CARIP-Seq i ChIP-Seq: Metody identyfikacji RNA związanych z chromatyną i interakcji białko-DNA w embrionalnych komórkach macierzystych
25 maja 2018
Tutaj opisujemy metody wykonywania ChIP-Seq i CARIP-Seq, w tym przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji, do generowania globalnych epigenomicznych i związanych z chromatyną map RNA w komórkach ES.
Ogólnym celem CARIP-Seq jest badanie RNA związanych z chromatyną w całym genomie. Celem projektu ChIP-Seq jest ocena interakcji białko-DNA w skali globalnej w embrionalnych komórkach macierzystych. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki i komórek macierzystych, zidentyfikować lokalizację genomu, czynniki transkrypcyjne lub epigenetyczne wiązanie regulatora lub zajętość modyfikacji histonów lub RNA związane z chromatyną w embrionalnych komórkach macierzystych.
Główną zaletą tych technik jest to, że pozwalają one na bezstronne badanie całego genomu RNA związanych ze składnikami chromatyny i globalną identyfikację interakcji DNA białek. Chociaż metody te mogą zapewnić wgląd w biologię embrionalnych komórek macierzystych, można je również zastosować do innych typów komórek ssaków w celu zbadania biologii raka lub innych chorób ludzkich. Aby pobrać embrionalne komórki macierzyste, należy je najpierw przemyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami.
Następnie odłącz komórki za pomocą 0,25% trypsyny, podgrzanej do 37 stopni Celsjusza. Po trypsynizacji ponownie zawiesić komórki we wstępnie podgrzanym podłożu MEF, uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą. Następnie dodaj 37% formaldehydu do komórek w stożkowej probówce do końcowego stężenia 1% i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez osiem minut, aby usieciować komórki.
Aby zatrzymać reakcję utrwalania, dodaj 1,25 molowej glicyny wstępnie schłodzonej w temperaturze czterech stopni Celsjusza do końcowego stężenia 0,125 molowego. Następnie umieść rurkę na rotatorze i odwróć ją z prędkością ośmiu obrotów na minutę przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po pięciu minutach odwirować próbkę o masie 300 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Po zakończeniu wirowania wyrzucić supernatant. Następnie przepłukać granulat wstępnie schłodzonym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem i ponownie odwirować próbkę. Następnie usuń sól fizjologiczną zbuforowaną fosforanami i zamroź komórki w ciekłym azocie na minutę.
Gdy embrionalne komórki macierzyste zostaną rozmrożone na lodzie, ponownie zawieś osad w 2,5 mililitra buforu sonikacyjnego. Aby zbadać czynniki transkrypcyjne lub czynniki epigenetyczne, należy ponownie zawiesić osad komórkowy w buforze sonikacyjnym bez dodecylosiarczanu sodu. W celu modyfikacji histonów ponownie zawiesić osad komórkowy w buforze zawierającym dodecylosiarczan sodu.
Następnie, w celu immunoprecypitacji chromatyny, sonikuj chromatynę przez 14 do 18 cykli przy amplitudzie 40% z 30 sekundami włączenia i 30-sekundowym trybem spoczynku. Aby rozpuścić chromatynę dla czynnika białkowego ChIP, należy uzupełnić bufor sonikacyjny 28 mikrolitrami 10% dodecylosiarczanu sodu. W przypadku czynników białkowych w modyfikacjach histonów dodaj 28 mikrolitrów deoksycholanu sodu i 0,28 mililitra 10% Triton X-100 i dobrze wymieszaj.
Następnie odwirować próbkę w temperaturze 10 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby wstępnie oczyścić chromatynę. W 1,5 mililitrowej tubie o niskim stopniu wiązania dodaj 40 mikrolitrów kulek magnetycznych A lub G. Następnie umyj kulki 600 mikrolitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i przenieś probówkę z kulkami na stojak zawierający magnes i inkubuj przez minutę w temperaturze pokojowej.
Następnie usuń sól fizjologiczną buforowaną fosforanami i ponownie zawieś kulki w 100 mikrolitrach soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Do probówki dodaj od dwóch do czterech mikrogramów przeciwciała i inkubuj je, umieszczając na rotatorze na 40 minut z prędkością ośmiu obrotów na minutę, aby ułatwić wiązanie przeciwciał z kulkami. Następnie dodaj 200 mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, aby umyć kulki.
