Ablacja populacji neuronów za pomocą lasera dwufotonowego i jej ocena za pomocą obrazowania wapnia i rejestracji behawioralnej u larw danio pręgowanego
2 czerwca 2018
Tutaj prezentujemy protokół do ablacji genetycznie znakowanej subpopulacji neuronów za pomocą dwufotonowego lasera z larw danio pręgowanego.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest przetestowanie wpływu ablacji laserowej niektórych neuronów na aktywność i zachowanie obwodów. Dzięki tej eksperymentalnej technice możemy zbadać konieczność istnienia neuronów w obwodzie leżącym u podstaw zachowania. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na nasze kluczowe pytania w dziedzinie zachowania i neuronauki, takie jak to, jak postrzegana jest ofiara i jak zachowanie zdobyczy jest generowane przez aktywność neuronalną.
Główną zaletą tej techniki jest to, że neurony mogą być specyficznie ablowane ze względu na genetyczne znakowanie tych neuronów, a także wysoką rozdzielczość przestrzenną lasera. Po wyhodowaniu larw i umieszczeniu ich w 2% niskotopliwej agarozie zgodnie z protokołem tekstowym, umieść larwy osadzone w agarozie pod dwufotonowym laserowym mikroskopem skaningowym i uruchom system mikroskopowy. Otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazu i na karcie laser kliknij przycisk włączania, aby włączyć laser.
Poczekaj, aż stan lasera zmieni się z zajętego na tryb zablokowany. Na karcie kanałów ustaw długość fali lasera na 880 nanometrów dla ablacji EGFP lub 800 nanometrów dla ablacji GCaMP. Wybierz obiektyw subiektywny 20X, ręcznie przesuwając rewolwer obiektywu.
Następnie kliknij kartę lokalizacji, kliknij GFP, aby zmienić ścieżki optyczne i bezpośrednio view fluorescencja na oko. Wyśrodkuj mózg larwy zebry pręgowanego w polu view, a następnie kliknij kartę akwizycji, aby wrócić do mikroskopii dwufotonowej i ustawić moc i wzmocnienie lasera. Jako zapis warunku przed ablacją kliknij stos Z, aby wybrać opcję stosu Z.
Następnie, po skupieniu się na brzusznym końcu mózgu larwy, kliknij przycisk ustaw pierwszy, aby ustawić dolną granicę, a po skupieniu się na najbardziej grzbietowej powierzchni mózgu kliknij przycisk ustaw ostatni, aby ustawić górną granicę. Na koniec kliknij przycisk rozpocznij eksperyment, aby uruchomić akwizycję obrazu stosu Z. Następnie wybierz obiektyw subiektywny 63X, ręcznie przesuwając rewolwer obiektywu.
Następnie kliknij kartę lokalizacji, aby przełączyć się na mikroskopię epifluorescencyjną. Wyśrodkuj komórki, które mają zostać poddane ablacji wzrokowej, a następnie kliknij kartę akwizycji, aby wrócić do laserowej mikroskopii skaningowej. Na karcie trybu akwizycji ustaw rozmiar klatki na 256 na 256.
Kliknij na żywo i obserwuj interesujące Cię neurony. Następnie, zaczynając od najbardziej wysuniętej strony grzbietowej, znajdź płaszczyznę ogniskową, w której skupiają się komórki, które mają zostać poddane ablacji. Korzystając z funkcji regionów, zaznacz mały okrągły obszar o średnicy około 1/3 wielkości komórki na każdym neuronie jako ROI.
Ustaw prędkość skanowania na 13,9 sekundy na 256 na 256 pikseli, co odpowiada czasowi przebywania lasera wynoszącemu około 200 mikrosekund na piksel lub 200 mikrosekund na pół mikrona. Ustaw również cykl iteracji na cztery powtórzenia. Kliknij przycisk Rozpocznij eksperyment, aby wykonać funkcje szeregów czasowych i wybielania.
Porównaj obraz przed ablacją z obrazem po ablacji w cyklu szeregów czasowych, aby upewnić się, że fluorescencja w docelowych komórkach zniknęła. Następnie przesuń płaszczyznę ogniskowej nieco głębiej i wybierz następną płaszczyznę ogniskowej, w której pojawiają się nieablowane komórki. Przeprowadź funkcję wybielania, jak właśnie pokazano, i powtarzaj proces, aż wszystkie komórki w interesującej nas strukturze neuronalnej zostaną usunięte.
Po ablacji należy sprawdzić komórki pod kątem zniesionej fluorescencji i w razie potrzeby powtórzyć naświetlanie laserowe. Po napromieniowaniu larwy muszą zostać odzyskane. Ostrożnie wykonaj drobne prostopadłe nacięcia w agarozie wokół larw.
Następnie poczekaj, aż ryba sama wypłynie z agarozy, gdy środek znieczulający ustąpi. Po wyhodowaniu pantofelka i znieczuleniu larwy danio pręgowanego zgodnie z protokołem tekstowym, umieść larwy w 2% niskiej temperaturze topnienia agarozy i natychmiast usuń nadmiar agarozy, aby powierzchnia agarozy wyglądała na lekko wypukłą. Za pomocą igły do preparowania szybko ustaw larwy w pozycji pionowej.
Następnie za pomocą noża chirurgicznego wykonaj kilka małych nacięć w agarozie, aby usunąć agarozę wokół głowy danio pręgowanego, co zapewnia miejsce na pływanie pantofelka. Ostrożnie usuń pozostałą agarozę, delikatnie wlewając wodę systemową do komory. Następnie umieść jeden pantofelek w komorze nagraniowej, aby służył jako bodziec wizualny.
Następnie umieść komorę zapisu pod mikroskopem epifluorescencyjnym wyposażonym w naukową kamerę CMOS i wybierz soczewkę obiektywową 2,5x. Uruchom aplikację do akwizycji obrazu dla wyposażonej kamery. Kliknij okienko sekwencji i wybierz rekord dysku twardego w okienku.
W sekcji ustawień skanowania ustaw liczbę klatek na 900 lub dowolny inny żądany łączny numer klatki. W okienku przechwytywania ustaw czas ekspozycji na 30 milisekund i kategoryzację do dwóch na dwa. Kliknij na żywo w okienku przechwytywania, aby zlokalizować larwy w widoku kamery i ostrości, a następnie kliknij przycisk zatrzymaj na żywo i kliknij przycisk Start.
Zapisz film w formacie cxd i przeanalizuj dane zgodnie z protokołem tekstowym. Po ustawieniu systemu rejestracji behawioralnej i umieszczeniu larwy w komorze rejestrującej zgodnie z protokołem tekstowym, za pomocą mikropipety należy pobrać 50 pantofelków i umieścić je w komorze rejestrującej. Aby umieścić szkiełko nakrywkowe na górze komory nagraniowej, należy nasypać niewielką kroplę wody na szkiełko nakrywkowe przed umieszczeniem go na powierzchni wody w komorze nagraniowej, aby uniknąć wprowadzania powietrza do komory.
Umieść komorę nagrywania w systemie oświetleniowym. Następnie rozpocznij nagrywanie poklatkowe z prędkością 10 klatek na sekundę przez 11 minut. Na koniec przeprowadzana analiza zgodnie z protokołem tekstowym.
W tym eksperymencie z linią Gal4, która oznacza jądra w obszarze przedtektalnym i subpopulację neuronów opuszki węchowej. Neurony przedtektalne zostały obustronnie poddane laserowej ablacji. Neurony węchowe zostały poddane ablacji jako kontrola.
Wyniki pokazują, że laser dwufotonowy może usuwać wybrane komórki, pozostawiając sąsiednie neuryty nienaruszone. W tym eksperymencie zbadano funkcjonalną łączność neuronów przedtektalnych, które rzutują swoje aksony w kierunku ILH ipsilateralnie. Zarówno pretectum, jak i ILH wykazywały aktywność neuronalną w proksymalnej obecności ofiary, co sugeruje, że obie aktywności neuronalne są sterowane wizualnie.
Obrazowanie wapnia wykorzystano również do obserwacji aktywności neuronalnej w przedtectum i ILH w larwach ablowanych neuronów przedtektalnych. Lewe przedpiersie, które zostało poddane ablacji laserowej, wykazywało szczątkową lub żadną aktywność neuronalną. Ponadto, ipsilateralny ILH wykazywał dramatycznie przemieszczoną aktywność neuronalną, co sugeruje, że główny wkład w ILH pochodzi z ipsilateralnego przedtectum.
W przeciwieństwie do tego, ILH po drugiej stronie laserowo ablowanego przedpiersia wykazywało aktywność neuronalną porównywalną z aktywnością neuronalną w ipsilateral pretectum, co sugeruje, że prawy ILH otrzymuje dane wejściowe z prawego przedtectum. Po opanowaniu ablację laserową można wykonać w ciągu około godziny dla każdej larwy danio pręgowanego. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby dokonać ablacji tylko docelowych neuronów za pomocą odpowiedniego naświetlania laserowego, unikając uszkodzeń cieplnych przez laser.
Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić ablację neuronów w innych obszarach mózgu, takich jak przodomózgowie lub tyłomózgowie, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób te neurony są zaangażowane w funkcje poznawcze lub funkcje motoryczne. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się neuronauką behawioralną do badania funkcjonalnych obwodów neuronalnych w modelach danio pręgowanego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak dokładnie przeprowadzić ablację neuronów laserowo w mózgu larwy zebry i ocenić konsekwencje funkcjonalne i behawioralne.
Nie zapominaj, że praca z laserem może być bardzo niebezpieczna i zawsze postępuj zgodnie z instrukcjami producenta podczas wykonywania tej procedury.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół ablacji genetycznie oznakowanych subpopulacji neuronów u larw Zebrafish przy użyciu lasera dwufotonowego. Głównym celem jest zbadanie, w jaki sposób ablacja laserowa konkretnych neuronów wpływa na aktywność obwodów i zachowanie, w szczególności w odniesieniu do postrzegania ofiary i zachowań związanych z jej chwytaniem. Technika ta pozwala na precyzyjne celowanie w neurony dzięki oznakowaniu genetycznemu i zapewnia wysoką rozdzielczość przestrzenną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Techniki obrazowania
- Analiza behawioralna
Wstęp
- Zrozumienie obwodów neuronalnych sterujących zachowaniem jest kluczowe w neuronauce.
- Techniki ablacji neuronalnej pomagają określić, czy konkretne neurony są niezbędne do wystąpienia reakcji behawioralnych.
- Metoda ta pozwala na precyzyjne celowanie w neurony bez wpływania na sąsiednie struktury.
Cel badania
- Badanie wpływu ablacji laserowej na aktywność obwodów i zachowanie larw Zebrafish.
- Zbadanie roli neuronów pretekta w zachowaniu chwytania ofiar.
- Wykorzystanie ablacji laserowej w celu uzyskania informacji na temat oddziaływań neuronalnych i sieci połączeń.
Zastosowane Metody
- Główną wykorzystaną platformą jest dwufotonowy skaningowy mikroskop laserowy.
- Model biologiczny obejmuje genetycznie znakowane larwy Danio pręgowanego z ukierunkowanymi populacjami neuronów.
- Kluczowe etapy obejmują obrazowanie Z-stack w celu ustalenia bazowej fluorescencji, specyficzne ustawienia lasera do ablacji oraz procedury regeneracji po ablacji.
Główne wyniki
- Laser dwufotonowy skutecznie przeprowadził ablację celowanych neuronów przedtektaulnych, zachowując jednocześnie otaczające struktury komórkowe.
- Odnotowano aktywność neuronalną w odpowiedzi na bodźce wzrokowe, co wskazuje na funkcjonalność pozostałych neuronów.
- Wyniki sugerują, że neurony przedtektaulne są niezbędne do pośredniczenia w reakcjach podczas chwytania ofiary.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia wiarygodną metodę selektywnej ablacji neuronów w celu analizy ich funkcji.
- Zdobyta wiedza znacząco przyczynia się do zrozumienia mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw zachowania.
- Zastosowane podejście może mieć szersze znaczenie dla badania obwodów neuronalnych w różnych modelach zachowań i chorób.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Selektywna ablacja neuronalna z wykorzystaniem laserów dwufotonowych u larw rybek danio pozwala na precyzyjne badanie funkcji obwodów neuronalnych i wyników behawioralnych. Podejście to zapewnia wysokorozdzielcze, mechanistyczne ograniczanie ryzyka w celu walidacji celów we wczesnych etapach procesów odkrywania w neuronauce. Integracja obrazowania wapniowego i rejestracji behawioralnej zwiększa wiarygodność predykcyjną w wiązaniu populacji neuronalnych z fenotypami funkcjonalnymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednie testowanie niezbędności neuronów w określonych obwodach dla rezultatów behawioralnych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez powiązanie ablacji ze zmianami w obwodach i zachowaniu.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolowanie wpływu specyficznych populacji neuronów.
- Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie rozwoju neurobiologicznych celów terapeutycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane, genetycznie oznakowane układy do powtarzalnych badań ablacji.
- Zapewnia ilościowe wyniki obrazowania wapnia w celu standaryzacji testu.
- Umożliwia rzetelne fenotypowanie behawioralne po ablacji na potrzeby późniejszych badań przesiewowych.
- Wspiera ponowne wykorzystanie platformy w odniesieniu do różnych subpopulacji neuronów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie badania funkcjonalnych obwodów z behawioralnymi punktami końcowymi istotnymi dla danej choroby.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną w modelach neurobehawioralnych.
- Wspiera optymalizację ryzyka w procesie rozwoju poprzez wyjaśnienie zależności między obwodami a zachowaniem.
- Ułatwia opracowywanie biomarkerów translacyjnych dzięki ilościowemu obrazowaniu i analizie zachowania.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta znajduje zastosowanie w obszarze od wczesnego etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając walidację celu opartą na hipotezach oraz redukcję ryzyka mechanistycznego przed identyfikacją związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez ablację genetycznie zdefiniowanych neuronów oraz pomiar konsekwencji w obrębie obwodów i zachowań.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych danych obrazowych i behawioralnych do rozwoju testów.
- Analityka: Dostarcza mierzalnych wyników — sygnałów wapniowych i wskaźników behawioralnych — do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki odkryć z modelami przedklinicznymi poprzez powiązanie obwodów neuronalnych z obserwowalnymi zachowaniami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje reużywalny schemat pracy do badania zróżnicowanych populacji neuronalnych w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad obwodami neuronalnymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły ablacji i obrazowania w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez wczesne wyjaśnienie relacji między celem a zachowaniem w procesie badawczym.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów neurobiologicznych do dalszego rozwoju z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii dwufotonowej oraz genetycznego znakowania populacji neuronalnych.
- Wymaga dostępu do zaawansowanej infrastruktury obrazowania i rejestracji behawioralnej.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności ablacji i analizy.
- Możliżna jest konieczność adaptacji metody do różnych obwodów neuronalnych lub paradygmatów behawioralnych.
- Wymagana jest staranna kontrola, aby uniknąć efektów poza celowych i zapewnić specyficzność.
Najczęściej zadawane pytania z zakresu biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:51
Ablation of a Subpopulation of Neurons Using a Two-photon Laser Microscope
4:47
Calcium imaging to Record Prey-Evoked Neuronal Activity in the Pretectum-Ablated Zebrafish Larvae
6:38
Assessment of Behavioral Consequences Following Laser Ablation
7:30
Results: Assessment of Laser Ablated Pretectal Neurons with Calcium Imaging
9:05
Conclusion
