Name: Ablacja populacji neuronów za pomocą lasera dwufotonowego i jej ocena za pomocą obrazowania wapnia i rejestracji behawioralnej u larw danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Poznaj metodę ablacji laserowej neuronów u larw Danio rerio przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Technika ta umożliwia badanie aktywności obwodów neuronalnych i zachowań związanych z polowaniem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania zostały sfinansowane z grantów otrzymanych od MEXT, JSPS KAKENHI Granty o numerach JP25290009, JP25650120, JP17K07494 i JP17H05984.

<ol><li>Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+whole+picture%3A+A+comprehensive+imaging+approach+to+functional+mapping+of+circuits+in+behaving+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish.</a> Neuroscience. 296, 26-38 (2015).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Muto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+visualization+with+an+improved+GCaMP+calcium+indicator+reveals+spatiotemporal+activation+of+the+spinal+motor+neurons+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).</li>
<li>Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+space+cadet+gene+controls+axonal+pathfinding+of+neurons+that+modulate+fast+turning+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements.</a> Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).</li>
<li>Asakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits+by+Tol2+transposon-mediated+Gal4+gene+and+enhancer+trapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).</li>
<li>Sternberg, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+Neurotoxin+to+Investigate+the+Contribution+of+Excitatory+Interneurons+to+Speed+Modulation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo.</a> Curr Biol. , (2016).</li>
<li>Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+zebrafish+behavior+with+halorhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).</li>
<li>Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+visually+guided+behavior+by+distinct+populations+of+spinal+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons.</a> Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).</li>
<li>Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+projection+neurons+control+turning+behaviors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish.</a> Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).</li>
<li>Smear, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+glutamate+transport+at+a+central+synapse+limits+the+acuity+of+visual+perception+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish.</a> Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).</li>
<li>Bianco, I. H., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visuomotor+transformations+underlying+hunting+behavior+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish.</a> Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).</li>
<li>Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visually+driven+chaining+of+elementary+swim+patterns+into+a+goal-directed+motor+sequence%3A+a+virtual+reality+study+of+zebrafish+prey+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture.</a> Front Neural Circuits. 7, 86(2013).</li>
<li>Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+2D+virtual+reality+system+for+visual+goal-driven+navigation+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae.</a> Sci Rep. 6, 34015(2016).</li>
<li>Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+neuronal+activity+during+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of neuronal activity during perception.</a> Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).</li>
<li>Del Bene, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filtering+of+visual+information+in+the+tectum+by+an+identified+neural+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit.</a> Science. 330 (6004), 669-673 (2010).</li>
<li>Semmelhack, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dedicated+visual+pathway+for+prey+detection+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish.</a> Elife. 3, 04878(2014).</li>
<li>Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+object+size+in+retinotectal+microcircuits%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Classification of object size in retinotectal microcircuits.</a> Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).</li>
<li>Romano, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+Neuronal+Network+Dynamics+Reveal+Circuit%27s+Functional+Adaptations+for+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit's Functional Adaptations for Behavior.</a> Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).</li>
<li>Barker, A. J., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+decision+making+in+the+zebrafish+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum.</a> Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).</li>
<li>Ewert, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9783642675027">Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior</a>. , Springer Verlag. (1980).</li>
<li>Muto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+hypothalamic+feeding+centre+upon+visual+prey+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection.</a> Nat Commun. 8, 15029(2017).</li>
<li>Muto, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+in+Free-Swimming+Larval+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish.</a> Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="https://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
<li>National BioResource Project Paramecium. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://nbrpcms.nig.ac.jp/paramecium/?lang=en">http://nbrpcms.nig.ac.jp/paramecium/?lang=en</a> (2017).</li>
<li>Fiji. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://fiji.sc">https://fiji.sc</a> (2017).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Mueller, T., Wullimann, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrdU-%2C+neuroD+%28nrd%29-+and+Hu-studies+reveal+unusual+non-ventricular+neurogenesis+in+the+postembryonic+zebrafish+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain.</a> Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).</li>
<li>Muto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+genetic+analysis+of+visual+behavior+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish.</a> PLoS Genet. 1 (5), 66(2005).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zgłaszania konfliktu interesów.

