identifies+drugs+that+cooperate+with+ibrutinib+to+kill+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).</li>
<li>Herter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three-dimensional+heterotypic+spheroid+model+for+the+assessment+of+the+activity+of+cancer+immunotherapy+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).</li>
</ol>

Autorzy są pracownikami Novartisu, a niektórzy pracownicy są również akcjonariuszami.

Przedstawione tutaj metody pokazują szczegółowy protokół wytwarzania sferoid guza na płytkach 1536-dołkowych do badań przesiewowych związków na dużą skalę. Metody te zostały początkowo zaadaptowane z pracy w National Cancer Institute, gdzie sferoidy guza hodowano w testach niskoprzepustowych na płytkach 6-dołkowych i 96-dołkowych, aby zadać pytania o zależności genetyczne i wrażliwość związków 13,14,15. Krytyczną i unikalną cech...

W ciągu ostatniej dekady, coraz więcej badań wdrażało wykorzystanie modeli 3D hodowli komórkowych do zrozumienia koncepcji, które nie są w pełni podsumowane przez hodowlę komórek w 2D na plastiku. Przykładami tych pojęć są zmiany w normalnej polaryzacji komórek nabłonka1, w których utracona jest orientacja przestrzenna wierzchołkowych i podstawnych warstw komórek, a także rola macierzy zewnątrzkomórkowej w regulacji przeżycia i losu komórki. W szczególności w badaniach onkologicznych wykorzystano modele 3D, aby zrozumieć podstawową biologię komórek nowotworowych oraz różnice między systemami hodowli komórkowych 2D i 3D3,4. Rozwój bardziej wyrafinowanych technik hodowli komórkowych i ich dalsza adaptacja do formatów wielodołkowych umożliwiły poszukiwanie nowych leków w warunkach 3D. W przeciwieństwie do komórek hodowanych w warunkach 2D, modele 3D nowotworów różnią się złożonością od warstwowych systemów komórkowych5 do sfer jednokomórkowych o różnych rozmiarach, do złożonych sfer wielokomórkowych typu sup6,7,8. Odkrycie nowych związków lub leków biologicznych, które silnie indukują śmierć komórki w tych systemach modeli 3D, cieszy się zatem dużym zainteresowaniem w kampaniach rozwoju leków. Punkty końcowe tych testów są często identyczne z tymi wykonywanymi w hodowlach 2D w celu oceny zmian w proliferacji komórek, ale gdy są przeprowadzane w bardziej fizjologicznie istotnych warunkach, mogą ujawnić prawdziwy poziom zależności badanego genu lub szlaku docelowego.
Jak wspomniano powyżej, opracowano różne systemy modelowe do badania reakcji leków w systemach hodowli 3D, ale większość z nich wykorzystuje 96 lub 384-dołkowe płytki mikromiareczkowe i nie można ich łatwo dostosować do formatów wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS), często używanych w kampaniach przesiewowych odkrywania leków. Takie systemy obejmują wykorzystanie technologii wiszących kropel, kultur sferoidalnych, pulsujących komórek z cząstkami magnetycznymi w celu wywołania lewitacji oraz kultur zawierających naturalne lub syntetyczne żele, takie jak kolagen, Matrigel lub glikol polietylenowy (PEG)2. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe metody wcześniej opracowanej techniki wytwarzania kultur sferoidalnych 3D z ustalonych linii komórek nowotworowych w formacie płytki 1536-dołkowej. W tym protokole używane jest wysoce zdefiniowane podłoże, które zapobiega przyłączaniu się normalnie przylegających linii komórkowych9. System ten ma ograniczenia (tj. nie może w pełni podsumować złożonego systemu modelowego raka), niemniej jednak testy te umożliwiają wysokoprzepustowe badania przesiewowe dużych zbiorów małych cząsteczek i przekrojowe porównania odpowiedzi leków między hodowlami 2D i 3D na różne linie komórkowe i związki.