Po umyciu inkubować sonikowany ekstrakt chromatyny na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aby immunoprecypitować białka związane z chromatyną. Następnego dnia umyj kulki i inkubuj z buforem RIPA, buforem RIPA z solą, buforem chlorku litu, buforem Tris-EDTA z Triton X-100 i buforem Tris-EDTA, każdy przez 10 minut na rotatorze. Aby usunąć usieciowanie dla ChIP, ponownie zawieś kulki w 100 mikrolitrach bufora Tris-EDTA.
Następnie dodaj trzy mikrolitry 10% dodecylosiarczanu sodu i pięć mikrolitrów po 20 miligramów na mililitr proteinazy K i inkubuj kulki w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez noc. Po inkubacji, następnego dnia, odwróć probówki kilka razy, pozostaw je na stojaku magnetycznym i przenieś supernatant do świeżej probówki. Następnie umyj kulki magnetyczne, dodając 100 mikrolitrów buforu Tris-EDTA, zawierającego 0,5 molowego chlorku sodu i połącz dwa supernatanty.
Aby usunąć usieciowanie dla CARIP, ponownie zawieś kulki w 100 mikrolitrach buforu Tris-EDTA. Następnie dodaj trzy mikrolitry 10% dodecylosiarczanu sodu i pięć mikrolitrów po 20 miligramów na mililitr proteinazy K i inkubuj kulki w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez cztery do 12 godzin. Ponownie odwróć probówkę kilka razy i umieść ją na stojaku magnetycznym, aby przenieść supernatant do świeżej probówki.
Następnie umyj kulki magnetyczne, dodając 100 mikrolitrów buforu Tris-EDTA, zawierającego 0,5 molowego chlorku sodu, a następnie połącz dwa supernatanty. Na koniec wyizolować próbkę RNA za pomocą alkoholu fenolowo-chloroformalowego izoamylowego w stosunku 25 do 24 do jednej objętości. Następnie użyj DNazy do usunięcia DNA z próbki RNA związanej z chromatyną.
Następnie dodaj 10-krotny bufor DNazy do próbki CARIP i dostosuj końcową objętość do stężenia 1X. Następnie inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie zsyntetyzuj pierwszą nić komplementarnego DNA, wywołując reakcję PCR, dodając 10,5 mikrolitra RNA i jeden mikrolitr trzech mikrogramów na mililitr losowych starterów heksameru.
Aby zdenaturować strukturę drugorzędową, najpierw inkubuj probówkę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie na lodzie przez dwie minuty. Następnie dodaj mieszankę wzorcową do probówki PCR i inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Następnie dodaj jeden mikrolitr 200 jednostek na mikrolitr indeksu górnego dwa i uruchom program termocyklera.
Aby zsyntetyzować drugą nić komplementarnego DNA, ustaw reakcję na lodzie, dodając odczynniki, bufor i enzymy. Następnie delikatnie wymieszaj odczynniki i inkubuj w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po zsyntetyzowaniu DNA oczyść uzupełniające DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.
Następnie zdefragmentuj dwuniciowe DNA, użyj sonifiera do kąpieli wodnej i rurki o pojemności 1,5 mililitra, aby udostępnić DNA do wielkości od 250 do 500 par zasad przez trzy razy po 10 minut lub cztery razy po 10 minut. Następnie przygotuj bibliotekę i wykonaj sekwencjonowanie nowej generacji. W tym przypadku wykonano obrazy z kontrastem fazowym embrionalnych komórek macierzystych w celu wizualizacji kolonii komórek macierzystych.
W tym protokole komórki hodowano w obecności lub bez mitotycznie inaktywowanych mysich fibroblastów embrionalnych z LIF i/lub GSK3i w pożywce hodowlanej, aby zapobiec różnicowaniu komórek. Następnie, aby uwidocznić skuteczność sonikacji usieciowanej chromatyny embrionalnych komórek macierzystych, sonikowane dwuniciowe DNA załadowano na 2% żel agarozowy. Obraz żelu pokazuje ściętą chromatynę w zakresie od 200 do 500 par zasad.
