Name: Przedkliniczna ocena bioaktywności przeciwnowotworowej kumaryny OT48 za pomocą sferoid, testów tworzenia kolonii i ksenoprzeszczepów danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj metodę oceny przeciwnowotworowej aktywności kumaryn w modelach 3D i ksenoprzeszczepach danio pręgowanego. Technika ta pozwala badać skuteczność leków w fizjologicznie trafnym środowisku in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania w SNU są wspierane przez Narodową Fundację Badawczą (NRF) przez MEST of Korea for Tumor Microenvironment Global Core Research Center (GCRC), [numer grantu 2011-0030001]; przez Seoul National University Research Grant oraz przez program Brain Korea (BK21) PLUS.

1. Testy tworzenia kolonii
<ol>
	<li>Hodowla komórek A549 w stężeniu 20 000 komórek/cm2 w 15 ml pożywki do hodowli komórkowych RPMI1640 uzupełnionej 10% FBS (płodową surowicą bydlęcą) i 1% antybiotykami w kolbie o długości 75cm2 w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>W dniu eksperymentu określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru. Zbierz 50 000 komórek przez odwirowanie przy 400 x g przez 7 minut w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i ponownie zawieś komórki w 100 μl 1x sterylnego PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) w probówkach o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dozować 1,1 ml półstałego podłoża na bazie metylocelulozy (MCBM) do probówek o pojemności 15 ml za pomocą multipipety. Przygotuj jedną tubkę na każdy warunek.</li>
	<li>Dodaj 110 μl FBS do 1,1 ml MCBM za pomocą mikropipety P200.</li>
	<li>Komórki nasienne w ilości 1,000 komórek/ml. Zebrać 2,4 μl zawiesiny komórek z roztworu podstawowego (50 000 komórek w 100 μl 1x PBS) za pomocą mikropipety P2 i dodać do 1,1 ml MCBM uzupełnionego 10% FBS.</li>
	<li>Po dodaniu komórek wiruj probówki przez 1 minutę, trzymając je pionowo z najwyższą prędkością, aby dobrze wymieszać MCBM i komórki.</li>
	<li>Dodać badane związki (OT48 samodzielnie lub w połączeniu z A1210477). Przygotować oddzielną probówkę jako kontrolę dla użytego rozpuszczalnika (tutaj dimetylosulfotlenek (DMSO)). W zależności od stężenia związków i objętości dodanej dla każdego warunku, kontrola rozpuszczalnika będzie obejmować najwyższe stężenie rozpuszczalnika użyte do rozcieńczenia badanego związku, w celu oceny niekorzystnych skutków spowodowanych przez rozpuszczalnik.</li>
	<li>Wiruj rurki przez 1 minutę.</li>
	<li>Do każdego testu dodać 1 ml mieszaniny za pomocą mikropipety P1000 do środkowej studzienki 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej.</li>
	<li>Napełnij puste studzienki 1 ml sterylnej wody lub 1x PBS, aby ustabilizować wilgotność.</li>
	<li>Inkubować płytki hodowlane przez 10 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Po 10 dniach inkubacji dodać 200 μl roztworu podstawowego bromku MTT (metylotiazolyldiphenyl-tetrazolium) (5 mg/ml) do każdego dołka, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 mg/ml.</li>
	<li>Inkubować przez 10 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Żywotne kolonie zmienią kolor na fioletowy.</li>
	<li>Uchwyć obraz za pomocą aparatu cyfrowego, korzystając z białej płytki tła (taca o białej średnicy LAS). Użyj następujących ustawień: Metoda, digitalizacja; Rodzaj ekspozycji, precyzja; Czas naświetlania, ręczny, 1 sekunda; Czułość/rozdzielczość, wysoka rozdzielczość. Zapisz obraz w formacie tiff.</li>
	<li>Określ ilościowo żywotne kolonie za pomocą oprogramowania ImageJ. Wybierz menu "Obraz | Rodzaj | 8 bitów". Wybierz menu "Dostosuj | Próg". Ustaw próg do kontroli i utrzymuj stały dla wszystkich warunków; Wybierz menu "Analizuj | Analizuj cząstki". Zapisuj dane i analizuj je za pomocą oprogramowania statystycznego do graficznej reprezentacji.</li>
</ol>
2. Test tworzenia sferoidów
<ol>
	<li>Hodowla komórek A549 w stężeniu 20 000 komórek/cm,2 w kolbach o długości 75cm2 z 15 ml pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS i 1% antybiotykami.</li>
	<li>W dniu eksperymentu przygotuj 96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery U.</li>
