Przełącznik pojedynczego genu oparty na receptorze ekdyzonu do celowej ekspresji transgenu z solidnością, odwracalnością i znikomą nieszczelnością

Ogólnym celem tego eksperymentu jest modulacja ekspresji transgenu poprzez podanie induktora chemicznego tebufenozydu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórkowej i molekularnej, na przykład kiedy należy stymulować ekspresję interesującego genu w pożądanym czasie z pożądaną siłą. Główną zaletą tej techniki jest to, że łącząc wszystkie elementy wymagane do ekspresji transgenu w ramach jednego wektora, ekspresja transgenu może być stymulowana przez podanie induktora chemicznego tebufenozydu.

Po subklonowaniu EGFP lub ANKRD13A transgenów zgodnie z protokołem tekstowym, przygotuj cztery szalki do hodowli komórkowych zawierające świeżo pasażowane komórki HEK 293 w pięciu mililitrach DMEM uzupełnione pięcioma do 10% FBS i antybiotykami, które będą dalej określane jako pożywka hodowlana. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki osiągną gęstość od 50 do 60%, dodaj trzy mikrolitry odczynnika do transfekcji do 200 mikrolitrów rozcieńczalnika zawierającego DNA.

Po inkubacji reakcji w temperaturze pokojowej przez 30 minut dodać mieszaninę do komórek HEK 293. Do transfekcji należy użyć dwóch szalek, a pozostałe dwie pozostawić nietraktowane jako kontrole. Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 do 24 godzin.

Po inkubacji dodać Teb do jednej z transfekowanych próbek i do jednej z nietransfekowanych próbek. Pozostałe dwie próbki należy pozostawić niepoddane obróbce jako kontrolne doświadczalne metody kontroli. Inkubować płytki przez 12 do 48 godzin.

Jeśli używasz wkładki EGFP, przeanalizuj ekspresję EGFP pod mikroskopem fluorescencyjnym. W przeciwnym razie, aby zebrać komórki do immunoblottingu, użyj lodowatego PBS, aby dwukrotnie przepłukać komórki. Następnie użyj skrobaka do komórek, aby usunąć je z płytki i przenieś do 15-mililitrowej stożkowej tuby.

Następnie obracaj probówki z prędkością 21 000 g i w temperaturze od 18 do 25 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Następnie, po odrzuceniu PBS, dodaj 0,5 mililitra lodowatego odczynnika do ekstrakcji białek ssaków lub M-PER i inhibitora proteazy do osadu. Ponownie zawiesić komórki za pomocą kilku rund pipetowania.

Następnie inkubować zawiesinę komórkową w temperaturze od 18 do 25 stopni Celsjusza i temperaturze pokojowej przez 15 minut. Wiruj lizat komórkowy w temperaturze 21 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Następnie przenieś wodny supernatant do świeżej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki i przeanalizuj ją przez immunoblotting z odpowiednimi przeciwciałami.

Aby ugasić bodźce Teb, usuń z komórek pożywkę hodowlaną zawierającą Teb i użyj wstępnie podgrzanego PBS do dwukrotnego przepłukania komórek. Następnie dodaj jeden mililitr 0,25% trypsyny/EDTA i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Dodaj 10 mililitrów wstępnie podgrzanej, wolnej od Teb pożywki hodowlanej do komórek i użyj skrobaka do komórek, aby je zebrać.

Przenieś komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Następnie obracaj komórki w temperaturze 21 000 g i od 18 do 25 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Ponownie zawieś komórki w 50 mililitrach wstępnie podgrzanej, wolnej od Teb pożywki hodowlanej i przenieś pięć mililitrów komórek do trzech 60-milimetrowych świeżych naczyń do hodowli komórkowych.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza odpowiednio przez 24, 48 i 72 godziny. Na koniec zbierz komórki w różnych punktach czasowych i zmierz poziom ekspresji transgenu za pomocą immunoblottingu. W tym eksperymencie, w którym oceniano aktywność i nieszczelność pEUI-plus-EGFP, fałszywe transfektanty wektorowe nie wykazywały sygnału fluorescencyjnego niezależnie od leczenia Teb.

Jednak transfektanty pEUI-plus-EGFP stawały się coraz bardziej uwrażliwione na rosnącą ilość Teb. Co ważniejsze, transfektanty pEUI-plus-EGFP, które nie były poddawane działaniu Teb, nie wywoływały żadnych wykrywalnych sygnałów EGFP. ANKRD13A oznaczone flagą wykorzystano do dalszego sprawdzenia responsywności pEUI-plus na Teb.

Jak wykazano w tym western blot przy użyciu przeciwciał anty-FLAG, transfekowane komórki HEK 293 wykazywały silną ekspresję ANKRD13A po 24-godzinnym leczeniu Teb. Ponadto zubożenie Teb wykazało odwracalność przełącznika genu pEUI-plus, ponieważ nie było ANKRD13A już wykrywalne w komórkach hodowanych bez Teb. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby prawie cały eksperyment przeprowadzić w warunkach wolnych od zarazków. Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak system Tet-On lub Tet-Off, mogą być stosowane do zróżnicowanej ekspresji dwóch odrębnych transgenów. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórki do zbadania fizjologii molekularnej na poziomie komórkowym.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać wektora przełącznika genów pEUI-plus w celu wywołania ekspresji transgenu w pożądanym czasie z pożądaną siłą. Nie zapominaj, że praca z tebufenozydem może być niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie fartucha laboratoryjnego.