Następnie wygenerowano biblioteki ChIP-Seq i zsekwencjonowano je przy użyciu platformy sekwencjonowania nowej generacji, aby ocenić obłożenie enzymu modyfikującego histony w całym genomie oraz modyfikacje histonów w embrionalnych komórkach macierzystych. Z niestandardowego widoku przeglądarki UCSC wzbogacona trimetylacja H3K4, dimetylacja H3K4 i KDM5B są widoczne w genie regulatora pluripotencji, POU5F1 i w klastrze HOXC. Przeprowadzono również analizę CARIP-Seq w celu oceny RNA związanych z chromatyną w embrionalnych komórkach macierzystych.
Niestandardowy widok przeglądarki UCSC pokazuje RNA związane z trimetylacją H4K20 i zajętość trimetylacji H4K20 w embrionalnych komórkach macierzystych. Na podstawie wyników CARIP-Seq można zinterpretować, że chociaż RNA jest związany z trimetylacją H4K20, może nie wchodzić w interakcje z konkretnym locus. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać RNA związane z chromatyną za pomocą CARIP-Seq i identyfikować interakcje DNA białek w skali globalnej w embrionalnych komórkach macierzystych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metody przeprowadzania ChIP-Seq oraz CARIP-Seq w celu stworzenia globalnych map epigenomicznych i map RNA związanych z chromatyną w embrionalnych komórkach macierzystych. Techniki te umożliwiają ocenę oddziaływań białko-DNA oraz identyfikację cząsteczek RNA związanych z chromatyną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Epigenetyka
- Biologia komórek macierzystych
- Genomika
Wprowadzenie
- Metoda ChIP-Seq służy do globalnej oceny oddziaływań białko-DNA.
- Metoda CARIP-Seq pozwala na badanie związanych z chromatyną RNA w całej skali genomu.
- Metody te można zastosować w różnych typach komórek ssaków.
- dostarczają one wiedzy na temat biologii nowotworów i innych ludzkich chorób.
Cel badania
- W celu wygenerowania globalnych map epigenomicznych w embrionalnych komórkach macierzystych.
- W celu zidentyfikowania wiązania czynników transkrypcyjnych oraz zajętości modyfikacji histonowych.
- W celu zbadania RNA związanych z chromatyną w komórkach macierzystych.
Zastosowane metody
- ChIP-Seq do oceny oddziaływań białko-DNA.
- CARIP-Seq do badania RNA związanych z chromatyną.
- Przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania następnej generacji.
- Zbiór embrionalnych komórek macierzystych z użyciem soli fizjologicznej fosforanowej.
Główne wyniki
- Identyfikacja lokalizacji czynników transkrypcyjnych w genomie.
- Globalne mapowanie modyfikacji histonów.
- Wgląd w rolę RNA związanych z chromatyną.
- Potencjalne zastosowania w badaniu różnych chorób.
Wnioski
- ChIP-Seq i CARIP-Seq to potężne techniki stosowane w badaniach epigenomicznych.
- Metody te pozwalają na lepsze zrozumienie biologii embrionalnych komórek macierzystych.
- Mogą one zostać zaadaptowane do badań nad nowotworami oraz innymi schorzeniami.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Zrozumienie RNA związanych z chromatyną oraz oddziaływań białko-DNA ma kluczowe znaczenie dla minimalizacji ryzyka podczas walidacji celów w procesie odkrywania terapii opartych na komórkach macierzystych. Techniki CARIP-Seq i ChIP-Seq umożliwiają bezstronne mapowanie w skali całego genomu regulatorów epigenetycznych oraz oddziaływań niekodującego RNA, które wpływają na pluripotencję i szlaki różnicowania. Pozyskane w ten sposób informacje zwiększają pewność predykcyjną na wczesnym etapie odkryć, wiążąc stany epigenetyczne z funkcjonalną ekspresją genów w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Badanie sieci transkrypcyjnych i epigenetycznych regulujących samoodnawianie i różnicowanie się komórek macierzystych.
- Wartość naukowa: Identyfikacja RNA związanych z chromatyną, które mogą regulować modyfikacje histonów i wiązanie czynników transkrypcyjnych w kluczowych loci.
- Wartość operacyjna: Umożliwienie wyboru celów w oparciu o hipotezy poprzez mapowanie oddziaływań białko-DNA w przypadku regulatorów pluripotencji, takich jak POU5F1.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generowanie ilościowych map epigenomicznych i RNA powiązanego z chromatyną w celu standaryzacji analizy.
- Wartość operacyjna: Uzyskiwanie powtarzalnych odczytów w skali całego genomu, odpowiednich dla platform wysokoprzepustowego przesiewu.
- Wartość operacyjna: Wsparcie procesów przygotowania bibliotek kompatybilnych z sekwencjonowaniem nowej generacji w celu skalowalnego generowania danych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Powiązanie stanów chromatyny z szlakami istotnymi dla chorób w nowotworach i zaburzeniach rozwojowych poprzez zastosowalność w różnych typach komórek.
- Wartość operacyjna: Ułatwienie ciągłości translacyjnej od modeli komórek macierzystych do pierwotnych lub chorobowych komórek ssaków.
- Wartość strategiczna: Wsparcie decyzji o dostosowaniu poziomu ryzyka w rozwoju badań poprzez ujawnienie epigenetycznych czynników sterujących efektami fenotypowymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metody CARIP-Seq i ChIP-Seq służą jako narzędzia na etapie odkrywania, które wspomagają identyfikację wiodących cząsteczek poprzez wyjaśnianie mechanizmów sterujących ekspresją genów w modelach komórek macierzystych.
- Biologia odkrywcza: Wspieranie ograniczania ryzyka mechanistycznego poprzez mapowanie zajętości czynników transkrypcyjnych oraz wzorów modyfikacji histonów w locus docelowych.
- Przesiewanie: Umożliwienie stratyfikacji bibliotek związków pod kątem stanu chromatyny z wykorzystaniem sygnatur epigenomicznych jako biomarkerów.
- Analityka: Dostarczenie ilościowych wywołań piku (peak calls) i wyników wzbogacenia w celu porównania warunków eksperymentalnych pomiędzy powtórzeniami.
- Badania translacyjne: Umożliwienie rozszerzenia profilowania epigenomicznego na typy komórek istotne dla choroby, poza embrionalne komórki macierzyste.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanowienie zestandaryzowanych potoków profilowania chromatyny, które można zastosować w wielu projektach walidacji celów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w funkcji regulatorów epigenetycznych poprzez bezpośrednie mapowanie asocjacji RNA-chromatyna.
- Wartość operacyjna: Ustandaryzowane procedury sieciowania, immunoprecypitacji i sekwencjonowania zapewniają powtarzalność wyników pomiędzy laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Ulepszenie decyzji typu go/no-go poprzez powiązanie oddziaływania z celem z późniejszymi skutkami dla chromatyny i transkrypcji.
- Wpływ na portfolio: Umożliwienie priorytetyzacji celów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie dysregulacji epigenetycznej w modelach chorobowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie biochemii chromatyny, walidacji przeciwciał oraz przygotowania bibliotek do sekwencjonowania nowej generacji.
- Zależne od dostępu do sprzętu do sonikacji, systemów kulek magnetycznych oraz platform do ilościowego PCR lub sekwencjonowania.
- Wymaga standaryzacji warunków fiksacji, przemywania i elucji pomiędzy zespołami w celu uzyskania powtarzalnej immunoprecypitacji.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania protokołów przy zastosowaniu ich do komórek pierwotnych lub próbek tkankowych o różnej dostępności chromatyny.
- Ograniczone przez specyficzność przeciwciał oraz wydajność fragmentacji chromatyny, co wpływa na stosunek sygnału do szumu w detekcji pików.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
1:02
Crosslinking of Embryonic Stem Cells for ChIP and CARIP
2:29
Chromatin Sonication for ChIP and CARIP
3:48
ChIP and CARIP Process
7:12
Double-stranded cDNA Synthesis for CARIP-Seq
8:53
Use of ChIP-Seq and CARIP-Seq to Study Global Protein-DNA Interactions and Chromatin-Associated RNAs in Embryonic Stem Cells
10:43
Conclusion