	<li>Umieść 10 000 komórek w studzince, która zawiera już interesujący nas związek (tutaj 50 μM OT48 i/lub 20 μM A1210477). Dostosować końcową objętość do 100 μl pożywki do hodowli komórkowych. Liczba komórek, które tworzą jednolite sferoidy z nienaruszoną granicą zewnętrzną, jest uważana za odpowiednią do tworzenia sferoid.</li>
	<li>Inkubować przez 3 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 .</li>
	<li>Po 3 dniach inkubacji uchwyć obrazy sferoid za pomocą mikroskopu świetlnego z 4-krotnym powiększeniem.</li>
</ol>
3. Test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego
UWAGA: To techniczne podejście jest wizualizowane jako schemat (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
<ol>
	<li>Przygotowanie odczynników podstawowych
	<ol>
		<li>Przygotuj 1 l 30x roztworu Danieau: 1740 mM NaCl, 21 mM KCl, 12 mM MgSO4∙7H2O, 18 mM Ca(NO3)2 i 150 mM HEPES. Dostosować pH buforu do 7,6 za pomocą pH-metru.</li>
		<li>Przygotować 1% (50x) roztwór trykainy: Rozpuść 20 mg metanosulfonianu etylu 3-aminobenzoesanu (trikainy) w 2 ml wody destylowanej.</li>
		<li>Przygotować 1% roztwór fenolu Red-PBS: Dodać 2 μl roztworu soli sodowej czerwieni fenolowej do 198 μl wysterylizowanego roztworu PBS w probówce o pojemności 1,5 μl.</li>
		<li>Przygotuj 3% metylocelulozy: Dodaj 3 g metylocelulozy do 100 ml 1x roztworu Danieau.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Produkcja i inkubacja ikry danio pręgowanego
	<ol>
		<li>Oddziel jedną samicę i jednego samca danio pręgowanego w zbiorniku wypełnionym sterylizowaną promieniami UV i przefiltrowaną wodą z kranu o temperaturze 28,5 °C w ciemności. Po 24 godzinach separacji wymieszaj ryby obu płci, aby rozpocząć krycie. Przenieść zapłodnione jaja ze zbiornika krycia na szalkę Petriego zawierającą 5 ml świeżego roztworu Danieau.</li>
		<li>Umyj jajka trzy razy 5 ml roztworu Danieau. Do umycia ostrożnie odessać jaja pipetą i przenieść do 5 ml świeżego roztworu. Inkubować przez 8 godzin w temperaturze 28,5 °C.
		<ol>
			<li>Po 8 godzinach inkubacji w roztworze Danieau zmienić roztwór na Danieau zawierający 0,03% 1-fenylo-2-tiomocznika (PTU) w celu zahamowania pigmentacji. Sortuj nieprzezroczyste jaja (niezapłodnione lub zawierające nierozwinięte zarodki), aby zapobiec zakażeniu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dechorionacja zarodka
	<ol>
		<li>24 godziny po zapłodnieniu (HPF) Dechorionate zarodki danio pręgowanego za pomocą ostrych kleszczy. Inkubować wylęgające się zarodki w roztworze Danieau z 0,03% PTU w temperaturze 28,5 °C do 48 hpf.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komórek poddanych działaniu związków chemicznych
	<ol>
		<li>Nasiona komórek A549 w ilości 20 000 komórek/cm,2 w 25 cm, kolby hodowlane. Po 24 godzinach od wysiewu dodawać związki (w tym przypadku OT48 w temperaturze 50 μM i/lub A1210477 w temperaturze 20 μM) przez 24 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Ustal czas leczenia dla każdego związku, aby utrzymać żywotność komórek, ale zaangażować je w śmierć komórki. Ten punkt czasowy musi być indywidualnie ustalony na podstawie żywotności komórki, morfologii i markerów molekularnych.</li>
		<li>Na 2 godziny przed zakończeniem zabiegu wybarwić komórki 4 μM barwnika fluorescencyjnego CM-Dil w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Po 2 godzinach inkubacji trypsynizować komórki 0,05% trypsyną-EDTA, a przed wstrzyknięciem rozcieńczyć10-6 komórek w 50 μl roztworu fenolu Red-PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikroiniekcja komórek nowotworowych w celu wytworzenia ksenoprzeszczepu
	<ol>
		<li>Znieczulenie danio pręgowanego w 0,02% roztworze tricainy przez 5 minut, aż osiądą na płytce agarowej.</li>
		<li>Pociągnij szklaną kapilarnę o średnicy zewnętrznej 1,0 mm (OD)) za pomocą ściągacza do mikropipet (Ustawienia programu: P: 300, Ciepło: 260, Ciągnięcie: 60, VEL: 50 i Czas: 200). Przeciąć mikrokapilę strzykawką, aby uzyskać ostrą krawędź. Załaduj mikrokapilary 20 μl roztworu komórki/fenolu Red-PBS. Ustawić ciśnienie i czas wtrysku, aby dozować 2 nL na wstrzyknięcie.</li>
