Name: Dźwigacz Auris Longus Przygotowanie do badania przewodnictwa nerwowo-mięśniowego ssaków w warunkach cęgowania napięciowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Poznaj metodę izolacji mięśnia dźwigacza małżowiny usznej u myszy do badań przewodnictwa nerwowo-mięśniowego. Technika umożliwia rejestrację prądów synaptycznych i analizę transmisji w złączach nerwowo-mięśniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Markowi M. Richowi i Danielowi Mirandzie za komentarze redakcyjne, Ahmadowi Khedraki za pomoc w ustanowieniu tej techniki, oraz Wright State University za wsparcie finansowe (fundusz startowy dla A.A.V.).

<ol><li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse%3A+a+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).</li>
<li>Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+the+mouse+levator+auris+longus+muscle%3A+a+convenient+preparation+to+study+muscle+and+nerve+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity.</a> J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).</li>
<li>Bertone, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonic+anhydrase+inhibitor+acetazolamide+shifts+synaptic+vesicle+recycling+to+a+fast+mode+at+the+mouse+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction.</a> Synapse. , (2017).</li>
<li>Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrusion+of+Ca2%2B+from+mouse+motor+terminal+mitochondria+via+a+Na%2B-Ca2%2B+exchanger+increases+post-tetanic+evoked+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release.</a> J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).</li>
<li>Murray, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).</li>
<li>Nadal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+muscarinic+acetylcholine+autoreceptors+%28M1%2C+M2+and+M4+subtypes%29%2C+adenosine+receptors+%28A1+and+A2A%29+and+tropomyosin-related+kinase+B+receptor+%28TrkB%29+modulate+the+developmental+synapse+elimination+process+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction.</a> Mol Brain. 9 (1), 67(2016).</li>
<li>Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-glia+interactions+are+governed+by+synaptic+and+intrinsic+glial+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties.</a> Neuroscience. 167 (3), 621-632 (2010).</li>
<li>Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+neurotransmitter+release+at+the+neuromuscular+junction+in+a+mouse+model+of+polyglutamine+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease.</a> J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).</li>
<li>Takeuchi, A., Takeuchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+analysis+of+relationship+between+end-plate+potential+and+end-plate+current%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current.</a> J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).</li>
<li>McLachlan, E. M., Martin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non+linear+summation+of+end+plate+potentials+in+the+frog+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse.</a> The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).</li>
<li>Obis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+protein+kinase+C+epsilon+isoform+modulates+acetylcholine+release+in+the+rat+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction.</a> Mol Brain. 8 (1), 80(2015).</li>
<li>Silveira, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+and+inositol+triphosphate+receptors+modulate+facilitation+and+tetanic+depression+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction.</a> Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).</li>
<li>Wood, S. J., Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+factor+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Safety factor at the neuromuscular junction.</a> Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).</li>
<li>Miranda, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+Cl-+channel+defects+reveal+disrupted+skeletal+muscle+maturation+in+R6%2F2+Huntington%27s+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington's mice.</a> J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).</li>
<li>Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington+disease+skeletal+muscle+is+hyperexcitable+owing+to+chloride+and+potassium+channel+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).</li>
<li>Khedraki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depressed+Synaptic+Transmission+and+Reduced+Vesicle+Release+Sites+in+Huntington%27s+Disease+Neuromuscular+Junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington's Disease Neuromuscular Junctions.</a> Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).</li>
<li>Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreene%2C+EC+%22The+anatomy+of+the+rat%22">The anatomy of the rat</a>. , Hafner Pub. (1955).</li>
<li>Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+that+stain+living+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes that stain living nerve terminals.</a> J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).</li>
<li>Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJack%2C+JJB+%22Electric+current+flow+in+excitable+cells%22">Electric current flow in excitable cells</a>. , Clarendon Press. (1983).</li>
<li>Voss, A. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19805741">Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors.</a> Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).</li>
<li>Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+slow+mammalian+muscles+after+denervation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Fast and slow mammalian muscles after denervation.</a> Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).</li>
<li>Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+types+of+calcium+channels+mediate+transmitter+release+during+functional+recovery+of+botulinum+toxin+type+A-poisoned+mouse+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals.</a> Neuroscience. 95 (1), 227-234 (2000).</li>
<li>Gaffield, M. A., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+mobility+in+mouse+motor+nerve+terminals+with+and+without+synapsin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin.</a> J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).</li>
<li>Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+ATPase+Inserted+into+the+Plasma+Membrane+of+Motor+Terminals+by+Exocytosis+Alkalinizes+Cytosolic+pH+and+Facilitates+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis.</a> Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisano tutaj przygotowanie i zastosowanie mięśnia LAL myszy do pomiaru przekaźnictwa nerwowo-mięśniowego w warunkach cęgów prądowych lub napięciowych. Istnieje kilka ważnych punktów, które należy wziąć pod uwagę przy analizowaniu LAL. Oczyszczanie nadmiaru tkanki łącznej z mięśni pomaga w przebijaniu elektrod, ponieważ elektrody mogą zaczepić tkankę łączną podczas ustawiania ich do nabicia. Jednak usuwaj tylko tkankę łączną, którą można łatwo usunąć, aby ograniczyć ryzyko uszkodzenia mięśnia. Izolacja nerwu powinna być ...

Badanie transmisji synaptycznej w połączeniu nerwowo-mięśniowym dostarcza wglądu w dynamiczną relację między układem nerwowym i mięśniowym i jest doskonałym modelem do badania fizjologii synaptycznej. Dźwigacz auris longus (LAL) jest cienkim mięśniem, co pozwala na łatwą wizualizację połączeń nerwowo-mięśniowych. Poprzednie raporty opisywały wygodę korzystania z LAL do badania leków synaptycznych i toksyn oraz charakteryzowały charakterystykę typu włókien mięśni szkieletowych w LAL1,2. W licznych badaniach wykorzystano LAL do zbadania fizjologii nerwowo-mięśniowej3,4,5,6,7,8. W elektrofizjologii możliwość łatwej obserwacji połączeń nerwowo-mięśniowych LAL pozwala na dokładne umieszczenie mikroelektrod na płytce końcowej silnika i znacznie zmniejsza problemy z zaciskiem przestrzennym podczas nagrywania transmisji synaptycznej. Łatwo uzyskuje się zapisy cęgów prądowych właściwości błony mięśniowej, takie jak stała czasowa membrany (τm) i rezystancja wejściowa (Rin). Co więcej, właściwości te można mierzyć na podstawie tych samych włókien mięśniowych, które są używane do rejestrowania przekaźnictwa nerwowo-mięśniowego, co pozwala na bezpośrednie porównanie funkcji synaptycznych z właściwościami błony mięśniowej. Analiza tych danych może dostarczyć kluczowych informacji na temat fizycznych mechanizmów wielu chorób nerwowo-mięśniowych i stanów zmienionej aktywności.
Kluczowym aspektem opisanej tutaj techniki jest użycie zacisku napięcia do nagrań synaptycznych, które nie podlegają nieliniowości spotykanej w zaciskach prądowych i są niezależne od właściwości błony mięśniowej. Zalety używania cęgów napięciowych w przeciwieństwie do cęgów prądowych do badania przekaźnictwa nerwowo-mięśniowego zostały ustalone przez pionierskie wysiłki w latach 19509. Pod cęgami prądowymi EPP, które przekraczają 10-15 mV amplitudy, nie są liniowym iloczynem amplitudy mEPP amplitude9. Na przykład, jeżeli średnia wartość mEPP wynosi 1 mV, można założyć, że EPP wynoszące 5 mV jest iloczynem 5 mEPP (QC wynoszącej 5); podczas gdy EPP 40 mV będzie iloczynem ponad 40 mEPP. Ta nieliniowość przy większych EPP występuje, ponieważ siła napędowa EPP, która jest różnicą między potencjałem błonowym a potencjałem równowagowym dla receptora acetylocholiny (~-10 mV), znacznie zmniejsza się podczas dużych EPP. Tego problemu unika się w eksperymentach z zaciskami napięciowymi, ponieważ potencjał błony mięśniowej nie zmienia się podczas eksperymentów z zaciskami napięciowymi. Wadą jest to, że eksperymenty z cęgami napięciowymi są technicznie trudniejsze do wykonania niż nagrywanie z cęgami prądowymi. Mając to na uwadze, McLachlan i Martin opracowali prostą poprawkę matematyczną, która uwzględnia nieliniowość w nagraniach cęgowych EPPs10. Poprawki działają dobrze11,12,13, ale co ważne, zakładaj, że właściwości błony mięśniowej nie zostały naruszone.
Właściwości błony mięśniowej są szczególnie ważne do rozważenia podczas badania stanów chorobowych lub stanów chorobowych, które zakłócają pracę mięśnia. Na przykład mięśnie szkieletowe z transgenicznego modelu choroby Huntingtona R6/2 są nadpobudliwe z powodu postępującego zmniejszania się spoczynkowych prądów chlorkowych i potasowych14,15. W konsekwencji mEPP i EPP są amplifikowane w mięśniach szkieletowych R6/2. Z pewnością dodatkowe czynniki mogą zmienić mEPP i EPP. Praca z innym modelem myszy z chorobą Huntingtona (R6/1) wykazała zmiany w EPP, które wydawały się być związane z SNARE-proteins8. Aby ocenić mechanizmy powodujące zmienione przekaźnictwo nerwowo-mięśniowe, korzystne byłoby wyeliminowanie skutków zmienionych właściwości błony mięśniowej za pomocą zacisku napięciowego. W niedawnym badaniu przekaźnictwo nerwowo-mięśniowe R6/2 badano zarówno w warunkach cęgów prądowych, jak i napięciowych przy użyciu techniki opisanej w niniejszym dokumencie. Wszystkie płyty końcowe silnika zostały zaciśnięte napięciem z błędem mniejszym niż 1% poprzez umieszczenie dwóch mikroelektrod w stałej długości płyty końcowej16. Wykazano, że zapisy cęgów napięciowych i skorygowanych cęgów prądowych dały kontrastujące pomiary przekaźnictwa nerwowo-mięśniowego w mięśniu R6/2. Podkreśla to, że skorygowanie EPP pod kątem nieliniowości może być trudne, jeśli właściwości błony mięśniowej zostały zmienione, i pokazuje korzyści płynące z uzyskania zapisów napięciowych, które są niezależne od właściwości błony mięśniowej. Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół jest idealny do badania stanów lub stanów chorobowych, które wpływają na przekaźnictwo synaptyczne i właściwości błony postsynaptycznej.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop złożony Olympus</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>10x Obiektyw</td><td>Olympus</td><td>UMPLFLN10XW</td><td></td></tr><tr><td>40x</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr>Instrumenty <td>Sutter</td><td>ze szkła borokrzemianowego</td><td>BF150-86-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD Santa</td><td>Barbara Instruments Group</td><td>ST-7XMEI</td><td></td></tr><tr><td>Mater-9 Pulse Generator</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iso-flex Izolator bodźców</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10 Oprogramowanie do akwizycji i analizy danych</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>1-2500-0180</td><td></td></tr><tr><td>Koncentryczna elektroda bipolarna</td><td>FHC</td><td>CBDSH75</td><td></td></tr><tr><td>Manipulator kulowy</td><td>Narishige&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niemetalowe strzykawki 34 Gauge</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td></td></tr><tr><td>nr 5 Kleszcze</td><td>Narzędzia</td><td></td><td></td>do nauki</tr><tr><td>Narzędzia sprężynowe</td><td>Narzędzia do nauki</td> precyzyjnej <td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze nr 2</td><td>Roboz</td><td>RS-5Q41</td><td></td></tr><tr><td>Mikropreparacja Nożyczki</td><td>Roboz</td><td>RS-5912SC</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning</td><td>2404019862</td><td></td></tr><tr><td>Krem do depilacji</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grass SD9 Stymulator</td><td>trawy Model medyczny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-1000 Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Axon Digidata 1550 Niskoszumowy system pomiaru danych</td>Urządzenia <td></td><td></td><td>molekularne</td></tr><tr><td>Dolnoprzepustowy filtr Besselella Warner</td><td>Instrument Corp.</td><td>LPF-8</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator leworęczny</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641/45DL</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator praworęczny</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641/45DR</td><td></td></tr><tr><td>Pojedynczy kontroler ruchu</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MC100e</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator z krzyżowymi rolkami</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641R</td><td>Zostało to dodane do osi Z mikromanipulatorów leworęcznych i praworęcznych, aby umożliwić zmotoryzowanie osi z. Ta niestandardowa konfiguracja jest tańsza i mniej nieporęczna niż zakup 4-osiowego mikromanipulatora z napędem silnikowym. Pozwala nam to również na sterowanie oboma mikromanipulatorami za pomocą jednego kontrolera</td></tr><tr><td>Wszystkie chemikalia zostały zamówione od Fishera,</td><td></td><td></td><td></td> z wyjątkiem</tr> <tr><td>BTS</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>B315190</td><td></td></tr><tr><td>CTX</td><td>Alomone Labs</td><td>C-270</td><td></td></tr><tr><td>4-Di-2-Asp</td><td>Sondy</td><td></td><td>molekularne nie są już firmą. Teraz zamówione przez Fisher</td></tr></tbody></table>

dźwigacz auris longus przygotowanie do badania przewodnictwa nerwowo-mięśniowego ssaków w warunkach cęgowania napięciowego

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Ten protokół opisuje technikę rejestrowania transmisji synaptycznej z połączenia nerwowo-mięśniowego w warunkach zacisku prądowego i napięcia zaciskowego. Stosuje się preparat ex vivo dźwigacza długiego ulga długiego (LAL), ponieważ jest to cienki mięsień, który zapewnia łatwą wizualizację połączenia nerwowo-mięśniowego w celu przebicia mikroelektrod na płytce końcowej silnika. Metoda ta pozwala na rejestrację spontanicznych miniaturowych potencjałów i prądów płytki końcowej (mEPP i mEPC), potencjałów i prądów płytki końcowej wywołanych przez nerwy (EPP i EPC), a także właściwości membrany płyty końcowej silnika. Wyniki uzyskane tą metodą obejmują zawartość ilościową (QC), liczbę miejsc uwalniania pęcherzyków (n), prawdopodobieństwo uwolnienia pęcherzyków (prel), ułatwienie synaptyczne i depresję, a także stałą czasową błony mięśniowej (τm) i opór wejściowy. Zastosowanie tej techniki do mysich modeli chorób u ludzi może uwypuklić kluczowe patologie w stanach chorobowych i pomóc w identyfikacji nowych strategii leczenia. Dzięki pełnemu zaciskaniu napięcia pojedynczej synapsy, metoda ta zapewnia jedną z najbardziej szczegółowych analiz transmisji synaptycznej dostępnych obecnie na rynku.

Rysunek 8 przedstawia przykład impulsów prądowych (Rysunek 8A) oraz odpowiedzi napięciowych (Rysunek 8B) z jednego włókna LAL w trybie clampy prądowej (current-clamp) pobranych od 12-tygodniowej myszy szczepu dzikiego R6/2. Obecność mEPP wskazuje, że rejestracje te zostały wykonane z płytki motorycznej. Pomiary przeprowadzono w normalnym fizjologicznym roztworze soli. Te zapisy w trybie clampy prądow...

Protokół opisany w tym artykule wykorzystuje mięsień levator auris longus (LAL) myszy do rejestrowania spontanicznych i wywołanych przez nerwy potencjałów postsynaptycznych (zacisk prądowy) i prądów (zacisk napięcia) w złączu nerwowo-mięśniowym. Zastosowanie tej techniki może dostarczyć kluczowych informacji na temat mechanizmów transmisji synaptycznej w warunkach normalnych i chorobowych.

Dźwigacz Auris Longus Przygotowanie do badania przewodnictwa nerwowo-mięśniowego ssaków w warunkach cęgowania napięciowego

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie mięśnia dźwigacza długiego i jego nerwu w celu zarejestrowania prądów synaptycznych w nerwowym połączeniu mięśniowym. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu fizjologii synaptycznej, takie jak wielkość prądu płytki końcowej, zawartość kwantowa, prawdopodobieństwo uwolnienia oraz związki między neuroprzekaźnictwem a pobudliwością mięśni. Główną zaletą tej techniki jest to, że szczegółowe zapisy elektrofizjologiczne z pojedynczej synapsy można łatwo połączyć z eksperymentami optycznymi na żywych komórkach.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w funkcję synaps i komunikację sprzężenia zwrotnego między nerwem a mięśniami, może być również stosowana do innych układów, od drosophila po ssaki. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ przygotowanie mięśni nerwowych ssaków jest kruche, szczególnie nerw. Staranne pozyskiwanie i interpretacja kolejnych danych dotyczących cęgów napięciowych może być również wyzwaniem.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Procedurę zademonstruje Steve Burke z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, pod mikroskopem stereoskopowym wykonaj małe nacięcie w skórze na grzbiecie myszy na poziomie łopatek.Użyj nożyczek do mikrodysekcji. Przetnij skórę nad głową i plecami. Następnie pociągnij skórę wzdłuż nacięcia w pobliżu łopatek.Przetnij mięśnie, które są gorsze od LAL, zaczynając od prawej łopatki. Następnie delikatnie unieś przeciętą tkankę natychmiast na prawo od linii środkowej. Wykonaj cięcie w kierunku lewego ucha z ostrzami nożyczek przyciśniętymi do czaszki, aby usunąć kilka warstw mięśni, które są gorsze od lewego LAL.Unikaj przecinania nerwu unerwiającego LAL, który owija się wokół kanału słuchowego i wchodzi do mięśni po przyśrodkowej stronie ucha. Kontynuuj przecinanie kanału słuchowego, utrzymując jak największą część nerwu przyczepionego. Następnie przetnij tkankę tłuszczową za kanałem słuchowym wzdłuż brzuszno-bocznej części ucha.Przeciąć wzdłuż lewej łopatki, podobnie jak w przypadku zabiegów wykonywanych po prawej stronie, aby całkowicie usunąć mięsień z myszy. Następnie odetnij małżowinę uszną ucha wzdłuż podstawy, pozostawiając chrzęstną część ucha przyczepioną do LAL. Odwróć mięsień tak, aby dolna strona była skierowana do góry.Aby wyizolować mięsień LAL, umieść LAL i otaczającą tkankę na szalce Petriego z dnem z elastomeru krzemowego i przymocuj wypreparowaną tkankę do dna. Często myj tkankę w roztworze soli fizjologicznej. Następnie umieść szpilkę przeciw owadom przez kanał słuchowy, aby utrzymać preparat na miejscu.Za pomocą mniejszych szpilek przypnij pozostałą tkankę po przeciwnej stronie linii środkowej LAL. Użyj kleszczy. Delikatnie pociągnij skórę do góry na bocznej części ucha, aby rozciągnąć mięsień i umieść małą szpilkę przez skórę.Powtarzaj ten krok, aż tkanka będzie dobrze przymocowana do naczynia. Usuń mięśnie, które pokrywają LAL i te związane z LAL za pomocą tkanki łącznej i są szczególnie napięte w pobliżu linii środkowej. Następnie podciągnij leżącą warstwę mięśniową i przetnij tkankę łączną z ostrzami skierowanymi w stronę ciągniętej warstwy mięśniowej.Ciąć w kierunku linii środkowej do około 3/4 drogi do linii środkowej i usuwaj warstwy mięśni, aż pozostanie tylko LAL. Podczas procesu czyszczenia upewnij się, że nerwy nie są uszkodzone. Następnie usuń część pozostałej tkanki łącznej, która pokrywa LAL, aby pomóc w nabiciu elektrod.Usuwaj tylko tkanki, które można łatwo wykonać bez ryzyka uszkodzenia LAL w tym procesie. Aby zidentyfikować nerw unerwiający LAL, za pomocą stymulatora nerwów dotknij nerwów stymulatorem nerwów. Kiedy mięsień się kurczy, zidentyfikowano właściwy nerw.Następnie ostrożnie chwyć tkankę w pobliżu nerwu i użyj nożyczek sprężynowych, aby oddzielić nerw od tkanki otaczającej ucho. Aby zminimalizować uszkodzenia, utrzymuj większość nerwu osadzonego w otaczającej tkance, która zostanie później wykorzystana do przymocowania nerwu do naczynia nagrywającego. W tym momencie badacz może zrobić godzinną przerwę, o ile LAL jest skąpany w 20 mililitrach lub więcej fizjologicznego roztworu soli fizjologicznej.Następnie odpiąć i przenieść mięsień do wkładki scenicznej pod mikroskopem preparacyjnym w celu przeprowadzenia eksperymentów elektrofizjologicznych. Przypnij mięsień na końcach i wzdłuż jego krawędzi. Ustaw nerw prostopadle do włókien mięśniowych i przypnij go do dna naczynia przez nadmiar tkanki, która pozostała nienaruszona na końcu nerwu.Przez cały czas utrzymuj tkankę skąpaną w roztworze soli fizjologicznej. W przypadku eksperymentu elektrofizjologicznego przymocuj komorę perfuzyjną z LAL do stolika mikroskopu. Umieścić elektrodę odniesienia w kubku wypełnionym trójmolowym chlorkiem potasu, który jest połączony z komorą rejestracyjną za pomocą mostka agarowego.W tym momencie umieść elektrodę stymulującą nerwy na nerwie. Wystaw preparat LAL na działanie 4-Di-2-Asp przez 10 minut, aby uzyskać odpowiedni rozkwit do wizualizacji połączenia nerwowo-mięśniowego. Po 10 minutach wymienić roztwór 4-Di-2-Asp na normalny roztwór wapnia.W międzyczasie napełnij szklane kapilary odpowiednimi roztworami dla elektrod wykrywających napięcie i przepuszczających prąd. Delikatnie postukaj w kapilarę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza i przymocuj wypełnioną kapilarnę do uchwytu elektrody na głowicy. Używając mikroskopu pionowego ze standardowym jasnym polem i oświetleniem fluorescencyjnym, poszukaj jasnego pasma fluorescencyjnych zielonych połączeń nerwowo-mięśniowych biegnących prostopadle do włókien mięśniowych wzdłuż preparu z obiektywem emersyjnym o małym powiększeniu.Następnie przełącz się na obiektyw o większym powiększeniu, aby zidentyfikować połączenie nerwowo-mięśniowe na górnej warstwie mięśni w celu zbadania za pomocą elektrofizjologii. Używając głównie jasnego pola, umieść elektrodę nad błoną mięśniową w odległości 100 mikronów od zidentyfikowanego połączenia nerwowo-mięśniowego. Rysunek ten przedstawia przykład impulsów prądowych i odpowiedzi napięciowych z jednego włókna LAL pod cęgami prądowymi z 12-tygodniowej myszy R62 typu dzikiego.Zapisy uzyskano w normalnym fizjologicznym roztworze soli fizjologicznej, a obecność mEPP wskazuje, że zapisy te zostały pobrane z płytki końcowej silnika. Oto reprezentatywne nagranie EPC i dwóch mEPC uzyskanych w warunkach cęgów napięciowych. Ten rysunek przedstawia nałożone EPC i mEPC z reprezentatywnego włókna.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie żywych komórek za pomocą barwników błonowych, takich jak FM143 lub histologia, aby odpowiedzieć na pytania związane z wychwytem uwalniania pęcherzyków lub zmianami morfologicznymi. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie fizjologii do badania transmisji synaptycznej i komunikacji nerwowo-komórkowej w organizmach od drosophila po ssaki.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować unerwiony mięsień dźwigacza auris longus, aby rejestrować prądy synaptyczne w połączeniu nerwowo-mięśniowym. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o zachowaniu szczególnej ostrożności przy usuwaniu tkanki mięśniowej przylegającej do LAL i izolowaniu nerwu.

levator-auris-longus-preparation-for-examination-mammalian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszej pracy opisujemy metody elektrofizjologiczne służące do pomiaru przekaźnictwa synaptycznego w złączu nerwowo-mięśniowym larwy Drosophila. Uwalnianie wywołane inicjuje się sztucznie poprzez stymulację aksonów neuronów ruchowych, a przekaźnictwo w złączu NMJ można zmierzyć na podstawie odpowiedzi postsynaptycznej wywołanej w mięśniu.

Metody elektrofizjologiczne rejestracji potencjałów synaptycznych z złącza nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

Zastosowanie elektrofizjologii w badaniach dostępnych synaps umożliwia ilościowe pomiary aktywności synaptycznej, co jest przydatne w analizie mutantów synaptycznych. Niniejszy artykuł opisuje metodę dysekcji służącą do odsłonięcia złączy neuromięśniowych (NMJ) u Caenorhabditis elegans (C. elegans) i krótko omawia możliwe zastosowania tak przygotowanego preparatu.

Disekcja i rejestracja z połączenia nerwowo-mięśniowego C. elegans

Rejestracje elektrofizjologiczne z embrionów Drosophila umożliwiają analizę właściwości elektrycznych rozwijających się mięśni i neuronów, a także charakterystykę funkcjonalnej synaptogenezy w glutaminergicznych złączach neuromięśniowych oraz w centralnych synapsach cholinergicznych i GABAergicznych.

Rejestracja elektrofizjologiczna w zarodku Drosophila

Mięsień otwierający odnóża raków został zaprezentowany ze względu na jego historyczne znaczenie oraz wszechstronność eksperymentalną w badaniach nad fenotypem mięśni, fizjologią synaptyczną i plastycznością.

Historyczne ujęcie i demonstracja fizjologii złącza neuromięśniowego mięśnia otwieracza raków

Opisujemy procedury powtarzalnego podawania inhibitorów sygnalizacji muskarynowej do mięśnia dźwigacza małżowiny usznej (LAL) u młodych dorosłych myszy oraz późniejszego barwienia immunocytochemicznego jego złącz neuromięśniowych (NMJs) w preparatach całych organów. Mięsień LAL posiada wyjątkowe zalety w kontekście ujawniania farmakologicznych efektów in vivo w złączach NMJs.

Podskórne podawanie antagonistów muskarynowych oraz potrójne barwienie immunocytochemiczne mięśnia dźwigacza małżowiny usznej u myszy

Ta nowa metoda umożliwia jednoczesną rejestrację wewnątrzkomórkową pojedynczego motoneuronu dorosłej myszy oraz pomiar siły generowanej przez jego włókna mięśniowe. Połączone badanie właściwości elektrycznych i mechanicznych jednostek motorycznych u zwierząt zdrowych i modyfikowanych genetycznie stanowi przełom w badaniach nad układem nerwowo-mięśniowym.

Symultaniczne rejestrowanie wewnątrzkomórkowe lędźwiowego motoneuronu oraz siły generowanej przez jego jednostkę motoryczną u dorosłej myszy in vivo

Ocena funkcjonalna połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) może dostarczyć istotnych informacji na temat komunikacji między mięśniem a nerwem. W tym miejscu opisujemy protokół kompleksowej oceny zarówno NMJ, jak i funkcjonalności mięśni przy użyciu dwóch różnych preparatów mięśniowo-nerwowych, tj. płaszczkowato-kulszowego i przeponowo-przeponowego.

Pomiar funkcjonalności połączenia nerwowo-mięśniowego

Techniki pobudliwości aksonalnej dostarczają potężnego narzędzia do badania patofizjologii i zmian biofizycznych, które poprzedzają nieodwracalne zdarzenia zwyrodnieniowe. Manuskrypt ten demonstruje zastosowanie tych technik na nerwie łokciowym znieczulonych szczurów.

In vivo (in vivo)Pomiar elektrofizjologiczny nerwu łokciowego szczura z badaniem pobudliwości aksonalnej

Protokół opisuje metodę ładowania fluorescencyjnego barwnika wapniowego przez przecięty nerw do zakończeń nerwu ruchowego myszy. Ponadto przedstawiono unikalną metodę rejestracji szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwów obwodowych za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Rejestracja stanów przejściowych wapnia w mysim połączeniu nerwowo-mięśniowym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Tutaj prezentujemy protokół, który łączy elektroporację in vivo i denerwację mięśnia dźwigacza długiego czaszki (LAL). Zabieg ten umożliwia badanie potencjalnej roli białek pochodzenia mięśniowego w regeneracji synapsy nerwowo-mięśniowej.

Połączona elektroporacja in vivo i krótkotrwałe unerwienie mięśnia szkieletowego dźwigacza bocznego zorza długiego czaszki

Dynamiczna elektrofizjologia zaciskowa może ustalić związki przyczynowe między deficytami wyładowania neuronów a dysfunkcją kanału jonowego. Opisujemy metody i protokoły dynamicznego zaciskania w myszowych neuronach Purkinjego w móźku, zwracając uwagę na przydatne zasoby i kwestie techniczne. W badaniu reprezentatywnym dodaliśmy modelowaną przewodność sodu do neuronów Tsc1-/- Purkinje, aby zapobiec powtarzalnemu wyładowaniu.

Metody dynamicznego zacisku do badania upośledzonej pobudliwości neuronów związanych z autyzmem

Poznaj metodę izolacji mięśnia dźwigacza małżowiny usznej u myszy do badań przewodnictwa nerwowo-mięśniowego. Technika umożliwia rejestrację prądów synaptycznych i analizę transmisji w złączach nerwowo-mięśniowych.

Dźwigacz Auris Longus Przygotowanie do badania przewodnictwa nerwowo-mięśniowego ssaków w warunkach cęgowania napięciowego

Przeglądaj więcej filmów