Dźwigacz Auris Longus Przygotowanie do badania przewodnictwa nerwowo-mięśniowego ssaków w warunkach cęgowania napięciowego

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie mięśnia dźwigacza długiego i jego nerwu w celu zarejestrowania prądów synaptycznych w nerwowym połączeniu mięśniowym. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu fizjologii synaptycznej, takie jak wielkość prądu płytki końcowej, zawartość kwantowa, prawdopodobieństwo uwolnienia oraz związki między neuroprzekaźnictwem a pobudliwością mięśni. Główną zaletą tej techniki jest to, że szczegółowe zapisy elektrofizjologiczne z pojedynczej synapsy można łatwo połączyć z eksperymentami optycznymi na żywych komórkach.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w funkcję synaps i komunikację sprzężenia zwrotnego między nerwem a mięśniami, może być również stosowana do innych układów, od drosophila po ssaki. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ przygotowanie mięśni nerwowych ssaków jest kruche, szczególnie nerw. Staranne pozyskiwanie i interpretacja kolejnych danych dotyczących cęgów napięciowych może być również wyzwaniem.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Procedurę zademonstruje Steve Burke z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, pod mikroskopem stereoskopowym wykonaj małe nacięcie w skórze na grzbiecie myszy na poziomie łopatek.

Użyj nożyczek do mikrodysekcji. Przetnij skórę nad głową i plecami. Następnie pociągnij skórę wzdłuż nacięcia w pobliżu łopatek.

Przetnij mięśnie, które są gorsze od LAL, zaczynając od prawej łopatki. Następnie delikatnie unieś przeciętą tkankę natychmiast na prawo od linii środkowej. Wykonaj cięcie w kierunku lewego ucha z ostrzami nożyczek przyciśniętymi do czaszki, aby usunąć kilka warstw mięśni, które są gorsze od lewego LAL.

Unikaj przecinania nerwu unerwiającego LAL, który owija się wokół kanału słuchowego i wchodzi do mięśni po przyśrodkowej stronie ucha. Kontynuuj przecinanie kanału słuchowego, utrzymując jak największą część nerwu przyczepionego. Następnie przetnij tkankę tłuszczową za kanałem słuchowym wzdłuż brzuszno-bocznej części ucha.

Przeciąć wzdłuż lewej łopatki, podobnie jak w przypadku zabiegów wykonywanych po prawej stronie, aby całkowicie usunąć mięsień z myszy. Następnie odetnij małżowinę uszną ucha wzdłuż podstawy, pozostawiając chrzęstną część ucha przyczepioną do LAL. Odwróć mięsień tak, aby dolna strona była skierowana do góry.

Aby wyizolować mięsień LAL, umieść LAL i otaczającą tkankę na szalce Petriego z dnem z elastomeru krzemowego i przymocuj wypreparowaną tkankę do dna. Często myj tkankę w roztworze soli fizjologicznej. Następnie umieść szpilkę przeciw owadom przez kanał słuchowy, aby utrzymać preparat na miejscu.

Za pomocą mniejszych szpilek przypnij pozostałą tkankę po przeciwnej stronie linii środkowej LAL. Użyj kleszczy. Delikatnie pociągnij skórę do góry na bocznej części ucha, aby rozciągnąć mięsień i umieść małą szpilkę przez skórę.

Powtarzaj ten krok, aż tkanka będzie dobrze przymocowana do naczynia. Usuń mięśnie, które pokrywają LAL i te związane z LAL za pomocą tkanki łącznej i są szczególnie napięte w pobliżu linii środkowej. Następnie podciągnij leżącą warstwę mięśniową i przetnij tkankę łączną z ostrzami skierowanymi w stronę ciągniętej warstwy mięśniowej.

Ciąć w kierunku linii środkowej do około 3/4 drogi do linii środkowej i usuwaj warstwy mięśni, aż pozostanie tylko LAL. Podczas procesu czyszczenia upewnij się, że nerwy nie są uszkodzone. Następnie usuń część pozostałej tkanki łącznej, która pokrywa LAL, aby pomóc w nabiciu elektrod.