Chociaż laser dwufotonowy ma doskonałą rozdzielczość przestrzenną, aby specyficznie ablować poszczególne neurony, należy zachować dużą ostrożność, aby uniknąć niepożądanych uszkodzeń tkanki mózgowej spowodowanych ciepłem. Najważniejszym krokiem w eksperymencie ablacyjnym jest określenie optymalnej ilości promieniowania laserowego. Niewystarczające napromieniowanie nie jest w stanie zabić neuronów. Zbyt duże napromieniowanie spowoduje uszkodzenie cieplne otaczającej tkanki, co spowoduje niepożądane skutki. Optymalny zakre...

Aby zrozumieć, jak zachowanie wynika z aktywności neuronów w mózgu, konieczne jest zidentyfikowanie obwodów neuronowych, które są zaangażowane w generowanie tego zachowania. W stadium larwalnym danio pręgowany stanowi idealny model zwierzęcy do badania funkcji mózgu związanych z zachowaniem, ponieważ ich małe, przezroczyste mózgi umożliwiają badanie aktywności neuronalnej w rozdzielczości komórkowej w szerokim obszarze mózgu podczas obserwacji zachowania1. Obrazowanie aktywności neuronalnej w określonych neuronach stało się możliwe dzięki wynalezieniu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (Ca) (GECI), takich jak GCaMP2. Transgeniczne danio pręgowane GCaMP okazały się przydatne do kojarzenia funkcjonalnego obwodu neuronalnego z zachowaniem poprzez przeprowadzanie obrazowania Ca u zachowujących się zwierząt3.
Podczas gdy obrazowanie Ca może wykazać korelacje między aktywnością neuronalną a zachowaniem, aby pokazać przyczynowość, tłumienie aktywności neuronalnej i testowanie jej konsekwencji dla zachowania są ważnymi krokami. Można to osiągnąć na różne sposoby: wykorzystanie mutacji genetycznej, która zmienia określone obwody neuronalne4, ekspresja neurotoksyn w określonych neuronach5,6, użycie narzędzi optogenetycznych, takich jak halorodopsyna7, oraz laserowa ablacja docelowych neuronów8,9. Ablacja laserowa jest szczególnie przydatna do eliminowania aktywności w stosunkowo niewielkiej liczbie określonych neuronów. Nieodwracalna eliminacja aktywności neuronalnej poprzez zabijanie neuronów ułatwia ocenę konsekwencji behawioralnych.
Ciekawym zachowaniem, które można zaobserwować w stadium larwalnym u danio pręgowanego, jest chwytanie zdobyczy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). To wizualnie sterowane, ukierunkowane na cel zachowanie zapewnia korzystny system eksperymentalny do badania ostrości wzroku10, transformacja wzrokowo-ruchowa11,12,13, percepcja wzrokowa i rozpoznawanie obiektów14,15,16,17,18, i podejmowanie decyzji19. To, w jaki sposób ofiara jest rozpoznawana przez drapieżniki i jak wykrywanie zdobyczy prowadzi do zachowania łapania zdobyczy, było głównym pytaniem w neuroetologii20. W niniejszej pracy skupimy się na roli obwodu pretekto-podwzgórza utworzonego przez rzuty jądra w pretectum (nucleus pretectalis superficialis pars magnocellularis, dalej nazywane po prostu pretectum) do ILH. Wykazano, że laserowa ablacja przedpiersia zmniejsza aktywność chwytania zdobyczy i znosi aktywność neuronalną w ILH, która jest związana z wizualną percepcją zdobyczy21. W tym miejscu opisano protokoły wykonywania ablacji laserowej i testowania jej działania za pomocą obrazowania Ca2+ i rejestracji behawioralnej larw danio pręgowanego.