		<li>Wstrzyknąć 100–200 komórek do woreczka żółtkowego, wstrzykując od 6 do 10 nL w 3 do 5 wstrzyknięciach. Po wstrzyknięciu należy pozostawić ryby do regeneracji przez 10 do 30 minut w 5 ml świeżego roztworu Danieau zawierającego roztwór PTU. Ryby należy wysłać na 24-dołkowe płytki z 1 ml roztworu Danieau zawierającego roztwór PTU i inkubować przez 72 godziny w temperaturze 28,5 °C.</li>
		<li>Po 72 godzinach inkubacji znieczulić ryby w 0,02% roztworze tricainy i unieruchomić na szkiełku z kroplą 3% metylocelulozy. Wykonaj 5-krotne zdjęcia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o długości fali od 620 do 750 nm.</li>
		<li>Określ ilościowo rozmiar guzów fluorescencyjnych za pomocą oprogramowania ImageJ. Wybierz menu "Analizuj | Środek". Zapisz wartości odpowiadające sygnałowi fluorescencyjnemu i analizuj je za pomocą oprogramowania statystycznego do graficznej reprezentacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulation+of+cell+signaling+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Deregulation of cell signaling in cancer.</a> FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).</li>
<li>Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bioprinting for cancer research.</a> Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).</li>
<li>Santo, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+3D+in+vitro+tumor+models%3A+overcoming+current+pitfalls+of+efficacy+read-outs%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs.</a> Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).</li>
<li>Tanner, K., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+3D+culture+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Beyond 3D culture models of cancer.</a> Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289(2015).</li>
<li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture%3A+a+review+of+current+approaches+and+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).</li>
<li>Talhi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis%284-hydroxy-2H-chromen-2-one%29%3A+synthesis+and+effects+on+leukemic+cell+lines+proliferation+and+NF-kappaB+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).</li>
<li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17406473">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li>
<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Tumor+Models%3A+Advantages%2C+Disadvantages%2C+Variables%2C+and+Selecting+the+Right+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytostatic+hydroxycoumarin+OT52+induces+ER%2FGolgi+stress+and+STAT3+inhibition+triggering+non-canonical+cell+death+and+synergy+with+BH3+mimetics+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer.</a> Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+to+the+soft-agar+assay+that+permits+high-throughput+drug+and+genetic+screens+for+cellular+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).</li>
<li>Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Cell+Cycle+Imaging+in+a+3D+Cell+Culture+Model+of+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).</li>
<li>Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging-+and+Flow+Cytometry-based+Analysis+of+Cell+Position+and+the+Cell+Cycle+in+3D+Melanoma+Spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53486(2015).</li>
<li>Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+cell+culture+techniques+for+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery.</a> Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).</li>
<li>Ji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dialkyl+resorcinol+stemphol+disrupts+calcium+homeostasis+to+trigger+programmed+immunogenic+necrosis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer.</a> Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tempo tworzenia kolonii uzyskane za pomocą MCBM zależy od typu komórki. Zwykle w przypadku komórek nieprzylegających liczba kolonii jest znacznie wyższa w porównaniu z komórkami przylegającymi. Zaobserwowaliśmy, że komórki A549 utworzyły od 30 do 40 kolonii po 10 dniach. Wcześniej informowaliśmy, że dla różnych komórek białaczkowych liczba kolonii wynosi od 200 do 2509. Nasze wyniki wykazały, że sam OT48 nie spowodował znaczącego zmniejszenia liczby samych kolonii. Jednak w połączeniu z mimetyczny...

Rak jest spowodowany mutacjami komórkowymi i w konsekwencji biochemiczne szlaki sygnałowe są zakłócone, co powoduje niekontrolowane podziały komórek i odporność na śmierć komórki. Guzy zaburzają fizjologiczne funkcje układu pokarmowego, nerwowego, krążenia, a następnie sąsiednich tkanek1. Pomimo szeroko zakrojonych wysiłków badawczych, rak pozostaje najbardziej rozpowszechnioną chorobą zagrażającą życiu na świecie2. Medycyna precyzyjna została uznana za podstawę przyszłych terapii nowotworowych. Nowe jednostki molekularne są rutynowo testowane w połączeniu z istniejącymi lekami w celu poprawy wyników klinicznych.
Jednak jednym z istotnych ograniczeń związanych z rozwojem nowych, skutecznych terapii celowanych, jest brak powszechnie stosowanych testów symulujących dokładny biologiczny wynik ekspozycji na lek3. Odkrywanie leków przeciwnowotworowych nadal opiera się głównie na testowaniu skuteczności środków terapeutycznych w liniach komórek nowotworowych hodowanych w hodowlach jednowarstwowych 2D, które są trudne do walidacji w badaniach klinicznych4. W związku z tym rośnie zainteresowanie opracowywaniem lepszych modeli nowotworów, które lepiej naśladują rodzime cechy nowotworów in vivo5. W ostatnich latach rosnące zainteresowanie modelami hodowli 3D zaowocowało opracowaniem ulepszonych metodologii tworzenia modeli 3D nowotworów5.
Tutaj prezentujemy podejście z trzema różnymi technikami hodowli komórkowych 3D, które pozwalają lepiej zrozumieć moc hydroksykumaryny OT486 w połączeniu z mimetykami BH3 przed bardziej szczegółowymi testami in vivo. Nasza metoda polega na połączeniu kolonii i SFA z testem tworzenia guza in vivo opartym na modelu danio pręgowanego w celu dalszej walidacji skuteczności połączenia mimetyki OT48 i BH3 w komórkach raka płuc i monitorowania progresji raka w żywym organizmie.
Testy tworzenia kolonii są rutynowo używane do oceny skuteczności środków przeciwnowotworowych zarówno w przypadku raka stałego, jak i krwiotwórczego. Test określa zdolność komórki do namnażania się w nieskończoność i tworzenia kolonii7. Wpływ środka przeciwnowotworowego na zdolność komórek do tworzenia kolonii zależy od zmniejszenia liczby i/lub wielkości kolonii.
Sferoidy reprezentują modele nowotworów in vitro i służą jako tania platforma przesiewowa dla środków przeciwnowotworowych. Sferoidy to agregaty komórek rosnących w zawiesinie lub osadzonych w matrycy 3D. Podejście to jest szeroko stosowane do badań przesiewowych leków i badań wzrostu, proliferacji i interakcji immunologicznej guza8.
Aby w pełni zrozumieć właściwości nowego leku, konieczne jest przeprowadzenie eksperymentów in vivo na gryzoniach. Jednak ta konwencjonalna metoda jest kosztowna i czasochłonna. W ostatnich latach danio pręgowany (Danio rerio) stał się szeroko badanym organizmem laboratoryjnym, który jest tańszy i szybszy w hodowli. Guzy rozwinięte u danio pręgowanego reprezentują podejście do hodowli komórkowej 3D, ale w warunkach in vivo kręgowców9.
Razem, używamy tutaj trzech różnych podejść do hodowli 3D, w tym CFA, SFA i formowania nowotworów in vivo danio pręgowanego, aby zademonstrować zdolność przeciwnowotworową hydroksykumaryny OT48 w modelu komórkowym A549 raka płuc w połączeniu z mimetykami BH3.

<table><tbody><tr><td>Materiały wymagane do testów tworzenia kolonii</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Lonza</td><td>17-602E-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS roztwór</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>1,5 ml probówka</td><td>Extragene</td><td>Tube-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>15 ml probówka</td><td>Hyundai Micro</td><td>H20015</td><td>RT</td></tr><tr><td>12 dołków</td><td>SPL</td><td>30012</td><td>RT</td></tr><tr><td>MethoCult</td><td>StemCell technologies</td><td>4230-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Bromek tetrazolowy błękitu tiazolilowego (proszek MTT)</td><td>Sigma</td><td>M5622</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>LAS4000</td><td>GE Healthcare Technologies</td><td></td><td>RT</td></tr><<tr><td>strong>Materiały wymagane do badania tworzenia sferoidów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Lonza</td><td>17-602E-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS roztwór</td><td>Hyclon</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>Corning costar ultra low attachemnt 96-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>3474</td><td>RT</td></tr><tr><td>Microscopy</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>RT</td></tr><<tr><td>strong>Materiały wymagane do ksenoprzeszczepów danio pręgowanego</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Lonza</td><td>17-602E-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych T25</td><td>SPL</td><td>70025</td><td>RT</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych T175</td><td>SPL</td><td>71175</td><td>RT</td></tr><tr><td>Probówka 1,5 ml</td><td>Probówka Extragen-170-C</td><td>RT</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td>SPL</td><td>30024</td><td>RT</td></tr><tr><td>Petridish</td><td>SPL</td><td>10100</td><td>RT</td></tr><tr><td>Roztwór PBS</td><td>Hyclon</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71382</td><td>RT</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>RT</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td>RT</td></tr><tr><td>Czterowodny azotan wapnia (Ca(NO3)2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td>RT</td></tr><tr><td>Roztwór HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>RT</td></tr><tr><td>3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian (Trikaina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>RT</td></tr><tr><td>Roztwór czerwieni fenolowej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>RT</td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td>RT</td></tr><tr><td>1-fenylo-2-tiomocznik (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>RT</td></tr><tr><td>CM-Dil barwnik</td><td>Invitrogen</td><td>C7001-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Szklana kapilara</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW 100F-4</td><td>RT</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Przyrząd do migawki, USA</td><td>P-97</td><td>RT</td></tr><tr><td>Mikro wtryskiwacz</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td>RT</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>KOVAX</td><td>1ml</td><td>RT</td></tr><tr><td>Mikroładowarka</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>RT</td></tr><tr><td>Szkiełko szklane</td><td>Marienfeld</td><td>HSU-1000612</td><td>RT</td></tr><tr><td>Mikroskopia fluorescencyjna</td><td>Leica</td><td>DE/DM 5000B</td><td>RT</td></tr></tbody></table>

przedkliniczna ocena bioaktywności przeciwnowotworowej kumaryny ot48 za pomocą sferoid, testów tworzenia kolonii i ksenoprzeszczepów danio pręgowanego

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Przedkliniczne badania in vitro i in vivo nowych środków terapeutycznych są niezbędnym narzędziem w odkrywaniu leków na raka. Chociaż ludzkie linie komórkowe nowotworów reagują na związki terapeutyczne w jednowarstwowych hodowlach komórkowych 2D (wymiarowych), systemy hodowli 3D zostały opracowane, aby zrozumieć skuteczność leków w bardziej fizjologicznie istotnych modelach. W ostatnich latach zaobserwowano zmianę paradygmatu w badaniach przedklinicznych w celu walidacji siły działania nowych cząsteczek w systemach hodowli 3D, dokładniej naśladujących mikrośrodowisko guza. Systemy te charakteryzują stan chorobowy w sposób bardziej fizjologicznie istotny i pomagają uzyskać lepszy mechanistyczny wgląd i zrozumienie farmakologicznej siły działania danej cząsteczki. Co więcej, przy obecnym trendzie ulepszania modeli nowotworów in vivo, danio pręgowany stał się ważnym modelem kręgowców do oceny powstawania nowotworów in vivo i badania wpływu środków terapeutycznych. Tutaj zbadaliśmy skuteczność terapeutyczną hydroksykumaryny OT48 w monoterapii lub w połączeniu z mimetykami BH3 w linii komórkowej raka płuc A549, stosując trzy różne systemy hodowli 3D, w tym testy tworzenia kolonii (CFA), testy tworzenia sferoidów (SFA) i ksenoprzeszczepy danio pręgowanego in vivo.

Na Ryc. 2 przedstawiono linię komórkową raka płuca A549 wysianą w MCBM w celu utworzenia kolonii po traktowaniu samym OT48 lub w połączeniu z mimetykiem BH3 A1210477 w zaznaczonych stężeniach. Wyniki wykazały, że terapia skojarzona znacząco zredukowała liczbę, wielkość oraz całkowitą powierzchnię kolonii po 10 dniach inkubacji.
Na Ryc. 3 komórki A549 traktowano samym OT...

Tutaj prezentujemy przedkliniczne badania przesiewowe przeciwnowotworowych kumaryn z wykorzystaniem hodowli 3D i danio pręgowanego.

Przedkliniczna ocena bioaktywności przeciwnowotworowej kumaryny OT48 za pomocą sferoid, testów tworzenia kolonii i ksenoprzeszczepów danio pręgowanego

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie odkrywania leków w celu zidentyfikowania działania przeciwnowotworowego i uzyskania lepszego mechanistycznego wglądu w nowe cząsteczki przy użyciu systemów hodowli 3D in vitro i in vivo. Główną zaletą tej techniki jest różnorodność działania farmakologicznego związków w bardziej fizjologicznie istotnym modelu in vivo. Na początek umieść 20 000 komórek A549 na centymetr kwadratowy w 15 mililitrach pożywki do hodowli komórkowych RPMI 1640, uzupełnionej 10% FBS i 1% antybiotykami, w kolbie o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych.Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. W dniu eksperymentu użyj hemocytometru, aby określić stężenie komórek. Zbierz 50 000 komórek w 1,5 mililitrowej probówce mikrowirówkowej przez wirowanie przy 400 g przez siedem minut i ponownie zawieś komórki w 100 mikrolitrach sterylnego 1x PBS.Za pomocą wielopipety dozuj 1,1 mililitra półstałego podłoża na bazie metylocelulozy lub MCBM do probówek, przygotowując po jednej probówce na każdy stan. Następnie dodaj 110 mikrolitrów FBS do każdej probówki. Następnie zaoszczędź 1000 komórek na mililitr.Następnie odpipetować 2,4 mikrolitra roztworu ogniw podstawowych do probówek MCBM i FBS. Po dodaniu komórek trzymaj probówki pionowo i wiruj je z najwyższą prędkością przez jedną minutę, aby dokładnie wymieszać MCBM i komórki. Teraz dodaj do próbek badany związek OT48 sam lub w połączeniu z A1210477.Przygotować oddzielną probówkę jako kontrolę dla użytego rozpuszczalnika, takiego jak DMSO. Następnie wiruj próbki przez jedną minutę. Do każdego testu odpipetować jeden mililitr mieszaniny do środkowej studzienki 12-dołkowej płytki do hodowli komórek.Następnie użyj jednego mililitra sterylnej wody lub PBS, aby napełnić puste studzienki. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez 10 dni. Następnie dodaj 200 mikrolitrów pięciomiligramowego roztworu podstawowego MTT na mililitr do każdej studzienki.Po inkubacji płytek przez dziesięć minut sprawdź, czy nie ma żywotnych kolonii, które zmienią kolor na fioletowy. Korzystając z białej płyty tła, uchwyć obrazy przy użyciu następujących ustawień:Jako metodę wybierz digitalizację. W polu Typ ekspozycji wybierz precyzję.Jako czas ekspozycji wybierz ręczny i jedną sekundę. W przypadku czułości i rozdzielczości wybierz wysoką rozdzielczość. Następnie zapisz przechwycone obrazy w formacie TIFF.Za pomocą oprogramowania ImageJ określ ilościowo żywotne kolonie, wybierając obraz menu, typ, 8-bitowy. Wybierz menu regulacji i próg. Ustaw próg, który ma być kontrolowany i utrzymuj go na stałym poziomie we wszystkich warunkach.Następnie wybierz menu analizuj, analizuj cząsteczki. Zapisz dane i przeanalizuj je za pomocą oprogramowania statystycznego do graficznej reprezentacji. Po przygotowaniu odczynników podstawowych zgodnie z protokołem tekstowym, oddziel jedną samicę i jednego samca danio pręgowanego w zbiorniku wypełnionym sterylizowaną promieniami UV i przefiltrowaną wodą z kranu o temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza i umieść je w ciemności.Po 24 godzinach od separacji usuń przegrodę, aby rozpocząć krycie. Przenieś zapłodnione jaja ze zbiornika krycia na szalkę Petriego zawierającą pięć mililitrów świeżego roztworu Danios. Użyj pięciu mililitrów roztworu Danios, aby umyć jaja trzy razy za pomocą pipety, aby ostrożnie zassać jaja i przenieść je do pięciu mililitrów świeżego roztworu.Następnie wysiaduj jaja w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza przez osiem godzin. Zmień na roztwór Danios zawierający 0,03% PTU, aby zahamować pigmentację i oddzielić nieprzezroczyste niezapłodnione jaja, aby zapobiec zanieczyszczeniu. 24 godziny po zapłodnieniu użyj ostrych kleszczy, aby usunąć zarodki.Następnie inkubować zarodki w roztworze Danios z PTU do 48 godzin po zapłodnieniu. Po wysianiu komórek A549 i inkubacji ich ze związkami zgodnie z protokołem tekstowym, na 24 godziny przed końcem zabiegu, dodać cztery mikromole barwnika śledzącego komórki fluorescencyjne, CM-Dil, w celu wybarwienia komórek i inkubować je przez dwie godziny. Po inkubacji użyj 0,05% trypsyny-EDTA do trypsynizacji komórek.Następnie przed wstrzyknięciem rozcieńczyć od dziesięciu do szóstych komórek w 50 mikrolitrach roztworu PBS czerwieni fenolowej. Aby przeprowadzić mikroiniekcję komórek rakowych, pociągnij szklaną kapilę o średnicy 1,0 milimetra, korzystając z następujących ustawień programu:Użyj strzykawki, aby przeciąć kapilarę, aby uzyskać ostrą krawędź. Następnie załaduj mikrokapilę 20 mikrolitrami roztworu czerwieni fenolowej komórki.Po znieczuleniu danio pręgowanego zgodnie z protokołem tekstowym wstrzyknij od 100 do 200 komórek do worka z żółtkiem, wstrzykując od sześciu do dziesięciu nanolitrów za pomocą trzech do pięciu wstrzyknięć. Mikroiniekcje powinny być wykonywane bardzo ostrożnie i precyzyjnie, aby zapewnić wstrzyknięcie odpowiedniej objętości komórek, a obrażenia spowodowane wstrzyknięciem były minimalne, a ciśnienie dwutlenku węgla powinno być optymalne, aby uniknąć szczeliny bocznej. Po wstrzyknięciu należy pozostawić rybę do odzyskania sił przez dziesięć do 30 minut w pięciu mililitrach świeżego roztworu Danios zawierającego PTU.Przenieś ryby do 24-dołkowych płytek z jednym mililitrem roztworu Danios PTU i inkubuj je w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza przez 72 godziny. Po inkubacji, po znieczuleniu ryb zgodnie z protokołem tekstowym, unieruchamić je na szkiełku podstawowym z kroplą 3% metylocelulozy. Wykonaj 5-krotne obrazy fluorescencyjne o długości fali od 620 do 750 nanometrów.Użyj oprogramowania ImageJ, aby określić ilościowo wielkość guzów fluorescencyjnych, wybierając opcję analizy i pomiaru. Następnie zapisz wartości fluorescencji i przeanalizuj je za pomocą oprogramowania statystycznego do graficznej reprezentacji. W tym eksperymencie linia komórkowa raka płuc A549 została wysiana w MCBM w celu utworzenia kolonii po leczeniu samym OT48 lub w połączeniu z mimetykiem BH3, A1210477, w stężeniu widzianym tutaj.Wyniki pokazały, że kombinacja znacznie zmniejszyła liczbę, rozmiar i całkowitą powierzchnię kolonii po dziesięciu dniach inkubacji. Tutaj, po leczeniu samym OT48 lub w połączeniu z mimetykiem BH3, A1210477, komórkom pozwolono na tworzenie sferoid przy użyciu techniki płytki U-bottom. Po trzydniowej inkubacji sferoidy zostały zobrazowane i określone ilościowo, a następnie wygenerowano obrazy 3D.Rysunek ten ilustruje potencjał hamujący OT48 i / lub A1210477 w tworzeniu guza na podstawie kwantyfikacji guzów fluorescencyjnych powstałych po wstrzyknięciu leczonych komórek do worka z żółtkiem danio pręgowanego. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby liczba ryb dla każdego warunku wynosiła około dziesięciu lub więcej, aby uniknąć istotnych zmian wpływających na statystyczną ocenę danych. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza histologiczna, w celu oceny ekspresji białka docelowego w ksenoprzeszczepie danio pręgowanego.Technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się odkrywaniem leków do zbadania skuteczności związków w mikrośrodowisku in vivo w ksenoprzeszczepie danio pręgowanego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zweryfikować skuteczność leku w środowisku hodowli 3D.

preclinical-assessment-bioactivity-anticancer-coumarin-ot48-spheroids

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje technikę tworzenia modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta z danio pręgowanego. W protokole próbki oceniamy skuteczność leków Gemcytabina i Navitoclax na modelu ksenoprzeszczepu guza trzustki.

Ksenoprzeszczep danio pręgowanego od pacjenta (zPDX): model raka

Ten film opisuje test tworzenia kolonii, który pomaga określić zdolność komórek raka płuc do rozmnażania się w nieskończoność i tworzenia indywidualnych kolonii. Możemy przeanalizować wpływ środka przeciwnowotworowego na komórki tworzące kolonie, analizując zmiany w liczbie i/lub wielkości powstałych kolonii.

Test tworzenia kolonii: ocena skuteczności środków przeciwnowotworowych na komórkach raka płuc tworzących kolonie

Ten film opisuje test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego w celu oceny powstawania nowotworów in vivo i zbadania efektu środków terapeutycznych.

Test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego: metoda oceny skuteczności przeciwnowotworowej leków na rakotwórczość u danio pręgowanego in vivo

Ten film opisuje metodę badań przesiewowych genów modyfikujących czerniaka za pomocą transgenicznego modelu guza danio pręgowanego. Po wstrzyknięciu indukującego czerniaka wektora miniCoopR danio pręgowany rozwija czerniaka i dlatego może być wykorzystany do badania czynników genetycznych wpływających na rozwój guza u danio pręgowanego.

Transgeneza wektorowa miniCoopR: technika badań przesiewowych genów indukujących czerniaka w modelu guza danio pręgowanego

Przedstawiono szybki sposób na badanie modyfikatorów czerniaka za pomocą autochtonicznego modelu guza danio pręgowanego. Wykorzystuje wektor miniCoopR, który pozwala na ekspresję genów kandydujących na czerniaka w melanocytach. Opisano metodę uzyskiwania krzywych przeżycia wolnych od czerniaka, test inwazji, protokół barwienia przeciwciałami melanocytów łuskowych oraz test przeszczepiania czerniaka.

Badania przesiewowe w kierunku modyfikatorów czerniaka przy użyciu autochtonicznego modelu guza danio pręgowanego

Ta metoda wykorzystuje embriony danio pręgowanego do skutecznego testowania inwazyjnej zdolności komórek rakowych do naczyń krwionośnych. Fluorescencyjne komórki rakowe są wstrzykiwane do zatoki przedsercowej lub woreczka żółtkowego rozwijających się zarodków. Inwazję naczyniową i wynaczynienie komórek rakowych ocenia się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej obszaru ogonowego od 24 do 96 godzin później.

Badanie inwazyjnej zdolności naczyniowej komórek nowotworowych u danio pręgowanego (Danio rerio)

Modele ksenoprzeszczepów danio pręgowanego pozwalają na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków i obrazowanie fluorescencyjne ludzkich komórek nowotworowych w mikrośrodowisku in vivo. Opracowaliśmy przepływ pracy do zautomatyzowanych badań przesiewowych leków na dużą skalę na próbkach białaczki pobranych od pacjentów u danio pręgowanego przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia do obrazowania wyposażonego w mikroskop fluorescencyjny.

Badania przesiewowe leków w ksenoprzeszczepach nowotworowych pochodzących od pacjenta pręgowanego

Tutaj udostępniamy protokół krok po kroku, z poradami dotyczącymi generowania ksenoprzeszczepów i wytycznymi do analizy zachowania guza, immunofluorescencji całego montażu i kwantyfikacji obrazowania konfokalnego.

Generowanie ksenoprzeszczepów larw danio pręgowanego i analiza zachowania guza

Modele przedkliniczne mają na celu poszerzenie wiedzy na temat biologii nowotworów i przewidywanie skuteczności leczenia. W artykule opisano wytwarzanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (zPDX) na podstawie danio pręgowanego z fragmentami tkanki nowotworowej. ZPDX leczono chemioterapią, której efekt terapeutyczny oceniano pod kątem apoptozy komórek przeszczepionej tkanki.

Opracowanie ksenoprzeszczepów raka trzustki od pacjentów danio pręgowanego do testów wrażliwości na chemoterapię

Obecny protokół opisuje generowanie modeli hodowli 3D guzów z pierwotnych komórek nowotworowych i ocenę ich wrażliwości na leki za pomocą testów żywotności komórek i badań mikroskopowych.

Ustalanie trójwymiarowych sferoid na podstawie próbek guza pochodzących od pacjentów i ocena ich wrażliwości na leki

Ten protokół opisuje procedurę badania przesiewowego leków u larw danio pręgowanego 3-7 dni po zapłodnieniu, po której następuje ocena morfologiczna.

Badania przesiewowe małych cząsteczek i badania toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju

Poznaj metodę oceny przeciwnowotworowej aktywności kumaryn w modelach 3D i ksenoprzeszczepach danio pręgowanego. Technika ta pozwala badać skuteczność leków w fizjologicznie trafnym środowisku in vivo.

Przedkliniczna ocena bioaktywności przeciwnowotworowej kumaryny OT48 za pomocą sferoid, testów tworzenia kolonii i ksenoprzeszczepów danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal

Przedkliniczna ocena bioaktywności przeciwnowotworowej kumaryny OT48 za pomocą sferoid, testów tworzenia kolonii i ksenoprzeszczepów danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów