Mutageneza losowa ukierunkowana na geny w celu wyselekcjonowania mutantów proteasomów destabilizujących heterochromatynę w drożdżach rozszczepieniowych

Ogólnym celem tej losowej mutagenezy jest badanie przesiewowe w kierunku mutacji, które destabilizują heterochromatynę. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie heterochromatyny, takie jak czynniki regulujące powstawanie i utrzymywanie heterochromatyny. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona być ukierunkowana na pożądany gen mutagenezy, nawet jeśli gen ten jest niezbędny.

Na początek przygotuj ekstrakt drożdżowy z suplementami lub TAK, bez adeniny, Pombe Glutamate Medium lub PMG i PMG bez adeniny, mieszając składniki, jak pokazano w tej tabeli. Po sterylizacji w autoklawie i dodaniu G418, jeśli to konieczne, mieszaj pożywkę przez kolejne pięć do dziesięciu minut. Następnie podziel pożywkę na 90-mililitrowe szalki Petriego i przechowuj płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Używając sklonowanego rpt4-dodatniego, z pięcioma pierwszymi i trzema pierwszymi UTR i cichą mutacją, a także starterami p5 i p6 oraz specjalną polimerazą, zaprojektowaną w celu generowania wysokiego wskaźnika błędów, wykonaj podatny na błędy PCR w całkowitej objętości 50 mikrolitrów. Po wygenerowaniu konstruktu transformacyjno-fuzyjnego, zgodnie z protokołem tekstowym, zaszczepij dziesięć mililitrów pożywki YES drożdżami i inkubuj ją przez ponad 16 godzin do nasycenia. Użyj 200 mililitrów pożywki YES, aby rozcieńczyć komórki do OD600 0,2 i inkubować kulturę w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wstrząsając przez pięć do sześciu godzin do OD600 od 0,6 do 0,8.

Oblicz objętość komórek, które sumują się do OD600 wynoszącej 30. Następnie rozlej komórki do czterech 50-mililitrowych stożkowych probówek i schładzaj je na lodzie przez 10 minut. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 1050 g i czterech stopniach Celsjusza przez trzy minuty.

Następnie umieść probówki do mikrofuge z kasetą DNA i 10 elektrokuwetami na lodzie. Będąc jeszcze na lodzie, wyrzuć supernatant i dodaj 15 mililitrów 1,2-molowego sorbitolu, delikatnie potrząśnij probówkami, aby ponownie zawiesić komórki, a następnie odwiruj komórki w temperaturze 1050 G i czterech stopniach Celsjusza przez trzy minuty. Odrzucić supernatant i przeprowadzić drugie płukanie sorbitolem.

Po odwirowaniu odrzucić supernatant. Następnie ponownie zawieś komórki i zbierz je wszystkie w jednej 15-mililitrowej stożkowej probówce. Następnie dodaj 1,2 molowego sorbitolu do 2,4 mililitra.

Trzymaj probówkę z komórkami na lodzie. Następnie dodaj 200 mikrolitrów komórek zawieszonych w sorbitolu do probówki zawierającej konstrukt do fuzji PCR, dobrze wymieszaj i przenieś próbkę do kuwety elektrycznej. Ważne jest, aby nie używać nadmiernej ilości kasety PCR, ponieważ spowoduje to błędy rozładowania.

Elektroporuj ogniwa, korzystając z następujących opcji: dodaj 600 mikrolitrów 1,2-molowego sorbitolu do każdej elektrokuwety, aby uzyskać całkowitą objętość 800 mikrolitrów. Następnie rozłóż komórki na czterech płytkach YES. Inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Następnie wykonaj replikę posiewu na YES plus G418 przed inkubacją płytek przez dodatkowe trzy dni. Dla każdej płytki YES plus G418 wykonaj replikę posiewu do TAK bez adeniny i PMG bez płytek adeninowych. Inkubuj repliki płytek w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez jeden do dwóch dni, aż niektóre kolonie na TAK bez płytek adeninowych wykażą białe zabarwienie.

Porównaj TAK bez płytki adeninowej i PMG bez płytki adeninowej i wybierz komórki, które są różowe lub białe na płytce TAK bez adeniny, a także rosną na płytce PMG bez adeniny. Nie wybieraj kolonii bez wzrostu na PMG bez adeniny, ponieważ są to wyniki fałszywie dodatnie. Wybierz każdą kolonię i dodaj ją do 10 mikrolitrów roztworu SPZ zawierającego 2,5 miligrama na mililitr zymoliazy 100T.

Następnie inkubuj kolonie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 30 minut. Po inkubacji należy użyć jednego mikrolitra tego roztworu jako matrycy wyjściowej do PCR kolonii. Po strawieniu wybranych kolonii i przeprowadzeniu elektroforezy żelowej zgodnie z protokołem tekstowym, należy oznaczyć kolonie, których produkty PCR zostały wycięte przez XHO1 i załatać je do płytek YES plus G418.

Po wyizolowaniu gDNA z rozszczepienia komórek drożdży i sekwencjonowaniu produktów PCR zgodnie z protokołem tekstowym, porównaj uzyskaną sekwencję z sekwencją typu dzikiego w celu identyfikacji mutacji. Gdy mutacje zostaną ponownie wprowadzone do komórek typu dzikiego, użyj barwienia, aby potwierdzić fenotyp w nowo powstałych zmutowanych komórkach. Mutanty rpt4 wygenerowane przy użyciu protokołu pokazanego w tym filmie można analizować, oceniając kolory kolonii.

Jak pokazano na tym rysunku, kolonie zostały zauważone na odpowiednich płytkach w zmniejszającej się liczbie komórek. Reporter adeniny umieszczony w regionie heterochromatyny jest wyciszany w komórkach typu dzikiego i wytwarza czerwone kolonie na TAK bez płytek adeninowych. Po destabilizacji heterochromatyny i ekspresji reportera adeniny można zaobserwować białe kolonie na TAK bez płytek adeninowych, jak widać w przypadku mutanta clr4-delta.

Przebadane mutanty rpt4 są takie, jak pokazano, przy czym mutant rpt4-1 wykazuje najcięższą destabilizację heterochromatyny. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch tygodni, aby uzyskać pożądane mutanty. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wyeliminować wyniki fałszywie dodatnie, ponieważ są one częstsze niż oczekiwano.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak oczyszczanie białek i testy aktywności enzymatycznej, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak natura białek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować mutanty w docelowym genie o pożądanym fenotypie.