<table><tbody><tr><td>NuSieve GTG Agaroza</td><td>Lonza</td><td>Cat.#50080</td><td>niska temperatura topnienia agaroza</td></tr><tr><td>6 cm szalka Petriego</td><td>FALCON</td><td>Produkt#:351007</td><td></td></tr><tr><td>igła preparcyjna</td><td>AS ONE Corporation</td><td>Cat. Nr 2-013-01</td><td></td></tr><tr><td>https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 LSM7MP</td><td>Dwufotonowy laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Carl Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>W Plan-Apochromat 63x/1.0</td><td>Soczewka obiektywowa Carl Zeiss</td><td></td><td>63X</td></tr><tr><td>Imager.Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>mikroskop epi-fluorescencyjny</td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Oprogramowanie do akwizycji obrazów dla mikroskopów konfokalnych</td></tr><tr><td>Uszczelka komory hybrydyzacji Secure-Seal, 8 komór, średnica 9 mm x głębokość 0,8 mm</td><td>Katalog sond molekularnych</td><td># S-24732</td><td>Używany jako komora zapisowa w obrazowaniu</td></tr><tr><td>Ca Komory obrazowania</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>Komory obrazowania CoverWell PCI-A-2.5</td><td>Używany jako behawioralny</td></tr><tr><td>nóż chirurgiczny</td> w komorze zapisu <td>MANI</td><td>Nóż okulistyczny MST15</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>model: C11440-22CU</td><td>naukowa kamera CMOS</td></tr><tr><td>HCImage</td><td>Oprogramowanie do analizy ostrości obrazu</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td></tr><tr><td>Moduł nagrywania dysku twardego</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>Moduł oprogramowania umożliwiający zapis plików filmowych na dysku twardym w krótkim czasie</td></tr><tr><td>SZX7</td><td>Olympus</td><td></td><td>stereoskop</td></tr><tr><td>DF PL 0,5X</td><td>Olympus</td><td></td><td>obiektyw do SZX7</td></tr><tr><td>Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio</td><td>FLIR Systems, Inc.</td><td>Nr produktu Kamera CMOS GS3-U3-41C6NIR-C</td><td>Kamera</td></tr><tr><td>XIMEA xiQ Kamera</td><td>XIMEA</td><td>Nr produktu Kamera CMOS MQ042RG-CM</td><td></td></tr><tr><td>z pierścieniowym światłem LED</td><td>CCS</td><td>Model: LDR2-100SW2-LA</td><td>Biała dioda LED</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nylonowa siatka 32 i mikro; m</td><td>Ekran Tokyo</td><td>N-No.380T</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr> <tr><td>Siatka nylonowa 13 i mikro; m</td><td>Ekran tokijski</td><td>N-No. 508T-K</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr> <tr><td>Metal seive 150 mikronów</td><td>Ekran</td><td></td> tokijski <td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>Metal seive 75 mikronów</td><td>Ekran</td><td></td> tokijski <td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>EBIOS</td><td>Asahi Food & Opieka zdrowotna, Co. Sp. z o.o.</td><td></td><td>suche drożdże piwne</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>zintegrowane środowisko programistyczne do programowania</td></tr><tr><td>Mai-Tai HP</td><td>Spectra Physics&nbsp;</td><td></td><td>Laser dwufotonowy&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ablacja populacji neuronów za pomocą lasera dwufotonowego i jej ocena za pomocą obrazowania wapnia i rejestracji behawioralnej u larw danio pręgowanego

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Aby określić rolę subpopulacji neuronów w zachowaniu, konieczne jest przetestowanie konsekwencji blokowania jej aktywności u żywych zwierząt. Laserowa ablacja neuronów jest skuteczną metodą w tym celu, gdy neurony są selektywnie znakowane za pomocą sond fluorescencyjnych. W niniejszej pracy opisano protokoły laserowej ablacji subpopulacji neuronów za pomocą mikroskopu dwufotonowego oraz badania jej konsekwencji funkcjonalnych i behawioralnych. W tym badaniu jako model badawczy wykorzystano zachowanie chwytania zdobyczy u larw danio pręgowanego. Wiadomo, że obwód pretekto-podwzgórzowy leży u podstaw tego wizualnie sterowanego zachowania łapania zdobyczy. Pretectum zebry pręgowanego poddano ablacji laserowej i zbadano aktywność neuronalną w dolnym płacie podwzgórza (ILH; cel projekcji przedtektalnej). Przetestowano również zachowanie chwytania zdobyczy po ablacji pretektalnej.

Wybrane neurony zostały genetycznie znakowane za pomocą EGFP lub GCaMP6s, których ekspresja była sterowana w liniach Gal4. Linia Gal4 gSAIzGFFM119B została wykorzystana do znakowania jądra w obszarze pretekta (magnocelularne powierzchowne jądro przedtekta) oraz subpopulacji neuronów opuszki węchowej. Inna linia Gal4, hspGFFDMC76A, została użyta do znakowania ILH. Przeprowadziliśmy obustronną ablację laserową neuronów pretekta (Rysunek 2A pane...

Tutaj prezentujemy protokół do ablacji genetycznie znakowanej subpopulacji neuronów za pomocą dwufotonowego lasera z larw danio pręgowanego.

Ablacja populacji neuronów za pomocą lasera dwufotonowego i jej ocena za pomocą obrazowania wapnia i rejestracji behawioralnej u larw danio pręgowanego

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest przetestowanie wpływu ablacji laserowej niektórych neuronów na aktywność i zachowanie obwodów. Dzięki tej eksperymentalnej technice możemy zbadać konieczność istnienia neuronów w obwodzie leżącym u podstaw zachowania. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na nasze kluczowe pytania w dziedzinie zachowania i neuronauki, takie jak to, jak postrzegana jest ofiara i jak zachowanie zdobyczy jest generowane przez aktywność neuronalną.Główną zaletą tej techniki jest to, że neurony mogą być specyficznie ablowane ze względu na genetyczne znakowanie tych neuronów, a także wysoką rozdzielczość przestrzenną lasera. Po wyhodowaniu larw i umieszczeniu ich w 2% niskotopliwej agarozie zgodnie z protokołem tekstowym, umieść larwy osadzone w agarozie pod dwufotonowym laserowym mikroskopem skaningowym i uruchom system mikroskopowy. Otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazu i na karcie laser kliknij przycisk włączania, aby włączyć laser.Poczekaj, aż stan lasera zmieni się z zajętego na tryb zablokowany. Na karcie kanałów ustaw długość fali lasera na 880 nanometrów dla ablacji EGFP lub 800 nanometrów dla ablacji GCaMP. Wybierz obiektyw subiektywny 20X, ręcznie przesuwając rewolwer obiektywu.Następnie kliknij kartę lokalizacji, kliknij GFP, aby zmienić ścieżki optyczne i bezpośrednio view fluorescencja na oko. Wyśrodkuj mózg larwy zebry pręgowanego w polu view, a następnie kliknij kartę akwizycji, aby wrócić do mikroskopii dwufotonowej i ustawić moc i wzmocnienie lasera. Jako zapis warunku przed ablacją kliknij stos Z, aby wybrać opcję stosu Z.Następnie, po skupieniu się na brzusznym końcu mózgu larwy, kliknij przycisk ustaw pierwszy, aby ustawić dolną granicę, a po skupieniu się na najbardziej grzbietowej powierzchni mózgu kliknij przycisk ustaw ostatni, aby ustawić górną granicę. Na koniec kliknij przycisk rozpocznij eksperyment, aby uruchomić akwizycję obrazu stosu Z. Następnie wybierz obiektyw subiektywny 63X, ręcznie przesuwając rewolwer obiektywu.Następnie kliknij kartę lokalizacji, aby przełączyć się na mikroskopię epifluorescencyjną. Wyśrodkuj komórki, które mają zostać poddane ablacji wzrokowej, a następnie kliknij kartę akwizycji, aby wrócić do laserowej mikroskopii skaningowej. Na karcie trybu akwizycji ustaw rozmiar klatki na 256 na 256.Kliknij na żywo i obserwuj interesujące Cię neurony. Następnie, zaczynając od najbardziej wysuniętej strony grzbietowej, znajdź płaszczyznę ogniskową, w której skupiają się komórki, które mają zostać poddane ablacji. Korzystając z funkcji regionów, zaznacz mały okrągły obszar o średnicy około 1/3 wielkości komórki na każdym neuronie jako ROI.Ustaw prędkość skanowania na 13,9 sekundy na 256 na 256 pikseli, co odpowiada czasowi przebywania lasera wynoszącemu około 200 mikrosekund na piksel lub 200 mikrosekund na pół mikrona. Ustaw również cykl iteracji na cztery powtórzenia. Kliknij przycisk Rozpocznij eksperyment, aby wykonać funkcje szeregów czasowych i wybielania.Porównaj obraz przed ablacją z obrazem po ablacji w cyklu szeregów czasowych, aby upewnić się, że fluorescencja w docelowych komórkach zniknęła. Następnie przesuń płaszczyznę ogniskowej nieco głębiej i wybierz następną płaszczyznę ogniskowej, w której pojawiają się nieablowane komórki. Przeprowadź funkcję wybielania, jak właśnie pokazano, i powtarzaj proces, aż wszystkie komórki w interesującej nas strukturze neuronalnej zostaną usunięte.Po ablacji należy sprawdzić komórki pod kątem zniesionej fluorescencji i w razie potrzeby powtórzyć naświetlanie laserowe. Po napromieniowaniu larwy muszą zostać odzyskane. Ostrożnie wykonaj drobne prostopadłe nacięcia w agarozie wokół larw.Następnie poczekaj, aż ryba sama wypłynie z agarozy, gdy środek znieczulający ustąpi. Po wyhodowaniu pantofelka i znieczuleniu larwy danio pręgowanego zgodnie z protokołem tekstowym, umieść larwy w 2% niskiej temperaturze topnienia agarozy i natychmiast usuń nadmiar agarozy, aby powierzchnia agarozy wyglądała na lekko wypukłą. Za pomocą igły do preparowania szybko ustaw larwy w pozycji pionowej.Następnie za pomocą noża chirurgicznego wykonaj kilka małych nacięć w agarozie, aby usunąć agarozę wokół głowy danio pręgowanego, co zapewnia miejsce na pływanie pantofelka. Ostrożnie usuń pozostałą agarozę, delikatnie wlewając wodę systemową do komory. Następnie umieść jeden pantofelek w komorze nagraniowej, aby służył jako bodziec wizualny.Następnie umieść komorę zapisu pod mikroskopem epifluorescencyjnym wyposażonym w naukową kamerę CMOS i wybierz soczewkę obiektywową 2,5x. Uruchom aplikację do akwizycji obrazu dla wyposażonej kamery. Kliknij okienko sekwencji i wybierz rekord dysku twardego w okienku.W sekcji ustawień skanowania ustaw liczbę klatek na 900 lub dowolny inny żądany łączny numer klatki. W okienku przechwytywania ustaw czas ekspozycji na 30 milisekund i kategoryzację do dwóch na dwa. Kliknij na żywo w okienku przechwytywania, aby zlokalizować larwy w widoku kamery i ostrości, a następnie kliknij przycisk zatrzymaj na żywo i kliknij przycisk Start.Zapisz film w formacie cxd i przeanalizuj dane zgodnie z protokołem tekstowym. Po ustawieniu systemu rejestracji behawioralnej i umieszczeniu larwy w komorze rejestrującej zgodnie z protokołem tekstowym, za pomocą mikropipety należy pobrać 50 pantofelków i umieścić je w komorze rejestrującej. Aby umieścić szkiełko nakrywkowe na górze komory nagraniowej, należy nasypać niewielką kroplę wody na szkiełko nakrywkowe przed umieszczeniem go na powierzchni wody w komorze nagraniowej, aby uniknąć wprowadzania powietrza do komory.Umieść komorę nagrywania w systemie oświetleniowym. Następnie rozpocznij nagrywanie poklatkowe z prędkością 10 klatek na sekundę przez 11 minut. Na koniec przeprowadzana analiza zgodnie z protokołem tekstowym.W tym eksperymencie z linią Gal4, która oznacza jądra w obszarze przedtektalnym i subpopulację neuronów opuszki węchowej. Neurony przedtektalne zostały obustronnie poddane laserowej ablacji. Neurony węchowe zostały poddane ablacji jako kontrola.Wyniki pokazują, że laser dwufotonowy może usuwać wybrane komórki, pozostawiając sąsiednie neuryty nienaruszone. W tym eksperymencie zbadano funkcjonalną łączność neuronów przedtektalnych, które rzutują swoje aksony w kierunku ILH ipsilateralnie. Zarówno pretectum, jak i ILH wykazywały aktywność neuronalną w proksymalnej obecności ofiary, co sugeruje, że obie aktywności neuronalne są sterowane wizualnie.Obrazowanie wapnia wykorzystano również do obserwacji aktywności neuronalnej w przedtectum i ILH w larwach ablowanych neuronów przedtektalnych. Lewe przedpiersie, które zostało poddane ablacji laserowej, wykazywało szczątkową lub żadną aktywność neuronalną. Ponadto, ipsilateralny ILH wykazywał dramatycznie przemieszczoną aktywność neuronalną, co sugeruje, że główny wkład w ILH pochodzi z ipsilateralnego przedtectum.W przeciwieństwie do tego, ILH po drugiej stronie laserowo ablowanego przedpiersia wykazywało aktywność neuronalną porównywalną z aktywnością neuronalną w ipsilateral pretectum, co sugeruje, że prawy ILH otrzymuje dane wejściowe z prawego przedtectum. Po opanowaniu ablację laserową można wykonać w ciągu około godziny dla każdej larwy danio pręgowanego. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby dokonać ablacji tylko docelowych neuronów za pomocą odpowiedniego naświetlania laserowego, unikając uszkodzeń cieplnych przez laser.Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić ablację neuronów w innych obszarach mózgu, takich jak przodomózgowie lub tyłomózgowie, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób te neurony są zaangażowane w funkcje poznawcze lub funkcje motoryczne. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się neuronauką behawioralną do badania funkcjonalnych obwodów neuronalnych w modelach danio pręgowanego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak dokładnie przeprowadzić ablację neuronów laserowo w mózgu larwy zebry i ocenić konsekwencje funkcjonalne i behawioralne.Nie zapominaj, że praca z laserem może być bardzo niebezpieczna i zawsze postępuj zgodnie z instrukcjami producenta podczas wykonywania tej procedury.

ablation-neuronal-population-using-two-photon-laser-its-assessment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszej pracy opisujemy metodę montowania embrionów zebrafish do długotrwałego obrazowania, obrazowania dwufotonowego, technik uszkadzania tkanek oraz konfokalnego obrazowania time-lapse.

Dwufotonowa aksotomia i konfokalne obrazowanie time-lapse w żywych embrionach danio pręgowanego

Ten film opisuje test chwytania zdobyczy. Film omawia metodę badania zachowań larw danio pręgowanego podczas chwytania zdobyczy po laserowej ablacji określonych neuronów.

Test chwytania zdobyczy: metoda badania zachowania larw danio pręgowanego podczas chwytania zdobyczy

Ten film opisuje metodę uszkadzania aksonów w zarodkach danio pręgowanego za pomocą aksotomii lasera dwufotonowego i obserwacji regeneracji aksonów po urazie.

Aksotomia lasera dwufotonowego: metoda uszkadzania aksonów w zarodkach danio pręgowanego i obserwowania regeneracji aksonów

Ten film demonstruje metodę badania wizualnego wykrywania zdobyczy u transgenicznych larw danio pręgowanego za pomocą obrazowania fluorescencyjnego opartego na wskaźniku wapnia z ich neuronami wyrażającymi fluorescencyjne kompleksy wskaźnikowe wapnia.

Analiza aktywności neuronalnej wywołanej przez zdobycz w transgenicznej larwie danio pręgowanego

Źródło: Morsch, M.,  , Wywoływanie stresu i śmierci komórki za pomocą konwencjonalnej laserowej mikroskopii konfokalnej UV. J. Vis. Exp. (2017)...

Selektywna ablacja laserowa pojedynczego neuronu u larwy danio pręgowanego przy użyciu mikroskopu konfokalnego

Źródło: Muto, A., et al. Ablacja populacji neuronów za pomocą lasera dwufotonowego i jej ocena za pomocą obrazowania wapnia i rejestracji behawioralnej larw danio pręgowanego. J. vis. exp. (2018) W tym filmie  Zademonstrowano procedurę dwufotonowej ablacji laserowej, umożliwiającą selektywne niszczenie neuronów fluorescencyjnych w unieruchomionych agarozą larwach danio pręgowanego. Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości przed i po zabiegu potwierdza skuteczne uszkodzenie neuronów, co obserwuje...

Celowana ablacja neuronów przy użyciu mikroskopii dwufotonowej u danio pręgowanego Larava

Chociaż obwodowy układ nerwowy (PNS) jest zdolny do znacznej naprawy po urazie, niewiele wiadomo o komórkowych i molekularnych mechanizmach rządzących tym zjawiskiem. Korzystając z żywego, transgenicznego danio pręgowanego i powtarzalnego testu przecięcia nerwów, możemy badać dynamiczne zachowania komórek glejowych podczas degeneracji i regeneracji nerwów.

Przekrój nerwu ruchowego i obrazowanie poklatkowe zachowań komórek glejowych u żywych danio pręgowanego

Laserowa ablacja jest szeroko stosowaną technologią do badania regeneracji w systemach biologicznych. Prezentowany protokół opisuje zastosowanie standardowego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego do ablacji laserowej, a następnie obrazowania poklatkowego regenerujących się komórek międzynerwowych w linii bocznej danio pręgowanego.

Test ablacji i regeneracji laserowej oparty na mikroskopie konfokalnym w komórkach międzynerwowych danio pręgowanego

Przedstawiamy tutaj protokół przeprowadzania dwufotonowego obrazowania wapnia w grzbietowej części przedniej mózgu dorosłego danio pręgowanego.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia aktywności przedmózgu u zachowujących się dorosłych danio

Ten protokół opisuje dwufotonową ablację laserową przeprowadzaną na larwach danio pręgowanego, która służy jako model do badania regeneracji kości i efektów odpowiedzi immunologicznej na ablację.

Dwufotonowa, laserowa ablacja osteoblastów w rozwijających się larwach danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania aktywności neuronalnej w obszarach mózgu transgenicznego danio pręgowanego, które wyrażają wskaźniki wapnia GCaMP za pomocą mikroskopii konfokalnej.

In vivo (in vivo) Konfokalne obrazowanie fluorescencyjne aktywności neuronalnej wywołanej stymulacją sensoryczną u częściowo unieruchomionych larw danio pręgowanego

Poznaj metodę ablacji laserowej neuronów u larw Danio rerio przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Technika ta umożliwia badanie aktywności obwodów neuronalnych i zachowań związanych z polowaniem.

Ablacja populacji neuronów za pomocą lasera dwufotonowego i jej ocena za pomocą obrazowania wapnia i rejestracji behawioralnej u larw danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal

Ablacja populacji neuronów za pomocą lasera dwufotonowego i jej ocena za pomocą obrazowania wapnia i rejestracji behawioralnej u larw danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów