Name: Mutageneza losowa ukierunkowana na geny w celu wyselekcjonowania mutantów proteasomów destabilizujących heterochromatynę w drożdżach rozszczepieniowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Poznaj metodę losowej mutagenezy ukierunkowanej na geny w drożdżach rozszczepieniowych Schizosaccharomyces pombe w celu identyfikacji mutantów destabilizujących heterochromatynę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie finansowe dla tego projektu zostało zapewnione przez Program Badań Podstawowych za pośrednictwem Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Nauki i Technologii Informacyjnych (2016R1A2B2006354).

1. Przygotowanie mediów
<ol>
	<li>Przygotuj ekstrakt drożdżowy z suplementami (TAK), TAK bez adeniny (YES Low Ade), pożywkę z glutaminianu Pombe (PMG12) i PMG bez adeniny (PMG-Ade) mieszając składniki zgodnie z opisem w Tabeli 1. Płytki YES-Ade (Low Ade) i PMG-Ade mają wszystkie te same składniki, ale adenina jest pominięta w tej ostatniej.
	<ol>
		<li>Użyć następującego bulionu soli (50x): 52,5 g/L MgCl2·6H2O, 2 g/L CaCl2·2H2O, 50 g/L KCl, 2 g/L Na2SO4 w wodzie destylowanej. Filtr sterylizować za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Użyj następujących zapasów witamin (1000x): 1 g/L pantotenianu, 10 g/L kwasu nikotynowego, 10 g/L inozytolu, 10 mg/L biotyny w wodzie destylowanej. Filtr sterylizować za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Użyj następującego surowca mineralnego (10 000x): 5 g/L kwasu borowego, 4 g/L MnSO4, 4 g/L ZnSO4·7H2O, 2 g/L FeCl2·4H2O, 0,4 g/L MoO3, 1 g/L KI, 0,4 g/L CuSO4·5H2O, 10 g/L kwasu cytrynowego w wodzie destylowanej. Filtr sterylizować za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: TAK płynne podłoże można uzyskać, pomijając agar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłoże należy sterylizować w autoklawie i schłodzić do temperatury poniżej 60 °C, mieszając mieszadłem z prędkością 200 obr./min.</li>
	<li>W przypadku płytek YES+G418 (genetycyna) dodać 1 ml/l roztworu podstawowego G418 do pożywki YES.
	<ol>
		<li>Użyj następującego zapasu G418 (1,000x): 100 mg/ml G418 w wodzie destylowanej. Filtr sterylizować za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm, porcji do 1,5 ml probówek wirówkowych i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mieszaj przez kolejne 5 - 10 minut i podziel pożywkę na 90-milimetrowe szalki Petriego (1 l pożywki na około 40 szalek Petriego). Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Klonowanie rpt4+ i jego 5'/3' UTR-ów
<ol>
	<li>Przeprowadzić PCR ze starterami p1 i p2 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A) przy użyciu rozszczepienia genomowego DNA drożdży (gDNA) jako matrycy w całkowitej objętości 50 μL (~1 μg DNA, enzym 20 U, 1x bufor reakcyjny) i stosując cykle reakcji opisane w Tabeli 2 w celu amplifikacji fragmentu pary zasad 3,315 (bp) zawierającego rpt4+ i jego 5'/3' UTR. Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania13 zgodnie z zaleceniami producenta (Rysunek 1A).</li>
	<li>Trawić pBlueScript KS(-) vector14 i amplifikowany fragment DNA zawierający rpt4+ z jego 5'/3' UTR z BamH1 i Xho1 w całkowitej objętości 20 μL (~1 μg DNA, enzym 20 U, 1x bufor do mineralizacji) w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 16 - 18 godzin (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Żel oczyszcza strawiony wektor (1,2% żel agarozowy) i wstawkę DNA, wykonując elektroforezę w żelu agarozowym na bazie TAE (100 V, 1 h), wycinając prążki DNA o pożądanych rozmiarach i izolując DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu15.</li>
	<li>Zliguj wektor i wstawkę DNA za pomocą ligazy DNA T4, wykonując reakcję ligacji 20 μl zawierającą 50 - 100 ng DNA wektora, ~3-krotny molowy nadmiar DNA insertu, 400 U ligazy DNA T4 i 1x bufor ligacyjny. Inkubować tę mieszaninę w temperaturze 18 °C przez 16-18 godzin.</li>
	<li>Przekształć ligowany DNA w 100 μl E. coli DH5α, stosując szok termiczny przez 70 s w temperaturze 42 °C. Dodać 1 ml LB i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w celu odzyskania. Przeprowadzić odwirowanie (13 800 x g), odrzucić supernatant, umieścić wszystkie przekształcone komórki E. coli na płytkach LB-ampicyliny (LA) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.</li>
	<li>Wybierz 4 - 8 kolonii za pomocą wykałaczek i hoduj przez noc w temperaturze 37 °C w 3 ml pożywki LA.</li>
	<li>Wyizoluj plazmidy za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu16 używanego zgodnie z protokołem producenta i przeprowadź analityczne trawienie enzymu restrykcyjnego z 5 μl izolowanego plazmidu, 5 U każdego enzymu restrykcyjnego (BamH1 i Xho1) i 1x buforem restrykcyjnym. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 3 godziny. Potwierdź klonowanie, sekwencjonując plazmidy kandydujące.</li>
</ol>
3. Wprowadzenie Cichej Mutacji (Strona Restrykcyjna Xho1)
<ol>
	<li>Zaprojektuj parę starterów 33-pz (p3 i p4), które zawierają pożądaną mutację w sekwencji komplementarnej.</li>
	<li>Przeprowadzić PCR z polimerazą o wysokiej wierności17 (Rysunek 1C) w całkowitej objętości 25 μL (10 ng sklonowanego plazmidu, 2 μL mieszaniny starterów 10 pmol, enzym 2 U, 1x bufor reakcyjny) przy użyciu parametrów cyklicznych wymienionych w Tabeli 3.</li>
	<li>Plazmid matrycowy trawić za pomocą DpnI w całkowitej objętości 20 μL (enzym 20 U, 1x bufor do wytrawiania) w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przekształć, rozpropagować, wyizolować i zsekwencjonować plazmid zawierający cichą mutację, zgodnie z opisem w krokach 2.5 - 2.7. 
	nuta: Cicha mutacja może być również wprowadzona za pomocą metody klonowania, która pozwala na połączenie wielu fragmentów DNA w jednej reakcji18.</li>
</ol>
4. Losowa mutageneza rpt4+ metodą PCR podatnego na błędy
<ol>
	<li>Wykonaj podatny na błędy PCR, używając plazmidu z cichą mutacją (miejsce Xho1) jako matrycy, starterów p5 i p6, całkowitej objętości 50 μL (ilość matrycy zdefiniowanej w kroku 4.1.1, 2 μL mieszaniny starterów 10 pmol, enzymu 2,5 U, 1x bufor reakcyjny) i specjalnej polimerazy, która jest zaprojektowana do generowania wysokiego wskaźnika błędów19 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D). Przeprowadzić PCR zgodnie z opisem w Tabeli 2.
	<ol>
		<li>Użyj 4 - 5 μg plazmidu matrycowego, aby kontrolować częstotliwość mutacji do 1 pz / kb (kilozasada). 
		nuta: Wymagane jest plazmid o wysokim stężeniu (>500 ng/μl), który można uzyskać za pomocą zestawu Mini-prep20.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj elektroforezy żelowej, aby potwierdzić produkt PCR o masie 2670 pz (1,2% żelu agarozowego). Żel oczyść ten produkt PCR zgodnie z opisem w kroku 2.5.</li>
</ol>
5. Przygotowanie fragmentów Fusion PCR (KAN, 3'UTR)
<ol>
	<li>Aby uzyskać fragment markera, należy przeprowadzić PCR przy użyciu pFA6a-KANMX621 jako matrycy, starterów p7 i p8 oraz warunków wymienionych w Tabeli 4. Żel oczyszcza powstały fragment o długości 1 480 pz, jak opisano w kroku 2.5 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E).
	<ol>
		<li>Sprawdź, czy kodon stop genu docelowego do mutacji i region kodujący sąsiedniego genu są oddalone od siebie o więcej niż 500 pz. Terminator endogenny nie może być stosowany, gdy obszar ten jest mniejszy niż 500 pz; raczej zamiast terminatora endogenicznego należy użyć terminatora ADH. Zmiany w protokole wymagane do korzystania z terminatora ADH przedstawiono w tabeli 5. 
		nuta: Zmiany te mają zastosowanie tylko wtedy, gdy terminator ADH, który jest dostępny w plazmidzie pFA6a-3HA-KANMX6, jest używany zamiast terminatora endogennego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić PCR ze sklonowanym wektorem zawierającym rpt4+ jako matrycą i starterami p9 i p10 w całkowitej objętości 50 μL (20 ng sklonowanego plazmidu, 2 μL mieszaniny starterów 10 pmol, enzym 2 U, 1x bufor reakcyjny), stosując warunki przedstawione w tabeli 6. Żel oczyszcza otrzymany fragment 506-bp 3'UTR (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E).</li>
</ol>
6. Generowanie konstruktu transformacji metodą Fusion PCR (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E)
<ol>
	<li>Przygotuj 3 fragmenty (zmutagenizowane rpt4+, KAN i 3'UTR) w stężeniu 50 ng/μl.</li>
	<li>Przeprowadzić termowizyjną reakcję PCR trzech fragmentów przy użyciu starterów p11 i p12, jak opisano w Tabeli 7. (Protokół dla fusion PCR jest modyfikacją oryginalnego protocol22.) Oczyść główny produkt PCR o wartości 4,398 pz.
	<ol>
		<li>Użyj fragmentów rpt4+:KAN:3'UTR w stosunku 1:3:1, aby uzyskać optymalne wyniki. 
		nuta: Całkowita ilość wstawionego DNA nie powinna przekraczać 500 ng. Zalecana ilość rpt4+:KAN:3'UTR wynosi 50 ng:150 ng:50 ng. Region mutagenny wynosi około 1,6 kb, więc minimalna liczba kolonii drożdży, która odpowiadałaby za wszystkie możliwe kombinacje każdej zasady zmutowanej do pozostałych trzech, wynosi 1,600 x 3 = 4,800 kolonii. Ponieważ jedna reakcja przemiany zwykle daje 400 - 500 kolonii, potrzeba co najmniej 10 reakcji o wartości konstruktu fusion PCR. Potrzebę tę można zaspokoić, po prostu zwiększając ilość reakcji (tj. liczbę probówek PCR) dziesięciokrotnie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Przemiana drożdży rozszczepieniowych metodą elektroporacji (Rysunek 1F)
<ol>
	<li>Zaszczepić drożdże do 10 ml pożywki YES do nasycenia, inkubując je przez ponad 16 godzin.</li>
	<li>Rozcieńczyć komórki do gęstości optycznej przy 600 nm (OD600) wynoszącej 0,2 w 200 ml pożywki YES i inkubować w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przez 5-6 godzin, do OD600 = 0,6-0,8.</li>
	<li>Zagęścić komórki do OD600 = 30, przelać do czterech stożkowych probówek o pojemności 50 ml i schłodzić na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Zebrać komórki, przeprowadzając wirowanie przy 1 050 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Umieścić probówki i 10 elektrokuwet na lodzie. Wykonaj kroki 7.3 - 7.8 na lodzie.</li>
	<li>Odrzucić sklarowany osad i dodać 15 ml 1,2 M sorbitolu. Delikatnie potrząśnij probówkami, aby ponownie zawiesić komórki.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 1050 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Powtórz kroki 7.4 i 7.5. Odrzucić supernatant. Dodaj 500 μl 1,2 M sorbitolu do każdej probówki, ponownie zawieś komórki i zbierz wszystkie komórki w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodaj 1,2 M sorbitolu do 2,4 ml (OD600 = 10 na 0,2 ml). Trzymaj probówkę na lodzie.</li>
	<li>Dodaj 200 μl komórek zawieszonych w sorbitolu (upewnij się, że są całkowicie zawieszone) do probówki EP zawierającej konstrukt do fuzji PCR, dobrze wymieszaj i przenieś próbkę do elektrokuwety.</li>
	<li>Elektroportuj ogniwa za pomocą następujących opcji: Grzyby, ShS (2,00 kV, 1 impuls).</li>
	<li>Dodaj 600 μl 1,2 M sorbitolu do każdej elektrokuwety, aby uzyskać całkowitą objętość 800 μl, a następnie rozprowadź komórki na czterech płytkach YES (200 μL/płytkę). Dziesięć elektrokuwet dozuje na 40 płytek TAK.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Wykonać replikę posiewu do YES+G418 i inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 3 dni.</li>
</ol>
8. Wybór mutantów destabilizujących heterochromatynę i sprawdzanie fałszywych alarmów
<ol>
	<li>Dla każdej tabliczki YES+G418 wykonaj replikę poszycia na tabliczkach YES-Ade (Low Ade) i PMG-Ade (No Ade). Inkubować płytki replik przez 1-2 dni w temperaturze 30 °C, aż niektóre kolonie na płytkach YES-Ade wykażą czerwone zabarwienie (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1G).</li>
	<li>Porównaj płytki YES-Ade i PMG-Ade i wybierz komórki, które są różowe lub białe na płytce YES-Ade, a także rosną na płytce PMG-Ade. Nie należy wybierać kolonii bez wzrostu na PMG-Ade, ponieważ są to wyniki fałszywie dodatnie (np. odzwierciedlające, że kaseta KAN została zintegrowana w innym miejscu genomu innym niż docelowe).</li>
	<li>Pobrać około 1 x 105 komórek z każdej kolonii i inkubować w 10 μl roztworu SPZ zawierającego 2,5 mg/ml zymoliazy 100 T w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut. Użyj 1 μl tego roztworu, aby wykonać jako matrycę wyjściową do PCR kolonii (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1H).
	<ol>
		<li>Przygotować SPZ (50 ml), mieszając 30 ml 2 M sorbitolu, 4,05 ml 1 M Na2HPO4, 0,95 ml NaH2PO4 i 15 ml wody destylowanej (końcowe pH, 7,5). Próbki (5 ml) można uzupełnić zymoliazą i przechowywać w 500 μl podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj elektroforezę żelową (1,2% żel agarozowy, 180 V, 20 min), aby uwidocznić wyniki + PCR kolonii. Wybierz reakcje, które wykazują prążki PCR o odpowiedniej wielkości i trawią 5 μl każdego produktu reakcji za pomocą XhoI (enzym 4 U, 1x bufor wytrawiania, łaźnia wodna 37 °C, 1 h), aby odsiać wyniki fałszywie dodatnie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1H).</li>
	<li>Wykonaj elektroforezę żelową, aby uwidocznić trawienie XhoI (1,2% żel agarozowy, 180 V, 20 min). Zaznacz kolonie, których produkty PCR są cięte przez XhoI i przyklej je do płytek YES+G418 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1I).</li>
	<li>Wyizoluj gDNA z komórek drożdży rozszczepienia i wykonaj sekwencjonowanie produktów PCR23. Porównaj uzyskaną sekwencję z sekwencją typu dzikiego, aby zidentyfikować mutacje (<silna klasa="xfig">Rysunek 1I).</li>
	<li>Bezpośrednio ponownie wprowadź mutację (mutacje) do komórek typu dzikiego, przekształcając je za pomocą konstruktów fuzyjnych amplifikowanych metodą PCR ze zmutowanych komórek23. Użyj spottingu, aby potwierdzić fenotyp w nowo utworzonych zmutowanych komórkach (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1J).
	<ol>
		<li>Konstrukt transformacji fuzyjnej może być łatwo amplifikowany przez PCR ze starterami p1 i p10 przy użyciu genomowego DNA mutantów jako matrycy w całkowitej objętości 50 μL (~1 μg DNA, enzym 20 U, 1x bufor reakcyjny) i stosując cykle reakcji opisane w tabeli 2. Transformację konstrukcji można wykonać, wykonując kroki 7.1 - 7.13.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+model+of+error-prone+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">A general model of error-prone PCR.</a> J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).</li>
<li>Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+induced+by+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Mutations induced by ultraviolet light.</a> Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).</li>
<li>Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+analysis+of+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods Enzymol. 194, 795-823 (1991).</li>
<li>Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+evolution+of+novel+traits+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid evolution of novel traits in microorganisms.</a> Appl Environ Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).</li>
<li>Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+DNA+shuffling+works%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">How DNA shuffling works.</a> Science. 293 (5528), 237(2001).</li>
<li>Sahu, P. P., Sharma, N., Puranik, S., Chakraborty, S., Prasad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+26S+Proteasome+subunit+RPT4a+regulates+ToLCNDV+transcription+and+activates+hypersensitive+response+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Tomato 26S Proteasome subunit RPT4a regulates ToLCNDV transcription and activates hypersensitive response in tomato.</a> Sci Rep. 6, 27078(2016).</li>
<li>Xu, Q., Singer, R. A., Johnston, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sug1+modulates+yeast+transcription+activation+by+Cdc68%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sug1 modulates yeast transcription activation by Cdc68.</a> Mol Cell Biol. 15 (11), 6025-6035 (1995).</li>
<li>Bhat, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+19S+proteasome+ATPase+Sug1+plays+a+critical+role+in+regulating+MHC+class+II+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription.</a> Mol Immunol. 45 (8), 2214-2224 (2008).</li>
<li>Chang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gal4+activation+domain+binds+Sug2+protein%2C+a+proteasome+component%2C+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Gal4 activation domain binds Sug2 protein, a proteasome component, in vivo and in vitro.</a> J Biol Chem. 276 (33), 30956-30963 (2001).</li>
<li>Ekwall, K., Cranston, G., Allshire, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fission+yeast+mutants+that+alleviate+transcriptional+silencing+in+centromeric+flanking+repeats+and+disrupt+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Fission yeast mutants that alleviate transcriptional silencing in centromeric flanking repeats and disrupt chromosome segregation.</a> Genetics. 153 (3), 1153-1169 (1999).</li>
<li>Grewal, S. I., Jia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin revisited.</a> Nat Rev Genet. 8 (1), 35-46 (2007).</li>
<li>Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aForsburg%2C+SL+%22Forsburg+Lab+Recipes%3A+Fission+Yeast+Media%22">Forsburg Lab Recipes: Fission Yeast Media</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/media.html">http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/media.html</a> (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22QIAquick+PCR+Purification+Kit%22">QIAquick PCR Purification Kit</a>. , Qiagem. Venlo, Netherlands. Available from
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-pcr-purification-kit/#orderinginformation">https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-pcr-purification-kit/#orderinginformation</a> (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22pBlueScript+II+Vector%22">pBlueScript II Vector</a>. , Aglint. Santa Clara, CA. Available from
 <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/en/Cloning-Vectors/pBlueScript-II-Vectors/?cid=AG-PT-115&">http://www.genomics.agilent.com/en/Cloning-Vectors/pBlueScript-II-Vectors/?cid=AG-PT-115&</a> (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22QIAquick+Gel+Extraction+Kit%22">QIAquick Gel Extraction Kit</a>. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-gel-extraction-kit/#orderinginformation">https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-gel-extraction-kit/#orderinginformation</a> (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22QuickGene+SP+Kit+Plasmid+Kit+II+%28SP-PL2%29%22">QuickGene SP Kit Plasmid Kit II (SP-PL2)</a>. , Wako Chemicals GmbH. Fuggerstraße 12 41468 Neuss, Germany. Available from
 <a target="_blank" href="https://www.wako-chemicals.de/en/product/quickgene-sp-kit-plasmid-kit-ii-sp-pl2">https://www.wako-chemicals.de/en/product/quickgene-sp-kit-plasmid-kit-ii-sp-pl2</a> (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PfuUltra+High-fidelity+DNA+Polymerase%22">PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase</a>. , Aglient. Santa Clara, CA. Available from
 <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/en/High-Fidelity-PCR-Enzymes/PfuUltra-II-Fusion-HS-DNA-Polymerase/?cid=AG-PT-136">http://www.genomics.agilent.com/en/High-Fidelity-PCR-Enzymes/PfuUltra-II-Fusion-HS-DNA-Polymerase/?cid=AG-PT-136</a> (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Gibson+Assembly+Master+Mix%22">Gibson Assembly Master Mix</a>. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix#Product%20Information">https://www.neb.com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix#Product%20Information</a> (2017).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22GeneMorph+II+Random+Mutagenesis+Kits%22">GeneMorph II Random Mutagenesis Kits</a>. , Agilent. Santa Clara, CA. Available from
 <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/en/Random-Mutagenesis/GeneMorph-II/?cid=AG-PT-171&tabId=AG-PR-1057">http://www.genomics.agilent.com/en/Random-Mutagenesis/GeneMorph-II/?cid=AG-PT-171&tabId=AG-PR-1057</a> (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Plasmid+Plus+Midi+Kit%22">Plasmid Plus Midi Kit</a>. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from
 <a target="_blank" href="http://www.biocompare.com/9956-Assay-Kit/4640391-QIAGEN-Plasmid-Plus-Midi-Kit-25/">http://www.biocompare.com/9956-Assay-Kit/4640391-QIAGEN-Plasmid-Plus-Midi-Kit-25/</a> (1999).</li>
<li>Bahler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).</li>
<li>Szewczyk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+PCR+and+gene+targeting+in+Aspergillus+nidulans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3111-3120 (2006).</li>
<li>Nurse, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNurse%2C+P+%22Fission+Yeast+Handbook%22">Fission Yeast Handbook</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://wolflab.squarespace.com/s/Fission-Yeast-Handbook-Nurse-Lab.docx">https://wolflab.squarespace.com/s/Fission-Yeast-Handbook-Nurse-Lab.docx</a> (2000).</li>
<li>Seo, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+19S+proteasome+is+directly+involved+in+the+regulation+of+heterochromatin+spreading+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 19S proteasome is directly involved in the regulation of heterochromatin spreading in fission yeast.</a> J Biol Chem. , (2017).</li>
<li>Tang, N. H., et al. <a target="_blank" href="https://peerj.com/preprints/3377/">Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body.</a> PeerJ Preprints. 5, e3377v3371(2017).</li>
<li>Rasooly, A., Weisz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antibacterial+activities+of+phloxine+B+and+other+halogenated+fluoresceins+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro antibacterial activities of phloxine B and other halogenated fluoresceins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (11), 3650-3653 (2002).</li>
<li>Wilson, D. S., Keefe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+mutagenesis+by+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Random mutagenesis by PCR.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 8. Unit 8 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mutageneza losowa za pomocą podatnego na błędy PCR jest potężnym narzędziem do generowania zróżnicowanej puli mutantów w danym regionie. Technika ta jest szczególnie przydatna w badaniach, które mają na celu ocenę funkcji białka w określonych okolicznościach. Na przykład w niniejszym artykule użyliśmy podatnego na błędy PCR do oceny funkcji podjednostki proteasomu 19S, Rpt4, w utrzymaniu heterochromatyny. Zmieniając region, na który ukierunkowany jest podatny na błędy PCR i dostosowując warunki badań przesiewowych, byliś...

Genetyka do przodu to klasyczna metoda, w której badacze poszukują naturalnie występujących mutantów o określonym fenotypie i przeprowadzają analizy genetyczne. W genetyce odwrotnej mutacje są wprowadzane do genu będącego przedmiotem zainteresowania i badany jest fenotyp. W tym drugim przypadku losowa mutageneza genu docelowego jest często wykorzystywana do wygenerowania puli mutantów, które są następnie selekcjonowane pod kątem pożądanych fenotypów, takich jak wrażliwość na temperaturę lub zmieniona aktywność enzymatyczna. W celu osiągnięcia mutagenezy losowej można zastosować różne metody, w tym podatne na błędy PCR1; Naświetlanie promieniami UV2; mutageny chemiczne, takie jak metanosulfonian etylu (EMS) lub kwas azotawy3; użycie tymczasowych szczepów mutatorowych, takich jak te z nadmierną ekspresją mutD5 4; oraz tasowanie DNA5.
Tutaj opisujemy strategię genetyki odwrotnej, w której wykorzystujemy podatny na błędy PCR do generowania puli mutantów dla docelowego genu w drożdżach rozszczepienia. Jak można się domyślić po jej nazwie, metoda ta generuje mutacje poprzez celowe wprowadzanie błędów podczas PCR. W przeciwieństwie do innych metod mutagenezy, podatny na błędy PCR pozwala użytkownikowi zdefiniować region, który ma być mutagenizowany. To sprawia, że jest on szczególnie przydatny w wysiłkach mających na celu zbadanie funkcji białka/domeny będącej przedmiotem zainteresowania.
Aby zademonstrować tę losową procedurę mutagenezy, używamy tutaj rpt4+, który koduje podjednostkę proteasomu 19S, jako przykładu. Wykazano, że Rpt4 pełni funkcje niezależne od proteolizy w organizmach innych niż drożdże rozszczepienia6,7,8,9, a defekt proteolizy może powodować pośrednie skutki poprzez zmianę poziomu białek. W związku z tym przeprowadziliśmy badania przesiewowe pod kątem mutantów, które wywołały zmiany niezależne od proteolizy, w celu zbadania funkcji proteasomu na heterochromatynie.
Podatny na błędy PCR może być zastosowany do dowolnego regionu genu, dostrajając miejsce, w którym startery się wiążą. Mutanty, które wykazują pożądaną zmianę fenotypową, można zidentyfikować za pomocą odpowiednich reporterów. W tym przypadku użyliśmy reportera ade6+ umieszczonego w regionie środkowego 1 z zewnętrznym powtórzeniem (otr)10. Konstytutywna heterochromatyna powstaje w tym regionie11, więc reporter ade6+ jest wyciszony w stanie dzikim; Jest to sygnalizowane przez czerwone kolonie10. Mutacja, która destabilizuje konstytutywną heterochromatynę w centromerze, doprowadzi do ekspresji reportera ade6 +, który jest wizualizowany jako białe kolonie.

<table><tbody><tr><td><silny>1. Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-10KG</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>BD Biosciences</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucyna</td><td>JUNSEI</td><td>87070-0310</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan adeniny</td><td>ACR</td><td>16363-0250</td><td></td></tr><tr><td>Uracyl&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05108.0050</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JUNSEI</td><td>19015-0350</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12095</td><td></td></tr><tr><td>Ftalan potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6758-500g</td><td></td></tr><tr><td>Inozytol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508-50G</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7634-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&bull; 7H2O&nbsp;</td><td>JUNSEI</td><td>83060-031</td><td></td></tr><tr><td>FeCl2&bull; 4H2O</td><td>KANTO</td><td>CB8943686</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny molibdenian sodu</td><td>YAKURI</td><td>31621</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>JUNSEI</td><td>80090-0301</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&bull; 5H2O</td><td>YAKURI</td><td>09605</td><td></td></tr><tr><td>D-mio-inozytol</td><td>MP biomedyczny</td><td>102052</td><td></td></tr><tr><td>Pantotenian</td><td>YAKURI</td><td>26003</td><td></td></tr><tr><td>Kwas nikotynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4126-500G</td><td></td></tr><tr><td>(NH4)2SO4&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Biobasic</td><td>D0012</td><td></td></tr><tr><td>G418, genetycyna</td><td>LPS</td><td>G41805</td><td></td></tr><tr><td>2. Reakcje enzymatyczne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase</td><td>Aglient</td><td>600380</td><td>Do mutagenezy ukierunkowanej</td></tr><tr><td>GeneMorphII Zestaw do mutagenezy losowej</td><td>Aglient</td><td>200500</td><td>Do podatnego na błędy PCR</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Thermo Fisher</td><td>F-530L</td><td>Do fuzji PCR</td></tr><tr><td>Ex Taq&nbsp; Polimeraza DNA</td><td>Takara</td><td>RR001b</td><td>Do ogólnego PCR</td></tr><tr><td>BamH1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Xho1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>3. Ekwipunek</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aksamitny kwadrat,</td><td>VWR</td><td>89033-116</td><td>Do repliki</td></tr><tr><td>Replika narzędzia do galwanizacji</td><td>VWR</td><td>25395-380</td><td>Do repliki</td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>Biorad</td><td>1652100&nbsp;</td><td>Do przemiany drożdży rozszczepialnych</td></tr><tr><td>Kuwety do elektroporacji, odstęp 0,2 cm</td><td>Biorad</td><td>1652086&nbsp;</td><td>Do przemiany drożdży rozszczepialnych</td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td></td><td>Bioer BYQ6078</td><td>do reakcji narastania termojądrowej PCR&nbsp;</td></tr></tbody></table>

mutageneza losowa ukierunkowana na geny w celu wyselekcjonowania mutantów proteasomów destabilizujących heterochromatynę w drożdżach rozszczepieniowych

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Losowa mutageneza docelowego genu jest powszechnie stosowana do identyfikacji mutacji, które dają pożądany fenotyp. Spośród metod, które można zastosować do osiągnięcia mutagenezy losowej, podatny na błędy PCR jest wygodną i skuteczną strategią generowania zróżnicowanej puli mutantów (tj. biblioteki mutantów). Podatny na błędy PCR jest metodą z wyboru, gdy badacz stara się zmutować wstępnie zdefiniowany region, taki jak region kodujący gen, pozostawiając inne regiony genomu nienaruszone. Po amplifikacji biblioteki mutantów przez podatny na błędy PCR, należy ją sklonować do odpowiedniego plazmidu. Rozmiar biblioteki wygenerowanej przez podatny na błędy PCR jest ograniczony przez wydajność etapu klonowania. Jednak w drożdżach rozszczepialnych, Schizosaccharomyces pombe, etap klonowania można zastąpić zastosowaniem wysoce wydajnej jednoetapowej reakcji termojądrowej w celu wygenerowania konstruktów do transformacji. Mutanty o pożądanych fenotypach mogą być następnie selekcjonowane za pomocą odpowiednich reporterów. Tutaj szczegółowo opisujemy tę strategię, biorąc za przykład reporter umieszczony w centromerowej heterochromatynie.

