Name: Przełącznik pojedynczego genu oparty na receptorze ekdyzonu do celowej ekspresji transgenu z solidnością, odwracalnością i znikomą nieszczelnością (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Poznaj metodę modulacji ekspresji transgenu za pomocą przełącznika genowego pEUI(+) i induktora chemicznego tebufenozyd w komórkach HEK 293. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę czasu i siły ekspresji genu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują S-Y Choi (Chonnam National University) za cenne uwagi i dokładne zapoznanie się z naszym manuskryptem. Prace te były wspierane przez fundusz badawczy Uniwersytetu Narodowego Chungnam.

1. Subklonowanie transgenu
<ol>
	<li>Wybierz odpowiednie miejsce (lub miejsca) rozpoznawania enzymu restrykcyjnego w MCS pEUI(+) i sklonuj interesujący nas gen w pożądanym kierunku (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: Transgen powtórzeń ankryny 13A (ANKRD13A) znakowany epitopem EGFP lub FLAG został subklonowany w miejscu EcoRI wektora pEUI(+) przy użyciu polimerazy DNA T4 w metodzie klonowania niezależnej od sekwencji i ligacji19.</li>
	<li>Linearyzować pEUI(+) za pomocą EcoRI przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Wymieszać 50 ng/μl zlinearyzowanego pEUI(+) z 40 ng/μl EGFP lub ANKRD13A amplifikowanego PCR i reagować z polimerazą DNA T4 (1 U) przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT) przed inkubacją na lodzie przez 10 minut. Dodać 10 μl mieszaniny reakcyjnej bezpośrednio do 100 μl komórek kompetentnych DH10B do następującego eksperymentu transformacji. 
UWAGA: Chociaż do MCS pEUI(+) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B) dodano kilka miejsc rozpoznawania enzymów restrykcyjnych, zalecamy subklonowanie docelowego genu do miejsca EcoRI, przy użyciu technologii klonowania niezależnego od ligacji19,20.</li>
	<li>Zweryfikuj wstawkę przez sekwencjonowanie, a następnie oczyść DNA za pomocą zestawu do oczyszczania DNA, który nadaje się do transfekcji.</li>
</ol>
2. Transfekcja przejściowa i leczenie Teb
<ol>
	<li>Przygotuj cztery szalki do hodowli komórkowych (średnica 60 mm) zawierające świeżo pasażowane komórki HEK293 w 5 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 5-10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i antybiotykami (100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny). Dalej "pożywka do hodowli komórkowych" lub po prostu "pożywka hodowlana" reprezentuje DMEM uzupełniony FBS i antybiotykami. Utrzymuj komórki HEK293 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Transfekcja 1 μg oczyszczonego DNA do komórek HEK293 o gęstości 50 - 60% przy użyciu 3 μl odczynnika do transfekcji. Dodać odczynnik do transfekcji do 200 μl rozcieńczalnika (DMEM bez FBS i antybiotyków) zawierającego DNA. Po inkubacji mieszaniny reakcyjnej przez 30 minut w temperaturze pokojowej należy dodać mieszaninę do komórek HEK-293 na szalce hodowlanej. Do transfekcji należy użyć dwóch szalek, a pozostałe dwie pozostawić nietraktowane jako kontrole.</li>
	<li>Po 12 - 24 godzinach transfekcji dodać Teb (stężenia końcowe, 0,2 - 10 μmol) do jednej z transfekowanych próbek i do jednej z nietransfekowanych próbek. Pozostałe dwie próbki należy pozostawić niepoddane działaniu kontroli doświadczalnej. 
	UWAGA: Roztwór podstawowy Teb (50 mM rozpuszczony w dimetylosulfotlenku) można rozcieńczyć w pożywce do hodowli komórkowych, DMEM lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w odpowiednim stężeniu przed dodaniem do hodowanych komórek, w zależności od parametrów doświadczalnych. Jednak ze względu na niską rozpuszczalność Teb w roztworze wodnym należy unikać przygotowywania mieszanki wzorcowej o wysokim stężeniu Teb w podłożu; zamiast tego należy zastąpić kompletną pożywkę do hodowli komórkowych świeżą pożywką zawierającą Teb o pożądanym stężeniu.</li>
	<li>Hodować komórki poddane działaniu Teb i niepoddane działaniu Teb przez 12 - 48 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Jeśli używasz wkładki EGFP, przeanalizuj ekspresję EGFP pod mikroskopem fluorescencyjnym ( <silna klasa = "xfig">Rysunek 2). W przeciwnym razie zbierz komórki do testu immunoblottingowego.
	<ol>
		<li>W teście immunoblottingu należy dwukrotnie przepłukać komórki lodowatym PBS, a następnie zeskrobać je za pomocą skrobaka do komórek.</li>
		<li>W celu ułożenia komórek w stos należy odwirowywać zbiory w stożkowej probówce o pojemności 15 ml o stężeniu 21 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 18-25 °C (RT).</li>
		<li>Po całkowitym odrzuceniu PBS dodać 0,5 ml lodowatego odczynnika do ekstrakcji białek ssaków (M-PER) wraz z inhibitorem proteazy (5 μl 100-krotnego koktajlu inhibitorów proteazy) do osadu, jeśli komórki są hodowane w naczyniu o średnicy 60 mm.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki za pomocą kilku rund pipetowania, a następnie inkubować zawieszone komórki przez 15 minut w temperaturze 18-25 °C (RT).</li>
		<li>Wirować lizat komórkowy w temperaturze 21 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść wodny roztwór sklarowany nad osadem do świeżej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Analizuj supernatant za pomocą immunoblottingu, postępując zgodnie ze standardowymi protokołami z odpowiednimi przeciwciałami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Generacja stabilnych linii komórkowych HEK293 z genomiczną integracją przełącznika genu pEUI(+)
<ol>
	<li>Transfekcja 5 - 10 μg oczyszczonego pEUI(+) z transgenem do komórek HEK293, które są 50 - 60% zlewające się w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 90 mm, przy użyciu 15 - 30 μl odczynnika do transfekcji. Dodać odczynnik do transfekcji do 500 μl rozcieńczalnika (DMEM bez FBS i antybiotyków) zawierającego DNA. Po inkubacji mieszaniny reakcyjnej przez 30 minut w temperaturze pokojowej należy dodać mieszaninę do komórek HEK-293 na szalce hodowlanej.</li>
	<li>Po transfekcji pozwolić transfektantom na wzrost i ekspresję produktów genu oporności na puromycynę w nieselektywnej pożywce hodowlanej (bez puromycyny) przez 24-48 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Oddziel komórki od szalek hodowlanych przez trypsynizację. Po odrzuceniu pożywki hodowlanej przepłukać transfektanty wstępnie podgrzanym PBS (37 °C), dodać 1 ml 0,25% trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubować przez 1 minutę w temperaturze 37 °C. Po wygaszeniu trypsyny/EDTA przez dodanie wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej (10 ml, 37 °C), zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek, a następnie odwirować w stożkowej probówce o pojemności 15 ml przy 21 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 18-25°C.</li>
	<li>Zawiesić transfektanty w 50 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej (37 °C) i przenieść 10 ml komórek do 90 mm świeżych naczyń do hodowli komórkowych. Hodować komórki w temperaturze 37 °C do 50 - 60% zbiegu przed leczeniem puromycyną (zazwyczaj trwa to około 24 - 48 godzin).</li>
	<li>Hodować transfektanty w temperaturze 37 °C w pożywce do hodowli komórkowych uzupełnionej 3 μg/ml puromycyny przez 3-4 tygodnie. W okresie selekcji należy zmieniać pożywkę do hodowli komórkowych zawierającą puromycynę (3 μg/ml) co 2 - 3 dni, aby utrzymać ciśnienie selekcyjne. Gdy komórki staną się w pełni zlewne, podziel je zgodnie z procedurami opisanymi w krokach 3.3 - 3.4, za pomocą pożywki hodowlanej zawierającej puromycynę. Wyrzuć pozostałe komórki z pożywki hodowlanej, jeśli nie są potrzebne. 
	UWAGA: Warunki selekcji puromycyny muszą być ustalone eksperymentalnie dla określonych typów komórek. Użyliśmy 3 μg/ml puromycyny w pożywce do hodowli komórkowych; To wystarczyło, aby wywołać śmierć komórki w nietransfekowanym HEK293.</li>
	<li>Zbierz komórki z poszczególnych kolonii za pomocą cylindra do klonowania i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>Wyrzuć pożywkę do hodowli komórkowych. Przepłukać płytkę dwukrotnie wstępnie podgrzanym (37 °C) PBS w celu usunięcia pływających komórek.</li>
		<li>Za pomocą sterylnych kleszczy ustaw cylinder klonujący nad poszczególnymi koloniami.</li>
		<li>Dodaj 0,2 ml 0,35% trypsyny/EDTA do każdego cylindra.</li>
		<li>Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C przez 1 minutę, aż komórki się oderwą, a następnie dodać kilka kropli wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki hodowlanej do cylindrów.</li>
		<li>Przenieś komórki z każdego cylindra do indywidualnych studzienek 6-dołkowej płytki, z 2 ml pożywki hodowlanej i 1 μg/ml puromycyny w każdym dołku. 
		UWAGA: Gdy komórki zaczną się zlewać, zwiększ skalę hodowli. Teraz klon(y) mogą zostać ustanowione.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymuj pojedyncze klony w pożywce do hodowli komórkowych uzupełnionej 1 μg/ml puromycyny.</li>
	<li>Walidacja poszczególnych kolonii poprzez testowanie ich wrażliwości na traktowanie Teb (stężenie końcowe, 10 μM) przez 24 godziny. Przetestuj reakcję klonów na Teb, analizując poziom ekspresji transgenu za pomocą immunoblottingu. Wybierz żądany klon (lub klony). Próbkę poddaną działaniu Teb i próbkę niepoddaną działaniu teb hodować w pożywce przez 12–48 godzin w temperaturze 37 °C przed analizą poziomu indukcji transgenu. Poziom ekspresji transgenu można zmierzyć za pomocą immunoblottingu, postępując zgodnie z procedurami opisanymi w krokach 2.5.1 - 2.5.7.</li>
</ol>
4. Wyczerpanie Teb
<ol>
	<li>Ugasić bodźce Teb, zastępując pożywkę zawierającą Teb pożywką do hodowli komórkowych pożywką wolną od Teb. 
	UWAGA: Zaleca się wymianę pożywki wzrostowej bez uprzedniego ponownego wysiewu komórek na nową szalkę hodowlaną. Wydaje się, że resztki Teb przylegają do plastikowego naczynia i wywołują silną ekspresję transgenu w tle. Przed ponownym wysianiem komórek na nowej płytce hodowlanej, zebrane komórki należy kilkakrotnie przepłukać pożywką hodowlaną lub PBS.
	<ol>
		<li>Oddziel komórki od szalek hodowlanych przez trypsynizację. Po odrzuceniu pożywki zawierającej Teb, przepłukać komórki stymulowane Teb dwukrotnie wstępnie podgrzanym PBS (37 °C), dodać 1 ml 0,25% trypsyny/EDTA i inkubować przez 1 minutę w temperaturze 37 °C. Po schłodzeniu trypsyny/EDTA przez dodanie wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej wolnej od Teb (10 ml, 37 °C), zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek, a następnie odwirować w stożkowej probówce o pojemności 15 ml przy 21 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 18-25 °C.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 50 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej bez tełku (37 °C) i przenieść 5 ml komórek do trzech 60-milimetrowych świeżych szalek do hodowli komórkowych. Hodować komórki w temperaturze 37 °C odpowiednio przez 24, 48 i 72 godziny.</li>
		<li>Zbierz komórki w różnych punktach czasowych i zmierz poziom ekspresji transgenu za pomocą immunoblottingu. 
		UWAGA: W tych warunkach eksperymentalnych ekspresja transgenu stała się niewykrywalna około 3 dni po hodowli komórek w pożywce hodowlanej wolnej od Teb (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 3). Poziom ekspresji transgenu można zmierzyć za pomocą immunoblottingu, zgodnie z krokami 2.5.1 - 2.5.7.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Rossi, F. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+inducible+gene+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in inducible gene expression systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5), 451-456 (1998).</li>
<li>Clackson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+gene+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Regulated gene expression systems.</a> Gene Ther. 7 (2), 120-125 (2000).</li>
<li>Suzuki, Y., Suzuki, Y. Gene regulatable lentiviral system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSuzuki%2C+Y+%22Viral+Gene+Therapy%22">Viral Gene Therapy</a>. Xu, K. , InTech. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.intechopen.com/books/viralgene-therapy/gene-regulatable-lentiviral-vector-system">http://www.intechopen.com/books/viralgene-therapy/gene-regulatable-lentiviral-vector-system</a> 285-309 (2011).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li>
<li>Baron, U., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+repressor-based+system+for+regulated+gene+expression+in+eukaryotic+cells%3A+principles+and+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances.</a> Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).</li>
<li>Hentges, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP%2FmTOR+is+required+for+proliferation+and+patterning+during+embryonic+development+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 13796-13801 (2001).</li>
<li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+FKBP.rapamycin.FRB+ternary+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li>
<li>Seto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+and+mTOR%3A+a+serendipitous+discovery+and+implications+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer.</a> Clin Transl Med. 1 (1), 29(2012).</li>
<li>Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+uses+of+mifepristone+%28MFP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Clinical uses of mifepristone (MFP).</a> Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).</li>
<li>Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+properties+of+mifepristone%3A+toxicology+and+safety+in+animal+and+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Contraception%22%5BJournal%5D)">Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies.</a> Contraception. 68 (6), 409-420 (2003).</li>
<li>Yao, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+ecdysone+receptor+is+the+product+of+EcR+and+ultraspiracle+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes.</a> Nature. 366 (6454), 476-479 (1993).</li>
<li>Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecdysone+receptors+and+their+biological+actions%5BTitle%5D)+AND+%22Vitam+Horm%22%5BJournal%5D)">Ecdysone receptors and their biological actions.</a> Vitam Horm. 60 (2000), 1-73 (2000).</li>
<li>Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ligands+and+coligands+for+the+ecdysone-regulated+gene+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97 (26), 14512-14517 (2000).</li>
<li>Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+control+of+transgene+expression+with+ecdysone+receptor%3A+gene+switches+with+high+sensitivity+robust+expression%2C+and+reduced+size%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size.</a> Biotechniques. 39 (2), 191-200 (2005).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecdysone+receptor-based+singular+gene+switches+for+regulated+transgene+expression+in+cells+and+adult+rodent+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues.</a> Mol. Ther. Nucleic Acids. 5 (9), e367(2016).</li>
<li>Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+regulation+of+zebrafish+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Small-molecule regulation of zebrafish gene expression.</a> Nat Chem Biol. 3 (3), 154-155 (2007).</li>
<li>Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical-inducible%2C+ecdysone+receptor-based+gene+expression+system+for+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants.</a> Transgenic Res. 12 (1), 101-109 (2003).</li>
<li>Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dually+inducible+TetOn+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li>
<li>Jeong, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+sequence-+and+ligation-independent+cloning+as+a+rapid+and+versatile+cloning+method+for+functional+genomics+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (15), 5440-5443 (2012).</li>
<li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-fusion+assembly%3A+seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins%2C+modular+vectors%2C+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li>
<li>No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecdysone-inducible+gene+expression+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (8), 3346-3351 (1996).</li>
<li>Sawada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+insecticidal+activity+of+benzoheterocyclic+analogues+of+N%27-benzoyl-N-%28tert-butyl%29benzohydrazide%3A+Part+1.+Design+of+benzoheterocyclic+analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N'-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues.</a> Pest Manag Sci. 59 (1), 25-35 (2003).</li>
<li>Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excretion+and+metabolism+of+injected+ecdysone+in+the+white+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse.</a> Biochem Pharmacol. 37 (6), 1174-1177 (1988).</li>
<li>Carlson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+and+biological+properties+of+methoxyfenozide%2C+a+new+insecticidal+ecdysteroid+agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist.</a> Pest Manag Sci. 57 (2), 115-119 (2001).</li>
<li>McConnell, M. J., Imperiale, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+adenovirus+and+its+use+as+a+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 15 (11), 1022-1033 (2004).</li>
<li>Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+skin+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for skin diseases.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (4), a015149(2014).</li>
<li>Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Vectors+for+Gene+Therapy%3A+Translational+and+Clinical+Outlook%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook.</a> Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).</li>
<li>Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+gene+transfer+with+adenovirus+vector+via+the+spleen+safely+and+effectively+improves+posthepatectomized+conditions+in+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats.</a> J Surg Res. 110 (1), 228-234 (2003).</li>
<li>Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remission+of+diabetes+by+insulin+gene+therapy+using+a+hepatocyte-specific+and+glucose-responsive+synthetic+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter.</a> Mol Ther. 19 (3), 470-478 (2011).</li>
</ol>

Nie mamy żadnych konfliktów interesów w związku z tym raportem.

Główną wadą stosowania binarnego przełącznika ekspresji genów jest konieczność jednoczesnego dostarczania dwóch oddzielnych plazmidów (sterownika i efektora) do komórki docelowej. Może to prowadzić do nierównomiernego rozmieszczenia plazmidów i skutkować niespójną odpowiedzią przełącznika na induktory 1,2,3. Kolejną wadą systemu dwuwektorowego jest to, że do zidentyfikowania obiecujących linii komórkowych wymagane są co najmniej...

Kilka różnych przełączników genów zostało zbadanych pod kątem ich zdolności do precyzyjnego regulowania ekspresji transgenów w hodowlach komórkowych i modelach zwierzęcych, z różnym skutkiem1,2,3. Potencjalne systemy przełączania genów powinny spełniać kilka rygorystycznych kryteriów, w tym: precyzyjną ekspresję kierunkową transgenu, reakcję na induktory zależną od dawki i czasu, znikomą nieszczelność promotora, odwracalność aktywacji transgenu poprzez usunięcie induktora oraz poziomy toksyczności induktora tolerowane przez linie komórkowe i zwierzęta laboratoryjne1,2,3. Wykorzystano kilka induktorów małocząsteczkowych, w tym tetracyklinę4,5, rapamycin6,7,8, mifepristone9,10 oraz ecdysone11,12,13,14. Ogólnie rzecz biorąc, systemy te wymagają co najmniej dwóch plazmidów zawierających dwie lub trzy odrębne jednostki ekspresji, z których jedna lub dwie tworzą element regulatorowy (plazmid induktora), który wiąże induktor małej cząsteczki w celu uzyskania aktywności transkrypcyjnej; oraz inny plazmid (plazmid efektorowy) zawierający transgen pod kontrolą regulatorowego regionu DNA, który umożliwia dostęp elementu regulatorowego związanego z induktorem. Główną wadą systemu binarnego jest to, że wymaga on jednoczesnego wprowadzenia dwóch wektorów (induktora i efektora) do komórki docelowej. W eksperymentach z przejściową ekspresją transgenu, jednoczesna transfekcja dwóch plazmidów nieuchronnie wytwarza populację komórek, która jest pojedynczo transfekowana za pomocą induktora lub efektora, lub współtransfekowana nierównomiernie. Ponadto system binarny wymaga co najmniej dwóch rund selekcji antybiotyków w celu ustalenia stabilnych linii komórkowych, co jest czasochłonne i pracochłonne. Tak więc połączenie wszystkich składników wymaganych do ekspresji i regulacji transgenu w jeden wektor byłoby idealne, aby zagwarantować jednoczesną ekspresję wszystkich wymaganych elementów w jednej komórce i umożliwić regulację ekspresji transgenu poprzez leczenie induktorami małocząsteczkowymi.
Aby przezwyciężyć niedociągnięcia binarnych przełączników genów, niedawno opracowaliśmy pojedynczy przełącznik genów, używając systemu indukowania genów opartego na EcR opartego na Drosophila melanogaster15. Ekdyzon pośredniczy w ekspresji genów, gdy wiąże się z heterodimerem EcR/ultraspiracle (USP), co z kolei indukuje wiązanie EcR z elementami regulatorowymi DNA3,11. Receptor X retinoidu kręgowców (RXR), ortolog USP owadów, rekrutuje EcR do utworzenia aktywnego aktywatora transkrypcji16. Tak więc, w celu docelowej ekspresji transgenu w komórkach lub tkance kręgowców, EcR i RXR muszą być jednocześnie wyrażane przed stymulacją przez ekdyzon lub jego agonistów. Ponieważ na heterodimeryczną cechę przełącznika genu opartego na EcR może mieć wpływ endogenny poziom RXR, Padidam i wsp. zastąpił domeny wiążące i aktywujące DNA EcR heterologicznymi domenami aktywacyjnymi GAL4 wiążącymi DNA, domenami aktywacyjnymi białka wirusa opryszczki pospolitej vmw65 (VP16) połączonymi z domeną wiążącą ligand EcR, która następnie przestała reagować na endogenny RXR i utworzyła homodimer w celu uzyskania aktywności transkrypcyjnej17. Przełącznik genowy oparty na EcR został dodatkowo ulepszony poprzez skonstruowanie chimerycznego białka składającego się z minimalnej domeny aktywacyjnej VP16 w połączeniu z GvEcR, które tworzyło homodimer i lokalizowało się w cytozolu pod nieobecność agonisty ekdyzonu, Teb16,18. Wiążąc się z Teb, GvEcR zmienił swoją subkomórkową lokalizację z cytozolu na jądro, aby rozpoznać hybrydowy promotor składający się z minimalnego promotora E1b danio pręgowanego w połączeniu z dziesięcioma tandemowymi powtarzającymi się sekwencjami aktywacji (UAS) w celu zainicjowania transkrypcji docelowego genu 16.
Aby uprościć wcześniej zgłoszone przełączniki genów oparte na EcR16,18, połączyliśmy binarne cechy systemu w jeden wektor wyposażony we wszystkie wymagane elementy do stymulowania ekspresji transgenu, a następnie oznaczyliśmy nowo wygenerowany wektor, pEUI(+) (numer dostępu GenBank: KP123436, Rysunek 1A)15. Efektor reagujący na sterownik GvEcR (zwany dalej sterownikiem) składa się z dziesięciu powtórzeń tandemowego UAS obok minimalnego promotora E1b, po których następuje miejsce wielokrotnego klonowania (MCS) z sekwencjami rozpoznawania EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI i AflII (rysunek 1B). Dodatkowo, aby ułatwić selekcję transfekowanych komórek, gen N-acetylotransferazy puromycyny (PAC) sterowany promotorem SV40 umieszczono między regionami sterownika i efektora w celu utrzymania stabilnych linii komórkowych (Figura 1).
Opisujemy szczegółowy protokół przejściowej i stabilnej modulacji ekspresji transgenu za pomocą pEUI(+). Ponadto udostępniamy szczegółowe instrukcje dotyczące skutecznego stosowania Teb jako agonisty ekdyzonu.

<table><tbody><tr><td>pEUI(+)</td><td>TransLab</td><td></td><td>Licencja patentowa została przeniesiona na TransLab Inc.&nbsp;</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Gene-Fect</td><td>TransLab</td><td>TLC-001</td><td></td></tr><tr><td>HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Tebufenozyd</td><td>Fluka</td><td>31652</td><td></td></tr><tr><td>Cylinder klonujący</td><td>Sigma</td><td>CLS31668</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Corning</td><td>58-58-2</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyki</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Welgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Welgene</td><td>S001-01</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>SPL life science</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>mysz FLAGA M2</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-alfa tubuliny</td><td>Calbiochem</td><td>CP06</td><td></td></tr><tr><td>Cylinder klonujący</td><td>Sigma</td><td>CLS31668</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.1</td><td></td></tr><tr><td>M-PER Odczynnik do ekstrakcji białek ssaków </td><td>Thermo Fisher</td><td>78505</td><td></td></tr><tr><td>100X Inhibitor proteazy Cock. III</td><td>T& I</td><td>BPI-9200</td><td></td></tr></tbody></table>

przełącznik pojedynczego genu oparty na receptorze ekdyzonu do celowej ekspresji transgenu z solidnością, odwracalnością i znikomą nieszczelnością

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Precyzyjna kontrola ekspresji transgenu jest pożądana w badaniach biologicznych i klinicznych. Jednak ze względu na to, że binarna cecha obecnie stosowanych przełączników genowych wymaga jednoczesnego przeniesienia dwóch terapeutycznych jednostek ekspresji do jednej komórki, praktyczne zastosowanie systemu w terapii genowej jest ograniczone. Aby uprościć system ekspresji transgenu, wygenerowaliśmy przełącznik genowy oznaczony jako pEUI(+) obejmujący kompletny zestaw modułów ekspresji transgenu w jednym wektorze. Składający się z domeny wiążącej DNA GAL4 i zmodyfikowanego EcR (GvEcR), minimalnej domeny aktywacyjnej VP16 połączonej z domeną wiążącą DNA GAL4, a także zmodyfikowanego receptora ekdyzonu Drosophila (EcR), nowo opracowany pojedynczy przełącznik genowy jest wysoce wrażliwy na podawanie induktora chemicznego w sposób zależny od czasu i dawki. Wektor pEUI(+) jest potencjalnie potężnym narzędziem do poprawy kontroli ekspresji transgenu zarówno w badaniach biologicznych, jak i badaniach przedklinicznych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół modulacji przejściowej i stabilnej ekspresji transgenu za pomocą wektora pEUI(+) poprzez leczenie tebufenozydem (Teb). Ponadto dzielimy się ważnymi wskazówkami dotyczącymi stosowania Teb jako induktora chemicznego.

Pojedynczy przełącznik genowy oparty na GvEcR przedstawiono na Rysunku 1A. Wektor pEUI(+) został zoptymalizowany pod kątem regulowanej ekspresji transgenu poprzez traktowanie Teb. Region efektorowy pEUI(+) składa się z 10xUAS i minimalnego promotora E1b, po których następuje MCS zawierający miejsca rozpoznawania enzymów restrykcyjnych EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI oraz AflII. Za MCS dodano sygnał poly(A) SV40 (Rysunek 1B). Między...

Tutaj prezentujemy protokół modulacji ekspresji transgenu za pomocą przełącznika pojedynczego genu pEUI(+) przez leczenie tebufenozydem.

Przełącznik pojedynczego genu oparty na receptorze ekdyzonu do celowej ekspresji transgenu z solidnością, odwracalnością i znikomą nieszczelnością

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest modulacja ekspresji transgenu poprzez podanie induktora chemicznego tebufenozydu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórkowej i molekularnej, na przykład kiedy należy stymulować ekspresję interesującego genu w pożądanym czasie z pożądaną siłą. Główną zaletą tej techniki jest to, że łącząc wszystkie elementy wymagane do ekspresji transgenu w ramach jednego wektora, ekspresja transgenu może być stymulowana przez podanie induktora chemicznego tebufenozydu.Po subklonowaniu EGFP lub ANKRD13A transgenów zgodnie z protokołem tekstowym, przygotuj cztery szalki do hodowli komórkowych zawierające świeżo pasażowane komórki HEK 293 w pięciu mililitrach DMEM uzupełnione pięcioma do 10% FBS i antybiotykami, które będą dalej określane jako pożywka hodowlana. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki osiągną gęstość od 50 do 60%, dodaj trzy mikrolitry odczynnika do transfekcji do 200 mikrolitrów rozcieńczalnika zawierającego DNA.Po inkubacji reakcji w temperaturze pokojowej przez 30 minut dodać mieszaninę do komórek HEK 293. Do transfekcji należy użyć dwóch szalek, a pozostałe dwie pozostawić nie

an-ecdysone-receptor-based-singular-gene-switch-for-deliberate

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Zdolność do wytwarzania transgenów dla Caenorhabditis elegans z wykorzystaniem DNA genomicznego przenoszonego przez fosmidy jest szczególnie korzystna, ponieważ wszystkie rodzime elementy regulacyjne zostają zachowane. Opisano prostą i niezawodną procedurę wytwarzania transgenów poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK.

Produkcja transgenów C. elegans poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK

Zróżnicowanie fenotypowe cech może wynikać z mutacji w sekwencjach elementów cis-regulatorowych (CRE), które kontrolują wzorce ekspresji genów. Metody opracowane do zastosowania u Drosophila melanogaster pozwalają na ilościowe porównanie poziomów przestrzennych i czasowych wzorców ekspresji genów pośredniczonych przez zmodyfikowane lub naturalnie występujące warianty CRE.

Ilościowe porównanie cisAktywności cis-elementów regulacyjnych (CRE) w organizmach transgenicznych Drosophila melanogaster

Źródło: Berens, C. i in. Zastosowanie systemu indukowalnej ekspresji do badania interferencji czynników zjadliwości bakteryjnej z sygnalizacją wewnątrzkomórkową. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do identyfikacji, gdzie bakteryjne białko efektorowe CaeB zakłóca apoptotyczną kaskadę gospodarza. Opisuje ona kroki transfekujące komórki ekspresujące CaeB za pomocą systemu reagującego na tetracyklinę, aby indukować ekspresję genów pro-apoptotycznej w...

Transfekcja indukowalnego systemu ekspresji genów do komórek ekspresujących bakteryjne białko efektorowe

Ten film demonstruje system ekspresji genów tetracykliny lub Tet-On w modelu mysim. W obecności doksycykliny, pochodnej tetracykliny, system Tet-On składający się z białka transaktywatora kontrolowanego przez odwróconą tetracyklinę ulega aktywacji i ulega ekspresji interesującego genu.

Indukowalna regulacyjna ekspresja genów oparta na systemie Tet-On in vivo: indukowany tetracykliną system ekspresji genów do aktywacji transkrypcji genu docelowego w modelu mysim

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę szybkiej budowy sztucznych czynników transkrypcyjnych (ATF) z pokrewnymi reporterami GFP oraz ilościowe określenie zdolności ATF do stymulowania ekspresji GFP za pomocą cytometrii przepływowej.

Szybka synteza i badania przesiewowe chemicznie aktywowanych czynników transkrypcyjnych za pomocą reporterów opartych na GFP

Opisana tutaj metoda jest używana do indukowania kaskady sygnalizacji apoptotycznej na określonych etapach w celu zbadania aktywności antyapoptotycznego bakteryjnego białka efektorowego. Metoda ta może być również stosowana do indukowalnej ekspresji białek proapoptotycznych lub toksycznych lub do analizowania interferencji z innymi szlakami sygnałowymi.

Zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową

Badanie kanałów jonowych za pomocą heterologicznie wyrażającego systemu stało się podstawową techniką w badaniach biomedycznych. W tym manuskrypcie przedstawiamy efektywną czasowo metodę osiągania ściśle kontrolowanej ekspresji kanału jonowego poprzez przeprowadzanie transfekcji przejściowej pod kontrolą indukowalnego promotora.

Kontrolowana ekspresja kanału jonowego poprzez indukowalną transfekcję przejściową

Tutaj prezentujemy metodę generowania specyficznych dla tkanek binarnych systemów transkrypcyjnych u Drosophila poprzez zastąpienie pierwszego kodującego eksonu genów sterownikami transkrypcji. Metoda oparta na CRISPR/Cas9 umieszcza sekwencję transaktywatora pod endogenną regulacją zastąpionego genu, a w konsekwencji ułatwia ekspresję transktywatora wyłącznie we wzorcach czasoprzestrzennych specyficznych dla genu.

Skuteczna strategia generowania specyficznych tkankowo binarnych systemów transkrypcyjnych u Drosophila poprzez edycję genomu

Ten protokół przedstawia kroki potrzebne do wygenerowania modelowego systemu, w którym transkrypcja interesującego nas endogennego genu może być warunkowo kontrolowana u żywych zwierząt lub komórek za pomocą ulepszonych systemów represora lac i/lub aktywatora tet.

Zastosowanie in vivo systemu REMOTE-control do manipulacji endogenną ekspresją genów

Niezawodna kontrola komórek ssaków reagujących na światło wymaga standaryzacji metod optogenetycznych. Aby osiągnąć ten cel, badanie to nakreśla linię budowy obwodów genowych, inżynierii komórkowej, obsługi sprzętu optogenetycznego i testów weryfikacyjnych w celu standaryzacji badania ekspresji genów indukowanej światłem przy użyciu optogenetycznego obwodu genowego o ujemnym sprzężeniu zwrotnym jako studium przypadku.

Niezawodna inżynieria i kontrola stabilnych optogenetycznych obwodów genowych w komórkach ssaków

Badanie opisuje metodę eksperymentów o wysokiej przepustowości z wykorzystą matrycę LED drukowaną w 3D, aby zoptymalizować ekspresję genów indukowanych światłem w HEK293T komórkach.

Szybka optymalizacja systemu indukowalnego światłem do kontroli ekspresji genów ssaków

Poznaj metodę modulacji ekspresji transgenu za pomocą przełącznika genowego pEUI(+) i induktora chemicznego tebufenozyd w komórkach HEK 293. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę czasu i siły ekspresji genu.

Przełącznik pojedynczego genu oparty na receptorze ekdyzonu do celowej ekspresji transgenu z solidnością, odwracalnością i znikomą nieszczelnością (Wideo) | JoVE Journal

Przełącznik pojedynczego genu oparty na receptorze ekdyzonu do celowej ekspresji transgenu z solidnością, odwracalnością i znikomą nieszczelnością

Przeglądaj więcej filmów