Usuwaj tylko tkanki, które można łatwo wykonać bez ryzyka uszkodzenia LAL w tym procesie. Aby zidentyfikować nerw unerwiający LAL, za pomocą stymulatora nerwów dotknij nerwów stymulatorem nerwów. Kiedy mięsień się kurczy, zidentyfikowano właściwy nerw.

Następnie ostrożnie chwyć tkankę w pobliżu nerwu i użyj nożyczek sprężynowych, aby oddzielić nerw od tkanki otaczającej ucho. Aby zminimalizować uszkodzenia, utrzymuj większość nerwu osadzonego w otaczającej tkance, która zostanie później wykorzystana do przymocowania nerwu do naczynia nagrywającego. W tym momencie badacz może zrobić godzinną przerwę, o ile LAL jest skąpany w 20 mililitrach lub więcej fizjologicznego roztworu soli

Następnie odpiąć i przenieść mięsień do wkładki scenicznej pod mikroskopem preparacyjnym w celu przeprowadzenia eksperymentów elektrofizjologicznych. Przypnij mięsień na końcach i wzdłuż jego krawędzi. Ustaw nerw prostopadle do włókien mięśniowych i przypnij go do dna naczynia przez nadmiar tkanki, która pozostała nienaruszona na końcu nerwu.

Przez cały czas utrzymuj tkankę skąpaną w roztworze soli fizjologicznej. W przypadku eksperymentu elektrofizjologicznego przymocuj komorę perfuzyjną z LAL do stolika mikroskopu. Umieścić elektrodę odniesienia w kubku wypełnionym trójmolowym chlorkiem potasu, który jest połączony z komorą rejestracyjną za pomocą mostka agarowego.

W tym momencie umieść elektrodę stymulującą nerwy na nerwie. Wystaw preparat LAL na działanie 4-Di-2-Asp przez 10 minut, aby uzyskać odpowiedni rozkwit do wizualizacji połączenia nerwowo-mięśniowego. Po 10 minutach wymienić roztwór 4-Di-2-Asp na normalny roztwór wapnia.

W międzyczasie napełnij szklane kapilary odpowiednimi roztworami dla elektrod wykrywających napięcie i przepuszczających prąd. Delikatnie postukaj w kapilarę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza i przymocuj wypełnioną kapilarnę do uchwytu elektrody na głowicy. Używając mikroskopu pionowego ze standardowym jasnym polem i oświetleniem fluorescencyjnym, poszukaj jasnego pasma fluorescencyjnych zielonych połączeń nerwowo-mięśniowych biegnących prostopadle do włókien mięśniowych wzdłuż preparu z obiektywem emersyjnym o małym powiększeniu.

Następnie przełącz się na obiektyw o większym powiększeniu, aby zidentyfikować połączenie nerwowo-mięśniowe na górnej warstwie mięśni w celu zbadania za pomocą elektrofizjologii. Używając głównie jasnego pola, umieść elektrodę nad błoną mięśniową w odległości 100 mikronów od zidentyfikowanego połączenia nerwowo-mięśniowego. Rysunek ten przedstawia przykład impulsów prądowych i odpowiedzi napięciowych z jednego włókna LAL pod cęgami prądowymi z 12-tygodniowej myszy R62 typu dzikiego.

Zapisy uzyskano w normalnym fizjologicznym roztworze soli fizjologicznej, a obecność mEPP wskazuje, że zapisy te zostały pobrane z płytki końcowej silnika. Oto reprezentatywne nagranie EPC i dwóch mEPC uzyskanych w warunkach cęgów napięciowych. Ten rysunek przedstawia nałożone EPC i mEPC z reprezentatywnego włókna.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie żywych komórek za pomocą barwników błonowych, takich jak FM143 lub histologia, aby odpowiedzieć na pytania związane z wychwytem uwalniania pęcherzyków lub zmianami morfologicznymi. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie fizjologii do badania transmisji synaptycznej i komunikacji nerwowo-komórkowej w organizmach od drosophila po ssaki.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować unerwiony mięsień dźwigacza auris longus, aby rejestrować prądy synaptyczne w połączeniu nerwowo-mięśniowym. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o zachowaniu szczególnej ostrożności przy usuwaniu tkanki mięśniowej przylegającej do LAL i izolowaniu nerwu.