Linie komórkowe wybrane do zademonstrowania metod opisanych w tym artykule zawierają mutacje w genach związanych ze szlakiem sygnałowym MAPK, szlakiem, który jest wysoce rozregulowany w raku i dla którego dostępnych jest wiele terapii. Wiele linii ma aktywujące mutacje onkogenne w wirusie mięsaka szczura Kirsten, określanym również jako KRAS, Neuroblastoma RAS lub NRAS, onkogenie wirusa mięsaka szczura Harveya lub KRAS i powiązanych kinazach Szybko przyspieszone włókniakomięsaki, znane również jako RAF. Najnowsza literatura sugeruje, że inhibitory różnych węzłów tego szlaku są wyjątkowo bardziej skuteczne w podzbiorze linii komórkowych, gdy są hodowane w warunkach 3D9,10. Jedno z badań wykazało, że gdy komórki rakowe z aktywnym RAS były hodowane w 3D, wykazywały zwiększoną wrażliwość na inhibitory MAPK, a ponadto, że takie podejście może zidentyfikować szlaki i docelowe inhibitory, które mogą zostać pominięte w tradycyjnym ustawieniu 2D. Celem pracy jest przedstawienie metod stosowanych do hodowli tych linii komórkowych, a ponadto wykazanie zróżnicowanych odpowiedzi na te inhibitory, które można zaobserwować tylko przy użyciu systemów hodowli komórkowych 3D.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td>Zakupiony jako gotowy roztwór. Stwierdzono, że ten odbiór jest preferowany w porównaniu z innymi dostawcami.</td></tr><tr><td>DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td>Zakupiony jako gotowe rozwiązanie.</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)</td><td>Lonza</td><td>12-115Q</td><td>Zakupiony jako gotowe rozwiązanie.</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td>Zakupiona jako gotowy roztwór.</td></tr><tr><td>1x 0,25% Trypsyna z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA)</td><td>Hyclon</td><td>SH30042.01</td><td>Zakupiony jako gotowy roztwór.</td></tr><tr><td>1x Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>Zakupiony jako gotowy roztwór.</td></tr><tr><td>10 ng / ml Ludzki zasadowy czynnik wzrostu fibrobastu (bFGF)</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>Zawiesić w sterylnej wodzie.</td></tr><tr><td>20 ng / ml Ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>Zawiesić w sterylnej wodzie.</td></tr><tr><td>0,4% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td>Zawiesić w sterylnym PBS i przefiltrować.</td></tr><tr><td>1x Insulina Transferyna Selen (ITS)</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>1% KnockOut (KO) Zamiennik Surowicy</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>Dodaj świeże tuż przed użyciem.</td></tr><tr><td>100% dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7573</td><td>Zakupiony jako gotowy roztwór.</td></tr><tr><td><mocne>Materiały eksploatacyjne</mocna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mała kaseta Combi</td><td>ThermoFisher</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Mała kaseta wieloprzepływowa</td><td>BioTek</td><td>294085</td><td></td></tr><tr><td>1536-dołkowe sterylne płytki TC (białe)</td>Sterylne płytki TC <td>Corning</td><td>3727</td><td></td></tr><tr><td>1536 dołków (czarne)</td><td>Płytki</td><td></td> Corning 3893 <td></td></tr><tr><td>Scivax</td><td>MBL International</td><td>NCP-LH384-10</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleje uszczelniają</td><td>TermoFisher</td><td>AB0718</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator wirujący</td><td>LiCONiC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pokrywy ze stali nierdzewnej</td> Instytut <td>Genomiki Fundacji Badawczej Novartis (GNF)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATS Dozownik</td><td>akustyczny EDS Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dozownik akustyczny Echo</td><td>Luminometr Labcyte</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Envision-Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna - Multidrop Combi</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Handler-Multiflow FX</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie wysokoprzepustowych trójwymiarowych sferoid nowotworowych do badań przesiewowych leków

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Komórki rakowe były rutynowo hodowane w dwóch wymiarach (2D) na plastikowej powierzchni. Technice tej brakuje jednak prawdziwego środowiska, na które narażona jest masa guza in vivo. Guzy lite rosną nie jako arkusz przymocowany do plastiku, ale jako zbiór komórek klonalnych w trójwymiarowej (3D) przestrzeni oddziałujących ze swoimi sąsiadami i o różnych właściwościach przestrzennych, takich jak zakłócenie normalnej polaryzacji komórkowej. Interakcje te powodują, że komórki hodowane w 3D nabywają cech morfologicznych i komórkowych, które są bardziej istotne dla nowotworów in vivo. Ponadto masa nowotworowa jest w bezpośrednim kontakcie z innymi typami komórek, takimi jak komórki zrębowe i odpornościowe, a także z macierzą zewnątrzkomórkową ze wszystkich innych typów komórek. Zdeponowana matryca składa się z makrocząsteczek, takich jak kolagen i fibronektyna.
W celu zwiększenia przełożenia wyników badań w onkologii z laboratorium na łóżko, wiele grup zaczęło badać wykorzystanie systemów modeli 3D w swoich strategiach rozwoju leków. Uważa się, że systemy te są bardziej istotne fizjologicznie, ponieważ próbują podsumować złożone i niejednorodne środowisko guza. Systemy te mogą być jednak dość złożone i chociaż są podatne na wzrost w formatach 96-dołkowych, a niektóre z nich obecnie nawet w 384, oferują niewiele możliwości w zakresie hodowli na dużą skalę i badań przesiewowych. Ta zaobserwowana luka doprowadziła do opracowania szczegółowo opisanych tutaj metod hodowli sferoid guza w wysokiej przepustowości na płytkach 1536-dołkowych. Metody te stanowią kompromis w stosunku do wysoce złożonych systemów opartych na matrycach, które są trudne do zbadania przesiewowego, oraz konwencjonalnych testów 2D. Różne linie komórek nowotworowych z różnymi mutacjami genetycznymi są z powodzeniem badane przesiewowo, badając skuteczność związku przy użyciu wyselekcjonowanej biblioteki związków ukierunkowanych na szlak kinazy białkowej aktywowanej mitogenem lub MAPK. Odpowiedzi hodowli sferoidalnej są następnie porównywane z odpowiedzią komórek hodowanych w 2D i zgłaszane są zróżnicowane działania. Metody te zapewniają unikalny protokół testowania aktywności związku w środowisku 3D o wysokiej przepustowości.

Zastosowano metody opisane w niniejszym opracowaniu do przebadania szeregu uznanych linii komórek nowotworowych, które wykazują dobrą proliferację w warunkach hodowli 2D. Reprezentatywne obrazy z różnych linii komórek nowotworowych z mutacjami MAPK (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS oraz KNS-62:HRAS) przedstawiono w Rycina 1Obrazy te wykazują, że pomimo różnorodnej morfologii linii komórkowych, każda z nich utworzyła struktury 3D w płytkach assay z ...

W szerokim zakresie wskazań chorobowych, bardziej fizjologicznie istotne modele są opracowywane i wdrażane do programów odkrywania leków. Opisany tutaj nowy system modelowy pokazuje, w jaki sposób trójwymiarowe sferoidy nowotworowe mogą być hodowane i badane przesiewowo w wysokowydajnym systemie opartym na płytkach 1536-dołkowych w celu poszukiwania nowych leków onkologicznych.

Generowanie wysokoprzepustowych trójwymiarowych sferoid nowotworowych do badań przesiewowych leków

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie odkrywania leków, takie jak, jakie jest najodpowiedniejsze ustawienie hodowli tkankowej dla identyfikacji trafienia do odprowadzenia. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona hodowlę komórek w trzech wymiarach, w sposób wysokoprzepustowy, przy użyciu płytek 1536-dołkowych. Zademonstruje ten protokół Kalyani Gampa, starszy naukowiec z mojego laboratorium.Aby skonfigurować hodowlę sferoidalną guza 3D, odłącz interesujące nas linie komórek rakowych za pomocą trzech płukań BBS. Następnie dodaje się jeden mililitr trypsyny na pięć centymetrów kwadratowych powierzchni kolby hodowlanej. Po pięciu minutach zneutralizować trypsynę pięciokrotnością objętości pożywki uzupełnionej surowicą w każdej kolbie i policzyć komórki.Użyj wysterylizowanej, małej kasety ze stali nierdzewnej z systemem opartym na pompie perystaltycznej, aby wysiać łącznie 500 komórek w ośmiu mikrolitrach sferoidalnego podłoża do każdej studzienki na płytce poddanej działaniu 1 536 dołków poddanych kulturze tkankowej. Następnie użyj oddychającej uszczelki samoprzylepnej, aby zakryć płytę. I umieść płytkę w wirującym inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 10 obr./min z 5% dwutlenkiem węgla i 95% wilgotnością względną na trzy dni.Najważniejszym krokiem jest upewnienie się, że płytki są dobrze uszczelnione przed umieszczeniem ich w inkubatorze. Sferoidy będą potrzebowały trzech dni, aby się uformować, a ten krok zapobiega parowaniu medium. Pod koniec inkubacji szybko obróć płytki hodowlane wyłożone rakiem pod kątem 100-krotności grawitacji, aby zebrać kondensację i usunąć uszczelki adhezyjne.Umieść każdą płytkę, która ma być poddana obróbce, na dozowniku akustycznym ustawionym tak, aby dostarczyć łącznie osiem nanolitrów każdego związku. Rozcieńczenie do końcowego stężenia 0,1% DMSO na studzienkę i górna dawka związku 10 mikromolowych. Po dodaniu związku do odpowiednich płytek należy umieścić na każdej płytce specjalnie wykonaną pokrywę do hodowli komórkowych ze stali nierdzewnej, aby zapobiec parowaniu, i umieścić płytki z powrotem w wirującym inkubatorze na kolejne pięć dni.Pod koniec inkubacji dodać trzy mikrolitry wstępnie podgrzanego odczynnika do lizy komórek, uzupełnionego lucyferyną, do każdego dołka każdej płytki do hodowli komórkowej. I inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut. Następnie uchwyć luminescencję ATP na luminometrze płytkowym.Po przeanalizowaniu wszystkich płytek, należy wyodrębnić surowe dane z przyrządu i znormalizować wszystkie pola zawierające badane związki do średniej ze wszystkich studzienek zawierających sam DMSO jako neutralną kontrolę. Procentowe zahamowanie wzrostu każdego związku można następnie obliczyć zgodnie ze wzorem i krzywymi odpowiedzi na dawkę, a następnie można wygenerować hamujące IC50. Różne znane komórki rakowe, o których wiadomo, że dobrze rosną w warunkach hodowli 2D, również tworzyły struktury 3D podczas hodowli, jak właśnie wykazano, pomimo różnic morfologicznych.W przypadku stosowania do badań przesiewowych na dużą skalę można zaobserwować różnicową wrażliwość związków między kulturami uprawianymi w 2D w porównaniu z kulturami uprawianymi w 3D. Każda kropka reprezentuje stężenie hamujące pojedynczego związku, dla którego obserwuje się 50% odpowiedź zabijania komórek w obu warunkach hodowli. W tym reprezentatywnym eksperymencie oba testowane związki hamujące kinazę RAF były silniejsze w warunkach 3D w hodowli linii niedrobnokomórkowego raka płuca zawierającej mutację aktywującą białko KRAS.Jednak związki te wykazują podobną siłę działania zarówno w hodowlach linii feroidów 3D, jak i 2D raka jelita grubego, które zawierają mutację aktywującą G13D w KRAS. Test 3D pozwala również na obserwację paradoksalnego zjawiska aktywacji wzrostu, które występuje, gdy dochodzi do niepełnego zahamowania dimerów RAF w wysoce aktywowanych liniach mutantów RAF, o czym świadczy wzrost komórek przy niskich stężeniach leku, który jest tłumiony przy wysokich stężeniach. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się odkrywaniem leków przeciwnowotworowych do zbadania alternatywnych warunków hodowli w celu identyfikacji nowej, skutecznej materii chemicznej przeciwko znanym celom.

generation-high-throughput-three-dimensional-tumor-spheroids-for-drug

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Wprowadzamy protokół generowania dużych liczb (od tysięcy do setek tysięcy) sferoid guza o jednakowej wielkości i składzie, używając dostępnych na rynku płytek mikrodołkowych.

Produkcja dużej liczby sferoid guza o kontrolowanej wielkości przy użyciu płytek mikrodołkowych

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Przedstawiono protokół do zrobotyzowanego drukowania sferoid komórek rakowych na wysokoprzepustowej 96-dołkowej płytce przy użyciu wodnego systemu dwufazowego.

Zrobotyzowana produkcja sferoid komórek rakowych z wodnym dwufazowym systemem do testowania leków

Ksenoprzeszczepy glejaka wielopostaciowego pochodzące od pacjentów mogą być miniaturyzowane do żywych mikroguzów za pomocą systemu hodowli biożelu ludzkiego 3D. Ten test 3D guza in vivo nadaje się do testowania odpowiedzi na lek i profilowania molekularnego, w tym analizy kinomicznej.

Generowanie mikroguzów przy użyciu systemu hodowli biożelu ludzkiego 3D i komórek glejaka pochodzących od pacjentów do profilowania kinomicznego i testowania odpowiedzi na leki

Optyczna tomografia koherentna (OCT), technologia obrazowania trójwymiarowego, została wykorzystana do monitorowania i charakteryzowania kinetyki wzrostu sferoid wielokomórkowych guzów. Wykazano precyzyjną wolumetryczną kwantyfikację sferoid guza przy użyciu metody liczenia wokseli oraz bezznacznikowe wykrywanie martwych tkanek w sferoidach w oparciu o wewnętrzny kontrast tłumienia optycznego.

Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Ten protokół opisuje generowanie sferoid pochodzących od pacjentów oraz dalszą analizę, w tym kwantyfikację proliferacji, testy cytotoksyczności, cytometrię przepływową, barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie konfokalne, w celu oceny potencjału kandydatów na leki jako terapii przeciwnowotworowych. Protokół ten wspiera medycynę precyzyjną w identyfikacji specyficznych leków dla każdego pacjenta i stadium choroby.

Fizjologiczne sferoidy 3D pochodzące od pacjenta do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych w celu ukierunkowania na rakowe komórki macierzyste

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę produkcji trzech różnych typów sferoidów w sposób, który czyni je odpowiednimi do badań przesiewowych i analiz na dużą skalę o wysokiej zawartości. Ponadto przedstawiono przykłady pokazujące, w jaki sposób można je analizować na poziomie sferoidalnym i poszczególnych komórek.

Niezawodna metoda produkcji sferoid na dużą skalę do zastosowań związanych z przesiewaniem i analizą o wysokiej zawartości

Sferoidy nowotworowe są coraz częściej wykorzystywane do oceny interakcji komórek nowotworowych z mikrośrodowiskiem i odpowiedzi na terapię. Niniejszy protokół opisuje solidną, ale prostą metodę pół-wysokoprzepustowego obrazowania sferoid guza 3D przy użyciu szybkiego usuwania optycznego.

Szybkie oczyszczanie optyczne do półwysokoprzepustowej analizy sferoidów nowotworowych

Obecny protokół opisuje generowanie modeli hodowli 3D guzów z pierwotnych komórek nowotworowych i ocenę ich wrażliwości na leki za pomocą testów żywotności komórek i badań mikroskopowych.

Ustalanie trójwymiarowych sferoid na podstawie próbek guza pochodzących od pacjentów i ocena ich wrażliwości na leki

Ten artykuł demonstruje ustandaryzowaną metodę konstruowania trójwymiarowych sferoid nowotworowych. Opisano również strategię obserwacji sferoidy i analizy głębokiego uczenia opartego na obrazach przy użyciu zautomatyzowanego systemu obrazowania.

Generowanie sferoid 3D guza do badań oceny leków

W tym miejscu tworzymy platformę profilowania metabolicznego integrującą trójwymiarowe (3D) sferoidy glejaka i normalizację opartą na obrazowaniu za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego. Podejście to umożliwia dokładniejszą ocenę odpowiedzi metabolicznych guza na leczenie farmakologiczne i zapewnia wgląd w potencjalne mechanizmy oporności.

Postępy w profilowaniu metabolicznym trójwymiarowych sferoid guza mózgu do badań przesiewowych leków

Poznaj metodę hodowli trójwymiarowych sferoid nowotworowych w formacie 1536-well do badań przesiewowych leków onkologicznych. Technika umożliwia szybkie testowanie związków chemicznych w warunkach wysokoprzepustowych.

Generowanie wysokoprzepustowych trójwymiarowych sferoid nowotworowych do badań przesiewowych leków

Przeglądaj więcej filmów