Name: CARIP-Seq i ChIP-Seq: Metody identyfikacji RNA związanych z chromatyną i interakcji białko-DNA w embrionalnych komórkach macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Poznaj metody CARIP-Seq i ChIP-Seq do mapowania RNA związanych z chromatyną oraz interakcji białko-DNA w embrionalnych komórkach macierzystych. Te techniki pozwalają na globalne badanie epigenomu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Wayne State University, Karmanos Cancer Institute, grant z National Heart, Lung and Blood Institute (1K22HL126842-01A1) przyznany B.L.K. W pracy wykorzystano sieć obliczeniową Wayne State University High Performance Computing Grid do zasobów obliczeniowych (<https://www.grid.wayne.edu/>). Dziękujemy Jiji Kurup za pomoc w analizie danych CARIP-Seq.
WKŁAD AUTORÓW:
B.L.K. wymyślił metodę CARIP-Seq, zaprojektował i przeprowadził eksperymenty ChIP-Seq i CARIP-Seq, przeanalizował dane sekwencjonowania i sporządził manuskrypt. Wszyscy autorzy przeczytali i zatwierdzili ostateczną wersję tego manuskryptu.

<ol><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+external+signaling+pathways+with+the+core+transcriptional+network+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells.</a> Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).</li>
<li>Boyer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core+transcriptional+regulatory+circuitry+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells.</a> Cell. 122 (6), 947-956 (2005).</li>
<li>Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extended+transcriptional+network+for+pluripotency+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells.</a> Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+self-renewal+and+accelerated+reprogramming+in+the+absence+of+Kdm5b%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b.</a> Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KDM5B+focuses+H3K4+methylation+near+promoters+and+enhancers+during+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation.</a> Genome Biol. 15 (2), R32(2014).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Hudson, W. H., Ortlund, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure%2C+function+and+evolution+of+proteins+that+bind+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).</li>
<li>Khalil, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).</li>
<li>Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+RNA+binding+by+chromatin-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins.</a> Genome Biol. 17, 28(2016).</li>
<li>Kelley, R. L., Kuroda, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNA+genes+in+dosage+compensation+and+imprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting.</a> Cell. 103 (1), 9-12 (2000).</li>
<li>Koziol, M. J., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+traffic+control+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA traffic control of chromatin complexes.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).</li>
<li>Mercer, T. R., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+long+noncoding+RNAs+in+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation.</a> Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).</li>
<li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Xist+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li>
<li>Mak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+the+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Science. 303 (5658), 666-669 (2004).</li>
<li>Garfield, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+primary+mouse+embryonic+fibroblast+%28PMEF%29+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures.</a> Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).</li>
<li>Conner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+fibroblast+%28MEF%29+feeder+cell+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).</li>
<li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Zang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clustering+approach+for+identification+of+enriched+domains+from+histone+modification+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data.</a> Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29+to+analyze+short+reads+generated+by+sequencing+protein-DNA+interactions+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq%3A+technical+considerations+for+obtaining+high-quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data.</a> Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+genome+center%27s+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

ChIP-Seq jest użyteczną metodą oceny lokalizacji globalnych interakcji białko-DNA (np. czynniki transkrypcyjne/enzymy modyfikujące histony/modyfikacje histonów i DNA) w komórkach ES, podczas gdy nowo opracowany protokół CARIP-Seq jest przydatny w badaniu asocjacji RNA w całym genomie ze składnikami chromatyny. ChIP-Seq jest podstawowym narzędziem, które służy do oceny krajobrazów epigenetycznych komórek ES i innych typów komórek. Jakość bibliotek ChIP-Seq i CARIP-Seq zależy w dużej mierze od przeciwciał klasy Ch...