Pozyskane mutanty Rpt4, zgodnie z procedurami opisanymi na Rysunku 1, można analizować poprzez ocenę barwy kolonii. Barwy kolonii naniesione na odpowiednie szalki w malejącej liczbie komórek przedstawiono na Rysunku 2. Reporter ade6+ wstawiony w region heterochromatyny jest wyciszony u szczepu dzikiego, co objawia się czerwonymi koloniami na pożywce YES-Ade. Po destabilizacji heterochromatyny i ekspresji reportera ad...

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię losowej mutagenezy docelowego genu u drożdży rozszczepieniowych. Jako przykład celujemy w rpt4 +, który koduje podjednostkę proteasomu 19S i badamy pod kątem mutacji, które destabilizują heterochromatynę.

Mutageneza losowa ukierunkowana na geny w celu wyselekcjonowania mutantów proteasomów destabilizujących heterochromatynę w drożdżach rozszczepieniowych

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Ogólnym celem tej losowej mutagenezy jest badanie przesiewowe w kierunku mutacji, które destabilizują heterochromatynę. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie heterochromatyny, takie jak czynniki regulujące powstawanie i utrzymywanie heterochromatyny. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona być ukierunkowana na pożądany gen mutagenezy, nawet jeśli gen ten jest niezbędny.Na początek przygotuj ekstrakt drożdżowy z suplementami lub TAK, bez adeniny, Pombe Glutamate Medium lub PMG i PMG bez adeniny, mieszając składniki, jak pokazano w tej tabeli. Po sterylizacji w autoklawie i dodaniu G418, jeśli to konieczne, mieszaj pożywkę przez kolejne pięć do dziesięciu minut. Następnie podziel pożywkę na 90-mililitrowe szalki Petriego i przechowuj płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Używając sklonowanego rpt4-dodatniego, z pięcioma pierwszymi i trzema pierwszymi UTR i cichą mutacją, a także starterami p5 i p6 oraz specjalną polimerazą, zaprojektowaną w celu generowania wysokiego wskaźnika błędów, wykonaj podatny na błędy PCR w całkowitej objętości 50 mikrolitrów. Po wygenerowaniu konstruktu transformacyjno-fuzyjnego, zgodnie z protokołem tekstowym,

gene-targeted-random-mutagenesis-to-select-heterochromatin

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty protokół tworzenia losowej biblioteki mutantów dla określonej sekwencji docelowej. Pokazujemy, w jaki sposób metoda ta, realizowana in vivo w Escherichia coli, może być łączona z selekcją funkcjonalną w celu wyewoluowania nowych aktywności enzymatycznych.

Protokoły mutagenezy i selekcji funkcjonalnej dla ewolucji sterowanej białek w E. coli

Tutaj prezentujemy opłacalną metodę definiowania interakcji chemiczno-genetycznych w pączkujących drożdżach. Podejście to opiera się na podstawowych technikach biologii molekularnej drożdży i doskonale nadaje się do mechanistycznego badania małych i średnich zbiorów substancji chemicznych i innych środowisk pożywki.

Szybka identyfikacja chemicznych interakcji genetycznych u Saccharomyces cerevisiae

Przedstawiamy szczegółowy protokół do konstruowania i sprawdzania bibliotek mutantów dla kampanii ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae.

Metoda ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae: tworzenie i badanie przesiewowe biblioteki mutantów

Przedstawiamy protokół do oceny funkcjonalnej kompleksowych bibliotek mutagenezy saturacji pojedynczym miejscem białek wykorzystujących sekwencjonowanie wysokoprzepustowe. Co ważne, podejście to wykorzystuje ortogonalne pary starterów do budowy i sekwencjonowania bibliotek multipleksowych. Przedstawiono reprezentatywne wyniki przy użyciu TEM-1 β-laktamazy dobranej w klinicznie istotnej dawce ampicyliny.

Protokół oceny funkcjonalnej bibliotek mutagenezy nasycenia całych białek wykorzystujących sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości

Optogenetyczna mutageneza losowa z wykorzystaniem histonów-miniSOG u C. elegans

Przedstawiono strategię generowania mutacji w genach histonów w ich endogennym położeniu u Saccharomyces cerevisiae.

Ukierunkowana mutageneza in situ genów histonów u pączkujących drożdży

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Ten artykuł przedstawia metodę opartą na kojarzeniu, która ułatwia badanie przesiewowe nadekspresji u pączkujących drożdży przy użyciu biblioteki plazmidów z tablicą.

Badania przesiewowe biblioteki nadekspresji opartej na kryciach u drożdży

Prezentujemy prosty protokół ekranu tłumiącego w drożdżach rozszczepienia. Metoda ta jest skuteczna, wolna od mutagenów i selektywna w przypadku mutacji, które często występują w pojedynczym locus genomu. Protokół jest odpowiedni do izolowania supresorów, które łagodzą defekty wzrostu w płynnej kulturze, które są spowodowane mutacją lub lekiem.

Wspomagane głębokim sekwencjonowaniem, spontaniczne badanie supresorowe w drożdżach rozszczepienia Schizosaccharomyces pombe

Wrażliwe na temperaturę (ts) śmiertelne mutanty są cennymi narzędziami do identyfikacji i analizy podstawowych funkcji. W tym miejscu opisujemy metody generowania i klasyfikowania letalnych mutantów ts o wysokiej przepustowości.

Wysokoprzepustowa, wspomagana robotycznie izolacja wrażliwych na temperaturę śmiertelnych mutantów u Chlamydomonas reinhardtii

Poznaj metodę losowej mutagenezy ukierunkowanej na geny w drożdżach rozszczepieniowych Schizosaccharomyces pombe w celu identyfikacji mutantów destabilizujących heterochromatynę.

Mutageneza losowa ukierunkowana na geny w celu wyselekcjonowania mutantów proteasomów destabilizujących heterochromatynę w drożdżach rozszczepieniowych (Wideo) | JoVE Journal

Mutageneza losowa ukierunkowana na geny w celu wyselekcjonowania mutantów proteasomów destabilizujących heterochromatynę w drożdżach rozszczepieniowych

Przeglądaj więcej filmów