Decyzje dotyczące losu embrionalnych komórek macierzystych (ES) są regulowane przez komunikację między sygnałami zewnątrzkomórkowymi a wieloma regulatorami transkrypcji, w tym modyfikatorami histonów i modyfikacją ogonów histonów po translacji. Interakcje te ułatwiają dostęp do chromatyny i pakowanie chromatyny w jeden z dwóch stanów: euchromatynę, która jest otwarta i aktywna transkrypcyjnie, oraz heterochromatynę, która jest zwarta i ogólnie nieaktywna transkrypcyjnie. Czynniki transkrypcyjne z powinowactwem do wiązania specyficznym dla sekwencji DNA i modyfikatorami epigenetycznymi łączą się z regionami euchromatycznymi, aby uczestniczyć w kontrolowaniu ekspresji genów. Metody sekwencjonowania nowej generacji, w tym ChIP-Seq1, odegrały zasadniczą rolę w mapowaniu sieci transkrypcyjnych całego genomu, które mają fundamentalne znaczenie dla samoodnawiania się komórek ES i pluripotencji2,3,4,5,6. Co więcej, podczas gdy immunoprecyzja RNA, a następnie sekwencjonowanie nowej generacji (RIP-Seq)7 oceny interakcji RNA-białko sugerują, że białka wiążące DNA oddziałują z RNA w celu regulacji zdarzeń transkrypcyjnych7,8,9,10,11,12, niewiele badań dotyczyło lokalizacji RNA w całym genomie związanych z chromatyną12 lub globalnymi interakcjami między RNA a modyfikacjami histonów. Długie niekodujące RNA (lncRNA) to jedna z klas RNA, które, jak stwierdzono, regulują aktywność białek związanych z chromatyną13,14,15. Na przykład Xist jest lncRNA, które reguluje w komórkach ssaków żeńskich inaktywację jednego chromosomu X poprzez rekrutację represorów epigenetycznych16,17. Jednak pełne spektrum RNA związanych z chromatyną jest w dużej mierze nieznane. W tym miejscu opisujemy nowy protokół, immunoprecypitację RNA związaną z chromatyną (CARIP), a następnie sekwencjonowanie nowej generacji (CARIP-Seq), w celu identyfikacji RNA związanych z chromatyną na podstawie całego genomu w komórkach ES, w tym przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji, oraz ChIP-Seq do mapowania globalnego zajętości modyfikacji histonów, czynników transkrypcyjnych i modyfikatorów epigenetycznych. W przeciwieństwie do innych metod RIP-Seq7, CARIP-Seq obejmuje etapy sieciowania i sonikacji, które pozwalają na bezpośrednią identyfikację RNA związanych z chromatyną. Podsumowując, ChIP-Seq jest potężnym narzędziem do identyfikacji interakcji białko-DNA w całym genomie, podczas gdy CARIP-Seq jest potężną metodą badania RNA związanych ze składnikami chromatyny.

<table><tbody><tr><td>Czynnik hamujący białaczkę myszy (ESGRO LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>106 lub 107 jednostek </td></tr><tr><td>inhibitora GSK3 i beta CHIR99021 (GSK3i)</td><td>Rozpuszczalnik macierzysty</td><td></td>: <td>DMSO 10mM</td></tr><tr><td>Inhibitor MEK PD0325901 (MEKi)</td><td>Rozpuszczalnik stemjący</td><td></td><td>: DMSO 10mM</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM), wysoka zawartość glukozy</td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem)</td><td>Invitrogen</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (50 mM)</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax ES Kwalifikowana płodowa surowica bydlęca, 500 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-009-B</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0,1% roztwór żelatyny</td><td>EMD Milipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma</td><td>G7126-500G</td><td>1,25 M kontentacja zapasu w wodzie</td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu</td><td>Sigma</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>TE (Tris EDTA) pH 8,0 1X</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>351-011-131</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>93482-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór dodecylosiarczanu sodu (20%)</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>A611-0837-10</td><td></td></tr><tr><td>Q125 sonifier</td><td>Qsonica</td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 roztwór</td><td>Sigma</td><td>93443-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Białko G do immunoprecypitacji</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Białko A do immunoprecypitacji</td><td>Invitrogen</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Białko A/Białko G i Zestaw startowy magnesów</td><td>Invitrogen</td><td>10015D</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek litu</td><td>Sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Zestaw do oczyszczania mRNA (do oczyszczania mRNA z całkowitych preparatów RNA)</td><td>Invitrogen</td><td>61006</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript Dwuniciowa synteza cDNA Zestaw</td><td>Invitrogen</td><td>11917010</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do naprawy końca DNA End-It</td><td>Lucigen</td><td>ER81050</td><td></td></tr><tr><td>Fragment Klenowa (3'&rarr; 5' egzo-)</td><td>NEB</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>dATP (10 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>18252015</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10488085</td><td></td></tr><tr><td>E-gel EX żele agarozowe, 2%</td><td>Invitrogen</td><td>G402002</td><td></td></tr><tr><td>Phusion high-fidelity 2X master mix z buforem HF</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td>F531LPM</tr><tr><td>ChIPAb+ trimetylohiston H3 (Lys4) - Przeciwciało zatwierdzone przez ChIP</td><td>EMD Millipore</td><td>17-614</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-histonowe H3 (di metylo K4) [Y47] - Klasa ChIP (ab32356)</td><td>Abcam</td><td>ab32356</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych Corning Costar z płaskim dnem (6-dołkowe)</td><td>Fisher</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Standardowe naczynia do hodowli tkankowych (10 cm)</td><td>Fisher</td><td>08772E</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor pico</td><td>Diagenode</td><td>B01010001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Flurometer 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Zestaw testowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania reakcji MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28204</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-histonowe H4 (tri metylo K20) - Klasa ChIP (ab9053)</td><td>Abcam</td><td>ab9053</td><td></td></tr><tr><td>Rotator Labquake</td><td>Thermo Fisher</td><td>400110Q</td><td></td></tr><tr><td>Platforma Illumina HiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr></tbody></table>

carip-seq i chip-seq: metody identyfikacji rna związanych z chromatyną i interakcji białko-dna w embrionalnych komórkach macierzystych

CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells

Samoodnawianie i różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych (ES) jest regulowane przez sygnały zewnętrzne i wewnętrzne sieci czynników transkrypcyjnych, regulatorów epigenetycznych i modyfikacji histonów po translacji, które łącznie wpływają na stan ekspresji pobliskich genów. Wykazano również, że RNA oddziałuje z różnymi białkami w celu regulacji dynamiki chromatyny i ekspresji genów. Immunoprecypitacja RNA związana z chromatyną (CARIP), po której następuje sekwencjonowanie nowej generacji (CARIP-Seq) jest nową metodą badania RNA związanych z białkami chromatyny, podczas gdy immunoprecypitacja chromatyny, po której następuje sekwencjonowanie nowej generacji (ChIP-Seq) jest potężną techniką genomiczną do mapowania lokalizacji potranslacyjnej modyfikacji histonów, czynników transkrypcyjnych i modyfikatorów epigenetycznych w skali globalnej w komórkach ES. W tym miejscu opisujemy metody wykonywania CARIP-Seq i ChIP-Seq, w tym budowę biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji, w celu generowania globalnego RNA związanego z chromatyną i map epigenomicznych w komórkach ES.

Z powodzeniem zbadaliśmy wiązanie w całym genomie H3K4me3, H3K4me2 oraz KDM5B w komórkach ES, stosując niniejszy protokół ChIP-Seq6. Komórki ES hodowano w warunkach bez użycia komórek karmionek (Rysunek 1), a następnie poddano sieciowaniu zgodnie z powyższym opisem. Następnie przeprowadzono sonikację zgodnie z opisem w kroku 3.2 protokołu ChIP-Seq, a jej efekt oceniono poprzez elektroforezę DNA w 2% żelu agarozowym (<strong class="xfig...

Tutaj opisujemy metody wykonywania ChIP-Seq i CARIP-Seq, w tym przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji, do generowania globalnych epigenomicznych i związanych z chromatyną map RNA w komórkach ES.

CARIP-Seq i ChIP-Seq: Metody identyfikacji RNA związanych z chromatyną i interakcji białko-DNA w embrionalnych komórkach macierzystych

Embryonic stem (ES) cell self-renewal&#160;and differentiation is governed by extrinsic signals and intrinsic networks of transcription factors, ...

Ogólnym celem CARIP-Seq jest badanie RNA związanych z chromatyną w całym genomie. Celem projektu ChIP-Seq jest ocena interakcji białko-DNA w skali globalnej w embrionalnych komórkach macierzystych. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki i komórek macierzystych, zidentyfikować lokalizację genomu, czynniki transkrypcyjne lub epigenetyczne wiązanie regulatora lub zajętość modyfikacji histonów lub RNA związane z chromatyną w embrionalnych komórkach macierzystych.Główną zaletą tych technik jest to, że pozwalają one na bezstronne badanie całego genomu RNA związanych ze składnikami chromatyny i globalną identyfikację interakcji DNA białek. Chociaż metody te mogą zapewnić wgląd w biologię embrionalnych komórek macierzystych, można je również zastosować do innych typów komórek ssaków w celu zbadania biologii raka lub innych chorób ludzkich. Aby pobrać embrionalne komórki macierzyste, należy je najpierw przemyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami.Następnie odłącz komórki za pomocą 0,25% trypsyny, podgrzanej do 37 stopni Celsjusza. Po trypsynizacji ponownie zawiesić komórki we wstępnie podgrzanym podłożu MEF, uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą. Następnie dodaj 37% formaldehydu do komórek w stożkowej probówce do końcowego stężenia 1% i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez osiem minut, aby usieciować komórki.Aby zatrzymać reakcję utrwalania, dodaj 1,25 molowej glicyny wstępnie schłodzonej w temperaturze czterech stopni Celsjusza do końcowego stężenia 0,125 molowego. Następnie umieść rurkę na rotatorze i odwróć ją z prędkością ośmiu obrotów na minutę przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po pięciu minutach odwirować próbkę o masie 300 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Po zakończeniu wirowania wyrzucić supernatant. Następnie przepłukać granulat wstępnie schłodzonym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem i ponownie odwirować próbkę. Następnie usuń sól fizjologiczną zbuforowaną fosforanami i zamroź komórki w ciekłym azocie na minutę.Gdy embrionalne komórki macierzyste zostaną rozmrożone na lodzie, ponownie zawieś osad w 2,5 mililitra buforu sonikacyjnego. Aby zbadać czynniki transkrypcyjne lub czynniki epigenetyczne, należy ponownie zawiesić osad komórkowy w buforze sonikacyjnym bez dodecylosiarczanu sodu. W celu modyfikacji histonów ponownie zawiesić osad komórkowy w buforze zawierającym dodecylosiarczan sodu.Następnie, w celu immunoprecypitacji chromatyny, sonikuj chromatynę przez 14 do 18 cykli przy amplitudzie 40% z 30 sekundami włączenia i 30-sekundowym trybem spoczynku. Aby rozpuścić chromatynę dla czynnika białkowego ChIP, należy uzupełnić bufor sonikacyjny 28 mikrolitrami 10% dodecylosiarczanu sodu. W przypadku czynników białkowych w modyfikacjach histonów dodaj 28 mikrolitrów deoksycholanu sodu i 0,28 mililitra 10% Triton X-100 i dobrze wymieszaj.Następnie odwirować próbkę w temperaturze 10 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby wstępnie oczyścić chromatynę. W 1,5 mililitrowej tubie o niskim stopniu wiązania dodaj 40 mikrolitrów kulek magnetycznych A lub G. Następnie umyj kulki 600 mikrolitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i przenieś probówkę z kulkami na stojak zawierający magnes i inkubuj przez minutę w temperaturze pokojowej.Następnie usuń sól fizjologiczną buforowaną fosforanami i ponownie zawieś kulki w 100 mikrolitrach soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Do probówki dodaj od dwóch do czterech mikrogramów przeciwciała i inkubuj je, umieszczając na rotatorze na 40 minut z prędkością ośmiu obrotów na minutę, aby ułatwić wiązanie przeciwciał z kulkami. Następnie dodaj 200 mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, aby umyć kulki.Po umyciu inkubować sonikowany ekstrakt chromatyny na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aby immunoprecypitować białka związane z chromatyną. Następnego dnia umyj kulki i inkubuj z buforem RIPA, buforem RIPA z solą, buforem chlorku litu, buforem Tris-EDTA z Triton X-100 i buforem Tris-EDTA, każdy przez 10 minut na rotatorze. Aby usunąć usieciowanie dla ChIP, ponownie zawieś kulki w 100 mikrolitrach bufora Tris-EDTA.Następnie dodaj trzy mikrolitry 10% dodecylosiarczanu sodu i pięć mikrolitrów po 20 miligramów na mililitr proteinazy K i inkubuj kulki w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez noc. Po inkubacji, następnego dnia, odwróć probówki kilka razy, pozostaw je na stojaku magnetycznym i przenieś supernatant do świeżej probówki. Następnie umyj kulki magnetyczne, dodając 100 mikrolitrów buforu Tris-EDTA, zawierającego 0,5 molowego chlorku sodu i połącz dwa supernatanty.Aby usunąć usieciowanie dla CARIP, ponownie zawieś kulki w 100 mikrolitrach buforu Tris-EDTA. Następnie dodaj trzy mikrolitry 10% dodecylosiarczanu sodu i pięć mikrolitrów po 20 miligramów na mililitr proteinazy K i inkubuj kulki w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez cztery do 12 godzin. Ponownie odwróć probówkę kilka razy i umieść ją na stojaku magnetycznym, aby przenieść supernatant do świeżej probówki.Następnie umyj kulki magnetyczne, dodając 100 mikrolitrów buforu Tris-EDTA, zawierającego 0,5 molowego chlorku sodu, a następnie połącz dwa supernatanty. Na koniec wyizolować próbkę RNA za pomocą alkoholu fenolowo-chloroformalowego izoamylowego w stosunku 25 do 24 do jednej objętości. Następnie użyj DNazy do usunięcia DNA z próbki RNA związanej z chromatyną.Następnie dodaj 10-krotny bufor DNazy do próbki CARIP i dostosuj końcową objętość do stężenia 1X. Następnie inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie zsyntetyzuj pierwszą nić komplementarnego DNA, wywołując reakcję PCR, dodając 10,5 mikrolitra RNA i jeden mikrolitr trzech mikrogramów na mililitr losowych starterów heksameru.Aby zdenaturować strukturę drugorzędową, najpierw inkubuj probówkę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie na lodzie przez dwie minuty. Następnie dodaj mieszankę wzorcową do probówki PCR i inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Następnie dodaj jeden mikrolitr 200 jednostek na mikrolitr indeksu górnego dwa i uruchom program termocyklera.Aby zsyntetyzować drugą nić komplementarnego DNA, ustaw reakcję na lodzie, dodając odczynniki, bufor i enzymy. Następnie delikatnie wymieszaj odczynniki i inkubuj w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po zsyntetyzowaniu DNA oczyść uzupełniające DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.Następnie zdefragmentuj dwuniciowe DNA, użyj sonifiera do kąpieli wodnej i rurki o pojemności 1,5 mililitra, aby udostępnić DNA do wielkości od 250 do 500 par zasad przez trzy razy po 10 minut lub cztery razy po 10 minut. Następnie przygotuj bibliotekę i wykonaj sekwencjonowanie nowej generacji. W tym przypadku wykonano obrazy z kontrastem fazowym embrionalnych komórek macierzystych w celu wizualizacji kolonii komórek macierzystych.W tym protokole komórki hodowano w obecności lub bez mitotycznie inaktywowanych mysich fibroblastów embrionalnych z LIF i/lub GSK3i w pożywce hodowlanej, aby zapobiec różnicowaniu komórek. Następnie, aby uwidocznić skuteczność sonikacji usieciowanej chromatyny embrionalnych komórek macierzystych, sonikowane dwuniciowe DNA załadowano na 2% żel agarozowy. Obraz żelu pokazuje ściętą chromatynę w zakresie od 200 do 500 par zasad.Następnie wygenerowano biblioteki ChIP-Seq i zsekwencjonowano je przy użyciu platformy sekwencjonowania nowej generacji, aby ocenić obłożenie enzymu modyfikującego histony w całym genomie oraz modyfikacje histonów w embrionalnych komórkach macierzystych. Z niestandardowego widoku przeglądarki UCSC wzbogacona trimetylacja H3K4, dimetylacja H3K4 i KDM5B są widoczne w genie regulatora pluripotencji, POU5F1 i w klastrze HOXC. Przeprowadzono również analizę CARIP-Seq w celu oceny RNA związanych z chromatyną w embrionalnych komórkach macierzystych.Niestandardowy widok przeglądarki UCSC pokazuje RNA związane z trimetylacją H4K20 i zajętość trimetylacji H4K20 w embrionalnych komórkach macierzystych. Na podstawie wyników CARIP-Seq można zinterpretować, że chociaż RNA jest związany z trimetylacją H4K20, może nie wchodzić w interakcje z konkretnym locus. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać RNA związane z chromatyną za pomocą CARIP-Seq i identyfikować interakcje DNA białek w skali globalnej w embrionalnych komórkach macierzystych.

carip-seq-chip-seq-methods-to-identify-chromatin-associated-rnas

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Różnicowanie ESC zbiega się z charakterystycznymi dla danego typu komórek zmianami w strukturze i składzie chromatyny. Wykrycie tych zmian dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów definiujących pluripotencję oraz różnicowanie komórek. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) stanowi wartościową metodę analizy mechanizmów molekularnych leżących u podstaw różnicowania komórek macierzystych. <br...

Immunoprecypitacja chromatyny z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Ten film pokazuje podstawowe kroki do przeprowadzenia analizy całego transkryptomu na wypreparowanych próbkach rdzenia kręgowego piskląt po transfekcji z elektroporacją in ovo.

Analiza RNA-Seq zróżnicowanej ekspresji genów w rdzeniu kręgowym piskląt poddanych elektroporacji

Pytanie o to, jak regulatory chromatyny i stany chromatyny wpływają na genom in vivo, jest kluczowe dla naszego zrozumienia, jak wcześnie podejmowane są decyzje dotyczące losu komórki w rozwijającym się zarodku. ChIP-Seq – najpopularniejsze podejście do badania cech chromatyny na poziomie globalnym – zostało przedstawione tutaj dla zarodków Xenopus.

Migawka całego genomu regulatorów i stanów chromatyny w zarodkach Xenopus za pomocą ChIP-Seq

Precyzyjna regulacja transkrypcji genów leży u podstaw decyzji o losie komórki embrionalnej. W niniejszym artykule opisujemy testy immunoprecypitacji chromatyny stosowane do badania epigenetycznej regulacji zarówno różnicowania komórek macierzystych w sercu, jak i rozwoju serca zarodków myszy.

Epigenetyczna regulacja różnicowania serca embrionalnych komórek macierzystych i tkanek

Opisujemy endogenne rozszczepienie chromatyny połączone z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChEC-seq), ortogonalną metodą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do mapowania miejsc wiązania białek w całym genomie za pomocą białek fuzyjnych nukleazy mikrokokowej (MNazy).

Mapowanie całego genomu interakcji białko-DNA z sekwencją ChEC u Saccharomyces cerevisiae

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i przygotowania biblioteki ChIP-seq do generowania globalnych profili epigenomicznych z próbek embrionalnych kurczaków o niskiej liczebności.

Protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) dla próbek embrionalnych o niskiej liczebności

Opisujemy krok po kroku protokół sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny tandemowej (tChIP-Seq), który umożliwia analizę specyficznej dla typu komórki modyfikacji histonów w całym genomie.

TChIP-Seq: Profilowanie epigenomu specyficzne dla typu komórki

Precyzyjne określenie miejsc wiązania białek w całym genomie jest ważne dla zrozumienia regulacji genów. W tym miejscu opisujemy metodę mapowania genomu, która traktuje DNA immunoprecypitowane chromatyną za pomocą trawienia egzonukleazą (ChIP-exo), a następnie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Metoda ta wykrywa interakcje białko-DNA z rozdzielczością mapowania par zasad bliską i wysokim stosunkiem sygnału do szumu w neuronach ssaków.

Mapowanie w wysokiej rozdzielczości interakcji białko-DNA w neuronach pochodzących z mysich komórek macierzystych przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i egzonukleazy (ChIP-Exo)

Protokół ten zapewnia uproszczony proces obliczeniowy do ilościowej identyfikacji początkujących transkrypcji wzmacniaczy. Integrując dostępność chromatyny, cechy chromatyny oraz dane transkrypcyjne, umożliwia dokładne wykrywanie i analizę aktywności wzmacniacza specyficzną dla nici w złożonych regionach intragenowych, pozostając jednocześnie dostępnym dla badaczy bez rozległego szkolenia bioinformatycznego.

Tok obliczeniowy do ilościowej identyfikacji RNA intergenowego/wewnątrzgenowego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Przedstawiamy tutaj protokół umożliwiający wychwycenie interakcji chromatyny DNA z RNA w celu mapowania trójwymiarowej organizacji genomu powiązanej z RNA.

Metoda interakcji chromatyny DNA z DNA związanej z RNA

Metoda ChIRP oparta na UV do identyfikacji bezpośrednich interakcji lncRNA-białko.

Metoda ChIRP oparta na UV do zweryfikowanej identyfikacji białek, które bezpośrednio współpracują z LncRNA: Od hodowanych komórek do jąder mysich

Poznaj metody CARIP-Seq i ChIP-Seq do mapowania RNA związanych z chromatyną oraz interakcji białko-DNA w embrionalnych komórkach macierzystych. Te techniki pozwalają na globalne badanie epigenomu.

CARIP-Seq i ChIP-Seq: Metody identyfikacji RNA związanych z chromatyną i interakcji białko-DNA w embrionalnych komórkach macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

CARIP-Seq i ChIP-Seq: Metody identyfikacji RNA związanych z chromatyną i interakcji białko-DNA w embrionalnych komórkach macierzystych

Przeglądaj więcej filmów